Abstract
Studien von integralen Membranproteinen in vitro sind durch die Anwesenheit einer hydrophoben Transmembrandomäne häufig kompliziert. Weitere diese Studien zu verkomplizieren, reincorporation von Waschmittel-solubilisierte Membranproteine in Liposomen ist ein stochastischer Prozess, in dem Protein-Topologie zur Durchsetzung unmöglich ist. Dieses Papier bietet eine alternative Methode, um diese anspruchsvollen Techniken, die ein Liposom-basierten Gerüst verwendet. Protein Löslichkeit wird durch die Deletion der Transmembrandomäne erhöht und diese Aminosäuren sind mit einem Anbinden Einheit ersetzt, wie beispielsweise ein His-Tag. Dieser Haltegurt wirkt mit einer Ankergruppe (Ni 2+ koordiniert von Nitrilotriessigsäure (NTA (Ni 2+)) für His-markierte Proteine), die an der Oberfläche des Liposoms eine einheitliche Protein - Topologie erzwingt. Ein Beispiel präsentiert wird, wobei die Wechselwirkung zwischen Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) mit einem integralen Membranprotein, Mitochondrial Fission Factor (MFF) wurde investigated dieses Gerüst Liposom-Verfahren. In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit von Mff demonstriert effizient löslich DRP1 an die Oberfläche von Liposomen zu rekrutieren, die ihre GTPase-Aktivität stimuliert. Darüber hinaus war DRP1 der Lage, die MFF-dekorierten Lipid-Vorlage in Gegenwart von spezifischen Lipiden tubulate. Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Gerüst Liposomen strukturellen und funktionellen Assays und unterstreicht die Rolle von Mff Aktivitäts DRP1 regulieren.
Introduction
Studium membran proximal Protein-Protein - Wechselwirkungen ist eine herausfordernde Fangen wegen der Schwierigkeit in der natürlichen Umgebung der integralen Membranproteine beteiligt rekapituliert 1. Dies ist aufgrund der Notwendigkeit des Waschmittels Solubilisierung und der inkonsistenten Orientierung von Proteinen in Proteoliposomen. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine Strategie eingesetzt , wobei lösliche Membrandomänen integraler Membranproteine exprimiert werden als His-Tag - Fusionsproteine, und diese löslichen Fragmente werden auf Gerüst Liposomen über Wechselwirkungen mit NTA (Ni 2+) Kopfgruppen am Lipid verankert Oberfläche. Unter Verwendung dieser Gerüste, lipid-proximale Protein-Wechselwirkungen können über einen Bereich von Lipid- und Proteinzusammensetzungen untersucht werden.
Wir haben effektiv diese Methode angewandt, um die kritische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, die Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer regieren und Lipid-Wechselwirkungen zu untersuchen, die diese pr modulierenocess 2. Während mitochondrialen Spaltung, eine konservierte Membran - Remodeling - Protein, Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) 3 genannt, wird auf die Oberfläche der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) in Reaktion auf zelluläre Signale eingestellt , die Energie - Homöostase, apoptotische Signal regulieren, und mehrere andere Integral mitochondrialen Prozesse. 8 - Dieses große wird zytosolische GTPase an die Oberfläche der Mitochondrien durch Wechselwirkungen mit Proteinen integral OMM 4 eingestellt. Die Rolle eines solchen Proteins, Mitochondrial Fission Factor (MFF), ist schwierig gewesen , aufgrund einer scheinbaren schwache Wechselwirkung mit DRP1 in vitro zu untersuchen. Dennoch haben genetische Studien eindeutig gezeigt , dass Mff für eine erfolgreiche mitochondrialen Spaltung 7,8 wesentlich ist. Das Verfahren in diesem Manuskript beschrieben konnte früheren Mängel zu überwinden, indem die gleichzeitige Lipid-Wechselwirkungen, die Einführung von DRP1-Mff Wechselwirkungen fördern. Insgesamt ist dieses neuen Assay REVEAführte fundamentalen Wechselwirkungen der Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer Führung und eine neue Etappe für die laufende strukturelle und funktionelle Untersuchungen dieser wesentlichen molekularen Maschine zur Verfügung gestellt.
Bislang Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen DRP1 und Mff haben durch die inhärente Flexibilität der Mff 9, die Heterogenität der DRP1 Polymeren 2,10, und die Schwierigkeit bei der Reinigung und Rekonstitution von voller Länge Mff mit einer intakten Transmembran- Domäne 11 kompliziert. Wir adressiert diese Herausforderungen mithilfe von NTA (Ni 2+) Gerüst Liposomen His-markierte Mff fehlt seine Transmembran - Domäne (MffΔTM-His 6) zu rekonstruieren. Diese Strategie war vorteilhaft , da MffΔTM extrem gut löslich war , als überexprimiert in E. coli, und das isolierte Protein wurde auf Gerüst Liposomen leicht wiederhergestellt. Wenn auf diese Lipid templates gebunden, angenommen Mff eine identische, nach außen weisende Orientierung an der Oberfläche der Membran.Zusätzlich zu diesen Vorteilen wurden mitochondrialen Lipiden, wie Cardiolipin, hinzugefügt Mff Faltung und Assoziation mit der Membran 11 zu stabilisieren. Cardiolipin interagiert auch mit der variablen Domäne der DRP1 2,12 welche diese ungeordneten Bereich stabilisieren kann und die Montage der Spaltmaschinen erleichtern.
Diese robuste Methode ist allgemein anwendbar für zukünftige Studien, die Membran-proximalen Protein-Wechselwirkungen zu bewerten suchen. Durch den Einsatz von zusätzlichen Anbinden / affine Wechselwirkungen kann die Komplexität dieser Membran Rekonstitution Untersuchungen verbessert werden zusätzliche Komplexität an der Oberfläche der Membranen in Zellen zu imitieren. Zur gleichen Zeit, Lipidzusammensetzungen können modifiziert werden, um mehr, um genau die nativen Umgebungen dieser makromolekularen Komplexen nachahmen. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren ein Mittel, um die relativen Beiträge von Proteinen und Lipiden in der Gestaltung Membranmorphologien bei kritischen zellulären proc zu untersuchenzesse.
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Protocol
1. Scaffold Liposome Vorbereitung
HINWEIS: eine relativ einfache und featureless Gerüst (bestehend aus DOPC (1,2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin oder PC) und DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-Dioleoyl, anfänglichen Experimenten sollte Idealer verwenden - sn - glycero-3 - [(N - (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure) succinyl]. (Nickelsalz)) , das weg von diesen Experimenten Lipidladung, Flexibilität und Krümmung kann als einzelne Faktoren eingeführt werden , mit dem Potential Membran-proximalen Wechselwirkungen zu ändern. Diese Änderung kann durch Zugabe definierter Mengen spezifischer Lipidbestand erreicht werden, einschließlich Phosphatidylserin oder Cardiolipin (CL), Phosphatidylethanolamin (DOPE oder PE) oder Galactosyl (β) Ceramid.
- Kombinieren Sie in Chloroform in einem sauberen Glas Reagenzglas gelöst Lipide. Dampfe das Lösungsmittel unter trockenem Stickstoffgas, während das Rohr Drehen eines dünnen Lipidfilm zu bilden. Entfernen Restlösungsmittel mit einem centrifugal Verdampfer für 1 h bei 37 ° C.
HINWEIS: Verschiedene Liposomenformulierungen werden in den Protokollen beschrieben: Gerüst Liposomen (3,3 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7 Mol-% DOPC), Gerüst Liposomen mit Cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% Cardiolipin / 86,7 mol% DOPC), flexible Gerüst Liposomen mit Cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% Cardiolipin / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC) und angereichertem Gerüst Liposomen (10 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 15 Mol-% Cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 Mol-% DOPC). - Hinzufügen Puffer A (25 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure), 150 mM KCl, pH eingestellt auf 7,5 mit KOH), vorerhitzt auf 37 ° C, so dass die endgültige Lipidkonzentration von 1 bis 2 mM. Inkubieren 30 min bei 37 ° C unter gelegentlichem Vortexen vollständig das Lipidgemisch (Abbildung 1a) resuspendieren.
- Transfer zu einem Kunststoff-Teströhrchen, das Reagenzglas in flüssigem Stickstoff bis vollständig gefroren (roughly 30 s), und in einem 37 ° C Wasserbad °, bis sie vollständig aufgetaut (ca. 1-2 min). Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Gefrier-Auftau - Zyklen (Abbildung 1b).
- Vorbereiten eines Lipids Extruder durch Einweichen 4 Filterträger und einen Polycarbonatfilter in Puffer und Zusammenbauen des Extruders nach Herstelleranweisungen. Extrudieren der Lipidlösung durch den Filter 21-mal. Verwenden Sie sanft, mit konstantem Druck eine homogene Größenverteilung (Abbildung 1c) zu gewährleisten.
HINWEIS: Für alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimenten wurde eine 1,0 um Polycarbonatfilter wurde für die Extrusion verwendet. DRP1 Wechselwirkung mit anionischen Lipide können mit einer Vielzahl von Liposomendurchmessern beobachtet werden , im Bereich von 50 nm bis 400 nm 12 oder größer 13. Daher wurde die Filtergröße von 1 um als ideal sowohl GTPase-Aktivität ausgewählt und für die Elektronenmikroskopie. Wenn andere Liposoms Durchmesser gewünscht sind, Herstellung von riesigen unilamellaren Vesikeln 14,15 (GUVs) oder kleine unilamellar Vesikel 16 (SUVs) verwendet werden. Dynamische Lichtstreuung verwendet werden , um Liposomengrößenheterogenität 13 beurteilen. - Lagerung von extrudierten Liposomen bei 4 ° C und entsorgen Sie nach 3 bis 5 d.
2. Verwendung von Scaffold Liposome für die Proteinbindungsanalyse
- Probenvorbereitung
- Für mindestens 15 min; inkubieren MffΔTM (5 & mgr; M final) mit Gerüst Liposomen (50 uM final 40 Mol-% PC / 35 Mol-% PE / 15 Mol-% CL / 10 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+)) His-tagged bei RT in Puffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol (BME), pH auf 7,5 mit KOH eingestellt). Für eine Mff freie Steuerung, bebrüten Liposomen mit einem His-markierten Kontrollprotein (wie GFP) zu binden und Schirm ausgesetzt NTA (Ni 2+).
HINWEIS: MffΔTM wurde exprimiert und gereinigt , wie in einer früheren Studie 2 beschrieben. GFP wurde in ähnlicher Weise gereinigt, aber die Ionenaustauschschritt weggelassen wurde. BME wurde für diese experimen erforderlichts da ist DRP1 oxidationsempfindlich, die ihre Aktivität und Montageeigenschaften verändern kann. - In DRP1 (2 uM final) und Inkubation für 1 h bei RT.
HINWEIS: Es wurde DRP1 exprimiert und gereinigt , wie in einer früheren Studie 2 beschrieben. Nach Inkubation mit DRP1, kann die Wirkung der Nukleotid - Bindungs auf Membranverformung durch Inkubation eine weitere Stunde mit 2 mM MgCl 2 und entweder 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, oder Puffer A + BME sucht werden.
- Für mindestens 15 min; inkubieren MffΔTM (5 & mgr; M final) mit Gerüst Liposomen (50 uM final 40 Mol-% PC / 35 Mol-% PE / 15 Mol-% CL / 10 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+)) His-tagged bei RT in Puffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol (BME), pH auf 7,5 mit KOH eingestellt). Für eine Mff freie Steuerung, bebrüten Liposomen mit einem His-markierten Kontrollprotein (wie GFP) zu binden und Schirm ausgesetzt NTA (Ni 2+).
- Negative Stain Transmissions-Elektronenmikroskopie (EM) Analyse
- Transfer 5 ul der Probe auf ein Blatt Laborfolie und legen eine kohlenstoffbeschichteten Cu / Rh Gitter auf der Probe. Inkubieren Sie die Gitter 1 min auf der Probe, auslöschen überschüssige Flüssigkeit auf Filterpapier entfernt und übertragen zu einem Rückgang von 2% Uranylacetat. Inkubieren 1 min, auslöschen Überschuss Fleck auf Filterpapier und übertragen auf eine Gitterbox. Shop unter Vakuum O / N Vollaustrocknungs zu gewährleisten.
- Bild Proben mit einem Transmissions-Elektronen-Microsc mitope bei 18.500 - 30.000 - facher Vergrößerung ultrastrukturelle Veränderungen in Protein und Liposom - Morphologien 17 zu beachten.
Hinweis: Elektronenmikroskopische Veränderungen quantifiziert werden können Bildanalyse - Software, wie ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein Dekoration kann gemessen werden, wenn im Vergleich mit nackten Lipid-Vorlagen. Außerdem können die Durchmesser der rohrförmigen Segmente aus dem äußersten Abschnitt der 13 Baugruppen gemessen werden. Eine genauere Analyse kann Kryo-Elektronenmikroskopie 17 durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann ohne den Einsatz von Schwermetall Flecken, die Beschichtung der Probe in Lösungsmittel native Protein-Lipid-Baugruppen Bild verwendet werden. Auf diese Weise können detaillierte strukturelle Merkmale nicht in Negativfärbung erkennbar, einschließlich Änderungen in der darunter liegenden Lipid Morphologie kann untersucht und quantifiziert werden.
3. Verwendung von Scaffold Liposome für enzymatische Assay
Hinweis: A Colorimetrische GTPase - Test 18 wurde verwendet , Phosphat Befreiung über die GTP - Hydrolyse zu messen. Alternative GTPase - Assays sind 19 verfügbar und können je nach Bedarf umgesetzt werden.
- Inkubieren His-tagged MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1) oder GFP (5 uM final für alle) mit Gerüst Liposomen (150 & mgr; M final) für 15 min bei RT in Puffer A + BME (Volumen = 30 & mgr; l). In DRP1 (500 nM endgültige) und Inkubation weitere 15 min bei RT (Volumen = 80 & mgr; l).
HINWEIS: Fis1 wurde in ähnlicher Weise wie Mff 2, aber der Ionenaustausch - Chromatographie - Schritt weggelassen wurde gereinigt. Der Zweck His-Tag GFP ist es, die NTA (Ni 2+) Kopfgruppen zu schützen und nicht - spezifische Ladungs Wechselwirkungen mit anderen Proteinen zu verhindern. Wenn keine Wirkung in Abwesenheit von GFP beobachtet wird, dann kann diese Steuerung nicht erforderlich. Alternative blockieren Proteine (von vergleichbarer Größe wie das Protein von Interesse) können auch verwendet werden, aber GFP ermöglicht die direkte Visualisierung der Wechselwirkungen mit scaffalten Liposomen. - Übertragungsrohre zu einem Thermocycler auf 37 ° C eingestellt und initiieren Reaktionen durch Zugabe von GTP und MgCl 2 (1 mM und 2 mM final sind; Volumen = 120 ul).
- Zu gewünschten Zeitpunkten (dh T = 5, 10, 20, 40, 60 min), Transfer 20 ul Reaktion auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte , enthaltend 5 & mgr; l 0,5 M EDTA Mg 2+ zu chelatisieren und die Reaktion zu stoppen.
- Einen Satz von Phosphat - Standards von KH 2 PO 4 in Puffer A + BME Verdünnung Ergebnisse zu kalibrieren. Ein nützlicher Satz von Standards ist 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 und 0 & mgr; M. Geben Sie 20 & mgr; l von jedem zu den Vertiefungen, enthaltend 5 & mgr; l von 0,5 M EDTA.
- Fügen Sie 150 ul von Malachitgrün - Reagenz (1 mM Malachitgrün Carbinol, 10 mM Ammoniummolybdattetrahydrat und 1 N HCl) in jede Vertiefung und lesen OD 650 5 min nach der Zugabe.
HINWEIS: GTP ist säurelabil und wird in Gegenwart von Malachitgrün-Reagenz hydrolysieren. Stellen Sie sicher, dass ter Zeit zwischen Zugabe von Malachit-Reagenz und das Lesen ist konstant reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. - Generieren Sie eine Standardkurve von OD 650 der Standards als Funktion der Phosphatkonzentration aufgetragen ist . Verwenden der linearen Regression , die die Beziehung zwischen OD 650 und Phosphatkonzentration in einer Probe zu bestimmen.
- Mit Hilfe der linearen Regression, wandeln die OD 650 der Proteinreaktionsproben zu uM Phosphat. Bestimmen die Rate der Phosphat - Generierung für jedes Reaktionsgemisch durch Phosphatkonzentration als Funktion der Zeit aufgetragen, und konvertieren cat k durch die Rate der Konzentrations DRP1 Dividieren (0,5 uM).
HINWEIS: Nur der linearen Anfangsgeschwindigkeit sollte die Rate der Phosphaterzeugung und mindestens 3 Datenpunkte, um zu bestimmen, verwendet werden müssen, verwendet werden. Wenn die Reaktionsgeschwindigkeit ausreichend schnell ist , dass die ersten drei Datenpunkte nicht linear sind (dh der r 2 der linearen Anpassung kleiner als 0,9) ein Zeichenificantly kürzere Zeitverlauf mit mindestens 3 Zeitpunkten durchgeführt werden.
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Representative Results
Während die Interaktion zwischen DRP1 und Mff nachgewiesen wurde für mitochondriale Spaltung wichtig zu sein, hat diese Interaktion schwierig gewesen , in vitro zu rekapitulieren. Unser Ziel war es besser, die zelluläre Umgebung emulieren, wobei DRP1 und Mff interagieren. Zu diesem Zweck Liposomen , die Grenzkonzentrationen von NTA (Ni 2+) Kopfgruppen wurden durch Rehydratisieren ein Lipidfilm hergestellt , wie oben beschrieben. Die Lipidlösung besteht zunächst aus unilamellaren und multilamellaren Vesikeln heterogener Durchmesser , wie durch die Trübung der Lösung (Abbildung 1a) zeigt. Diese Trübung wird durch Gefrieren und Auftauen (Abbildung 1b) reduziert, was die Verbreitung von multilamellaren Vesikeln reduziert. Die Liposomendurchmesser werden durch Extrusion durch einen Polycarbonatfilter homogenisiert, was zu einer klaren Lösung führt (Figur 1c).
2 eingesetzt wurden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, verwendeten wir eine neue Vorlage, bestehend aus PC, PE, Ni und CL (genannt Enriched Scaffold Liposome oder ESL) bestellt Aufbau eines polymeren DRP1-Mff Komplex in der Lage zu induzieren Membran Verformung zu fördern. Insbesondere erhöht NTA (Ni 2+) und Cardiolipin Lipide wurden verwendet (10 mol% und 15 mol% jeweils) für diese Anwendung. Dann GFP oder Mff wurde in Anwesenheit und Abwesenheit von DRP1 (Abbildung 2), und die Fähigkeit von DRP1 zu ESL - Vorlagen gefesselte Membranen umzubauen wurde qualitativ beurteilt. In Abwesenheit von DRP1 weder Mff noch GFP resultierte in Membranverformung (3a, b), und in ähnlicher Weise im Fall der GFP-dekoriert ESL, nur featureless Liposomen beobachtet (Abbildung 3c). Wenn jedoch Drp1 wurde hinzugefügt , um Mff eingerichtete ESL - Vorlagen, Umbau der Liposomen war offensichtlich (Abbildung 3d).
Während makromolekularen Komplexbildung deutlich eine Wechselwirkung zwischen DRP1 und Mff zeigt, allein diese qualitative Analyse ist unfähig, die funktionellen Wirkungen einer solchen Wechselwirkung zu bestimmen. Daher verwendeten wir ein Malachitgrün Phosphat Generation Assay 18 Änderungen in der katalytischen Aktivität von DRP1 in Reaktion auf die Interaktion mit Mff beurteilen. Wie zuvor 2 beschrieben, verwendeten wir zunächst ein einfaches Gerüst Liposom (SL; 3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+), DOPC 96,7 mol%) die Wirkung der Mff allein auf DRP1 Struktur und Funktion zu untersuchen. Unspezifische Wechselwirkung von DRP1 mit NTA (Ni 2+) zuvor 20 beschrieben worden ist , so SL zunächst niedrige Konzentrationen von NTA (Ni 2+) enthalten entworfen wurde , nicht - spezifische Aktivität Stimulation von Dr zu vermeidenp1. Mit den größeren Mengen an NTA (Ni 2+) in ESL, die Verwendung von His-tagged GFP als Kontrolle wurde festgestellt , das Ni 2+ als kritisch abzuschirmen und unspezifischer Wechselwirkungen DRP1 verhindern. Nach Dekoration von SL Liposomen durch Mff oder GFP (wie in Abbildung 2 dargestellt), kann das Ausmaß der Selbstorganisation durch Messen der GTPase - Aktivität von DRP1 beurteilt werden. In Abwesenheit von Liposomen, hat DRP1 eine relativ niedrige basale GTPase-Aktivität, die durch Zugabe von SL leicht verbessert. Dekoration dieser Gerüst Liposomen mit Mff verstärkte GTPase - Aktivität (Abbildung 4a, 1,8 - fach). Umgekehrt, wenn der belichtete NTA (Ni 2+) Kopfgruppen mit His-tagged GFP blockiert waren, wurde dieser Augmented GTPase Aktivität ablatiert. Wir testeten auch die Rolle der Fis1 ein OMM Protein , das 21,22 eine Rolle bei der mitochondrialen Spaltung vorgeschlagen worden, obwohl diese 7,23 in neueren Studien herausgefordert wurde. Tethering von Fis1 fehlt seine Transmembran-Domänebis SL versagt auch eine Stimulation der DRP1 der GTPase - Aktivität (Figur 4a) hervorzurufen.
Wir verwendeten dann eine etwas kompliziertere Lipidgerüst eine kleine Menge von Cardiolipin (SL / CL: SL mit 10 Mol-% Cardiolipin ersetzt DOPC), die die Rolle dieses mitochondrialen Lipid in der Wechselwirkung von DRP1 und Mff zu bestimmen. Diese moderate Konzentration von Cardiolipin wurde speziell auf die Stimulation von DRP1 von Cardiolipin zu begrenzen gewählt wie zuvor 10 beschrieben. Ähnlich wie SL, die Zugabe von SL / CL zu DRP1 ergab eine leichte Stimulation der GTPase-Aktivität, die durch Anbinden His-tagged Fis1 oder GFP an die Liposomen umgekehrt wurde. Eine Synergie zwischen Mff und Cardiolipin wurde beobachtet , wie die GTPase - Aktivität von DRP1 2,6 - fache stimuliert wurde , wenn es mit Mff eingerichtete SL / CL (Abbildung 4b) inkubiert.
Membranfluidität und die Fähigkeit, of DRP1 Lipid-Doppelschichten umzubauen vorgeschlagen seine GTPase-Aktivität zu verbessern. Daher haben wir versucht, die Wirkung der Membranfluidität / Flexibilität mit einem flexiblen Gerüst Liposom zu untersuchen. Dies wurde durch Ersetzen von 35 Mol-% DOPC in SL / CL mit DOPE (SL / PE / CL) erreicht, die für DRP1-vermittelte Membran Remodeling 10 zuvor gezeigt worden ist , zu ermöglichen. Die Zugabe von undecorated SL / PE / CL Gerüst Liposomen DRP1 verbessert leicht DRP1 GTPase-Aktivität und Dekoration dieser Liposomen mit GFP eliminiert diesen Effekt. Wenn SL / PE / CL - Vorlagen mit Mff verziert wurden, wurde DRP1 Aktivität verbessert (Abbildung 4c, 2,4 - fach). Wie wir früher gezeigt haben, wurde die Fähigkeit von DRP1 umzubauen Liposomen in Lipid Tubuli durch Zusatz von PE zu den Gerüst Liposome erhöht. Interessanterweise ist diese verbesserte tubulation zur Bildung eines spiralförmigen DRP1 Polymer führenden hat in grßerem Stimulation führen im Vergleich zu Liposomen, die DRP1 konnte umzubauen Mit Hilfe dieser anpassungsfähigen Lipid - Vorlagen, Mff und DRP1 wurden gefunden in einer natürlichen Umgebung in vitro zu interagieren. Diese Technik hat uns ermöglicht , die relative Häufigkeit von DRP1 zu steuern, Mff (durch NTA (Ni 2+) -Konzentration) und spezifische Lipide (Cardiolipin und PE spezifisch), die die Montage dieses makromolekularen Komplexes zu regulieren schien. Wie wir gezeigt haben, kann diese Methode die Membran Remodellierung von Mff rekrutierten DRP1 durch Elektronenmikroskopie zur Visualisierung verwendet werden, und die Auswirkungen der DRP1 Montage auf seine katalytische Aktivität unter Verwendung GTPase-Aktivitätstest zu bestimmen. 71fig4.jpg "/> 
Abbildung 1: Lipid Vorbereitung Schematic. (A) Bei der Resuspension Liposomen verschiedener Größen bilden und bestehen aus unilamellaren und multilamellar Vesikel, die in einer undurchsichtigen Lösung (kleines Bild) führt. (B) Einfrieren und Auftauen der Lösung führt zu einer unilamellaren Population von Liposomen, die im Durchmesser immer noch heterogen sind. Gefrier-Auftau klärt die Lösung (kleines Bild). (C) Extrusion der Lipidlösung homogenisiert das Liposom Durchmesser (1,0 & mgr; m in diesem Beispiel), und führt zu einer klaren Lösung (kleines Bild). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 2: Methoden Protein Montage zu beurteilen. Eine schematische Darstellungspartnerprotein Montage auf Gerüst Liposomen vorgestellt. His-markierte Proteine oder Partner GFP mit Gerüst Liposomen inkubiert und dann wird DRP1 mit mit oder ohne Dekor Lipo inkubiert somes. Diese DRP1-vormontierte Liposomen können dann durch strukturelle Methoden (Elektronenmikroskopie) und funktionelle Assays (GTPase-Assay) untersucht werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3: Strukturelle Bewertung der DRP1 Recruitment. Negative Fleck Übertragung mikroskopische Aufnahmen von GFP oder Mff dekoriert Liposomen allein (A, B, respectively) oder inkubiert mit DRP1 (C, D, beziehungsweise). Maßstabsbalken = 100 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Scaffold Liposome Enzymtest. (A - C) Die Erzeugung von Phosphat über die Zeit gemessen wurde (kleines Bild) und die k cat bestimmt. Diese Methode wurde zur SL-tethered Proteinen (A), SL / CL-tethered Proteine (B) aufgebracht oder SL / PE / CL-tethered Proteinen (C). #: P <0,05, *: p <0,0001, **: p <0,000001 wie durch ungepaarten Student-T-Test bestimmt. Alle Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei unabhängigen Proben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen integralen Membranproteinen. Durch ein modulares Gerüst Liposom verwendet wird, sind Forscher, die die Aktivität eines oder mehrerer Proteine in einer Lipid-Umgebung proximal zu beurteilen. 26 - Frühere Studien haben eine ähnliche Methode für die Rezeptorenzyme der Plasmamembran 24 gezeigt. Wir haben dieses Verfahren erweitert, um Lipid-Cofaktoren integrieren und zu erforschen Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die die mechanoenzymatic Kern der mitochondrialen Teilungsmaschinerie bilden.
Für das Modellsystem oben dargestellt, fanden wir, dass Mff eingerichtete SL DRP1 Selbstmontage verbessert. Darüber hinaus zeigen wir nun, dass, wurden Mff eingerichtete ESL-Vorlagen effizient umgestaltet von Wildtyp DRP1 erweitert röhrenförmige Strukturen zu bilden. Wir untersuchten auch die Rollen der verschiedenen mitochondrialen Lipide, einschließlich der negativ geladenen Cardiolipin und dem konischen Lipid PE.Cardiolipin synergizes mit Mff weiter DRP1 Selbstorganisation zu verbessern, während die Membran Flexibilität und Fluidität verliehen durch PE-Membran tubulation verbessert, aber nicht weiter vermehren Stimulation-Mff induziert.
Zur Beurteilung ultrastrukturelle Veränderungen in Membranmorphologien Analysen EM erforderlich waren. DRP1 GTPase - Aktivität wurde durch Clustering und Montage von fädigen Polymere erhöht, die die Liposomen in einem großen Ausmaß 2 nicht neu zu gestalten hat. Jedoch wurde Membranverformung beobachtet, wenn die mehr Mitochondrien artigen SL / PE / CL Matrize verwendet wurde. Interessanterweise wurde die Enzymaktivität nicht verbessert. Daher wurden die EM-Studien wesentliche in wesentlichen Unterschiede zu identifizieren, die ansonsten fehlen würden die funktionelle Assay.
Während diese Technik für die Erforschung der Funktion und Wechselwirkung von löslichen Proteinen und löslichen Proteindomänen leistungsfähig ist, machen diese Lipid Gerüste nicht für die Rolle der Transmembran-Domänes. Dies ist eine wichtige Überlegung , da die transmembrane Domäne dynamische Protein Prozesse wie Selbstanordnung 27 und seitliche Diffusion 28 bewirken - 30 in Lipid - Doppelschichten. Wenn diese Faktoren entscheidend für die Bewertung Protein-Wechselwirkungen an der Membranoberfläche, dann herkömmliche Lipid Rekonstitutionsexperimenten mit Waschmittel würde bevorzugt werden. Alternative Anbindehaltung kann auch die Rekrutierung und Beweglichkeit der Membran verankerten Proteine zu steuern, untersucht werden.
Neben der Verwendung von His-markierten Proteinen mit NTA (Ni 2+) Lipidanker, andere Fangbänder wie Biotin-konjugiertem 31 oder reaktive Gruppe konjugiert Lipide können verwendet werden. Diese kovalente Modifikationen würden stabiler Falle Proteine an der Lipid-Oberfläche, sondern die Mobilität und den Austausch dieser Faktoren wahrscheinlich vermindert werden würde. Als solches sollte der Haltegurt sorgfältig im Rahmen der Proteinkomplexe angesehen werden untersucht. Wenn consideRing der Anwendung dieses Verfahrens, der Art der Proteine zu Lipid templates Anbinden haben das Potential bestimmter Assays zu beeinflussen. Zum Beispiel kann die Anbinden His-tag an NTA (Ni 2+) Verfahren kann zur in situ - Assays besser geeignet sein , anstatt Trennversuche, insbesondere im Falle von transienten Protein-Protein - Wechselwirkungen. Dies ist deutlich in Figur 3 durch die Diskrepanz zwischen dem in situ Negativfärbung - Elektronenmikroskopie und der Sedimentation Assay demonstriert.
In Zukunft wird eine Kombination von zwei oder mehreren dieser Anker Lipiden mit unterschiedlichen Zielkopfgruppen könnten für die Einstellung mehrerer Proteine an ein Gerüst Vorlage ohne Konkurrenz für eine einzelne Lipid Haltegurt zu ermöglichen implementiert werden. Darüber hinaus kann die relative Menge jeder Komponente durch Veränderung der Lipidzusammensetzung verwaltet werden. Zusätzliches Lipid Cofaktoren, wie Phosphoinositiden, Cardiolipin und Phosphatidylserin, kann leicht eingeführt werden,in diesen Vorlagen die isolierte Wirkung einer Vielzahl von Faktoren zu bewerten.
Insgesamt stellen diese Lipid Gerüste eine neuartige Plattform für komplexe Protein-Wechselwirkungen in der Nähe von Lipidmembranen zu untersuchen. Diese Schablonen sind leicht erzeugt und sind einfach in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen anzupassen, einschließlich enzymatischer Assays, Elektronenmikroskopie, oder Fluoreszenz-Bildgebung. Zusätzlich kann die Lipidzusammensetzung formuliert werden, um ein Organell oder Membranmikrodomäne von Interesse zu ähneln besser Proteinfunktion an diesen spezifischen Regionen rekapitulieren. Mit Hilfe dieser Techniken können Biochemiker untersuchen die komplexen Wechselwirkungen von membrangebundenen und Membran-assoziierten Proteinen mit ihren Partnern und ihrer Umgebung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
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- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
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