Abstract
Studier av integrerte membranproteiner in vitro, er ofte komplisert ved tilstedeværelsen av et hydrofobt transmembrandomene. Videre kompliserer disse studiene, er reincorporation av vaskemiddel-solubilisert membran proteiner i liposomer en stokastisk prosess hvor protein topologi er umulig å håndheve. Dette papiret gir en alternativ metode til disse utfordrende teknikker som benytter en liposom-baserte stillaset. oppløselighet proteinet økes ved delesjon av transmembrandomenet, og disse aminosyrer er erstattet med en deling del, slik som et His-tag. Dette tjore samvirker med en forankrings gruppe (Ni 2+ koordinert av nitriltrieddiksyre (NTA (Ni2 +)) for Hans-merkede proteiner), som håndhever en ensartet protein topologi ved overflaten av liposomet. Et eksempel er vist, karakterisert ved at interaksjonen mellom dynamin-relatert protein 1 (Drp1) med et integrert membranprotein, Mitokondriell spalting Factor (MFF), ble investigated bruke denne stillas liposomer metoden. I dette arbeidet har vi vist evne til MFF til effektivt å rekruttere oppløselig Drp1 til overflaten av liposomer, som stimulerte sin GTPase-aktivitet. Videre Drp1 var i stand til å tubulate den MFF-dekorerte lipid templat i nærvær av spesifikke lipider. Dette eksempel viser effektiviteten av stillas liposomer ved hjelp av strukturelle og funksjonelle analyser og belyser rolle i å regulere MFF Drp1 aktivitet.
Introduction
Studerer membran-proksimale protein-protein interaksjoner er en utfordrende oppgave på grunn av vanskeligheter med å rekapitulere den opprinnelige miljø av integrerte membranproteiner involvert en. Dette skyldes nødvendigheten av vaskemiddel oppløsning og inkonsekvent orientering av proteiner i proteoliposomes. For å unngå disse problemene, har vi anvendt en strategi hvorved oppløselige domener av integrerte membranproteiner er uttrykt som His-tag-fusjonsproteiner, og disse løselige fragmenter er forankret til stillas liposomer via interaksjoner med NTA (Ni2 +) hodegrupper ved lipid flate. Ved hjelp av disse stillasene, kan lipid-proksimale protein interaksjoner bli undersøkt over et spekter av lipid og protein komposisjoner.
Vi har effektivt brukt denne metoden for å undersøke kritiske protein-protein interaksjoner som styrer montering av mitokondrie fisjon komplekse og undersøke lipid interaksjoner som modulerer denne process to. Under mitokondrie fisjon, en konservert membran ombygging protein, kalt dynamin-relaterte protein 1 (Drp1) 3, blir rekruttert til overflaten av den ytre mitokondriemembranen (OMM) som reaksjon på cellulære signaler som regulerer energihomeostase, apoptotisk signalering, og flere andre integrerte mitokondrie prosesser. Denne store, cytosolic GTPase rekrutteres til overflaten av mitokondrier gjennom samhandling med integrerte OMM proteiner 4 - 8. Rollen av et slikt protein, Mitokondriell spalting Factor (MFF), har vært vanskelig å klargjøre på grunn av en tilsynelatende svake interaksjon med Drp1 in vitro. Likevel har genetiske studier tydelig vist at MFF er avgjørende for vellykket mitokondrie fisjon 7,8. Metoden som beskrives i dette manuskriptet var i stand til å overvinne tidligere mangler ved å innføre samtidige lipid interaksjonene som fremmer Drp1-MFF interaksjoner. Samlet denne romanen analysen revealedet fundamentalkraft guiding montering av mitokondrie fisjon komplekse og gitt en ny scene for pågående strukturelle og funksjonelle studier av denne viktige molekylære maskinen.
Til dags dato, har undersøkelse av interaksjonen mellom Drp1 og MFF blitt komplisert ved den iboende fleksibiliteten av MFF 9, heterogeniteten av Drp1 polymerer 2,10, og vanskeligheten med rensende og rekonstituering av full-lengde MFF med en intakt transmembrandomene 11. Vi adressert disse utfordringene ved hjelp av NTA (Ni 2+) stilla liposomer for å rekonstituere Hans-merket MFF mangler sitt transmembrandomene (MffΔTM-His 6). Denne strategien var en fordel fordi MffΔTM var ekstremt løselig når over-uttrykt i E. coli, og det isolerte protein ble lett rekonstituert på stillas liposomer. Når bundet til disse lipid malene, MFF antok en identisk utadvendt orientering på overflaten av membranen.I tillegg til disse fordeler, mitokondrielle lipider, slik som kardiolipin, ble tilsatt for å stabilisere MFF folding og assosiasjon med membranen 11. Cardiolipin samhandler også med variable domene Drp1 2,12 som kan stabilisere dette uordnede regionen og legge til rette for montering av fisjons maskiner.
Denne robuste metoden er allment gjeldende for fremtidige studier som søker å evaluere membran-proksimale protein interaksjoner. Gjennom bruk av ytterligere deling / affinitetsinteraksjoner kan raffinement av disse membranomdannings studiene økes for å etterligne ytterligere kompleksitet funnet på overflaten av membraner i cellene. På samme tid, kan lipid sammensetninger bli modifisert for mer nøyaktig å etterligne de native miljø i disse makromolekylære komplekser. I sammendrag, gir denne metoden et middel for å undersøke de relative bidragene fra proteiner og lipider i å forme membran morfologi til under kritisk cellulær procprosessene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stillas Liposome Forberedelse
MERK: Ideelt innledende forsøk bør bruke en relativt enkel og særpreg stillas (består av DOPC (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine eller PC) og DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl - sn -glycero-3 - [(N - (5-amino-1-karboksypentyl) iminodieddiksyre) succinyl]. (nikkelsalt)) Bygging av av disse eksperimentene, lipid-ladning, fleksibilitet, og krumningen kan innføres som individuelle faktorer med potensial til å endre membran-proksimale interaksjoner. Disse endringene kan oppnås ved tilsetning av definerte mengder av spesifikke lipidbestanddeler, inkludert fosfatidylserin eller kardiolipin (CL), fosfatidyl-etanolamin (DOPE eller PE), eller galaktosyl (β) ceramid.
- Kombiner lipider oppløst i kloroform i et rent prøverør av glass. Fordamp løsningsmidlet med tørr nitrogengass under rotasjon i røret til dannelse av en tynn lipidfilm. Fjern rester av løsemidler med en sentrifugel fordamperen i 1 time ved 37 ° C.
MERK: Forskjellige liposomformuleringene er benyttet i protokollene beskrevet nedenfor: stilla liposomer (3,3 mol% DGS-NTA (Ni2 +) / 96,7 mol% DOPC), stilla liposomer med kardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni2 +) / 10 mol% kardiolipin / 86,7 mol% DOPC), fleksible stillas liposomer med kardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% kardiolipin / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), og beriket stillas liposomer (10 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 15 mol% kardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC). - Legg Buffer A (25 mM HEPES (4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre), 150 mM KCI, pH justert til 7,5 med KOH) forvarmet til 37 ° C slik at den endelige lipidkonsentrasjon er 1 - 2 mm. Inkuber 30 minutter ved 37 ° C med leilighetsvis virvling til fullstendig resuspendere lipidblandingen (Figur 1a).
- Overføring til en plastisk prøverør, plassere røret i flytende nitrogen til det er helt frosset (RougHLY 30 s), og plasser i en 37 ° C vannbad til den er helt tint (ca 1-2 min). Gjenta til totalt 4 fryse-tine-sykluser (Figur 1b).
- Forbered en lipid ekstruder av soaking 4 filter støtter og en polykarbonat filter i buffer og montering av ekstruder i henhold til produsentens instruksjoner. Ekstrudere lipidoppløsningen gjennom filteret 21 ganger. Bruk milde, konstant press for å sikre en homogen størrelsesfordeling (Figur 1c).
MERK: For alle eksperimentene som er beskrevet i denne protokollen, ble en 1,0 mikrometer polykarbonatfilter brukes for ekstrudering. Drp1 vekselvirkning med anioniske lipider kan observeres med forskjellige liposom-diameter i området fra 50 nm til 400 nm 12 eller større 13. Derfor ble filterstørrelse på 1 um valgt til å være ideell for både GTPase aktivitet og for elektronmikroskopi. Hvis andre liposome diametre er ønsket, utarbeidelse av gigantiske unilamellære vesikler 14,15 (GUVs) eller liten unilamellar blemmer 16 (SUV) kan brukes. Dynamisk lysspredning kan brukes til å vurdere liposomstørrelse heterogenitet 13. - Oppbevar ekstruderte liposomer ved 4 ° C og kastes etter 3-5 d.
2. Bruk av Stillas liposomer for proteinbinding Analysis
- Prøvepreparering
- Inkuber Hans-merket MffΔTM (5 mM endelig) med stillas liposomer (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+), 50 mikrometer finalen) i minst 15 minutter ved RT i Buffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-merkaptoetanol (BME), pH justert til 7,5 med KOH). For en MFF-free kontroll, inkuber liposomer med hans-merket kontroll protein (for eksempel GFP) til å binde og skjold utsatt NTA (Ni 2+).
MERK: MffΔTM ble uttrykt og renset som beskrevet i en tidligere studie 2. GFP ble renset på en lignende måte, men den ionebytter-trinnet ble utelatt. BME var nødvendig for disse experiments fordi Drp1 er følsom for oksidering, noe som kan endre sin aktivitet og monteringsegenskaper. - Legg Drp1 (2 mM endelig) og inkuberes i 1 time ved RT.
MERK: Drp1 ble uttrykt og renset som beskrevet i en tidligere studie 2. Etter inkubasjon med Drp1, kan virkningen av nukleotid-bindende membranen deformasjon bli undersøkt ved å inkubere en ytterligere time med 2 mM MgCl2 og enten 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, eller Buffer A + BME.
- Inkuber Hans-merket MffΔTM (5 mM endelig) med stillas liposomer (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+), 50 mikrometer finalen) i minst 15 minutter ved RT i Buffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-merkaptoetanol (BME), pH justert til 7,5 med KOH). For en MFF-free kontroll, inkuber liposomer med hans-merket kontroll protein (for eksempel GFP) til å binde og skjold utsatt NTA (Ni 2+).
- Negative Stain transmisjonselektronmikroskopi (EM) Analyse
- Transfer 5 pl av prøve med et ark av laboratorie-film, og legge en karbon-belagte Cu / Rh gitter på prøven. Inkuber risten 1 min på prøven, blot bort overflødig væske på filterpapir, og overføre til en dråpe av 2% uranylacetat. Inkuber 1 min, blot overflødig flekken på filterpapir, og overføre til et rutenett boks. Oppbevares under vakuum O / N for å sikre full uttørking.
- Bilde prøver ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskopope på 18.500 - 30.000 forstørrelse å observere ultra endringer i protein og liposome morfologi 17.
Merk: ultrastructural endringer kan kvantifiseres ved hjelp av bildeanalyse programvare, for eksempel ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein dekorasjon kan måles sammenlignet med nakne lipid maler. I tillegg kan de diametrene av rørformede segmenter bli målt fra den ytterste del av sammenstillingene 13. En mer detaljert analyse kan utføres ved hjelp av kryo-elektronmikroskopi 17. Denne fremgangsmåten kan brukes til å avbilde nativt protein-lipid sammenstillinger i oppløsningsmiddel uten anvendelse av tungmetall flekker som belegge prøven. På denne måten detaljerte strukturelle trekk ikke åpen i negativ flekken, inklusive endringer i den underliggende lipid morfologi, kan undersøkes og kvantifiseres.
3. Bruk av Stillas liposomer for enzymatisk analyse
Merk: En colorimetrisk GTPase-analyse 18 ble anvendt for å måle fosfat frigjøring via GTP hydrolyse. Alternative GTPase-analyser er tilgjengelige 19 og kan gjennomføres etter behov.
- Inkuber His-tagget MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), eller GFP (5 uM endelig for alle) med stillas liposomer (150 uM slutt) i 15 min ved RT i Buffer A + BME (volum = 30 ul). Legg Drp1 (500 nM endelig) og inkuberes i ytterligere 15 minutter ved romtemperatur (volum = 80 ul).
MERK: Fis1 ble renset på en lignende måte som i MFF 2, men den ionebytterkromatografi trinnet ble utelatt. Hensikten med Hans-merket GFP er å skjerme NTA (Ni 2+) hodegrupper og hindre uspesifikke lade interaksjoner med andre proteiner. Hvis ingen virkning observeres i fravær av GFP, da denne kontroll kan ikke være nødvendig. Alternative blokkerende proteiner (av sammenlignbar størrelse for proteinet av interesse) kan benyttes i tillegg, men GFP gir mulighet for direkte visualisering av interaksjoner med SCAFfold liposomer. - Overføringsrørene til en thermocycler innstilt på 37 ° C, og innlede reaksjoner ved tilsetning av GTP og MgCl2 (1 mM og 2 mM slutt, henholdsvis volum = 120 ul).
- Ved ønskede tidspunkter (dvs. T = 5, 10, 20, 40, 60 min), overfør 20 pl reaksjon til brønner i en mikrotiterplate inneholdende 5 ul 0,5 M EDTA til å chelatere Mg2 + og stoppe reaksjonen.
- Forbered et sett av fosfat standarder ved å fortynne KH 2 PO 4 i Buffer A + BME å kalibrere resultatene. Et nyttig sett av standarder er 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 0 og uM. Tilsett 20 ul av hver til brønner inneholdende 5 ul 0,5 M EDTA.
- Tilsett 150 ul av malakittgrønt-reagens (1 mM malakittgrønt karbinol, 10 mM ammoniummolybdat-tetrahydrat, og 1 N HCl) til hver brønn, og lese OD 650 5 min etter tilsetningen.
MERK: GTP er syrelabile, og vil hydrolysere i nærvær av malakittgrønt-reagens. Sørg for at than tid mellom å legge malakitt reagens og lesing er konstant for å sikre reproduserbare resultater. - Generere en standardkurve ved å avsette OD 650 av standardene som en funksjon av fosfatkonsentrasjon. Bruke lineær regresjon for å bestemme forholdet mellom OD 650 og fosfatkonsentrasjonen i en prøve.
- Ved hjelp av lineær regresjon, konvertere OD 650 av protein reaksjons prøver å mikrometer fosfat. Bestemme frekvensen av fosfatgenerering for hver reaksjonsblanding ved plotting av fosfatkonsentrasjonen som en funksjon av tid, og konvertere til k katt ved å dividere hastigheten med Drp1 konsentrasjon (0,5 uM).
MERK: Bare den innledende lineære hastighet bør benyttes for å bestemme frekvensen av fosfat generasjon, og minst 3 datapunkter må brukes. Dersom reaksjonshastigheten er tilstrekkelig hurtig til at de tre første datapunktene ikke er lineære (dvs. r 2 av lineær tilpasning er mindre enn 0,9) et tegnificantly kortere tid selvfølgelig med minst 3 tidspunkter skal utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens interaksjonen mellom Drp1 og MFF har vist seg å være viktig for mitokondriell spalting, har denne interaksjonen vært vanskelig å rekapitulere in vitro. Vårt mål var å bedre etterligne den cellulære miljø der Drp1 og MFF samhandle. For dette formål, liposomer inneholdende begrensende konsentrasjoner av NTA (Ni2 +) hodegrupper ble fremstilt ved å rehydrere et lipid film som beskrevet ovenfor. Den lipid Løsningen består i utgangspunktet av unilamellære og multilamellære vesikler av heterogene diametre som gjenspeiles av tettheten av løsningen (Figur 1a). Denne opasitet blir redusert ved fryse-tining (figur 1b), som reduserer forekomsten av multilamellære vesikler. Diameterne liposom blir ytterligere homogenisert ved ekstrudering gjennom et polykarbonatfilter, noe som resulterer i en klar oppløsning (figur 1c).
to. Bygge på disse funnene, benyttet vi en ny mal sammensatt av PC, PE, Ni, og CL (kalt Beriket Stillas liposomer eller ESL) for å fremme bestilte montering av en polymer Drp1-MFF kompleks stand til å indusere membran deformasjon. Nærmere bestemt økte NTA (Ni2 +) og kardiolipin lipider ble anvendt (10 mol% og 15 mol% henholdsvis) for denne anvendelsen. Deretter GFP eller MFF ble bundet til ESL maler i nærvær og fravær av Drp1 (figur 2), og evnen til Drp1 til oppussing membraner ble kvalitativt vurdert. I fravær av Drp1, hverken MFF eller GFP resulterte i membranen deformert (figur 3a, b), og likeledes i tilfelle av GFP-dekorerte ESL, ble bare særpreg liposomer observert (figur 3c). Imidlertid, når DRP1 ble lagt inn i MFF-dekorerte ESL maler, ombygging av liposomer var tydelig (figur 3d).
Mens macromolecular kompleks formasjon tydelig demonstrerer et samspill mellom Drp1 og MFF, alene er dette kvalitativ analyse ute av stand til å bestemme de funksjonelle virkningene av en slik interaksjon. Derfor, benyttet vi en malakittgrønt fosfat-generasjon-analyse 18 for å vurdere endringer i den katalytiske aktiviteten til Drp1 som reaksjon på vekselvirkning med MFF. Som tidligere beskrevet 2, vi først brukt en enkel liposom stillas (SL; 3,3 mol% DGS-NTA (Ni2 +), 96.7 mol% DOPC) for å undersøke effekten av MFF alene på Drp1 struktur og funksjon. Ikke-spesifikk interaksjon mellom Drp1 med NTA (Ni2 +) er tidligere blitt beskrevet 20, så SL ble opprinnelig konstruert for å inneholde lave konsentrasjoner av NTA (Ni2 +) for å unngå ikke-spesifikk aktivitet stimulering av Drp1. Med større mengder av NTA (Ni2 +) i ESL, ble bruken av His-merket GFP som en kontroll viser seg å være kritisk for å skjerme Ni 2+ og forebygge ikke-spesifikke interaksjoner Drp1. Etter dekorasjon av SL liposomer ved MFF eller GFP (som illustrert i figur 2), kan graden av selv-sammenstillingen bli vurdert ved å måle GTPase aktivitet av Drp1. I fravær av liposomer, har Drp1 en forholdsvis lav basal GTPase-aktivitet, som er litt forbedret ved tilsetning av SL. Dekorasjon av disse stillas liposomer med MFF forbedret GTPase aktivitet (figur 4a, 1,8 ganger). Omvendt, når de utsettes NTA (Ni2 +) hodegrupper ble blokkert med His-merket GFP, ble denne augmented GTPase aktivitet ablateres. Vi testet også rollen Fis1, en OMM protein som har blitt foreslått å ha en rolle i mitokondrie fisjon 21,22, men dette har blitt utfordret i nyere studier 7,23. Tilknytning av Fis1 mangler sitt transmembrane domeneSL også klarte å lokke fram en stimulering av Drp1 sin GTPase aktivitet (figur 4a).
Vi deretter benyttet en litt mer komplisert lipid stillas som inneholder en liten mengde av kardiolipin (SL / CL: SL med 10 mol% kardiolipin erstatte DOPC) for å bestemme hvilken rolle denne mitokondriell lipid i interaksjonen av Drp1 og MFF. Denne moderat konsentrasjon av kardiolipin er spesielt valgt for å begrense stimulering av Drp1 ved kardiolipin, som beskrevet tidligere 10. I likhet med SL, tillegg av SL / CL å Drp1 resulterte i en liten stimulering av GTPase aktivitet som ble reversert av tethering Hans-merket Fis1 eller GFP til liposomer. En synergi mellom MFF og kardiolipin ble observert som GTPase aktivitet Drp1 ble stimulert 2,6 ganger da det ble inkubert med MFF-dekorerte SL / CL (figur 4b).
Membranfluiditet og evnen of Drp1 å fornye lipidbilagene har blitt foreslått for å forbedre sin GTPase aktivitet. Derfor, søkte vi å undersøke effekten av membranfluiditet / fleksibilitet ved hjelp av en fleksibel stillas liposom. Dette ble oppnådd ved å erstatte 35 mol% DOPC i SL / CL med DOPE (SL / PE / CL), som tidligere har vist seg å gi rom for Drp1-mediert membran remodeling 10. Tilsetting av undecorated SL / PE / CL stillas liposomer til Drp1 forbedrer litt Drp1 GTPase aktivitet, og dekorasjon av disse liposomer med GFP eliminerer denne effekten. Når SL / PE / CL maler ble dekorert med MFF ble Drp1 aktivitet forbedret (Figur 4c, 2,4 ganger). Som vi tidligere har vist, ble evnen til å fornye Drp1 liposomer inn i lipid-tubuli forbedret ved tilsetning av PE til stillas liposomer. Interessant nok har denne forbedrede tubulation som fører til dannelsen av en skruelinjeformet Drp1 polymer resulterte ikke i noen større stimulering sammenlignet med liposomer som Drp1 var ute av stand til å fornye Ved hjelp av disse tilpasningsdyktige lipid maler, ble MFF og Drp1 funnet å samhandle på en mer naturlig miljø in vitro. Denne teknikken har gjort oss i stand til å kontrollere den relative overflod av Drp1, MFF (gjennom NTA (Ni 2+) konsentrasjon), og bestemte lipider (kardiolipin og PE spesielt) som syntes å regulere montering av denne macromolecular kompleks. Som vi har vist, kan denne metoden bli anvendt for å visualisere membranen ombygging av MFF-rekruttert Drp1 ved elektronmikroskopi, og for å bestemme effektene av Drp1 montering på sin katalytiske aktivitet ved anvendelse GTPase aktivitetsanalyse. 71fig4.jpg "/> 
Figur 1: Lipid Forberedelse Skjematisk. (A) Etter resuspensjon, liposomer med forskjellige størrelser form og består av unilamellære og multilamelLar vesikler, noe som resulterer i en ugjennomsiktig løsning (innfelt). (B) fryse-tine løsnings resulterer i en mer unilamellær populasjon av liposomer, som fortsatt er heterogene i diameter. Freeze-tining klargjør løsning (innfelt). (C) ekstrudering av lipidoppløsningen homogeniserer den liposomdiameter (1,0 mikrometer i dette eksempel), og resulterer i en klar oppløsning (innfelt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2: Metoder for å vurdere Protein montering. En skjematisk skildrer partner protein montering på stillas liposomer er presentert. Hans-merket partner proteiner eller GFP inkuberes med stillas liposomer, og deretter Drp1 inkuberes med dekorert eller undecorated lipo somes. Disse Drp1-formontert liposomer kan deretter bli analysert ved strukturelle metoder (elektronmikroskopi) og funksjonelle analyser (GTPase assay). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3: Strukturelle Vurdering av Drp1 rekruttering. Negative flekk transmisjonsmikrografer av GFP eller MFF dekorert liposomer alene (A, B, henholdsvis) eller inkubert med Drp1 (C, D, henholdsvis). Scale bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Stillas Liposome Enzymatisk analysen. (A - C) for generering av fosfat over tid ble målt (innfelt), og k katt ble bestemt. Denne metoden ble anvendt for å SL-bundet protein (A), SL / CL-forankrede proteiner (B), eller SL / PE / CL-forankrede proteiner (C). #: P <0,05, *: p <0,0001, **: p <0,000001, som bestemt ved uparet t-test. Alle Feilstolpene representerer standardavviket av 3 uavhengige prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en metode for å undersøke protein-protein interaksjoner som involverer integrerte membranproteiner. Ved å benytte en modulær liposom stillas, søkere er i stand til å vurdere aktiviteten av ett eller flere proteiner i en lipid-proksimal miljø. Tidligere studier har vist en lignende metode for reseptor-enzymer i plasmamembranen 24 - 26. Vi har ekspandert denne metoden for å innlemme lipider kofaktorer og utforske interaksjonene mellom proteiner som utgjør mechanoenzymatic kjernen av mitokondriell fisjons maskineri.
For modellsystemet er presentert ovenfor, fant vi at MFF-dekorert SL forbedret Drp1 selvbygging. Videre viser vi nå at MFF-dekorerte ESL maler effektivt ble ombygd av villtype Drp1 å danne utvidet rørformede strukturer. Vi vurderte også rollene til forskjellige mitokondrielle lipider, inkludert den negativt ladede kardiolipin og den koniske lipid PE.Cardiolipin synergizes med MFF til å ytterligere styrke Drp1 selvbygging, mens membranen fleksibilitet og flyt formidles av PE forbedrer membran tubulation men har ikke ytterligere forsterke MFF-indusert stimulering.
For å vurdere ultra endringer i membran morfologi, analyser EM var nødvendig. Drp1 GTPase aktivitet ble forhøyet gjennom clustering og montering av trådformede polymerer som ikke omskape liposomene i særlig grad to. Imidlertid ble det observert membran deformering når mer mitokondriene-lignende SL / PE / CL templat ble anvendt. Interessant, enzymaktiviteten ble ikke forbedret. Derfor EM-studiene var avgjørende for å identifisere viktige forskjeller som ellers ville bli savnet ved hjelp av den funksjonelle analyse.
Selv om denne teknikken er kraftig for å utforske funksjon og samspill av løselige proteiner og løselige proteindomener, kan disse lipid stillaser ikke gjøre rede for rollen som transdomenes. Dette er en viktig faktor fordi det transmembrane domenet kan bevirke dynamiske protein prosesser slik som selv-sammenstillingen 27 og lateral diffusjon 28. - 30. i lipidbilag. Hvis disse faktorene er avgjørende for å vurdere protein interaksjoner på membranoverflaten, da ville tradisjonelle lipid rekonstituering eksperimenter med vaskemiddel bli begunstiget. Alternative tjoringene kan også bli undersøkt for å kontrollere rekruttering og mobiliteten av membran forankret proteiner.
I tillegg til å bruke Hans-merket proteiner med NTA (Ni 2+) lipid ankere, andre stagene som biotin-konjugert 31 eller reaktive gruppe konjugert lipider kan utnyttes. Disse kovalente modifikasjoner ville mer stabilt felle proteiner på lipid overflaten, men mobilitet og utveksling av disse faktorene vil trolig bli redusert. Som sådan bør tjore vurderes nøye i sammenheng med proteinkomplekser som studeres. når considering bruken av denne fremgangsmåten, fremgangsmåten for-tilknytning proteiner til lipid-malene har potensialet til å påvirke visse analyser. For eksempel kan His-tag-tilknytning til NTA (Ni2 +) Fremgangsmåte være mer passende for in situ analyser heller enn separasjons eksperimenter, spesielt i tilfelle av transiente protein-protein-interaksjoner. Dette er klart vist i figur 3 av avviket mellom den in situ negativ flekkelektronmikroskopi og sedimente analysen.
I fremtiden, kan en kombinasjon av to eller flere av disse anker lipider med forskjellige pulshodegrupper bli implementert for å tillate rekruttering av flere proteiner til et stillas mal uten konkurranse om et enkelt lipid tjore. Dessuten kan den relative mengde av hver komponent bli styrt ved å endre lipidsammensetning. Ytterligere lipid kofaktorer, slik som phosphoinositides, kardiolipin, og fosfatidylserin, kan lett innføresi disse malene for å vurdere den isolerte virkning av en rekke faktorer.
Samlet er disse lipid stillasene representerer en ny plattform for å undersøke komplekse protein interaksjoner i nærheten lipid membraner. Disse malene er lett generert og er enkle å tilpasse til en rekke ulike programmer, inkludert enzymatiske analyser, elektronmikroskopi, eller fluorescens bildebehandling. I tillegg kan lipid preparat formuleres for å ligne en organelle eller membran microdomain av interesse for bedre å rekapitulere proteinfunksjon på følgende spesifikke regioner. Ved hjelp av disse teknikkene, kan biokjemikere undersøke det komplekse samspillet av membranbundne og membran knyttet proteiner med sine partnere og deres miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
