Abstract
Изучение интегральных мембранных белков в пробирке часто осложняется наличием гидрофобного трансмембранного домена. Еще более усложняют эти исследования, реинкорпорация моющих-солюбилизированного мембранных белков в липосомы является случайным процессом, где топология белка невозможно провести в жизнь. Эта статья предлагает альтернативный метод для этих сложных методов, которые использует липосом на основе строительных лесов. растворимость белков усиливается за счет делеции трансмембранного домена, и эти аминокислоты заменяются привязывать остатком, такие как His-меткой. Этот фал взаимодействует с анкерной группой (Ni 2+ координируется нитрилтриуксусная кислоты (NTA (Ni 2+)) для His-меченных белков), который вводит единую топологию белка на поверхности липосом. Приведен пример, в котором взаимодействие между динамина связанных с белком 1 (drp1) с интегральным мембранным белком, митохондриальной осколочного Factor (ММФ), был Investigated с помощью этого метода эшафот липосом. В этой работе мы продемонстрировали способность ММФ эффективно вербовать растворимого drp1 к поверхности липосом, что стимулировало его активность ГТФ. Кроме того, drp1 смог придавать трубчатую форму ММФ-украшенный шаблон липидов в присутствии специфических липидов. Этот пример демонстрирует эффективность каркасных липосом с использованием структурных и функциональных анализов и выдвигает на первый план роль ММФ в регуляции активности drp1.
Introduction
Изучение мембранных проксимальных белок-белковых взаимодействий является сложной задачи из - за трудностей в обобщал родную среду интегральных мембранных белков , участвующих 1. Это связано с необходимостью моющего средства солюбилизации и непоследовательное ориентации белков в протеолипосомах. Для того , чтобы избежать этих проблем, мы использовали стратегию , в котором растворимые домены интегральных мембранных белков выражают в виде His-Tag слитых белков, и эти растворимые фрагменты прикреплены к каркасных липосом с помощью взаимодействий с NTA (Ni 2+) в полярных головных групп липидов поверхность. С помощью этих каркасах, липидные-проксимальный белковых взаимодействий могут быть исследованы в диапазоне липидного и белкового состава.
Мы эффективно применять этот метод для исследования критических белок-белковых взаимодействий, которые регулируют сборку митохондриального комплекса деления и изучения липидных взаимодействий, которые модулируют этот прocess 2. Во время митохондриального деления, законсервированный мембраны ремоделирования белок, называемый динамина-белок , связанный с 1 (drp1) 3, рекрутируется на поверхности наружной мембраны митохондрии (ОММ) в ответ на клеточные сигналы , которые регулируют энергетический гомеостаз, апоптический сигнализации, а также ряд других интегральные митохондриальные процессы. Этот большой, цитозольная GTPase рекрутируется на поверхности митохондрий через взаимодействие с интегральными белками OMM 4 - 8. Роль одного из таких белков, митохондриальная Деление фактор (ММФ), было трудно выяснить , из - за очевидного слабого взаимодействия с drp1 в пробирке. Тем не менее, генетические исследования ясно показали , что ММФ имеет важное значение для успешного митохондриальной 7,8 деления. Описанный в этой рукописи метод был в состоянии преодолеть прежние недостатки путем введения одновременных липидных взаимодействий, которые способствуют drp1-MFF взаимодействий. В целом, этот новый анализ reveaвел фундаментальные взаимодействия руководящих сборку митохондриального комплекса деления и обеспечило новый этап для текущих структурных и функциональных исследований этой важной молекулярной машины.
На сегодняшний день изучение взаимодействий между drp1 и MFF были осложнены гибкость , присущую MFF 9, разнородность drp1 полимеры 2,10, и трудность очистки и воссоздании полной длины MFF с интактным трансмембранный домен 11. Мы рассмотрели эти проблемы с помощью NTA (Ni 2+) эшафот липосом для воссоздания Его-меченый MFF не хватает его трансмембранный домен (MffΔTM-His 6). Эта стратегия была выгодна , поскольку MffΔTM был чрезвычайно растворим , когда чрезмерно выраженная в Е. палочка, и этот изолированный белок легко восстанавливали на эшафот липосом. Когда привязанными к этим шаблонам липида, МФФ предполагается идентичную, обращенной наружу ориентацию на поверхности мембраны.В дополнение к этим преимуществам, митохондриальные липиды, такие как кардиолипину, были добавлены к стабилизации МФФ складывание и ассоциации с мембраной 11. Кардиолипин также взаимодействует с вариабельным доменом drp1 2,12 , который может стабилизировать неупорядоченную область и облегчить сборку машин деления.
Этот надежный метод широко применим для будущих исследований, направленных на оценку мембранных проксимальных белковых взаимодействий. За счет использования дополнительных прикрепление / аффинных взаимодействий, изощренность этих Мембрана восстанавливающих исследований могут быть улучшены, чтобы имитировать дополнительные сложности, обнаруженные на поверхности мембран в клетках. В то же время, липидные композиции могут быть модифицированы, чтобы более точно имитировать родной среды этих макромолекулярных комплексов. Таким образом, этот метод обеспечивает средство для изучения относительного вклада белков и липидов в формировании мембранных морфологию к во время критических клеточного ргосцессы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Эшафот липосом Подготовка
Примечание: В идеале, первоначальные эксперименты должны использовать сравнительно простой и невыразительную эшафот (состоящий из DOPC (1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин или ПК) и DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-диолеоил - зп глицеро-3 - [(N - (5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусной кислоты) сукцинил]. (никелевую соль)) Строительство от этих экспериментов, липидный заряд, гибкость, и кривизна может быть введен в качестве индивидуальных факторов с потенциалом для изменения мембранами проксимальный взаимодействий. Эти изменения могут быть достигнуты путем добавления определенных количеств специфических липидных компонентов, в том числе и фосфатидилсерина или кардиолипину (CL), фосфатидилэтаноламин (DOPE или РЕ) или галактозил (& beta;) церамидов.
- Объединить липиды растворенные в хлороформе в чистом стеклянную пробирку. Выпаривать раствор сухим газообразным азотом при вращении трубки с образованием тонкой липидной пленки. Удалите остатки растворителя с centrifugaл испаритель в течение 1 ч при 37 ° С.
Примечание: Различные липосомные составы используются в протоколах описаны ниже: матриксные липосом (3,3 моль% АРД-NTA (Ni2 +) / 96,7 моль% ДОФХ), подмости Липосомы с кардиолипину (3,3 моль% АРД-NTA (Ni 2+) / 10% мол кардиолипином / 86,7 моль% DOPC), гибкие эшафот липосом с кардиолипину (3,3 моль% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% мол кардиолипином / 35% мол DOPE / 51,7 моль% DOPC), и обогащенные подмости липосом (10 моль% АРД-NTA (Ni2 +) / 15 мольных% кардиолипина / 35% мол ДОФЭ / 40% мол ДОФХ). - Добавить буфера А (25 мМ HEPES (4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота), 150 мМ KCl, рН доводили до 7,5 с помощью KOH), предварительно нагретую до 37 ° С, так что конечная концентрация липидов 1 - 2 мм. Инкубировать 30 мин при 37 ° С с периодическим встряхиванием до полного ресуспендирования липидной смеси (рисунок 1а).
- Перенесите в пластиковую пробирку, поместите трубку в жидком азоте до полного замороженного (RougHLY 30 лет), а также место в C водяной бане при 37 ° до полностью оттаявшей (примерно 1 - 2 мин). Повторить в общей сложности 4 циклов замораживания-оттаивания (рис 1b).
- Подготовить липидный экструдер путем замачивания 4 фильтра опоры и поликарбонатный фильтр в буфере и сборке экструдера в соответствии с инструкциями производителя. Выдавливание раствор липидов через фильтр 21 раз. Используйте нежный, постоянное давление , чтобы обеспечить равномерное распределение по размерам (рис 1в).
Примечание: Для всех экспериментов, описанных в данном протоколе, 1,0 мкм поликарбонатный фильтр был использован для экструзии. Drp1 взаимодействие с анионными липидами можно наблюдать с различными диаметрами липосом в пределах от 50 нм до 400 нм , 12 или больше 13. Таким образом, был выбран размер фильтра 1 мкм, чтобы быть идеально подходит для ГТФ активности и для электронной микроскопии. Если другие диаметры липосомные желательны, подготовка гигантских однослойных везикул 14,15 (GUVs) или небольшой unilamellар везикулы 16 (SUV) могут быть использованы. Динамическое рассеяние света может быть использован для оценки липосомальной размер гетерогенности 13. - Хранить экструдированных липосом при 4 ° С и отбросить после 3 - 5 дней.
2. Использование Scaffold липосом для анализа связывания белка
- Базовые приготовления
- Инкубировать His-меченый MffΔTM (5 мкМ окончательный) с подмостей липосом (40% мол PC / 35% мол PE / 15% мол CL / 10% мол DGS-NTA (Ni 2+), 50 мкМ конечная) в течение не менее 15 мин при комнатной температуре в буфере А + BME (25 мМ HEPES, 150 мМ KCl, 10 мМ β-меркаптоэтанола (BME), рН доводили до 7,5 с помощью КОН). Для MFF-свободного контроля, инкубировать липосом с его-меченого контрольного белка (например, GFP) , чтобы связать и щит подвергаются NTA (Ni 2+).
Была выражена MffΔTM и очищали , как описано в предыдущем исследовании 2: Примечание. GFP, был очищен таким же образом, но шаг ионного обмена была опущена. BME требовалось для этих экспериментальTS, потому что drp1 чувствителен к окислению, что может изменить свою деятельность и монтажные свойства. - Добавить drp1 (2 мкМ конечная) и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
Была выражена drp1 и очищали , как описано в предыдущем исследовании 2: Примечание. После инкубации с drp1, эффект нуклеотида связывания на деформации мембраны могут быть исследованы путем инкубирования один дополнительный час с 2 мМ MgCl 2 и либо 1 мМ ГТФ, 1 мМ GMP-PCP или буфер A + BME.
- Инкубировать His-меченый MffΔTM (5 мкМ окончательный) с подмостей липосом (40% мол PC / 35% мол PE / 15% мол CL / 10% мол DGS-NTA (Ni 2+), 50 мкМ конечная) в течение не менее 15 мин при комнатной температуре в буфере А + BME (25 мМ HEPES, 150 мМ KCl, 10 мМ β-меркаптоэтанола (BME), рН доводили до 7,5 с помощью КОН). Для MFF-свободного контроля, инкубировать липосом с его-меченого контрольного белка (например, GFP) , чтобы связать и щит подвергаются NTA (Ni 2+).
- Отрицательный Stain просвечивающей электронной микроскопии (ЭМ) анализ
- Передача 5 мкл образца к листу лабораторной пленкой, и возложит покрытую углеродом Cu / Rh сетки на образце. Выдержите сетки 1 мин на образце, промокните излишки жидкости на фильтровальную бумагу и переносят в каплю 2% ацетата уранила. Инкубируют 1 мин, промокните избыток пятно на фильтровальной бумаге, и передавать в коробку сетки. Хранить под вакуумом O / N, чтобы обеспечить полное высыхание.
- Образцы изображений с помощью просвечивающего электронного microscОПЕ на 18500 - 30,000X увеличения для наблюдения ультраструктурных изменений в белковых и липосом морфологией 17.
Примечание: изменения Ультраструктурные может быть определена количественно с помощью программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). украшение белка может быть измерена по сравнению с голыми шаблонами липидных. Кроме того, диаметры трубчатых сегментов могут быть измерены от наружной части сборок 13. Более детальный анализ может быть проведен с использованием крио-электронной микроскопии 17. Этот метод может быть использован для получения изображений нативный белок-липидных агрегатов в растворителе без использования металлических пятен тяжелым, что пальто образца. Таким образом, подробные структурные особенности не видны на отрицательной окраски, в том числе изменений в подлежащем липидов морфологии, могут быть исследованы и определены количественно.
3. Использование липосом для Scaffold ферментативной Пробирной
Примечание: Coloriметрический анализ GTPase 18 использовали для измерения фосфата освобождения с помощью гидролиза GTP. Альтернативные анализы ГТФазная доступны 19 и может быть реализован в случае необходимости.
- Выдержите His-меченый MffΔTM (МФФ), Fis1ΔTM (Fis1), или GFP (5 мкМ конечная для всех) с подмостей липосом (150 мкМ конечных) в течение 15 мин при комнатной температуре в буфере А + BME (объем = 30 мкл). Добавить drp1 (500 нмоль окончательный) и инкубировать еще 15 мин при комнатной температуре (объем = 80 мкл).
Примечание: Fis1 очищали аналогично ММФ 2, но стадия ионообменной хроматографии была опущена. Цель Его-меченых GFP должен оградить NTA (Ni 2+) и предотвращения полярных головных групп неспецифических взаимодействий зарядов с другими белками. Если никакого эффекта не наблюдается при отсутствии GFP, то этот контроль может не потребоваться. Альтернативные блокирующие белки (сравнимые по размеру с интересующего белка) могут быть также использованы, но GFP позволяет прямой визуализации взаимодействий с СКАФараза липосом. - Передача трубки , до амплификатора установить до 37 ° С, и инициировать реакцию добавлением ГТФ и MgCl 2 (1 мМ и 2 мМ окончательными, соответственно; объем = 120 мкл).
- В желательных точках времени (т.е. Т = 5, 10, 20, 40, 60 мин), передача 20 мкл реакции в лунки планшета для микротитрования , содержащей 5 мкл 0,5 М ЭДТА до хелат Mg 2+ и остановить реакцию.
- Подготовить набор стандартов фосфата путем разбавления KH 2 PO 4 в буфере А + BME для калибровки результатов. Полезный набор стандартов 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 и 0 мкМ. Добавьте 20 мкл каждого в лунки, содержащие 5 мкл 0,5 М ЭДТА.
- Добавьте 150 мкл реагента малахитового зеленого (1 мМ малахитовый зеленый карбинола, 10 мМ молибдата аммония тетрагидрат и 1 н HCl) в каждую лунку, и читать OD 650 через 5 мин после добавления.
Примечание: ГТФ кислотолабильным, и гидролизуется в присутствии реагента малахитового зеленого. Убедитесь в том, что тон время между добавлением малахитовый реагента и чтения является постоянным для обеспечения воспроизводимых результатов. - Создайте стандартную кривую OD 650 стандартов в зависимости от концентрации фосфата. С помощью линейной регрессии для определения взаимосвязи между OD 650 и концентрации фосфата в образце.
- Использование линейной регрессии, преобразовать OD 650 образцов реакции белка мкМ фосфата. Определить скорость фосфата генерации для каждой реакционной смеси путем построения графика концентрации фосфата в зависимости от времени, и преобразуют в K кошку делением скорости на концентрацию drp1 (0,5 мкМ).
Примечание: Только начальная линейная скорость должна быть использована для определения скорости фосфата поколения, и не менее 3 точек данных должны быть использованы. Если скорость реакции является достаточно быстрым , что первые три точки данных не являются линейными (т.е. R 2 линейной подгонки меньше 0,9) знакificantly более короткое время, конечно, по крайней мере, 3-х временных точках должны быть выполнены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В то время как взаимодействие между drp1 и MFF было продемонстрировано, что важно для митохондриального деления, это взаимодействие было трудно резюмировать в пробирке. Наша цель состояла в том, чтобы лучше подражать клеточной среды, в которой drp1 и MFF взаимодействовать. С этой целью, липосомы , содержащие предельные концентрации NTA (Ni2 +) полярных головных групп получали путем регидратации липидной пленки , как описано выше. Раствор липида первоначально состоит из однослойных и многослойных везикул гетерогенных диаметров, о чем свидетельствует помутнение раствора (рис 1а). Это непрозрачности уменьшается замораживания-оттаивания (рис 1b), что снижает распространенность многослойных везикул. Диаметры липосомные дополнительно гомогенизируют путем экструзии через поликарбонатный фильтр, который приводит к получению прозрачного раствора (рис 1в).
2. Основываясь на этих выводах, мы использовали новый шаблон, состоящий из PC, PE, Ni и CL (называется Enriched Scaffold липосом или ESL) в целях содействия упорядоченной сборки полимерной drp1-MFF комплекс, способный индуцировать деформации мембраны. В частности, увеличение NTA (Ni 2+) и использовались кардиолипину липиды (10 мольных% и 15 мол% соответственно) для этого приложения. Затем, GFP или MFF был привязан к шаблонам ESL в присутствии и отсутствии drp1 (рисунок 2), а также способность drp1 реконструировать мембраны была качественно оценена. При отсутствии drp1, ни МФФ , ни GFP , приводит к деформации мембраны (рис 3а, б), а так же в случае GFP декорированной ЭСЛ, наблюдались только безликие липосом (3в). Тем не менее, когда Drp1 был добавлен в MFF оформленных шаблонов ESL, ремоделирования липосом была очевидна (Рис 3).
В то время как макромолекулярная комплексообразование четко демонстрирует взаимодействие между drp1 и ММФ, этот качественный анализ сами по себе не способен определить функциональные эффекты такого взаимодействия. Таким образом, мы использовали малахитовый зеленый фосфатного анализа образования 18 для оценки изменений в каталитической активности drp1 в ответ на взаимодействие с МФФ. Как было описано выше 2, мы первоначально использовали простой помост липосом (SL; 3,3% мол DGS-NTA (Ni 2+), 96,7% мол DOPC) , чтобы исследовать влияние MFF только на структуре и функции drp1. Неспецифический взаимодействие drp1 с NTA (Ni2 +) , была описана ранее 20, так что SL был первоначально разработан , чтобы содержать низкие концентрации NTA (Ni 2+) , чтобы избежать неспецифического стимуляции активности Drp1. При больших количеств NTA (Ni 2+) в ESL, было обнаружено , что использование His-меченых GFP в качестве контроля , чтобы иметь решающее значение , чтобы оградить Ni 2+ и предотвратить неспецифические drp1 взаимодействий. После оформления SL липосом MFF или GFP (как показано на рисунке 2), степень самосборки может быть оценена путем измерения GTPase активности drp1. При отсутствии липосом, drp1 имеет относительно низкую базальную активность ГТФ, что немного усиливается добавлением SL. Оформление этих каркасных липосом с MFF усиливается активность ГТФ (рис 4а, в 1,8 раза). И наоборот, когда подвергается NTA (Ni 2+) были блокированы полярных головных групп с His-меченых GFP, эта дополненная GTPase активность абляции. Мы также проверили роль Fis1, белка ОММ , что было предложено , чтобы играть роль в митохондриальной делении 21,22, хотя это была поставлена под сомнение в недавних исследованиях 7,23. Прикрепление Fis1 отсутствует его трансмембранный домендля SL также не вызывают стимуляцию активности ГТФ drp1 (рисунок 4а).
Затем мы использовали несколько более сложный липидный леску, содержащий небольшое количество кардиолипину (SL / CL: SL с 10% мол кардиолипину заменой DOPC), чтобы определить роль этого митохондриального окисления липидов в результате взаимодействия drp1 и МФФ. Эта умеренная концентрация кардиолипину был специально выбран , чтобы ограничить стимуляцию drp1 путем кардиолипину , как описано выше 10. Подобно SL, добавление SL / CL к drp1 привело к незначительному стимуляции активности ГТФ, что было пересмотрено привязывать His-меченый Fis1 или GFP с липосомами. Наблюдается синергизм между ММФ и кардиолипину как GTPase активность drp1 стимулировалась в 2,6 раза , когда она инкубировали с MFF-украшенной SL / CL (Рисунок 4b).
Мембранная текучесть и способность Oе drp1 реконструировать липидные двухслойные были предложены для повышения ее активность ГТФ. Поэтому мы стремились изучить влияние текучести мембран / гибкости с помощью гибкого эшафот липосом. Это было достигнуто за счет замены 35% мол DOPC в SL / CL с DOPE (SL / ПЭ / CL), который ранее было показано , чтобы обеспечить drp1-опосредованной мембрана ремоделирования 10. Добавление недекорированного SL / PE / CL каркасных липосом drp1 слегка повышает активность ГТФ drp1, и оформление этих липосом с GFP устраняет этот эффект. Когда шаблоны / PE / CL SL были украшены MFF, активность drp1 была увеличена (рис 4в, в 2,4 раза). Как мы уже показали, способность drp1 реконструировать липосом в липидные канальцев были расширены за счет добавления ПЭ на эшафот липосом. Интересно отметить, что это улучшенный tubulation что приводит к образованию спиральной drp1 полимера не приводит к какой-либо большей стимуляции по сравнению с липосомами, что drp1 не смогла реконструируют Используя эти шаблоны адаптируемые липидов, ММФ и drp1 были найдены , чтобы взаимодействовать в более родной среде в пробирке. Этот метод позволил нам контролировать относительное обилие drp1, ММФ (через NTA (Ni 2+) концентрации), а также специфических липидов (кардиолипину и ПЭ в частности) , которые появились регулировать сборку этого макромолекулярного комплекса. Как мы показали, этот метод может быть использован для визуализации мембраны ремоделирования MFF-набираемых drp1 с помощью электронной микроскопии, а также для определения влияния сборки drp1 на его каталитической активности с использованием анализа ГТФ активности. 71fig4.jpg "/> 
Рисунок 1: Схема окисления липидов Подготовка. (А) После ресуспендирования, липосомы различных размеров формы и состоят из однослойной и multilamelLAR везикулы, что приводит к непрозрачным раствором (вставка). (Б) замораживания-оттаивания результаты решения в более однослойной популяции липосом, которые до сих пор неоднородны по диаметру. Замораживание-оттаивание уточняет решение (вставка). (С) экструдирование раствора липидной гомогенизация диаметр липосом (1,0 мкм в данном примере), и приводит к получению прозрачного раствора (вставка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 2: методы оценки сборки белка. Схематическое изображение партнер белка в сборе на эшафот липосом представлена. His-меченных белков-партнеров или GFP инкубируют с подмостей липосом, а затем drp1 инкубируют с украшенной или недекорированного липо Сомс. Эти drp1-собранном Липосомы могут быть проанализированы с помощью структурных методов (электронная микроскопия) и функциональных анализов (ГТФ-анализ). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 3: Структурная оценка drp1 вербовкой. Отрицательные микрофотографии передачи пятна или GFP MFF украшены липосом в одиночку (A, B, соответственно) или инкубировали с drp1 (C, D, соответственно). Шкала бар = 100 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Эшафот липосом Ферментативный Анализ. (А - С) измерялось Генерирование фосфата с течением времени (вставка), а K кошка была определена. Этот метод был применен к SL-привязных белки (А), SL / CL-привязных белки (В), или SL / PE / CL-привязных белки (С). #: Р <0,05, *: р <0,0001, **: р <0,000001, как определено Т-тест непарный студента. Все Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от 3-х независимых выборок. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предлагает метод исследования белок-белковых взаимодействий, связанных с интегральными мембранными белками. Используя модульную липосомальной леску, исследователи способны оценить активность одного или нескольких белков в липидном проксимальных среде. Предыдущие исследования показали аналогичный метод рецепторных ферментов плазматической мембраны 24 - 26. Мы расширили этот метод для включения липидов кофакторов и исследовать взаимодействия между белками, которые составляют mechanoenzymatic ядро митохондриального механизма деления.
Для модельной системы, представленной выше, мы обнаружили, что ММФ декорированной SL усиливается drp1 самосборки. Кроме того, мы сейчас покажем, что, ММФ оформленные шаблоны ESL были эффективно перестроен дикого типа drp1 для формирования расширенных структур трубчатые. Мы также провели оценку роли различных митохондриальных липидов, в том числе отрицательно заряженного кардиолипина и конической липидного PE.Кардиолипин синергично с MFF для дальнейшего повышения drp1 самосборки, в то время как гибкость мембраны и текучесть сообщаемая ПЭ усиливает мембраны tubulation, но не далее увеличивать MFF-индуцированной стимуляции.
Для оценки ультраструктурных изменений в мембранных морфологией, EM анализы необходимы. Drp1 GTPase активность была повышена за счет кластеризации и сборки нитевидных полимеров , которые не перекроить липосом в любой значительной степени 2. Тем не менее, наблюдалось деформации мембраны, когда использовалась более митохондрии-как SL шаблон / ПЭ / CL. Интересно отметить, что активность фермента не была увеличена. Таким образом, исследования EM играют существенную роль в определении ключевых различий, которые иначе были бы пропущены с помощью функционального анализа.
Хотя этот метод является мощным для изучения функции и взаимодействие растворимых белков и растворимых белковых доменов, эти липидные каркасы не могут объяснить роль трансмембранного доменаs. Это является важным фактором , так как трансмембранный домен может осуществлять динамические процессы белка , такие как самосборки 27 и латеральной диффузии 28 - 30 в липидных бислоев. Если эти факторы имеют решающее значение для оценки взаимодействия белков на поверхности мембраны, а затем традиционные эксперименты липидный восстановления с моющим средством будет отдавать предпочтение. Альтернативные привязи также могут быть изучены для контроля набора и подвижности мембранных белков на якорь.
В дополнение к использованию His-меченных белков с NTA (Ni 2+) липидных якорей, другие фалы , такие как биотин-конъюгированные 31 или реактивных групп , конъюгированным липиды могут быть использованы. Эти ковалентные модификации будут более стабильно ловушки белки на поверхности липидного, но мобильность и обмен этих факторов, вероятно, уменьшится. Таким образом, привязь следует тщательно рассматривать в контексте белковых комплексов изучаемых. Когда consideкольцо использование этого метода, способа привязывания белков липидных шаблоны имеют возможность влиять на определенные анализы. Так , например, His-метка привязывать к методу NTA (Ni2 +) , может быть более подходящим для в анализах на места , а не экспериментов по выделению, особенно в случае переходных белок-белковых взаимодействий. Это наглядно показано на рисунке 3 несоответствием на месте залегания отрицательного пятна электронной микроскопии и анализа оседания.
В будущем, сочетание двух или более из этих анкерных липидов с различными целевыми полярных головных групп может быть реализован для обеспечения набора из нескольких белков в шаблон подмостей без конкуренции за один липидный тросе. Кроме того, относительное содержание каждого компонента можно управлять с помощью изменения состава липидов. Дополнительные липидные кофакторы, такие как фосфоинозитидов, кардиолипина и фосфатидилсерина, легко могут быть введеныв этих шаблонов для оценки изолированного влияния разнообразных факторов.
В целом, эти липидные каркасы представляют собой новую платформу для исследования сложных белковых взаимодействий вблизи липидных мембран. Эти шаблоны легко сгенерирована и просты адаптировать к целому ряду разнообразных применений, в том числе ферментативных анализов, электронной микроскопии или флуоресцентных изображений. Кроме того, состав липида может быть приготовлена, чтобы походить на органеллы или мембранный микродоменного интерес к более перепросматривать функции белка в этих конкретных регионах. Используя эти методы, биохимики могут исследовать сложные взаимодействия мембраносвязанными и мембранных белков, ассоциированных со своими партнерами и их окружением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
