Abstract
Los estudios de proteínas integrales de membrana in vitro con frecuencia se complica por la presencia de un dominio transmembrana hidrófobo. Para complicar aún más estos estudios, la reincorporación de proteínas de membrana solubilizada con detergente en los liposomas es un proceso estocástico donde topología de la proteína es imposible de aplicar. Este trabajo ofrece un método alternativo para estas técnicas desafiantes que utiliza un andamio a base de liposomas. solubilidad de la proteína se ve reforzada por la supresión del dominio transmembrana, y estos aminoácidos se sustituyen con un resto de anclaje, tal como una etiqueta de His. Esta correa de sujeción interactúa con un grupo de anclaje (Ni 2+ coordinado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni 2+)) para marcado con His proteínas), que hace cumplir una topología de proteína uniforme en la superficie del liposoma. Se presenta un ejemplo en el que la interacción entre la proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) con una proteína de membrana, la fisión mitocondrial Factor (MFP), fue investigated utilizando este método andamio liposoma. En este trabajo, hemos demostrado la capacidad de reclutar Mff eficiente Drp1 solubles a la superficie de los liposomas, que estimuló su actividad GTPasa. Por otra parte, Drp1 pudo tubulate la plantilla de lípidos decorados a Mff en presencia de lípidos específicos. Este ejemplo demuestra la eficacia de los liposomas de andamio usando ensayos estructurales y funcionales y destaca el papel de Mff en la regulación de la actividad Drp1.
Introduction
El estudio de las interacciones proteína-proteína de membrana proximal es una tarea difícil debido a la dificultad para recapitular el entorno natural de las proteínas integrales de membrana que participan 1. Esto es debido a la necesidad de solubilización de detergente y la orientación inconsistente de proteínas en proteoliposomas. Con el fin de evitar estos problemas, se ha empleado una estrategia en la que dominios solubles de proteínas integrales de membrana se expresan como proteínas de fusión His-tag, y estos fragmentos solubles están anclados a los liposomas de andamio a través de interacciones con NTA (Ni 2+) grupos de cabeza en el lípido superficie. El uso de estos andamios, las interacciones proteína-lípido proximal pueden ser investigados en un rango de composiciones de lípidos y proteínas.
Hemos aplicado con eficacia este método para investigar las interacciones proteína-proteína críticos que rigen el ensamblaje del complejo de la fisión mitocondrial y examinar las interacciones de lípidos que modulan este proceso 2. Durante la fisión mitocondrial, una proteína de la remodelación de membrana conservada, denominado proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) 3, es reclutado para la superficie de la externa mitocondrial membrana (OMM) en respuesta a señales celulares que regulan la homeostasis de la energía, la señalización de apoptosis, y varias otras procesos mitocondriales integrales. Este GTPasa grande, citosólica es reclutado a la superficie de la mitocondria a través de interacciones con proteínas integrales de OMM 4 - 8. El papel de una de tales proteínas, Fisión mitocondrial Factor (MFP), ha sido difícil de dilucidar debido a una débil interacción aparente con Drp1 in vitro. Sin embargo, los estudios genéticos han demostrado claramente que Mff es esencial para el éxito de 7,8 fisión mitocondrial. El método descrito en este manuscrito fue capaz de superar las deficiencias anteriores mediante la introducción de lípidos interacciones simultáneas que promueven interacciones Drp1-MFP. En general, este novedoso ensayo REVEAconducido interacciones fundamentales ensamblaje del complejo de fisión mitocondrial de guía y proporcionó una nueva etapa para estudios estructurales y funcionales en curso de esta máquina molecular esencial.
Hasta la fecha, el examen de las interacciones entre Drp1 y Mff se han complicado por la flexibilidad inherente de Mff 9, la heterogeneidad de Drp1 Polímeros 2,10, y la dificultad en la purificación y reconstitución de longitud completa Mff con un dominio transmembrana intactas 11. Hemos abordado estos problemas mediante el uso de liposomas NTA (Ni2 +) de andamios para reconstituir His-Mff que carece de su dominio transmembrana (MffΔTM-Su 6). Esta estrategia fue una ventaja, ya MffΔTM era extremadamente soluble cuando se sobre-expresan en E. coli, y esta proteína aislada se reconstituyó fácilmente en liposomas de andamios. Cuando atado a estas plantillas de lípidos, Mff asumió una, la orientación hacia el exterior idéntica en la superficie de la membrana.Además de estas ventajas, los lípidos mitocondriales, tales como cardiolipina, se añadieron a estabilizar Mff plegado y la asociación con la membrana 11. La cardiolipina también interactúa con el dominio variable de Drp1 2,12 que puede estabilizar esta región desordenada y facilitar el montaje de la maquinaria de fisión.
Este método robusto es ampliamente aplicable para futuros estudios que pretenden evaluar las interacciones proteína-membrana proximal. Mediante el uso de interacciones adicionales tethering / afinidad, la sofisticación de estos estudios de reconstitución de membrana se puede mejorar para imitar la complejidad adicional que se encuentra en la superficie de las membranas dentro de las células. Al mismo tiempo, las composiciones lipídicas se pueden modificar para imitar con mayor precisión los ambientes nativos de estos complejos macromoleculares. En resumen, este método proporciona un medio para examinar las contribuciones relativas de las proteínas y lípidos de membrana en la configuración de morfologías que durante proc celulares críticaseses.
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Protocol
1. Preparación de liposomas Andamios
NOTA: Idealmente, los experimentos iniciales se debe utilizar un andamio relativamente simple y sin rasgos (compuesto por DOPC (1,2-sn dioleoyl- glicero-3-fosfocolina o PC) y DGS-NTA (Ni2 +) (1,2-dioleoil - sn -glicero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético) succinil]. (sal de níquel)) Building fuera de estos experimentos, la carga de los lípidos, la flexibilidad, y la curvatura puede introducirse como factores individuales con el potencial de alterar las interacciones de membrana proximal. Estos cambios se pueden lograr mediante la adición de cantidades definidas de los constituyentes lipídicos específicos, incluyendo fosfatidilserina o cardiolipina (CL), fosfatidiletanolamina (DOPE o PE), o galactosil ceramida (β).
- Combinar los lípidos disueltos en cloroformo en un tubo de ensayo de vidrio limpio. Se evapora el disolvente con gas nitrógeno seco mientras se gira el tubo para formar una película lipídica delgada. Eliminar el disolvente residual con una centrifugal evaporador durante 1 hora a 37 ° C.
NOTA: Varias formulaciones de liposomas se utilizan en los protocolos descritos a continuación: liposomas de andamio (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7% en moles de DOPC), liposomas de andamio con cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% en moles cardiolipina / 86,7% en moles de DOPC), liposomas andamio flexibles con cardiolipina (3,3% en moles DGS-NTA (Ni2 +) / 10% en moles cardiolipina / 35% en moles de DOPE / DOPC 51,7% en moles), y el andamio enriquecido liposomas (10% en moles DGS-NTA (Ni2 +) / 15% en moles cardiolipina / 35% mol DOPE / DOPC 40% en moles). - Añadir Tampón A (HEPES 25 mM (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico), KCl 150 mM, pH ajustado a 7,5 con KOH) precalentado a 37 ° C tal que la concentración final de lípidos es de 1 - 2 mM. Incubar 30 min a 37 ° C con agitación ocasional para resuspender completamente la mezcla de lípidos (Figura 1a).
- Transferir a un tubo de ensayo de plástico, colocar el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado (rougHly 30 s), y el lugar en un baño de agua a 37 ° hasta que esté completamente descongelado (aproximadamente 1 - 2 min). Repita para un total de 4 ciclos de congelación-descongelación (Figura 1b).
- Preparar una extrusora de lípidos por remojo 4 soportes de filtro y un filtro de policarbonato en tampón y montaje de la máquina de extrusión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Extruir la solución de lípidos a través del filtro 21 veces. Use una presión suave y constante para asegurar una distribución homogénea de tamaño (Figura 1c).
NOTA: Para todos los experimentos descritos en este protocolo, se utilizó un filtro de 1,0 micras de policarbonato para la extrusión. Interacción Drp1 con los lípidos aniónicos se puede observar con una variedad de diámetros de liposomas que van de 50 nm a 400 nm 12 o más grande 13. Por lo tanto, el tamaño del filtro de 1 m se elige para que sea ideal para la actividad GTPasa y de microscopía electrónica. Si se desean otros diámetros de liposomas, la preparación de vesículas unilamelares gigantes (14,15) o GUVs pequeña unilamellar vesículas 16 (SUVs) se puede utilizar. Dispersión dinámica de luz se puede utilizar para evaluar la heterogeneidad de liposomas de tamaño 13. - Almacenar los liposomas extruidos a 4 ° C y descartar después de 3 - 5 de d.
2. Uso de Andamios liposomas para análisis de unión de proteínas
- Preparación de la muestra
- Incubar Su-etiquetados MffΔTM (5 mM final) con liposomas de andamio (40% mol PC / 35% mol de PE / 15% mol CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 mM final) durante al menos 15 min a TA en tampón a + BME (HEPES 25 mM, KCl 150 mM, 10 mM β-mercaptoetanol (BME), pH ajustado a 7,5 con KOH). Para un control Mff libre, incubar liposomas con una marcada His proteína de control (tal como GFP) para atar y blindaje expuesto NTA (Ni2 +).
NOTA: MffΔTM se expresó y se purificó como se describe en un estudio previo 2. GFP se purificó de una manera similar, pero se omitió la etapa de intercambio iónico. BME se requiere para estos experiments porque Drp1 es sensible a la oxidación, lo que puede alterar sus propiedades de actividad y de montaje. - Añadir Drp1 (2 mM final) y se incuba durante 1 h a TA.
NOTA: Drp1 se expresó y se purificó como se describe en un estudio previo 2. Después de la incubación con Drp1, el efecto de la unión en la deformación de la membrana de nucleótidos puede ser investigado mediante la incubación de una hora más con 2 mM MgCl 2 y, o bien GTP 1 mM, 1 mM GMP-PCP, o tampón A + BME.
- Incubar Su-etiquetados MffΔTM (5 mM final) con liposomas de andamio (40% mol PC / 35% mol de PE / 15% mol CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 mM final) durante al menos 15 min a TA en tampón a + BME (HEPES 25 mM, KCl 150 mM, 10 mM β-mercaptoetanol (BME), pH ajustado a 7,5 con KOH). Para un control Mff libre, incubar liposomas con una marcada His proteína de control (tal como GFP) para atar y blindaje expuesto NTA (Ni2 +).
- Negativo a las manchas Microscopía Electrónica de Transmisión (EM) Análisis
- Transferencia de 5 l de muestra a una hoja de película de laboratorio y colocar una rejilla de Cu / Rh revestida de carbono en la muestra. Incubar la cuadrícula 1 min de la muestra, seque el exceso de líquido en el papel de filtro, y la transferencia a una gota de acetato de uranilo al 2%. Incubar 1 min, secar el exceso de tinta sobre papel de filtro, y la transfiere a una celda de la malla. Tienda al vacío O / N para asegurar la desecación completa.
- muestras de imagen utilizando un microsc electrónica de transmisiónOPE en 18.500 - 30,000X magnificación para observar los cambios ultraestructurales en proteínas y liposomas morfologías 17.
Nota: los cambios ultraestructurales pueden ser cuantificados usando el software de análisis de imágenes, tales como ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). decoración de proteína se puede medir cuando se compara con las plantillas de lípidos desnudos. Además, los diámetros de los segmentos tubulares se pueden medir desde la parte más externa de los conjuntos de 13. Un análisis más detallado se puede realizar utilizando crio-microscopía electrónica 17. Este método se puede utilizar para conjuntos de proteína-lípido nativas de la imagen en el disolvente sin el uso de manchas de metal pesado que la capa de la muestra. De esta forma, las características estructurales detallados no aparentes en tinción negativa, incluyendo cambios en la morfología de lípidos subyacente, pueden ser examinados y cuantificados.
3. El uso de liposomas para Andamios Ensayo enzimático
Nota: Un coloriensayo de GTPasa métrica 18 se utilizó para medir la liberación de fosfato a través de la hidrólisis de GTP. Ensayos de GTPasa alternativos están disponibles 19 y se pueden implementar según sea necesario.
- Incubar Su-etiquetados MffΔTM (MFP), Fis1ΔTM (Fis1) o GFP (5 mM final para todos) con liposomas de andamio (150 mM final) durante 15 min a TA en tampón A + BME (volumen = 30 l). Añadir Drp1 (500 nM final) y se incuba 15 minutos más a temperatura ambiente (volumen = 80 l).
NOTA: Fis1 se purificó de una manera similar a Mff 2, pero se omitió la etapa de cromatografía de intercambio iónico. El propósito de His-GFP es para proteger a la NTA grupos de cabeza (Ni2 +) y evitar interacciones de carga no específicos con otras proteínas. Si no se observa efecto en ausencia de GFP, a continuación, este control puede no ser necesaria. proteínas de bloqueo alternativos (de tamaño comparable al de la proteína de interés) se pueden utilizar también, pero GFP permite la visualización directa de las interacciones con SCAFdoblar liposomas. - Tubos de transferencia a un termociclador establece en 37 ° C, e inician las reacciones por adición de GTP y MgCl2 (1 mM y final 2 mM, respectivamente; volumen = 120 l).
- En los puntos de tiempo deseados (es decir, t = 5, 10, 20, 40, 60 min), la transferencia de 20 l de reacción a los pocillos de una placa de microtitulación que contiene 5 l de 0,5 M EDTA para quelar Mg 2+ y detener la reacción.
- Preparar un conjunto de normas de fosfato mediante la dilución de KH 2 PO 4 en tampón A + BME para calibrar los resultados. Una serie de normas útiles es de 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 y 0 M. Añadir 20 l de cada uno para los pocillos que contenían 5 l de 0,5 M EDTA.
- Añadir 150 l de reactivo de la malaquita verde (verde carbinol 1 mM malaquita, 10 mM de molibdato de amonio tetrahidratado, y HCl 1 N) a cada pocillo, y leer OD 650 5 min después de la adición.
NOTA: GTP es ácido lábil, y se hidrolizará en presencia de reactivo de verde de malaquita. Asegúrese de que tque el tiempo entre la adición del reactivo de malaquita y la lectura es constante para asegurar resultados reproducibles. - Generar una curva estándar trazando OD 650 de las normas en función de la concentración de fosfato. Utilizar la regresión lineal para determinar la relación entre OD 650 y la concentración de fosfato en una muestra.
- Uso de la regresión lineal, convertir el OD 650 de las muestras de reacción proteína a fosfato M. Determinar la velocidad de generación de fosfato para cada mezcla de reacción mediante el trazado de la concentración de fosfato como una función del tiempo, y convertir a k gato dividiendo la tasa por la concentración Drp1 (0,5 M).
NOTA: Sólo la tasa lineal inicial se debe utilizar para determinar la velocidad de generación de fosfato, y un mínimo de 3 puntos de datos debe ser utilizado. Si la velocidad de reacción es suficientemente rápida que los primeros tres puntos de datos no son lineales (es decir, el r 2 del ajuste lineal es inferior a 0,9) un signoificantly más corto transcurso de tiempo con al menos 3 puntos de tiempo debe ser realizada.
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Representative Results
Mientras que la interacción entre Drp1 y Mff ha demostrado ser importante para la fisión mitocondrial, esta interacción ha sido difícil de recapitular in vitro. Nuestro objetivo era emular mejor el entorno celular en el que Drp1 y Mff interactúan. Con este fin, los liposomas que contienen concentraciones limitantes de NTA (Ni 2+) grupos de cabeza se prepararon mediante rehidratación de una película de lípidos como se describió anteriormente. La solución de lípidos consiste inicialmente en vesículas unilamelares y multilamelares de diámetros heterogéneos como se evidencia por la opacidad de la solución (Figura 1a). Esta opacidad se reduce por congelación-descongelación (Figura 1b), que reduce la prevalencia de vesículas multilamelares. Los diámetros de liposomas se homogeneizan aún más por extrusión a través de un filtro de policarbonato, lo que resulta en una solución clara (Figura 1c).
2. Sobre la base de estos resultados, se utilizó una nueva plantilla compuesta de PC, PE, Ni y CL (llamado Enriquecido Andamios liposomas o ESL) para promover el ensamblaje ordenado de un polímero Drp1-Mff compleja capaz de inducir la deformación de la membrana. En concreto, el aumento de NTA (Ni 2+) y se utilizaron los lípidos cardiolipina (10% en moles y 15% en moles, respectivamente) para esta aplicación. Entonces, GFP o Mff estaba atado a las plantillas de ESL en la presencia y ausencia de Drp1 (Figura 2), y la capacidad de Drp1 para remodelar membranas se evaluó cualitativamente. En ausencia de Drp1, ni Mff ni GFP dieron lugar a la deformación de la membrana (Figura 3a, b), y de manera similar en el caso de ESL GFP-decorado, sólo se observaron liposomas sin rasgos (Figura 3c). Sin embargo, cuando DRP1 se añadió a las plantillas de ESL decoradas Mff, remodelación de los liposomas fue evidente (Figura 3d).
Mientras que la formación del complejo macromolecular demuestra claramente una interacción entre Drp1 y Mff, este análisis cualitativo solo es incapaz de determinar los efectos funcionales de tal interacción. Por lo tanto, se utilizó un ensayo de generación de fosfato de verde de malaquita 18 para evaluar las alteraciones en la actividad catalítica de Drp1 en respuesta a la interacción con Mff. Como se ha descrito anteriormente 2, que inicialmente se utilizó un sencillo liposoma andamio (SL; 3,3% en moles DGS-NTA (Ni 2+), 96,7% en moles de DOPC) para investigar el efecto de Mff solo en estructura y función Drp1. La interacción no específica de Drp1 con NTA (Ni2 +) ha sido descrito previamente 20, por lo SL fue diseñado inicialmente para contener bajas concentraciones de NTA (Ni2 +) para evitar la estimulación no específica la actividad del Dr.p1. Con las cantidades más grandes de NTA (Ni 2+) en ESL, se encontró el uso de GFP marcada con His como un control para ser crítico para proteger a la Ni2 + y prevenir interacciones Drp1 no específicos. Después de la decoración de SL liposomas por Mff o GFP (como se ilustra en la Figura 2), el grado de auto-ensamblaje se puede evaluar mediante la medición de la actividad GTPasa de Drp1. En ausencia de liposomas, Drp1 tiene una actividad GTPasa basal relativamente baja, que está ligeramente mejorada por adición de SL. Decoración de estos liposomas de andamio con Mff mejorada actividad GTPasa (Figura 4a, 1.8 veces). A la inversa, cuando el NTA expuesta (Ni2 +) grupos de cabeza se bloquearon con GFP marcada con His, se realizó ablación esta actividad GTPasa aumentada. También probamos el papel de Fis1, una proteína OMM que se ha sugerido que tienen un papel en la fisión mitocondrial 21,22, aunque esto ha sido cuestionado en estudios recientes 7,23. La inmovilización de Fis1 que carece de su dominio transmembranaa SL también falló para provocar una estimulación de la actividad GTPasa de Drp1 (Figura 4a).
a continuación, se utilizó un andamio de lípidos poco más complejo que contiene una pequeña cantidad de cardiolipina (SL / CL: SL con 10 mol% cardiolipina sustitución de DOPC) para determinar el papel de este lípido mitocondrial en la interacción de Drp1 y Mff. Esta concentración moderada de cardiolipina fue elegido específicamente para limitar la estimulación de Drp1 por cardiolipina como se describió anteriormente 10. Al igual que en SL, la adición de SL / CL a Drp1 dio lugar a una ligera estimulación de la actividad GTPasa que fue revertido por la inmovilización Fis1 o GFP marcada con His a los liposomas. Se observó una sinergia entre Mff y cardiolipina como la actividad GTPasa de Drp1 se estimuló 2,6 veces cuando se incubó con decorado-Mff SL / CL (Figura 4b).
fluidez de la membrana y la capacidad of Drp1 para remodelar se han propuesto bicapas lipídicas para mejorar su actividad GTPasa. Por lo tanto, hemos tratado de examinar el efecto de la membrana fluidez / flexibilidad, usando un liposoma andamio flexible. Esto se logró mediante la sustitución de 35% en moles de DOPC en SL / CL con DOPE (SL / PE / CL), que ya ha sido demostrado para permitir Drp1 mediada membrana remodelación 10. Además de no decoradas SL / PE / CL liposomas andamio para Drp1 mejora ligeramente la actividad GTPasa Drp1, y la decoración de estos liposomas con GFP elimina este efecto. Cuando las plantillas / PE / CL SL se decoraron con MFP, se potenció la actividad Drp1 (Figura 4c, 2,4 veces). Como hemos demostrado previamente, la capacidad de Drp1 para remodelar liposomas en los túbulos de lípidos se mejoró por la adición de PE a los liposomas de andamios. Curiosamente, esta mejora de tubulation que conduce a la formación de un polímero Drp1 helicoidal no dio lugar a ningún tipo de estimulación mayor que con liposomas que Drp1 no pudo remodelar El uso de estas plantillas adaptables de lípidos, Mff y Drp1 se encontraron para interactuar en un entorno más nativo in vitro. Esta técnica nos ha permitido controlar la abundancia relativa de Drp1, Mff (a través de NTA (Ni2 +) concentración), y los lípidos específicos (cardiolipina y PE) que aparecían en concreto para regular el montaje de este complejo macromolecular. Como hemos demostrado, este método puede ser utilizado para visualizar la remodelación de la membrana de Drp1 reclutado-Mff por microscopía electrónica, y para determinar los efectos de montaje Drp1 en su actividad catalítica usando el ensayo de actividad de GTPasa. 71fig4.jpg "/> 
Figura 1: Esquema de lípidos Preparación. (A) Tras la resuspensión, liposomas de diversos tamaños se forman y se componen de unilamelar y multilamelvesículas Lar, lo que resulta en una solución opaca (recuadro). (B) congelación-descongelación de los resultados de la solución en una población más unilamelar de liposomas, que son todavía heterogénea de diámetro. Congelación-descongelación aclara la solución (recuadro). (C) extrusión de la solución de lípidos homogeniza el diámetro de los liposomas (1,0 m en este ejemplo), y da como resultado una solución clara (recuadro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 2: Métodos para evaluar ensamblaje de proteínas. Se presenta un conjunto de proteína de pareja que representa esquemática en liposomas de andamios. Su-etiquetados proteínas asociadas o GFP se incuban con liposomas de andamios, y luego se incuba con Drp1 lipo decorado o sin decorar somes. Estos liposomas Drp1-preensamblado pueden ser analizados por métodos estructurales (microscopía electrónica) y ensayos funcionales (ensayo de GTPasa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3: Evaluación estructural de Drp1 Reclutamiento. Micrografías de transmisión de tinción negativa de GFP o Mff decoradas liposomas solo (A, B, respectivamente) o incubadas con Drp1 (C, D, respectivamente). Barra de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Andamios de liposomas Ensayo enzimático. (A - C) se midió la generación de fosfato con el tiempo (recuadro), y se determinó la k gato. Este método se aplicó a proteínas-SL tethered (A), / proteínas CL-tethered SL (B), o SL / PE / proteínas CL-tethered (C). #: P <0,05, *: p <0,0001, **: p <0,000001 tal como se determina por la prueba t de Student no apareado. Todas las barras de error representan la desviación estándar de 3 muestras independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo ofrece un método para la investigación de las interacciones proteína-proteína que participa en proteínas integrales de membrana. Mediante la utilización de un andamio modular de liposomas, los investigadores son capaces de evaluar la actividad de una o más proteínas en un entorno de lípidos proximal. Estudios anteriores han demostrado un método similar para las enzimas de los receptores de la membrana plasmática 24-26. Hemos ampliado este método para incorporar cofactores de lípidos y explorar las interacciones entre las proteínas que forman el núcleo de la maquinaria mechanoenzymatic fisión mitocondrial.
Para el sistema modelo presentado anteriormente, se encontró que los decorados a Mff SL mejorada Drp1 autoensamblaje. Por otra parte, ahora nos muestran que, plantillas ESL decoradas Mff fueron remodelados de manera eficiente por tipo salvaje Drp1 para formar estructuras tubulares extendidos. También se evaluó el papel de varios lípidos mitocondriales, incluyendo la cardiolipina cargada negativamente y el PE lípidos cónica.Cardiolipina sinergia con Mff para mejorar aún más Drp1 auto-ensamblaje, mientras que la flexibilidad y la fluidez de la membrana impartida por PE mejora tubulation membrana, pero no aumente aún más la estimulación MFF-inducida.
Para evaluar los cambios ultraestructurales en morfologías de membrana, EM análisis se requiere. La actividad GTPasa Drp1 fue elevada a través de la agrupación y el montaje de polímeros filamentosos que no reforman los liposomas de forma importante 2. Sin embargo, no se observó deformación de la membrana cuando se utilizó la mitocondria-como plantilla más SL / PE / CL. Curiosamente, no se mejoró la actividad de la enzima. Por lo tanto, los estudios de EM fueron esenciales en la identificación de las diferencias clave que otra manera se perderían usando el ensayo funcional.
Si bien esta técnica es de gran alcance para explorar la función e interacción de las proteínas solubles y los dominios de proteínas solubles, estos andamios de lípidos no puede explicar el papel del dominio transmembranas. Esta es una consideración importante debido a que el dominio transmembrana puede afectar a los procesos de proteína dinámicos como auto-ensamblaje 27 y difusión lateral 28 - 30 en bicapas lipídicas. Si estos factores son críticos para la evaluación de las interacciones de proteínas en la superficie de la membrana, a continuación, los experimentos tradicionales de reconstitución de lípidos con detergente se verían favorecidos. correas de sujeción alternativos también pueden ser exploradas para controlar el reclutamiento y la movilidad de las proteínas de membrana anclada.
Además de utilizar las proteínas Su-etiquetados con NTA anclajes lipídicos (Ni2 +), otras correas de sujeción tales como 31 o reactivos lípidos del grupo conjugado con biotina conjugado pueden ser utilizados. Estas modificaciones covalentes serían más establemente proteínas trampa en la superficie de los lípidos, pero la movilidad y el intercambio de estos factores es probable ser disminuidos. Como tal, la correa de sujeción se debe considerar cuidadosamente en el contexto de los complejos de proteínas en estudio. cuando consideanillo de la utilización de este método, el modo de inmovilización de proteínas a las plantillas de lípidos tienen el potencial de influir en ciertos ensayos. Por ejemplo, la inmovilización His-tag con el método NTA (Ni 2+) puede ser más apropiado para ensayos in situ en lugar de los experimentos de separación, especialmente en el caso de las interacciones proteína-proteína transitorios. Esto se demuestra claramente en la Figura 3 por la discrepancia entre la microscopía electrónica con tinción negativa in situ y el ensayo de sedimentación.
En el futuro, una combinación de dos o más de estos lípidos de anclaje con grupos de cabeza diana distintas podría implementarse para permitir el reclutamiento de múltiples proteínas a una plantilla de andamio sin competencia por una sola correa de lípidos. Por otra parte, la abundancia relativa de cada componente puede ser administrado por la alteración de la composición de lípidos. cofactores de lípidos adicionales, tales como fosfoinosítidos, cardiolipina y fosfatidilserina, fácilmente se pueden introduciren estas plantillas para evaluar el impacto aislado de una variedad de factores.
En general, estos andamios de lípidos representan una nueva plataforma para la investigación de las interacciones complejas de proteínas cerca de las membranas lipídicas. Estas plantillas se generan fácilmente y son fáciles de adaptar a una variedad de diversas aplicaciones, incluyendo ensayos enzimáticos, microscopía electrónica, o imágenes de fluorescencia. Además, la composición de lípidos puede ser formulado para parecerse a un orgánulo o membrana de microdominios de interés para recapitular mejor función de la proteína en estas regiones específicas. El uso de estas técnicas, los bioquímicos pueden sondear las complejas interacciones de membrana unida y proteínas de membrana asociada a sus parejas y su entorno.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
