Abstract
Des études sur les protéines membranaires intégrales in vitro sont souvent compliquées par la présence d'un domaine transmembranaire hydrophobe. Pour compliquer encore ces études, réincorporation des protéines membranaires détergent solubilisé dans des liposomes est un processus stochastique où la protéine topologie est impossible à appliquer. Cet article propose une méthode alternative à ces techniques difficiles qui utilise un échafaudage à base de liposomes. La solubilité des protéines est améliorée par deletion du domaine transmembranaire et les acides aminés sont remplacés par un fragment d'attache, telle qu'une étiquette His. Cette attache coopérant avec un groupe d' ancrage (Ni 2+ coordonné par l' acide nitrilotriacétique (NTA (Ni 2+)) pour les protéines à marquage His), qui applique une topologie de protéine homogène à la surface du liposome. Un exemple est présenté dans lequel l'interaction entre la protéine apparentée à Dynamin-1 (DRP1) avec une protéine membranaire intégrale, le facteur mitochondrial Fission (MFF) est investigated utilisant cette méthode échafaudage liposome. Dans ce travail, nous avons démontré la capacité de MFF de recruter efficacement DRP1 soluble à la surface des liposomes, ce qui a stimulé son activité GTPase. En outre, DRP1 a pu tubulé le modèle lipidique MFF-décoré en présence de lipides spécifiques. Cet exemple démontre l'efficacité des liposomes d'échafaudage en utilisant des analyses structurales et fonctionnelles et met en évidence le rôle de la CFP dans la régulation de l'activité DRP1.
Introduction
L' étude des interactions protéine-protéine membrane proximal est une entreprise difficile en raison de la difficulté à récapitulant l'environnement natif des protéines membranaires intégrales impliquées 1. Ceci est dû à la nécessité de solubilisation avec un détergent et de l'orientation non uniforme des protéines dans des protéoliposomes. Afin d'éviter ces problèmes, nous avons utilisé une stratégie selon laquelle les domaines solubles de protéines membranaires intégrales sont exprimés sous forme de protéines de fusion His-tag, et ces fragments solubles sont ancrés à des liposomes de l' échafaudage par des interactions avec le NTA (Ni 2+) , les groupes de tête au lipide surface. L'utilisation de ces échafauds, les interactions entre protéines lipides proximal peuvent être étudiés sur une gamme de compositions de lipides et de protéines.
Nous avons effectivement appliqué cette méthode pour étudier les interactions protéine-protéine critiques qui régissent l'assemblage du complexe de fission mitochondriale et examiner les interactions lipidiques qui modulent cette processus 2. Lors de la fission mitochondriale, une protéine de remodelage de la membrane conservée, appelée protéine apparentée Dynamin-1 (DRP1) 3, est recruté à la surface de la mitochondriale externe membrane (OMM) en réponse à des signaux cellulaires qui régulent l' homéostasie énergétique, la signalisation apoptotique, et plusieurs autres processus mitochondriales intégrés. Cette grande GTPase cytosolique est recruté à la surface des mitochondries par des interactions avec les protéines intégrales OMM 4 - 8. Le rôle d'une telle protéine, mitochondriale Fission Factor (MFF), a été difficile à élucider en raison d'une faible interaction apparente avec DRP1 in vitro. Néanmoins, les études génétiques ont clairement démontré que MFF est essentiel pour le succès de mitochondrial fission 7,8. La méthode décrite dans ce manuscrit a été en mesure de remédier aux lacunes précédentes en introduisant des interactions lipidiques simultanées qui favorisent les interactions DRP1-MFF. Dans l'ensemble, ce nouveau test REVEAconduit les interactions fondamentales guidant l'assemblage du complexe de fission mitochondriale et a fourni une nouvelle étape pour les études structurales et fonctionnelles en cours de cette machine moléculaire essentielle.
À ce jour, l' examen des interactions entre DRP1 et MFF ont été compliquées par la flexibilité inhérente du MFF 9, l'hétérogénéité des DRP1 Polymères 2,10, et la difficulté de la purification et la reconstitution pleine longueur MFF avec un domaine transmembranaire intact 11. Nous avons abordé ces défis en utilisant des liposomes NTA (Ni 2+) d'échafaudage pour reconstituer His-tagged MFF dépourvu de son domaine transmembranaire (MffΔTM-His 6). Cette stratégie a été avantageuse car MffΔTM était extrêmement soluble lorsque surexprimé dans E. coli, et cette protéine isolée a été facilement reconstituées sur des liposomes d'échafaudage. Quand attaché à ces modèles de lipides, MFF suppose un traitement identique, l'orientation tournée vers l'extérieur sur la surface de la membrane.En plus de ces avantages, les lipides mitochondriales, tels que la cardiolipine, ont été ajoutés pour stabiliser MFF pliage et son association avec la membrane 11. Cardiolipine interagit également avec le domaine variable de 2,12 DRP1 qui peut stabiliser cette région désordonnée et faciliter l' assemblage du mécanisme de fission.
Cette méthode robuste est largement applicable pour les futures études visant à évaluer les interactions entre protéines membranaires-proximal. Grâce à l'utilisation des interactions tethering / d'affinité supplémentaires, la sophistication de ces études de reconstitution de la membrane peut être améliorée pour imiter la complexité supplémentaire trouvée à la surface des membranes dans les cellules. Dans le même temps, les compositions lipidiques peuvent être modifiées pour mimer plus précisément les environnements d'origine de ces complexes macromoléculaires. En résumé, cette méthode fournit un moyen d'examiner les contributions relatives des protéines et des lipides dans la formation de morphologies membranaires au cours de proc cellulaire critiqueesses.
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Protocol
1. Préparation de liposomes Échafaudage
NOTE: Idéalement, les premières expériences devraient utiliser un échafaudage relativement simple et monotone (composé de DOPC (1,2-dioleoyl- sn - glycéro-3-phosphocholine ou PC) et DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioléoyl - sn - glycéro-3 - [(N - (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacétique) succinyl]. (sel de nickel)) Construction hors de ces expériences, la charge des lipides, la flexibilité et la courbure peut être introduit en tant que facteurs individuels avec la possibilité de modifier les interactions membranaires proximale. Ces modifications peuvent être obtenues en ajoutant des quantités déterminées de constituants lipidiques spécifiques, y compris la phosphatidylsérine ou la cardiolipine (CL), la phosphatidyléthanolamine (DOPE ou PE) ou galactosyle (β) céramide.
- Combinez les lipides dissous dans du chloroforme dans un tube à essai en verre propre. On évapore le solvant avec de l'azote gazeux sec, tout en faisant tourner le tube pour former un mince film de lipide. Retirer le solvant résiduel avec un centrifugal 'évaporateur pendant 1 h à 37 ° C.
REMARQUE: Différentes formulations de liposomes sont utilisées dans les protocoles décrits ci - dessous: liposomes d'échafaudage (3,3% en moles DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7% en moles DOPC), les liposomes d'échafaudage avec la cardiolipine (% DGS-NTA (Ni 2+ 3,3 mole) / 10 mol% cardiolipine / 86,7 mol% DOPC), des liposomes d'échafaudage flexibles avec cardiolipine (3,3% en mole DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipine / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), et échafaudage enrichi liposomes (10% en moles DGS-NTA (Ni 2+)% / 15 mole cardiolipine / 35% en moles de DOPE / 40% en moles DOPC). - Ajouter un tampon A (25 mM de HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic), KCl 150, pH ajusté à 7,5 avec du KOH) préalablement chauffée à 37 ° C de telle sorte que la concentration finale en lipide est de 1 - 2 mm. Incuber 30 min à 37 ° C avec un tourbillonnement occasionnel pour remettre en suspension complètement le mélange lipidique (figure 1a).
- Transférer dans un tube à essai en plastique, placer le tube dans de l'azote liquide jusqu'à ce que complètement gelé (roughly 30 s) et placer dans un bain-marie à 37 ° jusqu'à ce que complètement dégelé (environ 1 - 2 min). Répétez l' opération pour un total de 4 cycles de gel-dégel (figure 1b).
- Préparer une extrudeuse de lipide par trempage 4 supports de filtre et un filtre en polycarbonate dans un tampon et l'assemblage de l'extrudeuse, conformément aux instructions du fabricant. Extruder la solution lipidique à travers le filtre 21 fois. Utiliser doux, une pression constante pour assurer une distribution de taille homogène (figure 1c).
NOTE: Pour toutes les expériences décrites dans ce protocole, un filtre de 1,0 um de polycarbonate a été utilisé pour l'extrusion. L' interaction avec les lipides anioniques DRP1 peut être observée avec une variété de diamètres de liposomes allant de 50 nm à 400 nm ou supérieure à 12 13. Par conséquent, la taille du filtre de 1 pm a été choisie pour être idéal pour les activité GTPase et pour la microscopie électronique. Si d' autres diamètres de liposomes sont souhaités, la préparation des vésicules géantes unilamellaires 14,15 (de GUVs) ou petite unilamellar vésicules 16 (VUS) peuvent être utilisés. Diffusion de la lumière dynamique peut être utilisé pour évaluer liposome hétérogénéité de taille 13. - Rangez liposomes extrudés à 4 ° C et jeter après 3-5 d.
2. Utilisation de Échafaudages Liposomes pour Protein Analyse Binding
- La préparation des échantillons
- Incuber marquée par His MffΔTM (5 uM final) avec des liposomes d'échafaudage (40% en moles PC / 35 mol% PE / 15% en moles CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 uM finale) pendant au moins 15 min à la température ambiante dans du tampon A + BME (25 mM HEPES, 150 mM de KCl, 10 mM de β-mercaptoéthanol (BME), pH ajusté à 7,5 avec du KOH). Pour un contrôle MFF-libre, incuber les liposomes avec un tag his protéine de contrôle (comme la GFP) pour lier et bouclier exposé NTA (Ni 2+).
NOTE: MffΔTM a été exprimé et purifié comme décrit dans une étude précédente 2. GFP a été purifié d'une manière similaire, mais l'étape d'échange d'ions a été omise. BME a été nécessaire pour ces experiments parce DRP1 est sensible à l'oxydation, ce qui peut modifier ses propriétés d'activité et d'assemblage. - Ajouter DRP1 (2 uM final) et on incube pendant 1 h à température ambiante.
NOTE: DRP1 a été exprimé et purifié comme décrit dans une étude précédente 2. Après incubation avec DRP1, l'effet de la liaison de la déformation de la membrane nucléotidique peut être étudiée par incubation d' une heure supplémentaire avec 2 mM de MgCl2 et soit 1 mM GTP, 1 mM de GMP-PCP ou du tampon A + BME.
- Incuber marquée par His MffΔTM (5 uM final) avec des liposomes d'échafaudage (40% en moles PC / 35 mol% PE / 15% en moles CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 uM finale) pendant au moins 15 min à la température ambiante dans du tampon A + BME (25 mM HEPES, 150 mM de KCl, 10 mM de β-mercaptoéthanol (BME), pH ajusté à 7,5 avec du KOH). Pour un contrôle MFF-libre, incuber les liposomes avec un tag his protéine de contrôle (comme la GFP) pour lier et bouclier exposé NTA (Ni 2+).
- Négatif Stain microscopie électronique à transmission (EM) Analyse
- Transfert 5 pi d'échantillon à une feuille de film de laboratoire, et jeter une grille recouverte de carbone Cu / Rh sur l'échantillon. Incuber la grille 1 min sur l'échantillon, épongez loin l'excès de liquide sur du papier filtre, et transfert à une baisse de 2% d'acétate d'uranyle. Incuber 1 min, éponger l'excès de colorant sur du papier filtre, et transférer à une boîte de grille. Magasin sous vide O / N pour assurer la pleine dessiccation.
- Des échantillons de cette image au moyen d'un Microsc électronique à transmission,ope à 18.500 - 30,000X grossissement pour observer les changements ultrastructuraux en protéines et liposomes morphologies 17.
Remarque: les modifications ultrastructurales peuvent être quantifiés en utilisant un logiciel d'analyse d'images, tels que ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein décoration peut être mesurée par rapport aux modèles lipidiques nus. En outre, les diamètres des segments tubulaires peuvent être mesurés à partir de la partie la plus externe des assemblages 13. Une analyse plus détaillée peut être effectuée en utilisant cryo-microscopie électronique 17. Cette méthode peut être utilisée pour des assemblages de protéines lipidiques natives d'image dans un solvant sans l'utilisation de taches de métaux lourds qui enrobent l'échantillon. De cette façon, les caractéristiques structurelles détaillées non apparentes dans la tache négative, y compris des changements dans la morphologie des lipides sous-jacente, peuvent être examinés et quantifiés.
3. Utilisation de Échafaudages Liposomes pour Enzymatic Assay
Note: Un colorimétrique test GTPase 18 a été utilisé pour mesurer la libération de phosphate par l' intermédiaire de l' hydrolyse du GTP. Essais de GTPase alternatifs sont disponibles 19 et peuvent être mises en œuvre au besoin.
- Incuber marquée par His MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), ou GFP (5 uM finale pour tous) avec des liposomes d'échafaudage (150 uM final) pendant 15 min à température ambiante dans le tampon A + BME (volume = 30 pi). Ajouter DRP1 (500 nM final) et incuber pendant 15 minutes supplémentaires à la température ambiante (volume = 80 pi).
REMARQUE: Fis1 a été purifié d'une manière similaire à FFM 2, mais l'étape de chromatographie échangeuse d' ions a été omise. Le but de His-tagged GFP est de protéger le NTA (Ni 2+) et d' empêcher des groupes de tête des interactions de charges non spécifiques avec d' autres protéines. Si aucun effet est observé en l'absence de la GFP, alors ce contrôle peut ne pas être nécessaire. protéines alternatives de blocage (de taille comparable à la protéine d'intérêt) peuvent être utilisés aussi bien, mais GFP permet une visualisation directe des interactions avec SCAFpliez liposomes. - Les tubes de transfert à un thermocycleur réglé sur 37 ° C, et initient des réactions par addition de GTP et de MgCl2 (1 mM et 2 mM finale, respectivement; volume = 120 ul).
- Aux points temporels désirés ( par exemple T = 5, 10, 20, 40, 60 min), transférer 20 pi de réaction dans les puits d'une plaque de microtitrage contenant 5 pi de 0,5 M d' EDTA pour chélater Mg 2+ et arrêter la réaction.
- Préparer un ensemble de normes de phosphate par dilution KH 2 PO 4 dans le tampon A + BME pour calibrer les résultats. Un ensemble utile de normes est de 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 et 0 uM. Ajouter 20 pi de chaque puits contenant 5 pi de 0,5 M d'EDTA.
- Ajouter 150 ul de réactif malachite verte (carbinol vert malachite 1 mM, 10 mM de molybdate d' ammonium tétrahydraté et du HCl 1 N) dans chaque puits et lire la DO 650 5 minutes après l' addition.
REMARQUE: GTP est labile en milieu acide, et l'hydrolyse en présence d'un réactif de vert malachite. Veiller à ce que til le temps entre l'ajout de réactif malachite et de la lecture est constante pour obtenir des résultats reproductibles. - Générer une courbe d' étalonnage en traçant DO650 des normes en fonction de la concentration en phosphate. Utiliser une régression linéaire pour déterminer la relation entre la DO650 et la concentration en phosphate dans un échantillon.
- En utilisant la régression linéaire, la conversion de la DO650 des échantillons de réaction de la protéine de phosphate uM. Déterminer le taux de génération de phosphate pour chaque mélange de réaction en traçant la concentration de phosphate en tant que fonction du temps, et à convertir kcat en divisant le débit par la concentration DRP1 (0,5 uM).
NOTE: Seul le taux linéaire initial doit être utilisé pour déterminer le taux de production de phosphate, et un minimum de 3 points de données doit être utilisé. Si la vitesse de réaction est suffisamment rapide pour que les trois premiers points de données ne sont pas linéaires ( par exemple r 2 de l'ajustement linéaire est inférieur à 0,9) , un signeificantly plus court en fonction du temps avec au moins 3 points de temps doit être effectué.
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Representative Results
Alors que l'interaction entre DRP1 et MFF a été démontrée comme étant important pour la fission mitochondriale, cette interaction a été difficile à récapituler in vitro. Notre objectif était de mieux émuler l'environnement cellulaire dans lequel DRP1 et MFF interagissent. A cet effet, des liposomes contenant des concentrations de limitation de NTA (Ni 2+) , les groupes de tête ont été préparées en réhydratant un film lipidique tel que décrit ci - dessus. La solution lipidique consiste tout d' abord des vésicules unilamellaires et multilamellaires ayant des diamètres hétérogènes , comme en témoigne l'opacité de la solution (figure 1a). Cette opacité est réduite par congélation-décongélation (figure 1b), ce qui réduit la fréquence des vésicules multilamellaires. Les diamètres des liposomes sont ensuite homogénéisés par extrusion à travers un filtre en polycarbonate, ce qui donne une solution limpide (figure 1c).
2. Fort de ces résultats, nous avons utilisé un nouveau modèle composé de PC, PE, Ni et CL (appelé Enriched Échafaudages Liposomes ou ALS) pour promouvoir l'assemblage ordonné d'un polymère DRP1-MFF complexe capable d'induire une déformation de la membrane. Plus précisément, l' augmentation NTA (Ni 2+) , et les lipides ont été utilisés cardiolipine (10% en moles et 15 moles% respectivement) pour cette application. Ensuite, la GFP ou MFF a été attachés à des modèles d'ALS en présence et en absence de DRP1 (Figure 2), et la capacité des DRP1 à remodeler les membranes ont été qualitativement évaluées. En l'absence de DRP1, ni MFF ni GFP conduit à la déformation de la membrane (Figure 3a, b), et de même dans le cas d'ESL GFP décoré, seuls les liposomes monotones ont été observées (Figure 3c). Cependant, lorsque DRP1 a été ajouté à des modèles d'ALS MFF-décorés, le remodelage des liposomes était évident (figure 3d).
Alors que la formation du complexe macromoléculaire démontre clairement une interaction entre DRP1 et MFF, cette analyse qualitative seule est incapable de déterminer les effets fonctionnels d'une telle interaction. Par conséquent, nous avons utilisé un essai de production de phosphate de vert malachite 18 pour évaluer les changements dans l'activité catalytique de DRP1 en réponse à une interaction avec FFM. Comme décrit précédemment 2, nous avons d' abord utilisé un simple , liposome d'échafaudage (SL; 3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+),% 96,7 mol DOPC) pour étudier l'effet de la MFF seule sur la structure et la fonction DRP1. Interaction non spécifique de DRP1 avec NTA (Ni 2+) a été décrit précédemment 20, donc SL a été initialement conçu pour contenir de faibles concentrations de NTA (Ni 2+) pour éviter la stimulation de l' activité non spécifique du Drp1. Avec les plus grandes quantités de NTA (Ni 2+) dans ESL, l'utilisation de His-tagged GFP comme témoin a été jugée essentielle pour protéger le Ni 2+ et prévenir les interactions DRP1 non spécifiques. SL après décoration de liposomes par MFF ou GFP (comme cela est illustré sur la figure 2), le degré d'auto-assemblage peut être évaluée en mesurant l'activité GTPase de DRP1. En l'absence de liposomes, DRP1 a une activité GTPase de base relativement faible, ce qui est légèrement améliorée par ajout de SL. Décoration de ces liposomes d'échafaudage avec MFF améliorée activité GTPase (figure 4a, 1,8 fois). Inversement, lorsque la NTA exposée (Ni 2+) Les groupes de tête ont été bloqués avec His-tagged GFP, cette activité GTPase augmentée a été ablatée. Nous avons également testé le rôle de Fis1, une protéine OMM qui a été proposée pour jouer un rôle dans la fission mitochondriale 21,22, bien que cela a été contestée dans des études récentes 7,23. Tethering de Fis1 dépourvu de son domaine transmembranaireà SL a également échoué à induire une stimulation de l'activité GTPase de DRP1 (figure 4a).
Nous avons ensuite utilisé un échafaudage lipidique légèrement plus complexe contenant une petite quantité de cardiolipine (SL / CL: SL avec 10 mol% cardiolipine remplaçant DOPC) afin de déterminer le rôle de ce lipide mitochondrial dans l'interaction des DRP1 et MFF. Cette concentration modérée de cardiolipine a été spécialement choisie pour limiter la stimulation de DRP1 par cardiolipine comme décrit précédemment 10. Semblable à SL, ajout de SL / CL à DRP1 a entraîné une légère stimulation de l'activité GTPase qui a été renversée par attacher Fis1 ou GFP marquée par His aux liposomes. Une synergie entre MFF et cardiolipine a été observé que l'activité GTPase de DRP1 a été stimulée 2,6 fois quand il a été incubé avec MFF-décoré SL / CL (figure 4b).
Membrane fluidité et la capacité of DRP1 de remodeler les bicouches lipidiques ont été proposées afin d'améliorer son activité GTPase. Par conséquent, nous avons cherché à examiner l'effet de fluidité de la membrane / flexibilité en utilisant un liposome d'échafaudage flexible. Ceci a été réalisé en remplaçant 35% en moles de DOPC dans SL / CL avec la DOPE (SL / PE / CL), qui a été montré précédemment pour permettre DRP1 à médiation par le remodelage de la membrane 10. Ajout de undecorated SL / PE / CL échafaudage liposomes à DRP1 améliore légèrement l'activité GTPase de DRP1, et la décoration de ces liposomes avec GFP élimine cet effet. Lorsque SL / PE / CL modèles ont été décorés de MFF, l' activité DRP1 a été améliorée (Figure 4c, 2,4 fois). Comme nous l'avons montré précédemment, la capacité à remodeler DRP1 liposomes dans les tubules lipidiques a été améliorée par l'addition de PE aux liposomes d'échafaudage. Fait intéressant, cette amélioration de la tubulure conduisant à la formation d'un polymère DRP1 hélicoïdal n'a pas entraîné une plus grande stimulation par rapport à des liposomes qui DRP1 a été incapable de remodeler L' utilisation de ces modèles lipidiques adaptables, MFF et DRP1 ont été trouvés pour interagir dans un environnement plus natif in vitro. Cette technique nous a permis de contrôler l'abondance relative des DRP1, MFF (par NTA (Ni 2+) concentration), et de lipides spécifiques (cardiolipine et PE spécifiquement) qui semblaient réguler l'ensemble de ce complexe macromoléculaire. Comme nous l'avons mis en évidence, ce procédé peut être utilisé pour visualiser le remodelage de la membrane du MFF recrutés DRP1 par microscopie électronique et de déterminer les effets de l'ensemble DRP1 sur son activité catalytique, en utilisant l'activité GTPase dosage. 71fig4.jpg "/> 
Figure 1: Préparation Lipid schématique. (A) Sur resuspension, les liposomes de diverses tailles se forment et se composent de unilamellaire et multilamelvésicules lar, qui se traduit par une solution opaque (en médaillon). (B) congélation-décongélation de la solution conduit à une population de liposomes unilamellaires plus, qui sont encore hétérogènes de diamètre. Gel-dégel clarifie la solution (en médaillon). (C) extrusion de la solution lipidique homogénéise le diamètre des liposomes (1,0 pm dans cet exemple) et donne lieu à une solution limpide (encart). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 2: méthodes d'évaluation de l' assemblage des protéines. Un partenaire dépeignant assemblage protéique schématique sur des liposomes d'échafaudage est présenté. His-tagged protéines ou GFP partenaires sont incubés avec des liposomes d'échafaudage, puis DRP1 est incubé avec lipo décoré ou undecorated somes. Ces liposomes DRP1-prémonté peuvent ensuite être analysés par des méthodes structurelles (microscopie électronique) et des dosages fonctionnels (dosages GTPase). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 3: l' évaluation des structures de recrutement DRP1. Négatif micrographies de transmission de tache de la GFP ou MFF décorées liposomes seuls (A, B, respectivement) ou incubées avec DRP1 (C, D, respectivement). Barre d'échelle = 100 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Échafaudages liposome Enzymatic Assay. (A - C) La production de phosphate au cours du temps a été mesurée (encart), et le k cat a été déterminée. Cette méthode a été appliquée à SL-tethered protéines (A), SL / CL-tethered protéines (B), ou SL / PE / protéines CL-tethered (C). #: P <0,05, *: p <0,0001 **: p <0,000001 tel que déterminé par le test t de Student non apparié. Toutes les barres d'erreur représentent l'écart-type à partir de 3 échantillons indépendants. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole offre une méthode pour l'étude des interactions protéine-protéine impliquant des protéines membranaires intégrales. En utilisant un liposome échafaudage modulaire, les chercheurs sont capables d'évaluer l'activité d'une ou plusieurs protéines dans un environnement lipidique proximale. Des études antérieures ont démontré un procédé similaire pour les enzymes des récepteurs de la membrane plasmatique 24-26. Nous avons élargi cette méthode pour incorporer des cofacteurs de lipides et d'explorer les interactions entre les protéines qui composent le noyau mechanoenzymatic des machines de fission mitochondriale.
Pour le système de modèle présenté ci-dessus, nous avons constaté que MFF-décorée SL améliorée DRP1 auto-assemblage. De plus, nous montrons maintenant que, les modèles d'ALS MFF-décorés ont été efficacement remodelés par type sauvage DRP1 pour former des structures tubulaires étendues. Nous avons également évalué les rôles des différents lipides mitochondriaux, y compris le cardiolipine chargé négativement et le lipide PE conique.Cardiolipin en synergie avec MFF pour améliorer encore DRP1 auto-assemblage, tandis que la flexibilité de la membrane et la fluidité conférée par PE améliore queusot de la membrane mais n'augmentent pas davantage la stimulation MFF-induite.
Pour évaluer les changements ultrastructuraux dans morphologies membranaires, EM analyses ont été nécessaires. Activité GTPase DRP1 a été élevé par le regroupement et l' assemblage de polymères filamenteux qui ne remodèlent les liposomes dans une grande mesure 2. Cependant, la déformation de la membrane a été observée lorsque plus mitochondries comme SL / PE / CL modèle a été utilisé. Fait intéressant, l'activité enzymatique n'a pas été améliorée. Par conséquent, les études EM étaient essentielles pour identifier les principales différences qui seraient autrement manqués en utilisant le test fonctionnel.
Bien que cette technique est efficace pour explorer la fonction et l'interaction des protéines solubles et des domaines de protéines solubles, ces échafaudages lipidiques ne peuvent rendre compte du rôle du domaine transmembranaires. Ceci est une considération importante parce que le domaine transmembranaire peut effectuer des processus de protéines dynamiques telles que l' auto-assemblage 27 et la diffusion latérale 28 - 30 dans des bicouches lipidiques. Si ces facteurs sont essentiels pour évaluer les interactions entre protéines à la surface de la membrane, des expériences de reconstitution des lipides puis traditionnels avec un détergent seraient favorisés. longes alternatifs peuvent également être explorées pour contrôler le recrutement et la mobilité des protéines membranaires ancrées.
En plus d'utiliser des protéines à marquage His avec le NTA (Ni 2+) , les ancres de lipides, tels que longes autres 31 réactifs ou des lipides du groupe conjugué à la biotine conjugué peut être utilisé. Ces modifications covalentes seraient plus stable des protéines piège à la surface des lipides, mais la mobilité et l'échange de ces facteurs seraient probablement diminuées. A ce titre, l'attache doit être soigneusement examinée dans le contexte des complexes protéiques étudiées. Lorsque consisonner l'utilisation de cette méthode, le mode d'attacher les protéines aux modèles lipidiques ont le potentiel d'influencer certains essais. Par exemple, l'étiquette His tethering à la méthode NTA (Ni 2+) peut être plus approprié dans des essais in situ plutôt que des expériences de séparation, en particulier dans le cas des interactions protéine-protéine transitoires. Ceci est clairement démontré à la figure 3 par la différence entre la microscopie électronique à coloration négative in situ et l'essai de sédimentation.
A l'avenir, une combinaison de deux ou plusieurs de ces lipides d'ancrage avec des groupes de tête cibles distincts pourraient être mis en oeuvre pour permettre le recrutement de protéines multiples dans une matrice d'échafaudage sans compétition pour une seule attache lipidique. En outre, l'abondance relative de chaque composant peut être administré par modification de la composition lipidique. cofacteurs lipidiques supplémentaires, tels que les phosphoinositides, la cardiolipine et la phosphatidylsérine, peuvent facilement être introduitsdans ces modèles pour évaluer l'impact isolé d'une variété de facteurs.
Dans l'ensemble, ces échafauds lipidiques représentent une nouvelle plate-forme pour étudier les interactions complexes de protéines près de membranes lipidiques. Ces modèles sont facilement générés et sont faciles à adapter à une gamme d'applications diverses, y compris les dosages enzymatiques, microscopie électronique, ou imagerie par fluorescence. En outre, la composition lipidique peut être formulée de manière à ressembler à un organite ou d'une membrane micro-domaine d'intérêt pour mieux récapituler fonction de la protéine dans ces régions. L'utilisation de ces techniques, les biochimistes peuvent sonder les interactions complexes de membrane liée et des protéines associées à la membrane avec leurs partenaires et de leur environnement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
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