Abstract
In vitro bütün zar proteinlerinin çalışmalar sıklıkla bir hidrofobik zar geçiş alanına varlığı ile karmaşıktır. Dahası bu çalışmaları komplike, lipozomlar içine deterjan-çözünmüş membran proteinlerinin yeniden birleştirilmesi protein topoloji zorlamak için imkansız bir stokastik süreçtir. Bu kağıt bir lipozom tabanlı iskele kullanan bu zorlu tekniklere alternatif bir yöntem sunuyor. Protein çözünürlüğü transmembran alanının silinmesi ile arttırılır ve bu amino asitler, bir His-etiketi olarak bir bağlama yarımı ile değiştirilir. Bu bağlama Lipozomun yüzeyinde üniform bir protein topoloji zorlar, (nitrilotriasetik asit His-etiketli proteinleri (NTA (Ni2 +)) tarafından koordine Ni 2+) bir ankraj grubu ile etkileşime girer. bütünsel zar proteini, mitokondriyal Fizyon Faktörü (mff) ile Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) arasındaki etkileşim, inve olarak, burada bir örnek sunulmuşturBu yapı iskelesi lipozom yöntemiyle stigated. Bu çalışmada, verimli bir şekilde GTPaz aktivitesi stimüle lipozom yüzeyine çözünebilir Drp1 işe mff yeteneğini göstermiştir. Ayrıca, Drp1 belirli lipid mevcudiyetinde mff dekore edilmiş lipit şablonu tubulate edebildi. Bu örnek, yapısal ve işlevsel tahliller kullanılarak iskele lipozomlar etkinliğini göstermektedir ve Drp1 aktivitesinin düzenlenmesinde mff rolü vurgulamaktadır.
Introduction
Zara yakın protein-protein etkileşimlerini incelemek bağlı 1 dahil bütün zar proteinlerinin doğal ortamından yansıtan zorluk zorlu bir çalışmadır. Bu deterjan, çözündürme gerekliliği ve proteoliposomes protein tutarsız yönlendirmesine bağlıdır. Bu sorunları önlemek için amacıyla, bütün zar proteinlerinin çözünür etki His-Tag füzyon proteinleri olarak ifade edilmiştir, burada bir strateji bulunmaktadır ve bu bu çözünür fragmanları lipid de NTA (Ni2 +) ana grupları ile etkileşimler yoluyla iskele lipozomlara tutturulmuş yüzey. Bu iskeleler kullanılarak, lipid yakın protein etkileşimleri, lipid ve protein bileşimlerinin bir aralığı üzerinde araştırılabilir.
Biz etkili bu pr modüle lipit etkileşimleri mitokondriyal fisyon kompleksinin montajını yöneten kritik protein-protein etkileşimleri araştırmak ve incelemek için bu yöntemi uyguladıkkapsayabilecektir 2. Mitokondriyal parçalanma sırasında Dynamin-ilişkili protein 1 (Drp1) 3 adı verilen bir korunmuş membran yeniden modelleme proteini, enerji homeostazı, apoptotik sinyali ve diğer birçok düzenleyen hücresel sinyallere yanıt olarak dış mitokondriyal zarın (OMM) yüzeyi için görevlendirilir İntegral mitokondrial süreçler. 8 - Bu büyük, sitozolik GTPaz ayrılmaz OMM proteinleri 4 etkileşim yoluyla mitokondri yüzeyine işe alınır. Bu tür bir protein rolü Mitokondrial Fizyon Faktörü (mff), in vitro olarak Drp1 ile belirgin bir zayıf etkileşim aydınlatmak için zor olmuştur. Bununla birlikte, genetik çalışmalar net bir şekilde mff başarılı bir mitokondriyal fisyon 7,8 için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu yazıda anlatılan yöntem Drp1-MFF etkileşimleri teşvik eşzamanlı lipit etkileşimleri tanıtarak önceki eksikliklerin üstesinden gelmek başardı. Genel olarak, bu yeni tahlil reveamitokondriyal fisyon kompleksinin montajını rehberlik temel etkileşimleri açtı ve bu temel moleküler makinenin devam eden yapısal ve işlevsel çalışmalar için yeni bir aşama sağladı.
Bugüne kadar, Drp1 ve mff arasındaki etkileşimlerin incelenmesi mff 9, esneklikleri ile komplike olan, Drp1 heterojenitesi 2,10 polimerler, ve zorluk arındırıcı ve sağlam bir transmembran alanı 11, tam uzunlukta mff yeniden yapılandırmak. Biz onun transmembran (MffΔTM-His 6) eksik His-etiketli MFF sulandırmak için NTA (Ni 2+) iskele lipozomlar kullanarak bu zorlukların ele. E aşırı ifade edildiğinde MffΔTM derece çözünür olduğunu, bu strateji, avantajlı olmuştur. E. coli ve bu izole protein kolayca iskele lipozomlar üzerinde yeniden çözüldü. Bu lipit şablonlarına gergin olduğunda, MFF membran yüzeyinde aynı, dışa bakan yönünü üstlendi.Bu avantajlar, örneğin kardiyolipin gibi mitokondriyal lipidler, ek olarak, membran 11 mff katlama ve sağlam bir yapıya eklenmiştir. Kardiyolipin de bu bozukluğu bölge stabilize etmek ve fisyon makine aksamını kolaylaştırabilir Drp1 2,12 değişken alanı ile etkileşime girer.
Bu sağlam yöntem zara yakın protein etkileşimlerini değerlendirmek istiyoruz gelecek çalışmalar için yaygın olarak uygulanabilir. Ek bağlantısı / afinite etkileşimler kullanımı sayesinde, bu membran yeniden oluşturma çalışmaları sofistike hücreleri içinde membran yüzeyinde bulunan ek karmaşıklık taklit etmek için arttırılabilir. Aynı zamanda, lipid bileşimleri, daha doğru bir şekilde, bu makromoleküler kompleksler doğal ortamları taklit etmek için modifiye edilebilir. Özet olarak, bu yöntem, kritik hücresel proc sırasında membran morfolojileri şekillendirmede göre proteinlerin katkı ve lipidler incelemek için bir araç sağlaresses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İskele Liposome Hazırlık
Not: İdeal olarak, bu ilk uygulamalar DOPC (1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin veya PC) DGS-NTA (Ni2 +) (1,2-dioleoil oluşan nispeten basit ve idi iskelesi (kullanmalıdır - sn -glisero-3 - [(N - (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) sukkinil]. (nikel tuzu)) Yapı bu deneylerin rahatsız lipid yük, esneklik ve eğrilik tek tek faktörler olarak dahil edilebilir potansiyeli olan zara yakın etkileşimlerini değiştirmek. Bu değişiklikler, fosfatidilserin veya kardiyolipin (CL), fosfatidiletanolamin (DOPE veya PE) veya galaktosil (β) seramid gibi özel lipit bileşenlerin, belirlenen miktarda eklenmesi ile elde edilebilir.
- Temiz bir cam test tüpünde kloroform içinde çözündürülmüş olan lipitler birleştirin. ince bir lipid film meydana getirmek üzere tüp dönerken kuru azot gazı ile çözücü buharlaşır. Bir centrifuga olan, kalan solventin çıkması37 ° C'de 1 saat l evaporatör.
NOT: Çeşitli lipozom formülasyonları protokollerde kullanılmaktadır aşağıda açıklanan: iskele lipozomlar (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96.7 mol% DOPC), kardiyolipine ile iskele lipozomlar (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% 'si kardiyolipin / 86.7 mol% DOPC), kardiyolipin esnek iskele lipozomlar (3.3 mol%' si DGS-NTA (Ni2 +) /% 10 mol kardiyolipin / 35 mol% 'si DOPE / 51.7 mol% DOPC) ve zenginleştirilmiş bir iskele lipozomlar (% 10 mol DGS-NTA (Ni2 +) / 35 mol% 'si DOPE / 40 mol%' si DOPC / 15 mol% 'si kardiyolipin). - 37 ° C'ye ön-ısıtılmış, Tampon A (25 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit), KOH ile 7.5 değerine ayarlandı, 150 mM KCI, pH) ilave nihai lipid konsantrasyonu 1 olacak şekilde - 2 mM arasındadır. Tam lipid karışımı (Şekil 1a) tekrar süspansiyon arada sırada burgaç gibi karıştırılarak 37 ° C'de 30 dakika kuluçkalayın.
- tamamen donmuş (Roug kadar sıvı azot tüpü, plastik bir test tüpüne transfer koyunhly 30 s), ve tam çözülmüş (yaklaşık 1 oluncaya kadar 37 ° C su banyosu içinde yer - 2 dakika). 4 dondurma-çözme döngüsü (Şekil 1b) bir toplam tekrar edin.
- 4 filtre destekleri ve tampon maddesi içinde bir polikarbonat filtresi ıslatma ve üretici talimatlarına göre ekstruder araya getirilmesiyle, bir lipid ekstruder hazırlayın. filtre üzerinden 21 kez lipid çözeltisi a'ya. Homojen bir boyut dağılımına (Şekil 1c) sağlamak için yumuşak, sabit basınç kullanın.
NOT: Bu protokol açıklanan Bütün deneyler için, bir 1.0 um polikarbonat filtre ekstrüzyon için kullanılmıştır. Anyonik lipidler ile Drp1 etkileşimi 50 nm ile 400 nm arasında, 12 ya da daha büyük 13 arasında lipozom çaplarının çeşitli gözlenebilir. Bu nedenle, 1 um'lik filtre boyutu her iki GTPaz aktivitesi ve elektron mikroskopisi için ideal olarak seçilmiştir. Diğer lipozom çapları istenirse, dev tek lamelli vesiküller 14,15 (GUVs) ya da küçük unilamell hazırlanmasıar kullanılabilir 16 (SUV) vezikülleri. Dinamik ışık saçılım lipozom boyutu heterojen 13 değerlendirmek için de kullanılabilir. - 4 ° C'de haddelenmiş lipozomlar saklayın ve 3 sonra atın - 5 d.
Protein Bağlanma Analizi İskele Lipozomlar 2. Kullanım
- Örnek hazırlama
- En az 15 dakika boyunca, skafold lipozomlar (50 uM son% 40 mol PC / 35 mol% 'si PE / 15 mol%' si CL /% 10 mol DGS-NTA (Ni2 +)) (5 uM nihai) MffΔTM His ile etiketlenmiş inkübe Tampon A + BME'de oda sıcaklığında (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-merkaptoetanol (BME), pH, KOH ile 7.5 değerine ayarlanır). Bir mff içermeyen kontrol için, NTA (Ni2 +) maruz kalan bir His-etiketli kontrol bağlamak için (GFP gibi) protein ve kalkan lipozomlar inkübe edin.
Not: Önceki bir çalışmada 2'de tarif edildiği gibi MffΔTM ifade edildi ve saflaştınldı. GFP benzer şekilde saflaştırılmıştır fakat iyon değişim aşaması çıkartılmıştır. BME, bu experimen için gerekli olants Drp1 faaliyet ve montaj özelliklerini değiştirebilir oksidasyona karşı duyarlı olduğu için. - Drp1 (son 2 uM) ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir.
Not: Önceki bir çalışmada 2'de tarif edildiği gibi Drp1 ifade edildi ve saflaştınldı. Drp1 ile kuluçkalamadan sonra, membran deformasyon bağlayıcı nükleotid etkisi 2 ile mM MgCI2 ve 1 ya mM GTP, 1 mM GMP-PCP veya Tampon A + BME, bir saat daha inkübe ederek araştırılabilir.
- En az 15 dakika boyunca, skafold lipozomlar (50 uM son% 40 mol PC / 35 mol% 'si PE / 15 mol%' si CL /% 10 mol DGS-NTA (Ni2 +)) (5 uM nihai) MffΔTM His ile etiketlenmiş inkübe Tampon A + BME'de oda sıcaklığında (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-merkaptoetanol (BME), pH, KOH ile 7.5 değerine ayarlanır). Bir mff içermeyen kontrol için, NTA (Ni2 +) maruz kalan bir His-etiketli kontrol bağlamak için (GFP gibi) protein ve kalkan lipozomlar inkübe edin.
- Negatif Leke Transmisyon Elektron Mikroskobu (EM) Analizler
- Aktarım 5 laboratuar film tabakaya örnek ul ve örnek bir karbon ile kaplanmış Cu / Rh Düzeneği. , Örnek üzerinde ızgara 1 dakika inkübe filtre kağıdı üzerinde aşırı sıvı leke ve% 2 uranil asetat bir damla transfer. 1 dakika kuluçkalayın filtre kağıdı üzerinde aşırı leke leke ve bir ızgara kutusuna aktarılır. Vakum O / N altında saklayın tam kuruma sağlamak.
- Bir transmisyon elektron Microsc kullanarak görüntü örnekleri18.500 at ope - 30,000X büyütme protein ve lipozom morfolojileri 17 ultrastrüktürel değişiklikleri gözlemek için.
Not: ultrastrüktürel değişiklikler, ImageJ 13 gibi, görüntü analizi yazılımı kullanılarak belirlenebilir (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein dekorasyon çıplak lipit şablonları ile karşılaştırıldığında ölçülebilir. Buna ek olarak, boru biçimli bölümlerin çapları düzenekleri 13 en dış kısmından ölçülebilir. Daha detaylı analiz cryo-elektron mikroskobu 17 kullanılarak yapılabilir. Bu yöntem, bu kaplama örneği, ağır metal lekeleri kullanılmadan çözücünün görüntü doğal protein-yağ derlemeler için kullanılabilir. Bu şekilde, altta yatan lipit morfolojisi değişiklikler dahil olmak üzere negatif leke, belirgin olmayan ayrıntılı yapısal özellikler, incelenir ve ölçülebilir.
Enzimatik Deneyi ilişkin yapı lipozomların 3.
Not: A Colorimetrik GTPaz tahlil 18 GTP hidrolizi yoluyla fosfat kurtuluş ölçmek için kullanılmıştır. Alternatif GTPaz deneyleri 19 mevcuttur ve gerektiğinde uygulanabilir.
- (150 uM nihai) iskele lipozomlar Tampon A + BME (hacim = 30 ul) içinde, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca birlikte His-etiketli MffΔTM (mff) Fis1ΔTM (Fis1), veya GFP (tüm 5 uM nihai) inkübe edin. Drp1 (500 nM nihai) ilave edin ve oda sıcaklığında (hacim = 80 ul) ilave bir 15 dakika kuluçkalayın.
Not: Fis1 mff 2'ye benzer şekilde saflaştırılmıştır, fakat iyon değişim kromatografisi adımı atlandı. His-etiketli GFP amacı NTA (Ni2 +) baş gruplarım korumak ve diğer proteinler ile spesifik olmayan yük etkileşimleri önlemektir. herhangi bir etki GFP yokluğunda gözlemlenen ise, o zaman bu denetim gerekmeyebilir. (Ilgilenilen proteine benzer boyutta) alternatif bloke proteinler de kullanılabilir, ancak GFP SCAF etkileşimlerin doğrudan görselleştirme sağlarlipozomlar katlayın. - Bir ısıl transfer tüpleri, 37 ° C olarak ayarlanmış ve GTP ve MgCI2 ilave reaksiyonları başlatmak (sırasıyla 1 mM, 2 mM son; hacim = 120 uL).
- İstenen zaman noktalarında (örneğin, t = 5, 10, 20, 40, 60 dakika), Mg + 2 ve kenetlenmesi reaksiyonu durdurmak için 0.5 M EDTA 5 uL ihtiva eden bir mikro-titre plaka çukurlarına reaksiyon 20 ul transfer.
- Sonuçları kalibre etmek için Tampon A + BME içinde KH 2 PO 4 sulandırarak fosfat standartlar kümesi hazırlayın. standartlar yararlı bir dizi 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 ve 0 uM'dir. 0.5 M EDTA 5 uL ihtiva eden çukurlara, her biri 20 uL ekleyin.
- Her bir oyuğa 150 ul malakit yeşil maddesi (1 mM malakit yeşili karbinol, 10 mM amonyum molibdat tetrahidrat, ve 1 N HCl) ekleyin ve OD ilave edildikten sonra 650 5 dakika okuyun.
Not: GTP kararsız asittir ve malakit yeşili maddesi varlığında hidrolize olur. Bu t sağlamakmalakit reaktifi ekleme ve okuma arasındaki o zaman tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için sabittir. - Fosfat konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak aykırı OD 650 işaretlenmesiyle standart bir eğri oluşturur. Bir numunede OD 650 ve fosfat konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi belirlemek için lineer regresyon kullanın.
- Doğrusal regresyon kullanılarak uM fosfat protein Reaksiyon numunelerin OD 650 dönüştürün. Zamanın bir fonksiyonu olarak, fosfat konsantrasyon çizilerek her reaksiyon karışımı, fosfat üretimi oranını belirlemek ve Drp1 konsantrasyonu (0.5 uM) ile hızının bölünmesiyle kedi k dönüştürmek.
NOT: Sadece ilk doğrusal oran fosfat nesil oranını belirlemek için kullanılması gerektiğini ve 3 veri noktalarının en az kullanılmalıdır. Reaksiyonun oranı, ilk üç veri noktası doğrusal değildir yeterince hızlı olması halinde bir işaret (örneğin, doğrusal bir uyum R2 az 0.9)en az 3 zaman noktaları ile ificantly kısa zaman süreci yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drp1 ve mff arasındaki etkileşim mitokondriyal reaksiyonu için önemli olduğu gösterilmiştir, ancak bu etkileşim, in vitro olarak özetlemek zor olmuştur. Amacımız daha iyi Drp1 ve MFF etkileşim burada hücresel ortamı taklit etmek oldu. Bu amaçla, lipozomlar NTA (Ni2 +) ana grupları arasında sınırlayıcı konsantrasyonlarını ihtiva eden yukarıda tarif edildiği gibi bir lipid filmi rehidre ile hazırlanmıştır. Çözeltisi (Şekil 1a) donukluk ile kanıtlandığı gibi, lipid çözeltisi ilk heterojen çap tek katmanlı ve çok katmanlı veziküller oluşur. Bu opaklık çok katmanlı veziküller sıklığını azaltır dondurup-eritme (Şekil 1b), azaltılır. Lipozom çapları daha berrak bir çözelti (Şekil 1c) ile sonuçlanan bir polikarbonat filtreden ekstrüzyon ile homojenize edilir.
2 istihdam edildiğinde membran tubulation gözlenmiştir bulundu. Bu bulgulara dayanarak, biz bir polimerik Drp1-MFF sıralı derleme membran deformasyon uyaran karmaşık yetenekli teşvik PC, PE, Ni, ve CL (denilen Zenginleştirilmiş İskele Liposomes veya ESL) oluşan yeni bir şablon kullanılmaktadır. Bu uygulama için özel olarak, NTA (Ni2 +) artarak kardiyolipin lipidler (sırasıyla% 10 mol ve% 15 mol) kullanıldı. Daha sonra, bir GFP veya mff Drp1 (Şekil 2) varlığında ve yokluğunda ESL şablonları bağlıydı ve membranlar yeni model Drp1 kabiliyeti nitel değerlendirildi. Drp1 yokluğunda, mff de GFP de (Şekil 3a, b), ve benzer şekilde GFP edilmiş ESL durumunda, sadece özelliksiz lipozomlar gözlenmiştir (Şekil 3c) membran deformasyon ile sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, ne DRP1 mff dekore ESL şablonları eklendi, lipozomların yeniden şekillenme belirgin (Şekil 3D) idi.
makromoleküler kompleks oluşumu açıkça Drp1 ve MFF arasında bir etkileşim gösterir iken, bu nitel analiz tek başına böyle bir etkileşimin fonksiyonel etkilerinin belirlenmesi aciz. Bu nedenle, mff ile etkileşimine yanıt olarak Drp1 katalitik aktivitesinde değişikliklerin değerlendirilmesi için malakit yeşili fosfat üretimi deneyi 18 kullanılmaktadır. Daha önce 2 açıklandığı gibi, başlangıçta basit bir iskele lipozom (SL 3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+), 96.7 mol% DOPC) kullanılan yalnız Drp1 yapısı ve fonksiyonu üzerine MFF etkisini araştırmak. Ile Drp1 arasında spesifik olmayan etkileşimleri NTA (Ni2 +) SL ilk Dr spesifik olmayan aktivitesi uyarılmasını önlemek için NTA (Ni2 +) düşük konsantrasyonlarını ihtiva şekilde tasarlanmıştır, böylece daha önce, 20 tarif edilmiştirp1. ESL NTA (Ni2 +) daha büyük miktarları ile, bir kontrol olarak His-etiketli GFP kullanımı Ni2 + kalkan ve spesifik olmayan Drp1 etkileşimleri önlemek için önemli olduğu tespit edildi. Mff veya GFP (Şekil 2'de gösterildiği gibi) ile SL lipozomlar dekorasyon sonra, otomatik montaj ölçüde Drp1 ve GTPaz aktivitesi ölçülerek değerlendirilebilir. Lipozomların yokluğunda, Drp1 hafif SL eklenmesi ile arttırılır nispeten düşük taban GTPaz aktivitesi vardır. MFF bu iskele lipozom Dekorasyon (Şekil 4a, 1,8 kat) GTPaz aktivitesini artırmıştır. Maruz kalan NTA (Ni2 +) ana gruplar His ile etiketlenmiş GFP ile bloke edildi tersine, bu artmış GTPaz aktivitesi ablasyon. Bu son yıllarda yapılan çalışmalarda 7,23 meydan olmasına rağmen biz de Fis1, mitokondriyal fisyon 21,22 bir rol oynadığı ileri sürülmüştür bir OMM proteinin rolünü test etti. Fis1 gerilmesi olan transmembran alanından yoksunSL da Drp1 en GTPaz aktivitesi (Şekil 4a) bir uyarım ortaya çıkarmada başarısız.
Drp1 ve MFF etkileşiminde bu mitokondriyal lipid rolünü belirlemek için: Biz o zaman kardiyolipin küçük bir miktar (% 10 mol kardiyolipin DOPC yerine SL SL / CL) içeren biraz daha karmaşık bir lipit iskelesi kullanılmaktadır. Daha önce tarif edildiği gibi, 10 kardiyolipin Bu makul bir konsantrasyon özellikle kardiyolipin göre Drp1 uyarılmasını sınırlamak için seçildi. SL benzer şekilde, Drp1 SL / CL eklenmesi lipozomlara His ile etiketlenmiş Fis1 veya GFP hayvan zinciri ile tersine dönmüştür GTPaz aktivitesi hafif bir uyarıcı ile sonuçlanmıştır. Mff ve kardiyolipin arasında bir sinerji bu mff dekore SL / CL (Şekil 4B) ile kuluçkaya zaman Drp1 bölgesinin GTPaz aktivitesi 2.6 kat uyarıldığı gözlenmiştir.
Membran akışkanlığı ve yeteneği of Drp1 lipit bilayers onun GTPaz aktivitesini arttırdığı ileri sürülmüştür pişmanlık. Bu nedenle, biz esnek bir iskele lipozom kullanarak membran akışkanlığı / esneklik etkisini incelemek için çalıştı. Bu DOPE ile / Cl SL DOPC 35 mol% değiştirilmesiyle elde edilmiştir (SL / PE / CL) daha önce Drp1 aracılığında zar 10 biçimlenme izin vermek için gösterilmiştir. Drp1 için bezemesiz SL / PE / CL iskele lipozomlar eklenmesi biraz Drp1 GTPaz aktivitesini arttırır, ve GFP ile bu lipozomlar dekorasyonu bu etkisini ortadan kaldırır. SL / PE / CL şablonları MFF ile dekore edildiğinde, Drp1 aktivitesi (Şekil 4c, 2.4 kat) geliştirilmiştir. Daha önce gösterildiği gibi, lipit tübüllerine lipozomlar yeni model Drp1 kabiliyeti iskele lipozomlara PE'nin eklenmesiyle geliştirilmiştir. İlginç bir şekilde, sarmal bir Drp1 polimerin oluşumuna yol açan bu geliştirilmiş tubulation Drp1 yeni model mümkün olduğu lipozomlara göre bir yüksek uyarım ile sonuçlanmamıştır Bu adapte lipit şablonları kullanılarak, mff ve Drp1 in vitro daha doğal bir ortamda etkileşim bulunmuştur. Bu teknik (NTA ile (Ni 2+) konsantrasyonu) Drp1, MFF ve bu makromoleküler kompleks montajını düzenleyen çıktı spesifik lipitlerin (özellikle kardiyolipine ve PE) göreceli bolluk kontrol sağladı. gösterdiğimiz gibi, bu yöntem, elektron mikroskobu ile mff-işe Drp1 membran biçimlenme görselleştirmek ve GTPaz aktivitesi tahlili kullanılarak katalitik aktivitesi üzerindeki Drp1 tertibatının etkilerini belirlemek için kullanılabilir. 71fig4.jpg "/> 
Şekil 1: Lipid Hazırlık şematik. (A) yeniden süspansiyon halinde, çeşitli boyutlarda lipozomlar oluşturur ve tek katmanlı ve multilamel oluşmaktadıropak çözeltisi (ek) ile sonuçlanır lar veziküller. (B) Donma-çözülme hala çapı heterojen lipozomlar, bir daha tek katmanlı popülasyonda çözüm sonuçlarını. Freeze-çözülme çözümü (ilave) açıklar. Lipid çözeltisi (c) Ekstrüzyon lipozom çapı (bu örnekte 1.0 um) homojenize ve berrak bir çözelti (ek) ile sonuçlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2: Yöntem Protein düzeneğini değerlendirin. iskele lipozomlar üzerinde şematik tasvir ortağı protein montaj sunulmuştur. Ortak protein veya GFP His-etiketli iskele lipozomlar ile inkübe edilir ve daha sonra Drp1 edilmiş ya undecorated lipo ile kuluçkalanır somes. Bu Drp1-önceden monte lipozomlar daha sonra yapısal yöntemler (elektron mikroskobu) ve fonksiyonel deneylerde (GTPaz deneyi) ile analiz edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 3: Drp1 İşe Alım Yapısal Değerlendirilmesi. GFP veya mff negatif leke iletim mikrograflan (sırasıyla, C, D) (sırasıyla A, B), tek başına lipozomlar edilmiş ya Drp1 inkübe edildi. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: İskele Lipozom Enzimatik Deneyi. (A - C) zamanla fosfat üretimi ölçülür (ek) ve k kedi belirlendi edildi. Bu yöntem, SL-gergin proteinler (A), SL / CL-gergin proteinlerinin (B) veya SL / PE / CL-gergin proteinler (C) uygulanmıştır. #: P <0.05, *: p <0.0001, **: eşleşmemiş öğrencinin T-testi ile belirlenen p <0.000001. Tüm hata çubukları 3 bağımsız örneklem standart sapmasını temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, yekpare zar proteinleri içeren, protein-protein etkileşimlerinin araştırılması için bir yöntem sunmaktadır. modüler lipozom iskele kullanarak, araştırmacılar lipid yakın bir ortamda bir veya daha fazla protein aktivitesini değerlendirmek yeteneğine sahiptirler. 26 - Daha önce yapılan çalışmalar, plazma zarının 24 reseptör enzim için de benzer bir yöntem gösterilmiştir. Biz lipit kofaktör birleştirmek ve mitokondriyal fisyon makine mechanoenzymatic çekirdeğini oluşturan proteinler arasındaki etkileşimleri keşfetmek için bu yöntemi genişlettik.
Yukarıda sunulan model sistem için, MFF dekore SL Drp1 kendini montaj geliştirilmiş bulundu. Ayrıca, şu anda mff dekore ESL şablonları etkin uzatılmış boru şekilli yapıları oluşturmak için doğal tipte Drp1 tarafından yenilenmiş edildi göstermektedir. Biz de negatif yüklü kardiyolipine ve konik lipit PE dahil olmak üzere çeşitli mitokondriyal lipitlerin rolleri, değerlendirilir.PE tarafından kazandırılan membran esneklik ve akışkanlık membran tubulation artırır ama daha fazla uyarılması MFF kaynaklı çoğaltmak değil iken kardiyolipin, daha Drp1 kendini montaj geliştirmek için MFF ile sinerji içinde.
Membran morfolojileri ultrastrüktürel değişiklikleri değerlendirmek için, EM gerekli analizleri. Drp1 GTPaz aktivitesi kümeleme ve herhangi bir büyük ölçüde 2 lipozomlar yeniden şekillendirmek değil ipliksi polimerlerin montaj yoluyla artmıştı. Daha fazla mitokondri benzeri SL / PE / CL şablon kullanıldığı Ancak, membran deformasyon gözlenmiştir. İlginç bir şekilde, enzim aktivitesi gelişmedi. Bu nedenle, EM çalışmaları aksi fonksiyonel testi kullanılarak cevapsız olurdu kilit farklılıkların belirlenmesi gerekli idi.
Bu teknik, fonksiyonu ve çözülebilir proteinler ve çözünür protein etkileşimiyle keşfetmek için güçlü ise de, bu lipit iskeleleri transmembran alan rolü için hesap edemezs. Lipit bilayers 30 - transmembran alanı gibi öz-montaj 27 ve yanal difüzyon 28 gibi dinamik protein süreçleri etkileyecek, çünkü bu önemli bir husustur. Bu faktörler, membran yüzeyinde protein etkileşimlerini değerlendirmek için kritik ise, bir deterjan ile daha sonra geleneksel bir lipit yeniden oluşum deneyleri, tercih edilebilir. Alternatif bariyerler de zar demirlemiş proteinlerin işe ve hareketliliğini kontrol etmek için keşfedilmeyi olabilir.
NTA (Ni2 +) lipit çapa, örneğin biyotin-konjuge 31 ya da reaktif grup konjüge lipidler gibi bariyerler kullanılabilir ile His ile etiketlenmiş proteinleri kullanarak ek olarak. Bu kovalent modifikasyonlar daha stabil tuzak lipit yüzeyinde proteinler, ancak hareketlilik ve bu faktörlerin değişimi olasılıkla azalmış olacaktır olacaktır. Bu nedenle, urgan dikkatle çalışılan protein komplekslerinin bağlamında ele alınmalıdır. ne zaman düşünüldüğüBu yöntemin kullanımını halka, lipit şablonları proteinleri cepheye modu belirli testlerin etkileme potansiyeline sahiptir. Örneğin, NTA (Ni2 +) yöntemine His-tag bağlantısı özellikle geçici protein-protein etkileşimlerinin durumunda, in situ tahlilleri yerine ayırma deneyleri için daha uygun olabilir. Bu açıkça yerinde olumsuz leke elektron mikroskobu ve sedimantasyon tahlil arasındaki ayrışmaya bağlı olarak Şekil 3'te gösterilmiştir.
Gelecekte, iki ya da farklı hedef ana grupları bu bağlantı lipidlerin daha fazlasının bir kombinasyonu tek bir lipit bağlama ipi için rekabet etmeden bir iskele şablonuna birden fazla protein alımı sağlamak için uygulanabilir. Ayrıca, her bir bileşenin görece bolluğu lipit bileşimi değiştirilerek kontrol edilebilir. Bu tür fosfoinositidlerde kardiyolipine ve fosfatidilserin gibi ek lipit kofaktörler, kolaylıkla sokulabilirBu şablonlar çeşitli faktörlere izole etkisini değerlendirmek için.
Genel olarak, bu lipid iskeleleri lipid zarlar yakın kompleks protein etkileşimleri araştırmak için yeni bir platformu temsil etmektedir. Bu şablonlar kolaylıkla üretilen ve enzimatik tahliller, elektron mikroskobu, veya floresan görüntüleme de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar, bir dizi uyarlamak için basittir. Buna ek olarak, lipit kompozisyonu daha bu özel bölgelerde protein işlevi özetlemek için, ilgili bir organel ya da zar mikro bölgesine benzer şekilde formüle edilebilir. Bu teknikler kullanılarak, biyokimyacı eşleri ve çevreleri ile membranın bağlı ve membran ilişkili proteinlerin karmaşık etkileşimleri soruşturma olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
