Abstract
インビトロでの内在性膜タンパク質の研究は、しばしば、疎水性膜貫通ドメインの存在によって複雑になります。さらに、これらの研究を複雑に、リポソームへの界面活性剤で可溶化膜タンパク質の再取り込みは、タンパク質のトポロジーが強制することは不可能である確率過程です。本稿では、リポソームベースの足場を利用し、これらの困難な技術に代わる方法を提供しています。タンパク質の溶解度は、膜貫通ドメインの欠失によって増強され、そしてこれらのアミノ酸は、Hisタグのように、つなぎ部分で置換されています。このテザーはアンカー基ニッケル（Ni 2+ Hisタグタンパク質についてニトリロ三酢酸（NTAニッケル（Ni 2+））によって調整）、リポソームの表面に均一なタンパク質のトポロジーを強制すると相互作用します。内在性膜タンパク質、ミトコンドリア分裂因子（MFF）とダイナミン関連タンパク質1（DRP1）の間の相互作用は、inveだった例が提示されますこの足場のリポソーム法を用いstigated。本研究では、効率的にそのGTPase活性を刺激したリポソームの表面に可溶性DRP1を募集するMFFの能力を実証しています。また、DRP1は、特定の脂質の存在下でMFF装飾脂質テンプレートをチューブ状にすることができました。この例では、構造的および機能的アッセイを用いて足場リポソームの有効性を実証し、DRP1活性の調節におけるMFFの役割を強調しています。
Introduction
膜近位のタンパク質-タンパク質相互作用を研究することにより、1関わる内在性膜タンパク質のネイティブ環境を反復するのが困難に挑戦し努力です。これは、界面活性剤可溶化およびプロテオリポソーム中のタンパク質の矛盾した姿勢の必要性に起因しています。これらの問題を回避するために、我々は、内在性膜タンパク質の可溶性ドメインは、Hisタグ融合タンパク質として発現させる戦略を採用しており、これらの可溶性断片は、脂質でNTAニッケル（Ni 2+）頭部基との相互作用を介して足場リポソームに固定されています表面。これらの足場を使用して、脂質近位タンパク質相互作用は、脂質およびタンパク質組成の範囲にわたって調べることができます。
我々は、ミトコンドリア分裂複合体のアセンブリを管理する重要なタンパク質 - タンパク質相互作用を調査し、このPRを調節する脂質との相互作用を調べるために、この方法を有効に適用していますocess 2。ミトコンドリア分裂の間、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）3と呼ばれる保存された膜のリモデリングタンパク質は、エネルギー恒常性、アポトーシスシグナル伝達、およびその他のいくつかを調節する細胞シグナルに応答してミトコンドリア外膜（OMM）の表面に補充され一体的なミトコンドリアのプロセス。 8 -この大規模な、細胞質ゾルのGTPアーゼは、一体のOMMタンパク質4との相互作用を介してミトコンドリアの表面に補充されます。そのようなタンパク質の役割、ミトコンドリア分裂因子（MFF）は、原因in vitroで DRP1と明らか弱い相互作用に解明することは困難でした。それにもかかわらず、遺伝学的研究は、MFFが成功したミトコンドリア分裂7,8に必須であることを実証しました。本稿に記載される方法は、DRP1、MFFの相互作用を促進し、同時に脂質相互作用を導入することによって、以前の欠点を克服することができました。全体的に、この新規アッセイreveaミトコンドリア分裂複合体の構築を導く基本的な相互作用を導き、この本質的な分子機械の継続的な構造的および機能的研究のための新たなステージを提供します。
現在までに、DRP1とMFFの間の相互作用の検討はMFF 9、DRP1ポリマー2,10、および精製することが困難と無傷の膜貫通ドメイン11と、全長MFFを再構成するの異質性の固有の柔軟性によって複雑にされています。私たちは、その膜貫通ドメイン（MffΔTM-彼の6）を欠いているHisタグMFFを再構成するNTA（ニッケル2+）足場リポソームを用いて、これらの課題に対処しました。 Eにおいて過剰発現された場合MffΔTMは非常に可溶であったため、この戦略が有利でした。大腸菌 、この単離されたタンパク質は、簡単に足場リポソームに再構成しました。これらの脂質のテンプレートに繋留すると、MFFは、膜の表面上の同一の、外向きの方向性を仮定しました。これらの利点に加えて、カルジオリピンのようなミトコンドリアの脂質は、膜11とMFFの折り畳みおよび会合を安定化させるために添加しました。カルジオリピンはまた、この無秩序地域を安定させ、核分裂機械の組み立てを容易にすることができるDRP1 2,12の可変ドメインと相互作用します。
このロバストな方法は、膜近位タンパク質相互作用を評価するために求める将来の研究のために広く適用可能です。追加のテザリング/親和性相互作用を使用することにより、これらの膜の再構成の研究の高度化は、細胞内の膜の表面で見出される付加的な複雑性を模倣するように拡張することができます。これと同時に、脂質組成物は、より正確に、これらの巨大分子複合体のネイティブ環境を模倣するように改変することができます。要約すると、この方法は、重要な細胞PROC中に膜形態を形成する上でのタンパク質及び脂質の相対的な寄与を検討するための手段を提供しますesses。
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Protocol
1.足場リポソームの調製
注：理想的には、最初の実験は、比較的シンプルで特徴足場を使用する必要があります（DOPC（1,2- dioleoyl- のsn -glycero-3ホスホコリンまたはPC）およびDGS-NTA（ニッケル2 +）（1,2-ジオレオイルで構成される- SN -glycero -3 - [（N - （5-アミノ-1-カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル]（ニッケル塩））建物これらの実験のオフ、脂質電荷、柔軟性、及び曲率は、個々の要素として導入することができます膜近位の相互作用を変化させる可能性を有する。これらの変化は、ホスファチジルセリンまたはカルジオリピン（CL）、ホスファチジルエタノールアミン（DOPEまたはPE）、又はガラクトシル（β）、セラミドを含む特定の脂質成分の規定量を添加することによって達成することができます。
- きれいなガラス試験管にクロロホルムに溶解した脂質を組み合わせます。薄い脂質フィルムを形成するためにチューブを回転させながら乾燥窒素ガスで溶媒を蒸発させます。 centrifugaで残留溶媒を除去37℃で1時間リットル蒸発器。
注：様々なリポソーム製剤は、以下に記載されたプロトコルで使用されている：足場リポソーム（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2 +）/ 96.7モル％DOPC）、カルジオリピン（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2+）との足場リポソーム/ 10モル％のカルジオリピン/ 86.7モル％DOPC）、カルジオリピンとの柔軟な足場リポソーム（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2 +）/ 10モル％のカルジオリピン/ 35モル％のDOPE / 51.7モル％DOPC）、および濃縮された足場リポソーム（10モル％DGS-NTAニッケル（Ni 2+）/ 35モル％DOPE / 40モル％のDOPC / 15モル％のカルジオリピン）。 - 37℃に予熱し、緩衝液A（25mMのHEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、KOHで7.5に調整し、150mMの塩化カリウム、pH値）を追加し、最終脂質濃度が1であるよう - 2 mmです。完全に脂質混合物（ 図1a）を再懸濁し、時々ボルテックスしながら37℃で30分間インキュベートします。
- 完全に凍結（rougまで液体窒素中でチューブを、プラスチック試験管に移す配置HLY 30秒）、37℃の水浴に入れ、完全に解凍するまで（およそ1 - 2分）。 4凍結融解サイクル（ 図1b）の合計に対して、この手順を繰り返します。
- 4フィルタ支持体およびバッファ内のポリカーボネートフィルターを浸漬し、製造業者の指示に従って押出機を組み立てることによって脂質押出機を準備します。フィルターを通して21回脂質溶液を押し出します。均質なサイズ分布（ 図1c）を確保するために、穏やかに、一定の圧力を使用してください。
注：このプロトコールに記載されているすべての実験について、1.0μmのポリカーボネートフィルター押出のために使用しました。アニオン性脂質とDRP1の相互作用は、50ナノメートルから400ナノメートル12以上13までの範囲のリポソーム直径の様々な観察することができます。したがって、1μmのフィルタサイズは、両方のGTPアーゼ活性および電子顕微鏡法のために理想的であるように選択しました。他のリポソームの直径が所望される場合には、巨大な単層小胞14,15（GUVs）の調製または小unilamellARベシクル16（SUV車）を用いることができます。動的光散乱は、リポソームサイズの異質13を評価することができます。 - 4℃で押し出されたリポソームを格納し、3の後に捨てる - 5日間。
タンパク質結合分析のための足場リポソームの2.
- 試料調製
- 足場リポソームとHisタグMffΔTM（最終5μM）をインキュベート（40モル％のPC / 35モル％PE / 15モル％CL / 10モル％DGS-NTA（ニッケル2+）;最終50μM）は、少なくとも15分間緩衝液A + BMEにおけるRT（25mMのHEPES、150mMの塩化カリウム、10mMのβメルカプトエタノール（BME）、pHはKOHで7.5に調整）で。 MFF無制御のために、結合してシールドする（GFPなど）のhisタグ付き対照タンパク質を有するリポソームをインキュベートNTAニッケル（Ni 2+）が露出。
注：以前の研究2で説明したようにMffΔTMを発現および精製しました。 GFPは、同様の方法で精製したが、イオン交換工程を省略しました。 BMEは、これらのexperimenために必要でしたTS DRP1は、その活性およびアセンブリ特性を変化させることができる酸化に敏感に反応するためです。 - DRP1（2μM最終）を追加し、室温で1時間インキュベートします。
注：以前の研究2で説明したようにDRP1を発現および精製しました。 DRP1とのインキュベーション後、膜の変形に結合ヌクレオチドの効果は、2のMgCl 2および1mM GTP、1mMのGMP-PCP、または緩衝液A + BMEのいずれかでさらに1時間インキュベートすることにより調べることができます。
- 足場リポソームとHisタグMffΔTM（最終5μM）をインキュベート（40モル％のPC / 35モル％PE / 15モル％CL / 10モル％DGS-NTA（ニッケル2+）;最終50μM）は、少なくとも15分間緩衝液A + BMEにおけるRT（25mMのHEPES、150mMの塩化カリウム、10mMのβメルカプトエタノール（BME）、pHはKOHで7.5に調整）で。 MFF無制御のために、結合してシールドする（GFPなど）のhisタグ付き対照タンパク質を有するリポソームをインキュベートNTAニッケル（Ni 2+）が露出。
- ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（EM）分析
- 実験用フィルムのシートへの転写サンプルの5μLを、サンプル上に炭素被覆銅/ Rhのグリッドを置きます。サンプル上のグリッド1分間インキュベートし、濾紙上で余分な液体を離れブロット、および2％酢酸ウラニルのドロップに移します。 、1分間インキュベートし、濾紙上で余分な汚れを吸い取ると、グリッドボックスに転送します。完全な乾燥を確実にするために、真空O / Nの下に保管してください。
- 透過型電子microscを使用して画像サンプル18500でのOPE - 30,000Xの倍率は、タンパク質およびリポソームの形態17における超微細構造の変化を観察しました。
注：微細構造の変化は、ImageJの13（http://imagej.nih.gov/ij/）として、画像解析ソフトウェアを用いて定量することができます。裸の脂質のテンプレートと比較してタンパク質の装飾を測定することができます。さらに、管状セグメントの直径は、アセンブリ13の最も外側の部分から測定することができます。より詳細な分析は、低温電子顕微鏡17を用いて行うことができます。この方法は、そのコートサンプルを重金属の汚れを使用せずに溶媒中に画像天然タンパク質、脂質集合体に使用することができます。このようにして、基礎となる脂質の形態の変化を含む、ネガティブ染色で明らかでない詳細な構造的特徴は、検査及び定量することができます。
酵素アッセイのための足場リポソームの3.
注：コロリメトリックGTPアーゼアッセイ18は、GTP加水分解を介してリン酸遊離を測定するために使用されました。代替GTPアーゼアッセイは、19入手可能であり、必要に応じて実施することができます。
- 緩衝液A + BME（ボリューム= 30μL）中、室温で15分間足場リポソーム（最終150μM）でHis標識MffΔTM（MFF）、Fis1ΔTM（Fis1）、またはGFP（すべての最終的な5μM）をインキュベートします。 DRP1（最終500 nM）を追加し、RT（体積= 80μL）でさらに15分間インキュベートします。
注：Fis1はMFF 2と同様に精製したが、イオン交換クロマトグラフィー工程を省略しました。 HisタグGFPの目的は、NTA（ニッケル2+）頭部基を保護し、他のタンパク質との非特異的な電荷相互作用を防止することです。何の効果がGFPの非存在下で観察されていない場合、この制御が必要とされないかもしれません。 （目的のタンパク質に匹敵する大きさの）代替的なブロッキングタンパク質も同様に使用することができるが、GFPはSCAFとの相互作用の直接可視化を可能にしますリポソームを折ります。 - 転送37℃に設定したサーモサイクラーにチューブ、およびGTPおよびMgCl 2の添加によって反応を開始（それぞれ1から2mmの最終;体積= 120μL）。
- 所望の時点（ すなわち、T = 5、10、20、40、60分）で、マグネシウムをキレート2+と反応を停止させるために0.5 M EDTAを5μLを含むマイクロタイタープレートのウェルに反応の20μLを移します。
- 結果を校正するために緩衝液A + BMEにKH 2 PO 4を希釈することにより、リン酸標準のセットを準備します。標準の有用なセット100、80、60、40、20、10、5、0μMです。 0.5 M EDTAの5μLを含むウェルに各20μLのを追加します。
- 各ウェルにマラカイトグリーン試薬の150μL（1 mMのマラカイトグリーンカルビノール、10mMのモリブデン酸アンモニウム四水和物、および1NのHCl）を追加し、さらに後にOD 650 5分をお読みください。
注：GTPは酸に不安定であり、マラカイトグリーン試薬の存在下で加水分解する。そのトンを確認してくださいマラカイト試薬を添加し、読書の間、彼は時間が再現可能な結果を確実にするために一定です。 - リン酸濃度の関数として標準のOD 650をプロットすることにより標準曲線を生成します。サンプル中のOD 650とリン酸濃度との関係を決定するために、線形回帰を使用してください。
- 線形回帰を使用して、タンパク質の反応試料のOD 650は μMリン酸に変換します。時間の関数としてのリン酸濃度をプロットすることにより、各反応混合物のためのリン酸生成速度を決定し、DRP1濃度（0.5μM）によって速度を分割して猫を kに変換します。
注：のみ最初の線形速度は、リン酸の生成速度を決定するために使用する必要があり、そして3つのデータ点の最小値を使用しなければなりません。反応速度は、最初の3つのデータ点が線形ではないことは十分に迅速である場合（線形フィットのR 2は 0.9未満である）記号少なくとも3の時点でificantly短い時間のコースを実施すべきです。
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Representative Results
DRP1とMFFとの間の相互作用は、ミトコンドリア分裂に重要であることが実証されているが、この相互作用は、 インビトロで再現することは困難でした。私たちの目標は、より良いDRP1とMFFが相互作用前記細胞環境をエミュレートすることでした。この目的のために、NTAニッケル（Ni 2+）の限界濃度を含有するリポソームは、頭部基は、上述のように脂質膜を再水和することによって調製しました。脂質溶液は、最初に溶液（ 図1a）の不透明度によって証明されるように、不均一な直径の単層および多層小胞で構成されています。この不透明度は、多重膜小胞の有病率を減少させる凍結融解（ 図1b）、減少します。リポソームの直径は、さらに透明な溶液（ 図1c）になるポリカーボネートフィルターを通して押し出して均質化されています。
2を使用したときの膜細管が観察されたことがわかりました。これらの知見を基盤に、我々は、膜の変形を誘導する複雑なことが可能な高分子DRP1-MFFの順序付けられた集合を促進するために、PC、PE、Ni及びCL（エンリッチド足場リポソームまたはESLと呼ばれる）で構成される新しいテンプレートを利用しました。具体的には、このアプリケーションのNTAニッケル（Ni 2+）およびカルジオリピン脂質が利用された（それぞれ、10モル％、15モル％）増加しました。そして、GFPまたはMFFはDRP1（ 図2）の存在下および非存在下でのESLテンプレートに繋留し、そして膜を改造するDRP1の能力を定性的に評価しました。 DRP1の非存在下で、MFFもGFPいずれも（ 図3a、b）は 、同様にGFP装飾ESLの場合には、唯一の特徴のリポソームが観察された（ 図3c）は、膜の変形をもたらしました。しかし、DRP1はMFF装飾ESLテンプレートに追加された、リポソームの改造が明らかに（ 図3d）でした。
巨大分子複合体の形成が明らかDRP1とMFFとの間の相互作用を示しているが、この定性分析だけでは、そのような相互作用の機能的効果を決定することができません。そこで、MFFとの相互作用に応答してDRP1の触媒活性の変化を評価するために、マラカイトグリーンリン酸発生アッセイ18を利用します。 DRP1の構造と機能上だけではMFFの効果を調べるために、先に2述べたように、我々は最初は単純な足場リポソーム（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2+）、96.7モル％のDOPC SL）を利用しました。 SLは、最初NTAニッケル（Ni 2+）の低濃度を含有するように設計されたので、NTAとDRP1ニッケル（Ni 2+）の非特異的相互作用は、以前に博士の非特異的活性の刺激を避けるために、20に記載されていますP1。 ESLにおけるNTAニッケル（Ni 2+）のより大きな量で、対照としてのHis標識GFPの使用をNi 2+を遮断し、非特異的DRP1相互作用を防止するために重要であることが見出されました。 MFFまたはGFP（ 図2に示されるように）によってSLリポソームの装飾した後、自己組織化の程度は、DRP1のGTPアーゼ活性を測定することにより評価することができます。リポソームの非存在下では、DRP1はわずかSLの添加によって増強される比較的低い基礎GTPase活性を有しています。 MFF強化されたGTPアーゼ活性（ 図4a、1.8倍）で、これらの足場のリポソームの装飾。露出したNTAニッケル（Ni 2+）頭部基は、Hisタグ付きGFPでブロックしたときには逆に、この増補GTPase活性は、アブレーションされました。これは最近の研究7,23に挑戦したが、我々はまた、Fis1、ミトコンドリア分裂21,22において役割を有することが示唆されているOMMタンパク質の役割を試験しました。その膜貫通ドメインを欠くFis1のテザリングSLにもDRP1のGTPase活性（ 図4a）の刺激を誘発することができませんでした。
DRP1とMFFの相互作用で、このミトコンドリアの脂質の役割を決定するために：私たちは、その後、カルジオリピンの少量（DOPCを交換し10モル％のカルジオリピンとSL SL / CL）を含む少し複雑な脂質足場を利用しました。以前10記載されているようにカルジオリピンのこの適度な濃度は、特にカルジオリピンによってDRP1の刺激を制限するために選ばれました。 SLと同様に、DRP1にSL / CLの添加は、リポソームにHisタグFis1またはGFPを係留することによって逆転されたGTPase活性のわずかな刺激をもたらしました。 MFFとカルジオリピンとの間の相乗効果は、それがMFF-飾らSL / CL（ 図4b）とインキュベートしたときDRP1のGTPase活性が2.6倍に刺激されたように観察されました。
膜の流動性と能力O脂質二重層を改造するためのF DRP1は、GTPase活性を増強することが提案されています。そこで、柔軟な足場リポソームを用いた膜流動性/柔軟性の効果を検討しようとしました。これは、以前に10を改造DRP1媒介膜を可能にするために示されている、SL / DOPEとCL（SL / PE / CL）でDOPCの35モル％を置換することによって達成されました。 DRP1に装飾されていないSL / PE / CL足場リポソームの添加はわずかDRP1 GTPase活性を高め、GFPと、これらのリポソームの装飾は、この効果を排除します。 SL / PE / CLテンプレートがMFFで飾られたときに、DRP1活性が（ 図4c、2.4倍）に増強されました。我々が以前に示されたように、脂質細管にリポソームを改造するDRP1の能力は、足場リポソームにPEの添加によって増強されました。興味深いことに、ヘリカルDRP1ポリマーの形成をもたらす。この改善された管状体はDRP1は改造することができなかったことをリポソームと比較した場合、任意の大きな刺激にはなりませんでした これらの適応脂質テンプレートを使用して、MFF及びDRP1は、in vitroで 、より天然の環境で相互作用することが見出されました。この手法は、（NTAを通じてニッケル（Ni 2+）濃度）DRP1、MFF、この高分子複合体のアセンブリを調節するために登場し、特定の脂質（特にカルジオリピン及びPE）の相対量を制御することができました。我々は実証したように、この方法は、電子顕微鏡でMFF-動員DRP1の膜リモデリングを視覚化し、GTPアーゼ活性アッセイを使用して、触媒活性のDRP1アセンブリの効果を決定するために利用することができます。 71fig4.jpg "/> 
図1： 脂質の準備回路図。 （a）に再懸濁すると、多様なサイズのリポソームが形成し、単層とmultilamelから成り不透明な溶液（挿入図）になりLAR小胞、。 （b）の凍結融解直径はまだ不均質であるリポソーム、より多くの単層人口で溶液が得られます。凍結融解は、溶液（挿入図）を明確にしています。 （C）脂質溶液の押出は、リポソームの直径（この例では1.0μm）、透明な溶液（挿入図）で結果を均質化します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図2： 方法は、タンパク質のアセンブリを評価します 。足場リポソーム上の模式描いパートナータンパク質のアセンブリが提示されています。パートナータンパク質またはGFP Hisタグは、足場リポソームとインキュベートし、その後DRP1は、装飾されたまたは非装飾リポとインキュベートしますサムス。これらDRP1、予め組み立てられたリポソームは、次に、構造方法（電子顕微鏡）および機能アッセイ（GTPアーゼアッセイ）により分析することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図3：DRP1 募集の構造評価。 GFPまたはMFFのネガティブ染色透過型顕微鏡写真（それぞれ、C、D）（それぞれ、A、B）を単独でリポソーム装飾またはDRP1とインキュベートしました。スケールバー= 100nmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 足場リポソーム酵素アッセイ 。 （A - C）経時的なリン酸の生成は、（挿入図）を測定し、 の k catを測定しました。この方法は、SL-係留タンパク質（A）、SL / CL-係留タンパク質（B）、またはSL / PE / CL-係留タンパク質（C）に適用しました。 ＃：P <0.05、*：P <0.0001、**：P <0.000001不対スチューデントのt検定によって決定されます。すべてのエラーバーは、3つの独立したサンプルからの標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、内在性膜タンパク質を含むタンパク質 - タンパク質相互作用を調査するための方法を提供しています。モジュラーリポソーム足場を利用することにより、研究者らは、脂質近位環境内の1つ以上のタンパク質の活性を評価することが可能です。 26 -これまでの研究は、原形質膜24の受容体酵素の同様の方法を実証しました。私たちは、脂質補因子を組み込み、ミトコンドリア分裂機械のmechanoenzymaticコアを構成するタンパク質間の相互作用を調査するために、この方法を拡大してきました。
上記のモデルシステムのために、我々はMFF装飾SLはDRP1の自己組織化を増強することを見出しました。さらに、我々は今、MFF装飾ESLテンプレートを効率的に拡張された管状構造を形成するために、野生型DRP1によって改造された、ことを示しています。また、負に帯電したカルジオリピンと円錐脂質PEを含む様々なミトコンドリア脂質の役割を評価しました。PEによって付与膜の柔軟性と流動性膜管状を高めるが、さらにMFF誘発性刺激を増強しないがカルジオリピンは、さらにDRP1の自己集合を増強するためにMFFと相乗作用します。
膜の形態における超微細構造の変化を評価するために、EM解析が必要でした。 DRP1 GTPase活性は、クラスタリングと任意の大きく2リポソームの形状を変更しなかった糸状ポリマーのアセンブリを介して上昇しました。多くのミトコンドリアのようなSL / PE / CLテンプレートを使用した場合しかし、膜の変形が観察されました。興味深いことに、酵素活性が増強されませんでした。したがって、EM研究は、それ以外の機能アッセイを使用して、見逃されることになる主な違いを識別するのに不可欠でした。
この技術は、可溶性タンパク質および可溶性タンパク質ドメインの機能と相互作用を探索するために強力ですが、これらの脂質足場は、膜貫通ドメインの役割を考慮することはできません秒。脂質二重層30 -膜貫通ドメインは、自己アセンブリ27と横方向の拡散28と動的タンパク質プロセスを行うことができるので、これは重要な考慮事項です。これらの要因は、膜表面でのタンパク質間相互作用を評価するために重要である場合には、界面活性剤と、従来の脂質再構成実験は好まれるであろう。代替テザーはまた、膜アンカー型タンパク質の動員および移動性を制御するために探求することができます。
NTA（ニッケル2+）脂質アンカー、例えば、ビオチンコンジュゲート31または反応性基結合脂質などの他のテザーを利用することができるとHisタグタンパク質を使用することに加えて。これらの共有結合修飾は、より安定的にトラップ脂質表面でのタンパク質が、モビリティおよびこれらの要因の交換は可能性が減少することになるだろう。このように、テザーは、注意深く研究されたタンパク質複合体との関連で考慮されるべきです。ときconsideこの方法の使用を鳴らす、脂質テンプレートのタンパク質を係留するモードは、特定のアッセイに影響を与える可能性を有します。例えば、Hisタグは、NTAニッケル（Ni 2+）に係留方法は、特に一過性のタンパク質-タンパク質相互作用の場合には、 インサイチュアッセイではなく、分離実験においてより適切であり得ます。これは明らかにその場でネガティブ染色電子顕微鏡及び沈降アッセイの間の不一致により、図3に示されています。
将来的には、異なる標的頭部基を有するこれらのアンカーの脂質の二つ以上の組み合わせは、単一の脂質テザーの競合なし足場テンプレートに複数のタンパク質の動員を可能にするために実施することができます。また、各成分の相対量は、脂質組成を変更することによって管理することができます。そのようなホスホイノシチド、カルジオリピン、ホスファチジルセリンなどの追加の脂質補因子は、容易に導入することができますこれらのテンプレートには、様々な要因の孤立した影響を評価します。
全体的に、これらの脂質足場は、脂質膜に近い複雑なタンパク質相互作用を研究するための新規プラットフォームを表します。これらのテンプレートは、簡単に生成され、酵素アッセイ、電子顕微鏡、または蛍光イメージングなどの多様な用途の範囲に調整するために単純なされています。また、脂質組成物は、より優れたこれらの特定の領域にタンパク質の機能を再現するために、目的の細胞小器官または膜ミクロドメインに類似するように製剤化することができます。これらの技術を用いて、生化学者は、そのパートナーとその環境との膜結合および膜結合タンパク質の複雑な相互作用を調べることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
