Abstract
对于乳腺癌的局部导管的治疗提供了潜在的优势，包括有效递送至肿瘤，并降低全身毒性和副作用1，2，3，4，5，6，7。然而，一些挑战依然存在之前这些处理可以更广泛地应用。在合适的动物模型的发展和导管治疗的有效性促进导管内治疗策略对患者的发展。而小鼠乳腺已被广泛地用作乳腺发育和肿瘤的模型系统中，解剖来自人腺不同。较大的动物模型，如兔，可作为乳腺结构和管内治疗开发一个更好的模型。在Contrast小鼠，在十个由导管树木在空间沿体轴分布，在一个单独的乳头每个终止，兔子乳腺更类似于人类腺，具有多个重叠导管系统该出口通过在一个乳头分开的开口。这里，我们提出了试剂的递送微创方法直接进入兔乳腺导管和用于递送本身具有高分辨率超声波成像的可视化。
Introduction
治疗剂的导管内输送已经研究了在啮齿动物模型中和在早期的人体试验3，4，5，6，11，12。最近的I期临床试验证明导管内卡铂或女性乳房等待为浸润癌2治疗导管内聚乙二醇化脂质体阿霉素的安全性和可行性。
对导管内输送以前的协议已被开发用于小鼠和大鼠乳腺6，7，8，9。出于研究目的，导管内的肿瘤细胞注射和癌基因的慢病毒载体递送也已在啮齿动物模型中进行的裁判“> 13，14，15，16，但是， 在导管内输送过程的体内模型的理想应允许新的类治疗化合物的发展和促进临床前评估。啮齿动物和人类之间的解剖学差异有复杂的这些翻译学习。
不像小鼠，其中每个管道在一个单独的乳头结束时，人乳腺癌由5至9个独立的导管系统中，每个与奶嘴结束一个单独的开口。兔乳腺怀有四个独立导管系统中，每个分别通过在一个单一的奶头4孔可接触。兔模型更接近人体解剖，并允许导管内给药的研究更相关的情境。
在这里，我们用两种方法来评估导管内交付。的一个共同给予活体染料允许可视化通过皮肤，并提供该方法的一个简单的和快速的确认。对于一些应用，导管的更高分辨率映射可以是优选的。我们在座的管道超声成像协议通过非靶向造影剂的导管内交付。
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Protocol
使用动物对象的程序已通过得克萨斯大学奥斯汀分校的机构动物护理和使用委员会。
1.术前准备
- 记录体重每只兔。如同所有的临床前研究，定期监测动物的重量来评估潜在的毒性。
- 前麻醉兔子，填充的50mL锥形管与可商购的超声凝胶并在500 xg离心旋转30秒;应在离心结束后的凝胶无可见的气泡。
- 在剂量为0.75毫克/公斤给药格隆皮下注射，剂量为0.1毫克/千克和乙酰丙嗪肌注。等待15-20分钟的镇静，同时监测生命体征和行为才能生效。
注：格隆溴铵是防止心动过缓和减少呼吸道和胃肠道分泌物的抗胆碱能剂。乙酰丙嗪是作为一个premedicati镇静剂对麻醉。 - 施用35毫克/千克氯胺酮和5mg / kg的甲苯噻嗪的皮下作为麻醉剂。但是，随着操作者变得更有经验，并且可以更迅速地完成导管内输送，降低药物剂量以15mg / kg的氯胺酮和3mg / kg的甲苯噻嗪皮下;这会缩短麻醉时间，并为动物从麻醉中恢复所需的时间。
- 检查并记录心脏率，SPO 2，温度，呼吸频率和粘液膜的颜色，每15分钟。敷眼润滑剂双眼。
注：只有谁曾接受适当的培训，并已通过其机构的IACUC应该管理或监督人员的麻醉。使用兽医麻醉监视器可以在获取生命体征和推荐帮助。兽医的麻醉监测，但是，并不能取代需要手动检查动物每隔15分钟。请参阅制造商的说明˚F或正确使用兽医显示器。 - 验证麻醉用温柔的脚趾捏发作;兔子应该在继续之前无响应。
- 仔细剃兔子的尾腹部周围的第三和第四对腹股沟奶嘴的面积。
- 与大多数除去毛发，施加过度的计数器脱毛膏到剃区域。删除使用用温水浸湿水的湿纸巾申请后，奶油10分钟。
注：兔子的皮肤是非常脆弱性/敏感性。脱毛膏应使用不超过10分钟。实际上，这是更安全的在5分钟以尝试“测试点”，如果测试点表示需要一段较长的时间仅在再离开。 - 用酒精擦拭浸泡的纱布垫清洁注射部位的区域。
- 放置在其背部的兔子在具有循环温水毯和吸收垫衬一个V形槽。
2.镨造影剂的eparation
- 根据制造商的说明重组的非靶向对照试剂。移液器上下轻轻混合。
注意：在这个协议中所使用的造影剂是在室温下搅拌4稳定 - 重构后6小时。轻轻摇动每个检索之间的小瓶。
注意：被注入的，将取决于管道的数目所需溶液的体积。兔子具有每奶头4导管开口，和0.2毫升的溶液是足以填满一个成年新西兰白兔（Oryctolaguscuniculus）之一导管树。因此，为0.8毫升总体积可以被传递给一个乳腺。
3.乳腺导管内交货
- 找到合适的奶嘴被注入;推荐腹股沟奶嘴的3 次和第 4 次对，如当动物被定位在其背部它们容易可视化。
- 无菌的0.9％生理盐水的负载0.2毫升1毫升鲁尔锁结核菌素注射器用22克针。妥善处置了22克针的一次生理盐水是在注射器，并用无菌25号针头更换。轻轻地用一个纱布垫85％异丙醇的区域。
- 用针上并平行于动物的身体的注射器的斜角，插入针的斜角到乳头的侧面和缓缓注入0.1-0.2毫升盐水;这将允许对导管开口的更好的可视化。
- 负载0.2毫升注射溶液到1毫升鲁尔锁结核菌素注射器。
- 用拇指和食指轻轻按住乳头，将其抬起稍微将它定位为导管内注射;可穿戴眼放大镜可在可视化导管开口帮助。
- 在保持乳头的位置抬起，仔细导管插入的使用兴趣将25g钝尖的针管道。
- 插管后，轻轻一拧就不客气-T的集线器鲁尔锁注射器IP输液针，直到它被锁定就位。
- 提起乳头并注入溶液慢慢地减少因快速移动的管道内流体的潜在损害;在任何时候注入解决方案时，应该有阻力。
4.超声成像
- 应用离心超声凝胶的一个自由量的感兴趣的区域的皮肤上。确保有在凝胶中无气泡，因为这些将损害图像质量。
- 成像深度设置为6毫米。放置在与凝胶接触的21-MHz的换能器和扫描的B模式感兴趣的区域。观察包括导管开放和整个管道的扫描区域的造影剂。
注意：这些设置已针对与特定光声超声机使用而开发的。请参阅材料表了解更多详情。可能需要调整的发射功率和其它成像系统的成像深度以优化乳腺可视化。 - 从动物的皮肤用纱布垫除去超声波凝胶。
5.术后护理
- 观察注射部位：应该没有创伤乳头区域或周围组织的迹象，并在包围乳头区域肿胀可能表示一个乳房脂肪垫注射，而不是一个成功的导管内注射。
- 将兔子在胸骨位置。如果需要的话，得到0.2毫克/公斤的育亨宾静脉内边缘耳静脉;这将扭转赛拉嗪的影响，并允许动物从麻醉中恢复得更快。
- 监控兔子整个恢复期每15分钟，直到动物警觉，反应灵敏，并保持胸骨位置。
注：此过程不应导致组织损伤或肿胀。如果观察到发红或肿胀，管理一个剂量的美洛昔康0.1-0.2毫克/公斤PO一旦动物警觉，并能服用药物口服。为进一步指导联系该机构的兽医人员。
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Representative Results
这里，我们表明，对比试剂兔的乳腺导管的导管内输送而不创伤可以实现对组织（ 图2）。家兔，四个单独的导管系统会聚在同一乳头，并且因此可以被访问和使用这种方法单独地成像。个别导管开口容易显现;注意箭头标记相邻于图2B中的空心管的第二导管开口。
与线性成像模式不相关的对比试剂的高分辨率超声成像可提供导管内输送的实时读出。代表性图像显示检测试剂达45分钟后输送（ 图3）。这种技术还可以用于通过导管监测治疗递送的动力学是有用的。
图4）和任何管道是否递送过程中损坏。
图1：兔乳腺示意图。两下对点代表了腹股沟淋巴结的奶嘴。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：准备和腹股沟乳腺导管内对配送的插管。 （A）右腹股沟乳腺乳头如下所示0.2 0.9毫升％无菌生理盐水交付之后。注射后，乳腺导管开口更加清晰可见。 （B）一个导管开口在同一奶头然后与地下25钝尖输液针插管。箭头显示了一个导管开口，不要套管。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.非靶向造影试剂超声我的乳腺导管内可视化maging。 （A）的对比试剂分娩后立即本地化，并可视化（B）30分钟后的交付和（C）45分钟交付后。乳腺导管内的试剂的持续性允许的可视化在本协议的期限。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：腹股沟乳腺通过与伊文思蓝生理盐水注射乳头。 （A）的0.2毫升的伊文思蓝液导管内注射后的外观。 （B）在打开皮肤，伊文思蓝允许整个乳腺导管树的可视化，并确认完整导管结构。 （<固定和染色与胭脂红明矾后强> C）的全体贴装腹股沟乳腺的区域的标本。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
可用于超声对比试剂和许多其他的水溶液，包括重要的染料和治疗剂导管内输送到兔的乳腺的此方法。以前的研究已经表明激素17，18，19的导管内交付。在啮齿动物模型中，核酸8的导管内输送，化学治疗6,7和纳米颗粒的载体8，20已被执行。此处所描述的协议可适于以及用于这些应用。
对于一些应用，通过伊文思蓝活体染料的导管内输送的确认，因为通过皮肤可视化，可能是足够的。然而，可视化通过皮肤弥漫，和个人的管道都没有得到很好的demarca特德。在终点的研究中，伊文思蓝活体染料确实提供了整个导管树的清晰的地图，但是这需要在乳腺组织的分离。因此，超声造影提供用于可视化在活的动物研究中导管内递送至个体导管的另一种方法。我们注意到，伊文思蓝染料映射整个导管树，包括最小直径终端管道，而对比试剂和超声映射仅包括较大的管道。另一个区别是监视在超声时间动态的可能性，而伊文思蓝仅提供单个快照测量。
作为在导管内输送到啮齿动物乳腺导管9的方法中，最显著挑战和限制该技术很可能是对操作者的专业知识的依赖。然而，在一个兔子模型中的导管开口的较大尺寸，简化了程序，省去了执行ING用立体显微镜的帮助的技术中，并缩短开发能力所需的新的操作的时间。在我们的经验，0.1-0.2毫升盐水到奶头的侧的导管内输送前的注射是一个关键步骤，使导管开口（步骤3.2，以上）的清晰的可视化。输送位点的准确定位和提升也是必不可少的;这保证了溶液流入管道（步骤3.5和3.6，以上）。我们注意到，对比度试剂的共施用必然减少用于测试其他试剂或治疗剂的可用容积。然而，也可以不成像或用简单的检查由伊文思蓝进行导管内输送确认交货。
乳房的最常见的非侵入性的病变是原位 （DCIS）导管癌，其中异常导管上皮细胞增殖的乳腺导管内，但不穿透通过量小时基底膜到相邻的组织中。随着乳房X线成像的进步，DCIS的检出率显着增加。在美国，新诊断乳腺病变的约25％被列为DCIS，而到2020年，超过100万的女性会与DCIS在美国就有22，23，24，25生活。然而，许多DCIS病变保持休眠状态，和大多数人估计发现只有15-40％，21，22，23，24，DCIS病灶25都不会发展到浸润癌。然而，目前还没有预测生物标记中的识别，其中肿瘤会变得侵入来帮助。
随着越来越多的妇女被诊断出这种癌前期病变，关于过度诊断过度治疗和严肃的问题已经出现。癌前疾病的治疗通常是侵略性。多数患者DCIS将接受手术（乳房肿瘤切除术或乳房切除术），不少还接受放疗25。一些患者激素受体阳性DCIS也会收到5年或更多年的内分泌疗法，这已被证明是降低复发。这种治疗的副作用包括中风，血栓，骨损失，以及子宫癌和子宫内膜癌的升高的风险。所有这些选项有严重的全身性的副作用和影响患者的生活质量。存在用于微创治疗策略25显著需要。
在两种小鼠模型和乳腺癌患者的化疗剂的导管内输送先前已证明是有效的，没有全身毒性或长期组织病理学变化的证据参考“> 3，4，5，6，治疗剂的导管内施用可能一天以停止肿瘤提供诊断与原位癌一个尚未进展到局部侵袭性病变妇女新的选择。该电位，同时还保护导管结构使这一个有吸引力的治疗策略10。重要的是，局部递送方法确保治疗达到有关的异常细胞，而潜在地最小化对其它组织的附带损害。尽管兔肿瘤模型不可用，兔的正常乳腺可提供相关模型来测试局部递送，安全，运输和治疗剂的摄取动力学的乳腺导管内，这些体内研究将使相关组织环境中的测试和候选诊断和治疗的验证。
8,9。然而，小鼠乳腺的解剖结构的不同之处的一些重要的方面，包括组织组成，并且结束在每个乳头管的数目的人的乳房。在这里，我们这种技术扩展到一个更大的动物模型，其中乳腺上皮结构更密切地代表了人类乳腺癌12,14的解剖结构。这开辟了通过成像扩展监控并用于测定各种试剂的伴随导管内输送到兔的乳腺导管上皮的可能性。进展局部递送到适当的动物模型中，用导管解剖学类似于人类腺，应加快非i的应用nvasive，有针对性地在人类治疗策略。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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