Abstract
Lokaliserte intraductal behandlinger for brystkreft har potensielle fordeler, blant annet effektiv levering til tumoren og redusert systemisk toksisitet og uønskede bivirkninger 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Men flere utfordringer gjenstår før disse behandlingene kan brukes mer allment. Utvikling og validering av intraductal therapeutics i en passende dyremodell rette for utvikling av intraductal terapeutiske strategier for pasientene. Mens musemelkekjertelen har blitt mye brukt som et modellsystem av mammary utvikling og tumorgenese, er det anatomi forskjellig fra det humane kjertel. En større dyremodell, for eksempel kanin, kan tjene som en bedre modell for melkekjertler struktur og intraductal terapeutisk utvikling. i contrast til mus, i hvilket ti ductal trær er romlig fordelt langs kroppens akse, som hver ender i en separat spenen, kanin brystkjertel mer ligner det menneskelige kjertel, med flere overlappende ductal systemer som kan gå ut gjennom separate åpninger i en spene. Her presenterer vi minimalt invasive metoder for levering av reagenser direkte inn i kanin melkekanalen og for visualisering av leveransen selv med høy oppløsning ultralydavbildning.
Introduction
Den intraductal levering av terapeutiske midler har blitt studert i gnagermodeller og i tidlig stadium menneskelige forsøk 3, 4, 5, 6, 11, 12. En fersk fase I-studie demonstrerte sikkerhet og muligheten for intraductal karboplatin eller intraductal pegylert liposomalt doxorubicin hos kvinner venter mastektomi for behandling av invasiv kreft to.
Tidligere protokoller for intraductal arrangementet har blitt utviklet for mus og rotte brystkjertler 6, 7, 8, 9. For forskningsformål, intraductal tumorcelle injeksjoner og lentiviral vektor levering av onkogener har også blitt utført i gnagermodellerref "> 13, 14, 15, 16. Imidlertid kan en ideell in vivo-modell av intraductal leveringsprosessen bør tillate utviklingen av nye klasser av terapeutiske forbindelser og lette preklinisk bedømmelse. anatomiske forskjeller mellom gnagere og mennesker har kompliserte translasjonen av disse studier.
I motsetning til mus, i hvilket hver kanal ender ved et separat spene, den humane bryst består av 5 til 9 uavhengige ductal systemer, hver med en separat åpning ender i spenen. Kanin melkekjertler båtplass fire uavhengige duktale systemer, hver for seg tilgjengelig gjennom en av fire åpninger i en enkelt spene. En kanin modell mer samsvarer den menneskelige anatomi og tillater studier av intraductal levering av legemidler i en mer relevant sammenheng.
Her bruker vi to teknikker for å vurdere intraductal levering. Samtidig administrering av envitale fargestoff tillater visualisering gjennom huden og tilveiebringer en enkel og hurtig bekreftelse av fremgangsmåten. For noen anvendelser kan høyere oppløsning kartlegging av kanalene være foretrukket. Vi presenterer her en protokoll for ultralydavbildning av kanalene gjennom intraductal levering av en ikke-målrettede kontrast reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer ved hjelp av dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Texas i Austin.
1. Preoperativ forberedelse
- Ta opp kroppsvekten til hver kanin. Som med alle prekliniske studier overvåke dyre vekter jevnlig for å vurdere potensielle toksisitet.
- Før bedøvelse kaninen, fylle en 50 ml konisk rør med kommersielt tilgjengelige ultralyd gel og spinn ved 500 xg i 30 s; det bør ikke være noen synlige bobler i gelen ved gjennomføring av sentrifugering.
- Administrere glykopyrrolat subkutant i en dose på 0,1 mg / kg og acepromazin intramuskulært i en dose på 0,75 mg / kg. Vent 15-20 min for den sedative skal tre i kraft, mens overvåking av vitale tegn og atferd.
MERK: Glykopyrrolat er en anti-kolinerge middel som hindrer bradykardi og reduserer luftveiene og GI sekret. Acepromazin er et beroligende middel som fungerer som en premedicatipå for anestesi. - Administreres 35 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin subkutant som et bedøvelsesmiddel. Men som operatør blir mer erfaren og kan utføre intraductal levering raskere, redusere legemiddeldoser til 15 mg / kg av ketamin og 3 mg / kg xylazin subkutant; Dette vil forkorte anestesi tid og den tid som er nødvendig for dyret å komme seg fra anestesi.
- Sjekk og dokumentere hjertefrekvens, SPO 2, temperatur, lufthastighet, og slimhinnene farger hver 15 min. Påfør øye smøremiddel til begge øynene.
MERK: Kun personell som har gjennomgått hensiktsmessig opplæring og er godkjent av deres institusjons IACUC skal administrere eller overvåke anestesi. Bruken av en veterinær anestesi skjerm kan hjelpe til med å skaffe vitale og anbefales. Veterinær anestesi skjerm, men erstatter ikke behovet for å sjekke dyret manuelt hver 15 min. Se produsentens instruksjoner feller riktig bruk av en veterinær monitor. - Kontroller utbruddet av anestesi ved en mild tå klype; kaninen bør være ikke-responsive før du fortsetter.
- barbere nøye hale magen av kanin i området rundt den tredje og fjerde par av lyske spenene.
- Med de fleste av håret fjernet, gjelder en over-the-counter hårfjerning krem til det barberte området. Fjern kremen 10 minutter etter påføring ved hjelp av fuktig tørkepapir fuktet med varmt vann.
MERK: Rabbit huden er veldig skjør / følsom. Den hårfjerning krem bør brukes for ikke mer enn 10 min. Faktisk er det tryggere å prøve en "test spot" på 5 min og bare la på lenger hvis testen sted indikerer en lengre tidsperiode er nødvendig. - Tørk området med alkohol-gjennomvåt gasbind pads å rengjøre injeksjonsstedet.
- Plasser kanin på sin fotens rygg i et V-formet trau foret med en resirkulerende varmt vann teppe og en absorberende pute.
2. Preparation av kontrastmiddelet
- Rekonstituere den ikke-målrettede kontrast reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Pipetter opp og ned forsiktig for å blande.
MERK: kontrastmiddel som brukes i denne protokollen er stabil ved romtemperatur til 4 - 6 timer etter rekonstituering. Rist forsiktig hetteglasset mellom hver henting.
MERK: Volumet av oppløsningen som kreves vil avhenge av antallet av kanaler som skal injiseres. Kaninen har 4 ductal åpninger per spene, og 0,2 ml oppløsning er tilstrekkelig til å fylle en ductal tre av en voksen New Zealand hvit kanin (Oryctolaguscuniculus). Således kan et totalvolum på 0,8 ml leveres til en melkekjertler.
3. Intraductal Levering
- Finn de riktige spenene som skal injiseres; den 3. og 4. par av lyske spenene anbefales fordi de er lett visualisert når dyret er plassert på sin dorsum.
- Belastning 0,2 ml sterilt 0,9% saltvann tilen 1 ml Luer-lock tuberkulin sprøyte med en 22 G nål. Kast den 22 G nål når saltvann er i sprøyten og erstatte den med en steril 25 gauge nål. Tørk forsiktig området med 85% isopropylalkohol på en kompress.
- Med skråkant av nålen opp og sprøyten parallelt til kroppen til dyret, sett skråkant av nålen inn i siden av spenen og langsomt injisere 0,1-0,2 ml av saltløsning; Dette vil muliggjøre bedre visualisering av ductal åpninger.
- Load 0,2 ml av injeksjonsvæsken i en 1 ml Luer-lock tuberkulin sprøyte.
- Hold smokken forsiktig med tommelen og pekefingeren, og løft den litt for å plassere den på intraductal injeksjon; en bærbar okulær lupe kan hjelpe til å visualisere ductal åpninger.
- Samtidig opprettholde den løftede posisjonen til smokken, nøye cannulate duct av interesse å bruke en 25 G sløv-spiss nål.
- Etter kanylering, vri forsiktig på Luer-lock sprøyte på navet i den butte-tip infusjon nål til den låses på plass.
- Løft smokken og injisere løsningen sakte for å minimere skader som følge av raskt flytte væske i kanalen; ikke på noe tidspunkt bør det være motstand når injisering av oppløsningen.
4. ultralydavbildning
- Påfør rikelig mengde sentrifugert ultralyd gel til huden i området av interesse. Pass på at det ikke er noen bobler i gel, da disse vil kompromittere bildekvalitet.
- Sett avbildningsdybden til 6 mm. Plasser 21-MHz-transduseren er i kontakt med gelen og skanne området av interesse i B-modus. Observer kontrastmiddel i det skannede regionen inkludert ductal åpning og gjennom kanalen.
MERK: Disse innstillingene har blitt utviklet for bruk med spesifikke fotoakustisk ultralyd maskin. Se i tabellen for material for flere detaljer. Det kan være nødvendig å justere sendereffekten og avbildning dybde av andre bildedannende systemer for å optimalisere mammarykjertel visualisering. - Fjern ultralyd gel fra dyrets hud med en kompress.
5. Postoperativ Care
- Observer injeksjonsstedet: det bør ikke være noen tegn på traumer til smokken region eller til omkringliggende vev, og hevelse i området rundt smokken sannsynlig indikerer et melkefettpute injeksjon i stedet for en vellykket intraductal injeksjon.
- Plasser kanin i en sternal posisjon. Hvis nødvendig, gi 0.2 mg / kg yohimbin intravenøst til den marginale ørevenen; Dette vil reversere virkningen av xylazin og at dyret kan komme raskere fra anestesi.
- Overvåk kanin hvert 15 min hele utvinning perioden før dyret er våken, responsive, og opprettholder en sternal posisjon.
MERK: Denne prosedyren skal ikke føre til vevsskade eller hevelse. Hvis rødhet eller hevelse er observert, administrere en dose av meloksikam 0,1-0,2 mg / kg PO når dyret er våken og i standå ta medisiner muntlig. Kontakt institusjonens veterinær ansatte for videre veiledning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi at det intraductal levering av kontrast reagenser til melkekanalene i en kanin kan oppnås uten skade på vev (figur 2). Hos kaniner, fire separate duktale systemer samles i en spene, og dermed kan nås og avbildes individuelt ved hjelp av denne metoden. Individuelle duktale åpninger er lett visualisert; oppmerksom på pilspissen markerer en andre ductal åpning ved siden av cannulated kanalen i figur 2B.
Høy oppløsning ultralydavbildning med vilkårlige kontrast reagens i lineær bildemodusen kan gi en real-time avlesning av intraductal levering. Representative bilder viser deteksjon av reagensen opp til 45 min post-levering (figur 3). Denne teknikken kan også være nyttig for å overvåke kinetikken for terapeutisk levering gjennom kanalene.
(figur 4), og hvorvidt alle kanaler blir skadet under leveringen.
Figur 1: Skjematisk av Rabbit melkekjertler. De to nederste par av punktene representerer spenene av inguinal kjertler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Forberedelse og kanylering av inguinal melkekjertlene for Intraductal levering. (A) spenene til høyre inguinale melkekjertlene er vist her umiddelbart etter levering av 0,2 ml 0,9% steril saltløsning. Ved injeksjon, blir ductal åpningene visualisert mer tydelig. (B) En ductal åpning i den samme spene ble deretter kanylert med en 25 G-butt spiss infusjonsnål. Pilen viser en ductal åpning uten en kanyle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Ikke-målrettet Contrast Reagens Visualisert innen melke Duct ved ultralyd jegmaging. (A) Kontrasten reagens er lokalisert umiddelbart etter levering og visualiseres (B) 30 min post-levering og (C) 45 min post-levering. Utholdenhet av reagensen inne melkekanalen tillater visualisering gjennom hele denne protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: En inguinal melkekjertlene Støpt gjennom Smokk med Evans blå Saline Solution. (A) Det utvendige utseende etter intraductal injeksjon av 0,2 ml av Evans blå oppløsning. (B) Ved åpning av hud, tillater Evans Blue-visualiseringen av hele melke duktalt treet og bekrefter den intakte duktalt struktur. (<strong> C) Hel-mount eksemplar av en region av lyskemelkekjertler etter fiksering og farging med karmin alum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden for intraductal levering til kanin melkekjertelen kan anvendes for ultralydkontrast reagenser og mange andre vandige løsninger, inkludert vitale fargestoffer og terapeutiske midler. Tidligere studier har vist intraductal levering av hormoner 17, 18, 19. I gnager modeller, intraductal levering av nukleinsyrer 8 Kjemoterapeutika 6, 7 og nanopartikkel bærere 8, har 20 blitt utført. Protokollen er beskrevet her kan tilpasses for disse anvendelser også.
For noen anvendelser, er bekreftelse av intraductal levering av Evans blå fargestoff vital, som visualiseres gjennom huden, kan det være tilstrekkelig. Imidlertid visualisering gjennom huden er diffuse, og de enkelte kanaler er ikke godt demarcated. I endepunkt studier, gjør Evans blå fargestoff vital gi en klar kart av hele duktal treet, men dette krever isolering av brystvev. Derfor gir kontrastforsterket ultralyd en alternativ tilnærming for å visualisere intraductal levering til enkeltkanaler i levende dyrestudier. Vi merker oss at Evans blå fargestoff kartlegger hele ductal treet, inkludert den minste diameter terminal kanaler, mens kontrasten reagent og ultralyd kart bare omfatte de større kanalene. En annen forskjell er muligheten til å overvåke tidsmessige dynamikken i ultralyd, mens Evans blå gir bare et enkelt bilde måling.
Som i fremgangsmåten for intraductal levering til gnager mammary kanalen 9, er sannsynlig å være avhengighet av operatøren ekspertise den mest betydelig utfordring og begrensning for denne teknikken. Men jo større størrelsen av ductal åpningene i en kaninmodell forenkler prosedyren, eliminerer behovet for å utføreing teknikken ved hjelp av en stereomikroskop, og forkorter tiden som kreves for nye aktører å utvikle ferdigheter. Etter vår erfaring, injeksjon av 0,1-0,2 ml av saltløsning til siden av spenen før intraductal levering er et kritisk trinn som gjør det mulig å klare visualisering av ductal åpningene (trinn 3.2, ovenfor). Nøyaktig plassering og løfting av leveringsstedet er også viktig; dette sikrer at løsningen strømmer inn i kanalen (trinn 3.5 og 3.6, ovenfor). Vi merker oss at samtidig administrering av kontrast reagent nødvendigvis vil redusere tilgjengelig volum for å teste andre reagenser eller behandlingsformer. Imidlertid kan intraductal levering også utføres uten avbildning eller med enkel inspeksjon av Evans blå for å bekrefte leveransen.
Den mest vanlige ikke-invasiv lesjon av brystkreft er duktalt karsinom in situ (DCIS), der unormale ductal epitelceller proliferere inne i melkekanalen, men ikke trenge gjennom through basalmembranen til det tilstøtende vev. Med fremskritt i mammografisk bildebehandling, har deteksjon priser av DCIS økt dramatisk. I USA, er ca 25% av nydiagnostiserte bryst lesjoner klassifiseres som DCIS, og innen 2020 vil mer enn 1 million kvinner være å leve med DCIS i USA alene 22, 23, 24, 25. Men mange DCIS lesjoner forbli hvilende tilstand, og de fleste anslag finne at bare 15-40% 21, 22, 23, 24, 25 av DCIS lesjoner stadig vil utvikle seg til invasiv kreft. Men det er ikke prediktive biomarkører til hjelp i identifisering av hvilke svulster vil bli invaderende.
Som flere kvinner er diagnostisert med denne pre-cancerous lesjon, alvorlige spørsmål om over-diagnose og overbehandling har dukket opp. Behandlingen av premalign sykdom er vanligvis aggressiv. De fleste pasienter med DCIS vil gjennomgå en operasjon (lumpectomy eller mastektomi), og mange også motta stråling 25. Noen pasienter med hormon-reseptor-positive DCIS vil også motta 5 eller flere år med endokrin terapi, som har vist seg å redusere tilbakefall. Bivirkninger av denne behandlingen kan inkludere hjerneslag, blodpropp, bentap, og forhøyede risikoen for livmor og livmorkreft. Alle disse alternativene har alvorlige systemiske bivirkninger og påvirke pasientens livskvalitet. Det er et betydelig behov for mindre invasive terapeutiske strategier 25.
Den intraductal levering av kjemoterapeutika i begge musemodeller og hos brystkreftpasienter har tidligere vist seg å være effektive, uten tegn til systemisk toksisitet eller langsiktige histopatologiske forandringerref "> 3, 4, 5, 6. Den intraductal administrasjon av legemiddel en dag kunne tilby nye muligheter for kvinner diagnostisert med DCIS som ennå ikke har kommet til et lokalt invasiv lesjon. Potensialet for å stanse tumordannelse og samtidig bevare ductal struktur gjør dette et attraktivt terapeutisk strategi 10. Viktigere, sikrer lokalisert avgivelse tilnærming som behandlingen når de relevante unormale celler, mens potensielt minimere utilsiktet skade på andre vev. mens kanin tumormodeller ikke er tilgjengelig, kan den normale melkekjertelen hos kaniner tilveiebringe en relevant modell for å teste lokaliserte levering, sikkerhet, transport og kinetikk therapeutics opptak inne i melkekanalen. Disse in vivo studier vil gjøre det mulig testing og validering av kandidat diagnostikk og terapi innenfor et relevant vev miljø.
8, 9. Imidlertid anatomi av musebrystkjertelen er forskjellig fra den humane bryst i en rekke viktige måter, blant annet vevet sammensetning og det antall kanaler som ender ved hver spene. Her utvider vi denne teknikken til en større dyremodell hvori melke epiteliale struktur representerer nærmere anatomien i det menneskelige bryst 12, 14. Dette åpner opp muligheten for utvidet overvåking av bildebehandling og for analysering samtidig intraductal leveranse av forskjellige reagenser til kaninen melke duktale epitel. Advances in lokalisert avgivelse til en egnet dyremodell, med ductal anatomi tilsvarende for det menneskelige kjertel, skal akselerere anvendelsen av ikke-invasive, målrettet terapeutiske strategier hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
- Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ. Curr Breast Cancer Rep. 2 (2), 75-82 (2010).
- Love, S. M., et al. A Feasibility Study of the Intraductal Administration of Chemotherapy. Cancer Prevention Research. 6 (1), 51-58 (2013).
- Stearns, V., et al. Preclinical and Clinical Evaluation of Intraductally Administered Agents in Early Breast Cancer. Sci Transl Med. 3 (106), 106ra108 (2011).
- Zhang, B., et al. The Safety Parameters of the Study on Intraductal Cytotoxic Agent Delivery to the Breast before Mastectomy. Chin J Cancer Res. 26 (5), 579-587 (2014).
- Mahoney, M. E., Gordon, E. J., Rao, J. Y., Jin, Y., Hylton, N., Love, S. M. Intraductal Therapy of Ductal Carcinoma In Situ: a Presurgery Study. Clin Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Murata, S., et al. Ductal Access for Prevention and Therapy of Mammary Tumors. Cancer Res. 66 (2), 638-645 (2006).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally Administered Pegylated Liposomal Doxorubicin Reduces Mammary Stem Cell Function In the Mammary Gland but in the Long Term, Induces Malignant Tumors. Breast Cancer Res Treat. 135 (1), 201-208 (2012).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by Intraductal Injection of siRNA Lipidoid Nanoparticles Prevents Mammary Tumor Progression in Mice. Sci Trans Med. 6 (217), 2172a2 (2014).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal Injection For Localized Drug Delivery To The Mouse Mammary Epithelium. J Vis Exp. (80), e50692 (2013).
- Brock, A., Goh, H. T., Yang, B., Yu, L., Li, H., Loh, Y. H. Cellular Reprogramming: A New Technology Frontier In Pharmaceutical Research. Pharm Res. 29 (1), 35-52 (2012).
- Silverstein, M. J., et al. Ductal Carcinoma In Situ of the Breast. Annu. Rev Med. 51, 17-32 (2000).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the Nipple And Breast Ducts Revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Virnig, B. A., Shamliyan, T., Tuttle, T. M., Kane, R. L., Wilt, W. J. Diagnosis and Management of Ductal Carcinoma In Situ (DCIS). Evidence Report/Technology Assessment. , AHRQ Publication No. 09-E018 185 (2009).
- Mills, D., et al. Examination of Duct Physiology in the Human Mammary Gland. PLoS One. 11 (4), e0150653 (2016).
- King, B. L., Love, S. M. The Intraductal Approach to the Breast: Raison d'Etre. Breast Cancer Res. 8 (2), 206 (2006).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo . J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).
- Lyons, W. R. The Direct Mammotrophic Action of Lactogenic Hormone. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 51 (2), 308-311 (1942).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects Of Intraductal Prolactin On Some Aspects of the Ultrastructure and Biochemistry of Mammary Tissue in the Pseudopregnant Rabbit. J Endocrinol. 49 (3), 459-469 (1971).
- Falconer, I. R., Fiddler, T. J. Effects of Intraductal Administration Of Prolactin, Actinomycin D and Cycloheximide on Lipoprotein Lipase Activity in the Mammary Glands of Pseudopregnant Rabbits. Biochim Biophys Acta. 218 (3), 508-514 (1970).
- Singh, Y. Influence of Molecular Size on the Retention of Polymeric Nanocarrier Diagnostic Agents in Breast Ducts. Pharm Res. 29 (9), 2377-2388 (2012).
- Jain, R., et al. Atypical Ductal Hyperplasia: Interobserver and Intraobserver Variability. Mod Pathol. 24 (7), 917-923 (2011).
- Betsill, W. L. Jr, Rosen, P. P., Lieberman, P. H., Robbins, G. F. Intraductal Carcinoma. Long-term Follow-up After Treatment by Biopsy Alone. JAMA. 239 (18), 1863-1867 (1978).
- Eusebi, V., et al. Long-term Follow-up of In Situ Carcinoma of the Breast. Semin Diagn Pathol. 11 (3), 223-235 (1994).
- Sanders, M., et al. The Natural History Of Low-Grade Ductal Carcinoma In Situ Of The Breast In Women Treated By Biopsy Only Revealed Over 30 Years Of Long-Term Follow-Up. Cancer. 103 (12), 2481-2484 (2005).
- Esserman, L. J., et al. Addressing Overdiagnosis and Overtreatment in Cancer: A Prescription For Change. Lancet Oncol. 15 (6), e234-e242 (2014).
