Abstract
乳癌のためのローカライズされた管内の治療は、腫瘍への効率的な送達および減少全身毒性及び副作用1、2、3、4、5、6、7を含む潜在的な利点を提供します。これらの処理は、より広く適用することができる前に、しかし、いくつかの課題が残っています。適切な動物モデルにおける管内治療法の開発と検証は、患者のための管内治療戦略の開発を促進します。マウス乳腺広く乳腺発達および腫瘍形成のモデル系として使用されてきたが、解剖学的構造は、人間の腺と区別されます。大きな動物モデルは、ウサギのような乳腺構造と管内治療の開発のためのより良好なモデルとして役立つことができます。 C INマウスにontrast、ここで10乳管の木は空間的に分離した乳首の各終端は、ウサギの乳腺は、より密接1乳頭内の別の開口部を通ってその出口複数の重複乳管システムで、人間の腺に似ている、体軸に沿って分布しています。ここでは、直接ウサギ乳管に、高解像度の超音波画像で配信自体の可視化のための試薬の送達のための低侵襲的な方法を提示します。
Introduction
治療薬の管内送達は、齧歯類モデルおよび早期臨床試験3、4、5、6、11、12で検討されています。私は勉強最近のフェーズは、管内カルボプラチンまたは浸潤癌2の治療のために乳房切除術を待っている女性では管内ペグ化リポソームドキソルビシンの安全性と実現可能性を実証しました。
管内送達のための以前のプロトコルは、マウスおよびラット乳腺6、7、8、9のために開発されています。研究目的、管内腫瘍細胞注射および癌遺伝子のレンチウイルスベクターの送達のためにも、げっ歯類モデルで実施されていますREF "> 13、14、15、16が、管内デリバリプロセスのインビボモデルにおける理想的な治療用化合物の新規なクラスの開発を可能にし、前臨床評価を容易にするはずである。げっ歯類とヒトとの間の解剖学的差異は、これらの変換を複雑にしています研究。
マウスとは異なり、各ダクトは別々の乳首で終了した、ヒト乳房は5〜9の独立性乳管システム、乳首で終わる独立した開口部を有する各構成されています。ウサギの乳腺は、4つの独立した腺管システム、単一乳首の4つのオリフィスのうちの1つを介してそれぞれ個別にアクセスを抱きます。ウサギモデルは、より密接に人体解剖学と一致し、より関連性の文脈で管内薬物送達の研究を可能にします。
ここでは、管内の配信を評価するために2つの手法を使用します。の同時投与生体色素が皮膚を通して可視化を可能にし、方法の簡単かつ迅速な確認を提供します。いくつかの用途のために、管のより高い解像度のマッピングが好ましい場合があります。我々は、非標的コントラスト試薬の管内配信を通じてここダクトの超音波イメージングのためのプロトコルを提示します。
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Protocol
動物被験体を使用した手順は、テキサス大学オースティン校の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
1.術前の準備
- 各ウサギの体重を記録します。すべての前臨床試験と同様に、潜在的な毒性を評価するために定期的に動物の体重を監視します。
- ウサギを麻酔する前に、30秒間500×gで、市販の超音波ゲルとスピンで50 mLのコニカルチューブを埋めます。遠心分離終了時のゲルで目に見える泡があってはなりません。
- 0.75ミリグラム/ kgの用量でアセプロマジン筋肉内には0.1mg / kgの用量でグリコピロレートを皮下に投与し、。バイタルサインや行動を監視しながら有効にする鎮静のために15〜20分待ちます。
注：グリコピロレートは、徐脈を防止し、呼吸器およびGI分泌を低下させる抗コリン薬です。アセプロマジンはpremedicatiとして機能鎮静剤であります麻酔のために。 - ケタミン35mgの/キロとキロのキシラジン皮下麻酔薬としては5mg /を管理します。しかし、オペレータは、より経験豊富になるとケタミンとの3mg / kgの15 mgの薬剤の投与量を減少させ、より迅速に管内の配信を達成することができるように/キシラジンの皮下キロ。これは麻酔時間と麻酔から回復する動物に要する時間を短縮します。
- チェックして、心拍数、SPO 2、温度、呼吸数、および粘膜の色ごとに15分を記録。両眼に眼の潤滑剤を塗布します。
注：のみ適切な訓練を受けており、それらの機関のIACUCによって承認された職員は、麻酔を管理または監視する必要があります。獣医の麻酔モニタの使用はバイタルサインを取得するのを助けることができると推奨されています。獣医の麻酔モニタは、しかし、手動で動物を15分ごとにチェックする必要性を置き換えるものではありません。 fは、製造元の指示を参照してください。または獣医学的監視の適切な使用。 - 穏やかなつま先のピンチによって麻酔の開始を確認します。ウサギは、続行する前に非応答性であるべきです。
- 慎重に鼠径乳首3番目と4番目のペアの周りの領域にウサギの尾側腹部を剃ります。
- 削除髪の大部分では、剃った領域に店頭脱毛クリームを適用します。暖かい水で湿らせた湿ったペーパータオルを使用して、塗布後のクリーム10分を削除してください。
注：ウサギの皮膚が敏感な/非常に壊れやすいです。脱毛クリームは、せいぜい10分のために使用されるべきです。実際には、5分で「テスト・スポット」を試してみて、テストのみスポットがより長い期間が必要とされる示している場合に長く残すために安全です。 - 注射部位を洗浄する際には、アルコールに浸したガーゼパッドで拭きます。
- 再循環温水ブランケットと吸収パッドが並んでV字型の溝で、その背にウサギを置きます。
2. Prを造影剤のeparation
- 製造業者の説明書に従って、非標的化造影試薬を再構成します。混合する優しく上下にピペット。
注： - 再構成後6時間、このプロトコルで使用される造影剤は、4室温で安定です。静かに各検索の間にバイアルを揺すります。
注：必要な溶液の量は、注入されるダクトの数に依存します。ウサギは乳首あたり4腺管開口部、および液0.2 mLのを持っている大人のニュージーランドホワイトラビット（Oryctolaguscuniculus）の1乳管ツリーを満たすのに十分です。したがって、0.8mLの総容量は、一つ乳腺に送達することができます。
3.管内配達
- 注入されるべき適切な乳首の位置を確認します。動物がその背側に配置されたときに、それらが容易に可視化されているよう鼠径乳首の3 番目と4 番目のペアは、推奨されています。
- 0.9％滅菌生理食塩水の負荷を0.2mL22 G針で1 mLのルアーロックツベルクリン注射器。適切に生理食塩水を注射器になると22 G針を処分し、無菌の25ゲージの針に交換してください。ゆっくりガーゼパッド上の85％のイソプロピルアルコールで拭きます。
- ニードルアップや動物の体内に注射器の並列のベベルでは、乳頭の側に針のベベルを挿入し、ゆっくりと生理食塩水の0.1から0.2 mLのを注入します。これは、乳管開口部のより良い視覚化を可能にします。
- 負荷1 mLのルアーロックツベルクリン注射器に注射液0.2 mLです。
- 親指と人差し指で軽く乳首を持って、管内の注射のためにそれを配置するために少し持ち上げ、ウェアラブル眼ルーペは、乳管開口部を視覚化するのを助けることができます。
- 乳首の上昇位置を維持しながら、慎重に25 G鈍先端の針を使用して、関心のダクトにカニューレを挿入。
- 挿管後、軽く鈍-トンのハブのルアーロックシリンジをねじりますそれが所定の位置にロックされるまで、腹腔注射針。
- 乳首を持ち上げて、急速にダクト内の流体を移動させることによって引き起こされる潜在的な損傷を最小限に抑えるために、ゆっくりとソリューションを注入。液を注入する際、時間がない時に抵抗があるはずです。
4.超音波画像
- 関心領域の皮膚に遠心分離、超音波ゲルのリベラルな量を適用します。これらは、画像品質を妥協するように、ゲル中に気泡がないことを確認してください。
- 6ミリメートルにイメージング深さを設定します。ゲルと接触して21 MHzのトランスデューサーを配置し、Bモードでの関心領域をスキャンします。乳管開口部とダクトを通して含む走査領域における造影剤を観察します。
注：これらの設定は、特定の光音響超音波機器で使用するために開発されてきました。詳細については、材料の表を参照してください。乳房を最適化する送信電力及び他の撮像システムの撮像深さを調整する必要があるかもしれません腺の可視化。 - ガーゼパッドを動物の皮膚からの超音波ゲルを削除します。
5.術後ケア
- 乳頭領域に対するまたは周囲の組織への外傷の兆候があってはならない、と乳首を囲む領域で膨潤が可能性が高い乳房脂肪パッド注射ではなく、成功した管内注射を示し：注射部位を観察します。
- 胸骨の位置にウサギを置きます。必要に応じて、静脈内に辺縁耳静脈にヨヒンビンの0.2ミリグラム/キログラムを与えます。これは、キシラジンの効果を逆転し、動物が麻酔からより迅速に回復することができます。
- 動物が応答、警告であり、胸骨位置を維持するまで、回復期間を通してウサギを15分ごとに監視します。
注：この手順は、組織の損傷や腫れが生じてはなりません。赤みや腫れが認められた場合、動物が警告とできるようになると、メロキシカムは0.1〜0.2mg / kgのPOの用量を投与経口薬を服用します。さらに指導のために金融機関の獣医のスタッフにお問い合わせください。
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Representative Results
ここでは、ウサギの乳管の造影試薬の管内送達は、組織（ 図2）への外傷なしで達成することができることを示しています。ウサギでは、4つの別々の導管システムは、1つの乳頭に収束するので、アクセスし、この方法を使用して個別に撮像することができます。個々の管の開口部は、容易に可視化されます。 図2Bのカニューレを挿入し、ダクトに隣接する第2の管の開口部をマーキング矢印に注意してください。
線形撮像モードにおける非標的造影試薬での高解像度の超音波画像は、管内送達のリアルタイム読み出しを提供することができます。代表的な画像は、45分後に配信（ 図3）までの試薬の検出を示しています。この技術は、ダクトを介して治療的送達の速度を監視するために有用であり得ます。
図4）に達したかどうか、および任意のダクトは、送達中に破損しているかどうかを決定するために使用することができます。
図1：ウサギ乳腺の概略図。ドットの下位2組は鼠径腺の乳首を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：調製と管内送達のための鼠径乳腺のカニューレ挿入。 （A）右鼠径乳腺の乳頭を直ちに0.9％滅菌生理食塩水を0.2mLの送達後にここに表示されます。注射時に、管の開口部は、より明確に視覚化されます。同じ乳頭内腺管開口部（B）を25 G鈍先端の注射針でカニューレを挿入します。矢印は、カニューレことなく、管の開口部を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
超音波Iによって乳管の中に可視化図3.非標的コントラスト試薬maging。 （A）は、コントラスト試薬は、納品後すぐにローカライズされており、（B）30分後に配信および（C）45分後に配信を可視化されます。乳管内部の試薬の持続性は、このプロトコルの期間を通して可視化を可能にします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：エバンスブルー生理食塩溶液による乳頭を介して注入鼠径乳腺。 （A）エバンスブルー溶液を0.2mLの管内注入後の外観。皮膚を開くと（B）、エバンスブルーは全体の乳管ツリーの可視化を可能にし、無傷の腺管構造を確認しました。 （<強い> C）カルミンのミョウバンで固定し、染色後に鼠径乳腺領域の試料を全マウント。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ウサギの乳腺へ管内送達のこの方法は、超音波造影試薬および不可欠な染料および治療薬を含む多くの他の水溶液に使用することができます。以前の研究は、ホルモン17、18、19の管内送達を実証しました。げっ歯類モデル、核酸8の管内送達、化学療法剤6,7、及びナノ粒子のキャリア8において、20は、行われています。ここで説明するプロトコルは、これらの用途に適合させることができました。
一部のアプリケーションでは、エバンスブルー生体染色色素によって管内送達確認は、皮膚を通して可視化されるように、十分である可能性があります。しかし、皮膚を通しての可視化は、びまん性であり、そして個々のダクトが十分ではありませんdemarcaテッド。エンドポイントの研究では、エバンスブルー生体色素は、全体の乳管ツリーの明確なマップを提供しますが、これは乳房組織の単離を必要とします。したがって、造影超音波は、生きた動物の研究における個々のダクトに管内の配信を可視化するための別のアプローチを提供します。私たちは、コントラスト試薬および超音波マップは唯一の大きいダクトを含みながら、エバンスブルー色素は、最小直径端子ダクトを含む全体の乳管ツリーを、マップすることに注意してください。エバンスブルーは、単一のスナップショット測定を提供するのに対し、もう1つの違いは、超音波の時間ダイナミクスを監視するための可能性です。
げっ歯類乳腺管9へ管内送達するための方法のように、この技術の最も重要な課題および制限は、オペレータのノウハウに頼る可能性があります。しかし、ウサギモデルにおける管開口部の大きなサイズは、手順を単純化し実行する必要がなくなり実体顕微鏡の助けを借りて技術る、および能力を開発するための新たなオペレータのために必要な時間を短縮することができます。我々の経験では、管内の配信に先立って、乳頭の側に生理食塩水の0.1から0.2 mLの注射は、乳管開口部（上記のステップ3.2）の明確な可視化を可能にする重要なステップです。送達部位の正確な位置決めとリフティングにも不可欠です。これは（上記、3.5および3.6ステップ）ソリューションは、ダクト内に流入することを保証します。私たちは、コントラスト試薬の同時投与は、必ずしも他の試薬または治療薬をテストするための利用可能量を削減することに注意してください。しかし、管内送達は、送達を確認するために、エバンスブルーによってイメージングすることなく、または単純な検査を行うことができます。
乳房の最も一般的な非侵襲的病変は、異常な管上皮細胞が乳管の内側に増殖するが、throug浸透しないような非浸潤性乳管癌（DCIS）であり、H隣接する組織への基底膜。マンモグラフィイメージングの進歩により、DCISの検出率が劇的に増加しています。米国では、新たに診断された乳房病変の約25％は、DCISのように分類され、2020年までに、100万人以上の女性が米国だけでDCIS 22、23、24、25との生活されます。しかし、多くのDCIS病変が休止状態のままであり、ほとんどの推定値は唯一の15から40までパーセント21、22、23、24、DCIS病変の25が今まで浸潤がんに進行することがわかります。しかし、現在、腫瘍が浸潤性になるであろうそれらの識別を支援するために何を予測するバイオマーカーはありません。
より多くの女性がこの前癌病変と診断されたように、過剰診断や過剰治療に関する重大な疑問が浮上しています。前癌疾患の治療は、典型的には積極的です。 DCISのほとんどの患者は手術（乳腺腫瘤摘出または乳房切除術）を受けることになる、と多くは、放射線25を受け取ります。ホルモン受容体陽性のDCIS患者の一部はまた、再発を低減することが示されている内分泌療法、の5年以上を受け取ることになります。この治療の副作用は、脳卒中、血栓、骨損失、および子宮および子宮内膜癌の高められた危険性を含んでいてもよいです。これらのオプションのすべては、重大な全身性副作用を有し、患者の生活の質に影響を与えます。低侵襲性治療戦略25のための重要な必要性があります。
両方のマウスモデルにおいて、および乳癌患者における化学療法剤の管内送達は、以前に全身毒性または長期の組織病理学的変化の証拠で、有効であることが示されましたREF "> 3、4、5、6。治療薬の管内投与は1日、まだ局所浸潤病変に進行していないDCISと診断された女性のための新たな選択肢を提供することができます。潜在的に腫瘍形成を停止させるためにも、腺管構造がこれを行い維持しながら、魅力的な治療戦略10。重要なのは、局所的送達のアプローチは、潜在的に他の組織への巻き添え被害を最小限に抑えながら、治療が関連する異常細胞に到達することが保証されます。ウサギ腫瘍モデルが利用可能ではありませんが、ウサギの正常な乳腺がに関連するモデルを提供することができます局所送達、安全性、輸送、および乳管内部の治療薬の取り込みの動態をテストします。これらのインビボ研究は、関連する組織環境内で候補診断および治療のテストと検証を可能にします。
8、9に低侵襲性および局所的な薬物送達を可能にしました。しかし、マウスの乳腺の解剖学は、組織組成と各乳頭で終了ダクトの数などの重要な方法の数の人間の乳房とは異なります。ここで、我々はより密接に乳腺上皮構造で、より大きな動物モデルにこの技術を拡張することは、人間の乳房12、14の解剖学的構造を表します。これは、イメージングによる拡張監視のためとウサギの乳腺管上皮に種々の試薬の同時管内配信をアッセイするための可能性を開きます。人間の腺に似た腺管の解剖学的構造との適切な動物モデルへの局所送達の進歩は、非私の適用を加速させる必要がありますnvasive、ヒトにおける治療戦略をターゲットに。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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