Abstract
Trattamenti intraduttale localizzati per il cancro al seno offrono potenziali vantaggi, compresa la lettura efficiente al tumore e ridotta tossicità sistemica e effetti avversi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Tuttavia, rimangono molte sfide prima di questi trattamenti possono essere applicati più ampiamente. Lo sviluppo e la validazione di terapie intraduttale in un modello animale adeguato facilitano lo sviluppo di strategie terapeutiche per i pazienti intraduttale. Mentre la ghiandola mammaria topo è stato ampiamente utilizzato come sistema modello di sviluppo mammario e tumorigenesi, l'anatomia è distinta dalla ghiandola umana. Un modello animale più grande, come il coniglio, può servire come un modello migliore per la struttura della ghiandola mammaria e sviluppo terapeutico intraduttale. in contrast a topi, in cui dieci alberi dotto sono spazialmente distribuiti lungo l'asse del corpo, ciascuna terminante in un capezzolo a parte, la ghiandola mammaria di coniglio assomiglia più da vicino la ghiandola umana, con più sistemi duttale sovrapposti che escono attraverso le aperture separate in una tettarella. Qui, vi presentiamo i metodi minimamente invasive per la fornitura di reagenti direttamente nel condotto mammaria coniglio e per la visualizzazione della stessa consegna con ecografia ad alta risoluzione.
Introduction
La consegna intraduttale di agenti terapeutici è stata studiata in modelli di roditori e in fase iniziale sperimentazione umana 3, 4, 5, 6, 11, 12. Un recente studio di fase I ha dimostrato la sicurezza e la fattibilità di carboplatino intraduttale o intraduttale doxorubicina liposomiale pegilata in donne in attesa di mastectomia per il trattamento del cancro invasivo 2.
Precedenti protocolli per la consegna intraduttale sono stati sviluppati per topo e ratto mammarie ghiandole 6, 7, 8, 9. Per scopi di ricerca, iniezioni di cellule tumorali intraduttale e la consegna lentivirale vettore di oncogeni sono stati anche eseguiti in modelli di roditoriref "> 13, 14, 15, 16. Tuttavia, un ideale modello in vivo del processo di consegna intraduttale dovrebbe consentire lo sviluppo di nuove classi di composti terapeutici e facilitare la valutazione preclinica. differenze anatomiche tra i roditori e gli esseri umani hanno complicato la traduzione di questi studi.
Diversamente topi, in cui ciascun condotto termina in un capezzolo separata, il seno umano è costituito da 5 a 9 sistemi duttali indipendenti, ognuno con un'apertura separata termina al capezzolo. Coniglio ghiandole mammarie porto quattro sistemi duttale indipendenti, ciascuna separatamente, accessibile attraverso uno dei quattro orifizi in una sola tettarella. Un modello di coniglio più si avvicina al anatomia umana e consente lo studio di drug delivery intraduttale in un contesto più rilevante.
Qui, usiamo due tecniche per valutare la consegna intraduttale. La co-somministrazione di uncolorante vitale permette la visualizzazione attraverso la pelle e fornisce una conferma semplice e rapida del metodo. Per alcune applicazioni, la mappatura risoluzione maggiore dei condotti può essere preferito. Presentiamo qui un protocollo per l'imaging ad ultrasuoni dei condotti attraverso la consegna intraduttale di un reagente non mirato contrasto.
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Protocol
Le procedure che utilizzano soggetti animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Texas di Austin.
1. Preparazione preoperatoria
- Registrare il peso corporeo di ogni coniglio. Come per tutti gli studi preclinici, monitorare i pesi degli animali regolarmente per valutare la potenziale tossicità.
- Prima di anestetizzare il coniglio, riempire una provetta da 50 ml con gel per ultrasuoni disponibili in commercio e far girare a 500 xg per 30 s; ci dovrebbero essere visibili bolle nel gel al termine della centrifugazione.
- Somministrare glicopirrolato per via sottocutanea alla dose di 0,1 mg / kg e acepromazine intramuscolare alla dose di 0,75 mg / kg. Attendere 15-20 minuti per il sedativo abbia effetto, mentre il monitoraggio dei segni vitali e il comportamento.
NOTA: Glicopirrolato è un agente anti-colinergico che impedisce bradicardia e riduce respiratorie e GI secrezioni. Acepromazine è un sedativo che funge da premedication per l'anestesia. - Somministrare 35 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg di xylazina sottocutanea come anestetico. Tuttavia, come l'operatore diventa più esperto e può compiere la consegna intraduttale più rapidamente, diminuire i dosaggi farmaceutiche a 15 mg / kg di ketamina e 3 mg / kg di xylazina sottocutanea; questo ridurrà il tempo di anestesia e il tempo richiesto per l'animale per recuperare da anestesia.
- Controllare e documentare la frequenza cardiaca, SPO 2, temperatura, frequenza respiratoria, e il colore membrana mucosa ogni 15 min. Applicare il lubrificante occhio in entrambi gli occhi.
NOTA: Solo il personale che hanno subito la formazione adeguata e sono stati approvati dalla IACUC della loro istituzione dovrebbe amministrare o monitorare l'anestesia. L'uso di un monitor anestesia veterinario può aiutare ad acquisire segni vitali ed è consigliato. Il monitor anestesia veterinaria, tuttavia, non sostituisce la necessità di controllare manualmente l'animale ogni 15 min. Vedere le istruzioni del produttore Fo l'uso corretto di un monitor veterinaria. - Verificare l'insorgenza di anestesia da un pinch punta dolce; il coniglio deve essere non reattivi prima di continuare.
- radersi con cura l'addome caudale del coniglio nella zona attorno al terzo e quarto coppie di mammelle inguinali.
- Con la maggior parte dei capelli rimossi, applicare una crema depilatoria over-the-counter all'area rasata. Rimuovere il min crema 10 dopo l'applicazione usando tovaglioli di carta umidi bagnate con acqua tiepida.
NOTA: la pelle di coniglio è molto fragile / sensibile. La crema depilatoria deve essere utilizzato per non più di 10 min. In realtà, è più sicuro provare un "punto di prova" a 5 min e lasciare solo il più a lungo se posto test indica un tempo più lungo è necessario periodo. - Pulire l'area con tamponi di garza imbevuta di alcol per pulire il sito di iniezione.
- Posizionare il coniglio sul suo dorso in un recipiente a forma di v foderato con un ricircolo coperta acqua calda e un tampone assorbente.
2. Preparation del mezzo di contrasto
- Ricostituire il reagente non mirati contrasto in base alle istruzioni del produttore. Pipetta su e giù delicatamente per miscelare.
NOTA: L'agente di contrasto utilizzato in questo protocollo è stabile a temperatura ambiente per 4 - 6 h dopo la ricostituzione. oscillare delicatamente il flaconcino tra ogni recupero.
NOTA: Il volume di soluzione necessario dipende dal numero di condotti da iniettare. Il coniglio ha 4 aperture duttale per tettarella, e 0,2 ml di soluzione è sufficiente a riempire un albero duttale di un adulto Nuova Zelanda White Rabbit (Oryctolaguscuniculus). Così, un volume totale di 0,8 ml può essere consegnato ad una ghiandola mammaria.
3. La consegna intraduttale
- Individuare i capezzoli appropriate da iniettare; i 3 ° e 4 ° coppie di mammelle inguinali sono raccomandati, poiché essi vengono facilmente visualizzate quando l'animale è posizionato sul suo dorso.
- Carico 0,2 mL di sterile salina allo 0,9% inuna siringa da tubercolina da 1 ml Luer-serratura con un ago 22 G. Smaltire l'ago G 22 una volta che la soluzione salina è nella siringa e sostituirlo con un ago calibro 25 sterile. Pulire delicatamente l'area con 85% alcol isopropilico ed un tampone di garza.
- Con la smussatura dell'ago e la siringa parallelo al corpo dell'animale, inserire la smussatura dell'ago nel lato del capezzolo e iniettare lentamente 0,1-0,2 mL di soluzione fisiologica; questo permetterà per una migliore visualizzazione delle aperture duttale.
- Carico 0,2 ml di soluzione per l'iniezione in una siringa da tubercolina 1 ml Luer-lock.
- Mantenere la tettarella delicatamente con il pollice e l'indice e sollevarla leggermente per posizionarlo per l'iniezione intraduttale; una lente di ingrandimento oculare indossabile può essere di aiuto nel visualizzare le aperture duttale.
- Pur mantenendo la posizione sollevata del capezzolo, cannulate accuratamente il condotto di interesse utilizzando un ago smussato punta 25 G.
- Dopo l'incannulamento, torcere delicatamente la siringa luer-lock sul mozzo della smussato-tip ago infusione fino a quando non si blocca in posizione.
- Sollevare la tettarella e iniettare la soluzione lentamente per ridurre al minimo i potenziali danni causati dal rapido movimento fluido all'interno della condotta; in nessun momento ci dovrebbe essere la resistenza quando si inietta la soluzione.
4. Ultrasound Imaging
- Applicare una quantità di gel ultrasuoni centrifugato alla pelle della zona di interesse. Verificare che non vi siano bolle nel gel, in quanto questi saranno compromettere la qualità dell'immagine.
- Impostare la profondità di imaging a 6 mm. Posizionare il trasduttore 21 MHz in contatto con il gel e la scansione dell'area di interesse in B-mode. Osservare il mezzo di contrasto nella regione scansionata tra cui l'apertura duttale e nel condotto.
NOTA: Queste impostazioni sono stati sviluppati per l'utilizzo con una specifica macchina ad ultrasuoni fotoacustica. Fare riferimento alla tabella dei materiali per maggiori dettagli. Può essere necessario regolare la potenza di trasmissione e la profondità di imaging di altri sistemi di imaging per ottimizzare mammariavisualizzazione della ghiandola. - Rimuovere il gel per ultrasuoni dalla pelle dell'animale con un tampone di garza.
5. Cura postoperatoria
- Osservare il sito di iniezione: non ci dovrebbero essere i segni di un trauma alla regione del capezzolo o al tessuto circostante, e gonfiore nella zona circostante la tettarella probabilmente indica una mammaria iniezione cuscinetto adiposo, piuttosto che una iniezione di intraduttale successo.
- Posizionare il coniglio in una posizione sternale. Se necessario, dare 0,2 mg / kg per via endovenosa di yohimbina alla vena marginale dell'orecchio; ciò invertire l'effetto della xilazina e permettere all'animale di recuperare più rapidamente da anestesia.
- Monitorare il coniglio ogni 15 minuti per tutto il periodo di recupero fino a quando l'animale è vigile, reattivo, e mantiene una posizione sternale.
NOTA: Questa procedura non dovrebbe causare danni ai tessuti o gonfiore. Se rossore o gonfiore si osservano, somministrare una dose di meloxicam 0.1-0.2 mg / kg PO una volta che l'animale è vigile e in gradodi assumere farmaci per via orale. Contattare personale veterinario dell'istituto per ulteriori indicazioni.
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Representative Results
Qui mostriamo che la consegna intraduttale di reagenti contrasto ai dotti mammari di un coniglio può essere raggiunta senza traumi al tessuto (Figura 2). Nei conigli, quattro sistemi duttale separati convergono in una sola tettarella e, quindi, possono essere consultati e ripreso individualmente con questo metodo. Aperture individuali duttale sono facilmente visualizzati; notare la marcatura di una seconda apertura duttale adiacente al condotto cannulata in Figura 2B freccia.
immagini ecografiche ad alta risoluzione con il reagente di contrasto non mirati in modalità di imaging lineare può fornire una lettura in tempo reale della consegna intraduttale. Immagini rappresentative mostrano rilevamento del reagente fino a 45 min post-parto (Figura 3). Questa tecnica può anche essere utile per monitorare la cinetica della consegna terapeutico attraverso i condotti.
(figura 4) e se eventuali condotti sono danneggiati durante la consegna.
Figura 1: Schema di coniglio ghiandole mammarie. Le due coppie inferiori di punti rappresentano le mammelle delle ghiandole inguinali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione e Incannulazione della ghiandola mammaria inguinale per intraduttale consegna. (A) La tettarella del diritto ghiandola mammaria inguinale è indicato qui subito dopo la consegna di 0,2 ml di soluzione fisiologica 0,9% sterile. Dopo l'iniezione, le aperture duttali sono visualizzati più chiaramente. (B) Un'apertura duttale nella stessa tettarella viene poi cannulata con un ottuso-punta dell'ago infusione 25 G. La freccia indica un'apertura duttale senza una cannula. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. non mirato reagente di contrasto Visualized all'interno del mammaria condotto con l'ecografia IMaging. (A) Il reagente di contrasto è localizzato immediatamente dopo la consegna e viene visualizzata (B) 30 min post-consegna e (C) 45 min post-parto. La persistenza del reagente all'interno del condotto mammaria consente la visualizzazione per tutta la durata di questo protocollo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Una ghiandola mammaria inguinale iniettato attraverso il capezzolo con Blu di Evans soluzione salina. (A) L'aspetto esterno dopo l'iniezione intraduttale di 0,2 mL di soluzione Evans blu. (B) All'apertura della pelle, il Blu di Evans permette di visualizzare l'intero albero duttale mammaria e conferma la struttura duttale intatta. (<strong> C) esemplare di una regione di ghiandola mammaria inguinale tutto il montaggio dopo fissazione e colorazione con Carmine allume. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo modo di somministrazione intraduttale alla ghiandola mammaria coniglio può essere utilizzato per i reagenti di contrasto ecografici e molte altre soluzioni acquose, compresi coloranti vitali e terapeutica. Studi precedenti hanno dimostrato la consegna intraduttale di ormoni 17, 18, 19. Nei modelli di roditori, la consegna intraduttale di acidi nucleici 8, chemioterapici 6, 7 e vettori nanoparticelle 8, 20 sono stati eseguiti. Il protocollo qui descritto potrebbe essere adattato per queste applicazioni.
Per alcune applicazioni, la conferma della consegna intraduttale dal colorante vitale Blu di Evans, come visualizzato attraverso la pelle, può essere sufficiente. Tuttavia, la visualizzazione attraverso la pelle è diffusa, e singoli condotti non sono ben demarcaTed. In studi endpoint, Evans blu colorante vitale fornisce una mappa chiara dell'intero albero duttale, ma questo richiede l'isolamento del tessuto mammario. Pertanto, l'ecografia con contrasto fornisce un approccio alternativo per visualizzare la consegna intraduttale ai singoli condotti in studi su animali vivi. Notiamo che Evans blu colorante associa l'intero albero duttale, compresi i condotti terminali più piccolo diametro, mentre il reagente di contrasto e l'ecografia mappe solo includono i condotti più grandi. Un'altra differenza è la possibilità di monitorare dinamica temporale a ultrasuoni, mentre Evans blu fornisce soltanto una singola misurazione istantanea.
Come nel metodo per la consegna intraduttale al roditore mammaria condotto 9, la sfida più significativa e limitazione a questa tecnica è probabile che sia la dipendenza perizia dell'operatore. Tuttavia, la maggiore dimensione delle aperture duttali in un modello di coniglio semplifica la procedura, elimina la necessità di effettuarezione tecnica con l'ausilio di uno stereomicroscopio, e riduce il tempo richiesto per nuovi operatori per sviluppare competenza. Nella nostra esperienza, l'iniezione di 0,1-0,2 mL di soluzione salina al lato del capezzolo prima della consegna intraduttale è una fase critica che permette la chiara visualizzazione delle aperture duttali (passo 3.2, sopra). Posizionamento accurato e sollevamento del sito consegna è anche essenziale; ciò assicura che la soluzione fluisce nel condotto (passi 3.5 e 3.6, sopra). Notiamo che la co-somministrazione del reagente di contrasto sarà necessariamente ridurre il volume disponibile per testare altri reagenti o terapie. Tuttavia, la consegna intraduttale può anche venire eseguito senza imaging o con una semplice ispezione da Evans blu a confermare la consegna.
La lesione invasiva più comune del seno è il carcinoma duttale in situ (DCIS), in cui anormali cellule epiteliali duttali proliferano all'interno del condotto mammaria, ma non penetrano through la membrana basale al tessuto adiacente. Con i progressi nella diagnostica per immagini mammografico, i tassi di rilevamento di carcinoma duttale in situ sono aumentati drammaticamente. Negli Stati Uniti, circa il 25% delle lesioni mammarie di nuova diagnosi sono classificati come carcinoma duttale in situ, e entro il 2020, più di 1 milione di donne vivrà con DCIS negli Stati Uniti da soli 22, 23, 24, 25. Tuttavia, le lesioni DCIS molti restano in sospeso, e la maggior parte delle stime ritengono che solo 15-40% 21, 22, 23, 24, 25 delle lesioni DCIS potrà mai evolvere in cancro invasivo. Tuttavia, attualmente non esistono biomarcatori predittivi per aiutare nell'identificazione di tumori, che diventeranno invasive.
Mentre sempre più donne con diagnosi di questa lesione pre-cancerosa, domande serie riguardo eccesso di diagnosi e trattamento eccessivo sono emerse. Il trattamento della malattia precancerose è tipicamente aggressivo. La maggior parte dei pazienti con carcinoma duttale in situ saranno sottoposti a un intervento chirurgico (lumpectomia o mastectomia), e molti anche ricevere radiazioni 25. Alcuni pazienti con carcinoma duttale in situ recettori ormonali positivi riceveranno anche 5 o più anni di terapia endocrina, che ha dimostrato di ridurre le recidive. Gli effetti collaterali di questo trattamento possono comprendere ictus, coaguli di sangue, perdita di tessuto osseo, e rischi elevati di uterina e cancri endometriali. Tutte queste opzioni hanno gravi effetti collaterali sistemici e l'impatto della qualità della vita del paziente. C'è un forte bisogno di strategie terapeutiche meno invasive 25.
La consegna intraduttale di agenti chemioterapici in entrambi i modelli di topo e nei pazienti con cancro al seno è stato precedentemente dimostrato di essere efficace, senza evidenza di tossicità sistemica oa lungo termine cambiamenti istopatologiciref "> 3, 4, 5, 6. L'amministrazione intraduttale di terapie potrebbe un giorno offrire nuove opzioni per le donne con diagnosi di carcinoma duttale in situ che non è ancora progredita a una lesione localmente invasivo. Il potenziale per arrestare tumorigenesi pur preservando la struttura duttale rende questo una strategia terapeutica attraente 10. è importante sottolineare che l'approccio erogazione localizzata garantisce che il trattamento raggiunge le relative cellule anormali, mentre potenzialmente ridurre al minimo i danni collaterali ad altri tessuti. mentre i modelli di coniglio tumorali non sono disponibili, il normale ghiandola mammaria di conigli può fornire un modello rilevante per testare le localizzate di consegna, la sicurezza, i trasporti, e la cinetica di assorbimento terapeutica all'interno del condotto mammaria. Questi studi in vivo consentiranno la sperimentazione e la validazione della diagnostica e terapeutica candidati all'interno di un ambiente di tessuto rilevante.
8, 9. Tuttavia, l'anatomia della ghiandola mammaria del mouse differisce dal seno umano in vari modi importanti, tra cui la composizione del tessuto e il numero di condotti che terminano ad ogni capezzolo. Qui, estendiamo questa tecnica per un modello animale più grande in cui la struttura epiteliale mammaria rappresenta più da vicino l'anatomia del seno umano 12, 14. Questo apre la possibilità per il monitoraggio prolungato mediante imaging e per saggiare la consegna intraduttale concomitante di diversi reagenti per il coniglio mammaria duttale epitelio. I progressi nella erogazione localizzata di un modello animale adeguato, con l'anatomia duttale simili alla ghiandola umana, dovrebbero accelerare l'applicazione della non-invasive, mirate strategie terapeutiche negli esseri umani.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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