Abstract
Intracanalaires traitements localisés pour le cancer du sein présentent des avantages potentiels, y compris une livraison efficace de la tumeur et une toxicité systémique réduite et des effets secondaires 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Cependant, plusieurs défis restent à relever avant que ces traitements peuvent être appliqués plus largement. Le développement et la validation de la thérapeutique intracanalaires dans un modèle animal approprié de faciliter le développement de stratégies thérapeutiques pour les patients intracanalaires. Alors que la glande mammaire de la souris a été largement utilisé comme système de modèle de développement mammaire et la tumorigenèse, l'anatomie est distincte de la glande humaine. Un modèle animal plus grand, comme le lapin, peut servir de modèle pour améliorer la structure de la glande mammaire et le développement thérapeutique intracanalaire. en contrast à des souris, dans laquelle dix arbres canalaires sont spatialement répartis le long de l'axe du corps, chacune se terminant dans un trayon distinct, la glande de lapin mammaire ressemble plus étroitement à la glande humaine avec de multiples systèmes canalaires qui se chevauchent et sortent à travers des ouvertures distinctes dans une tétine. Ici, nous présentons les méthodes peu invasives pour la fourniture de réactifs directement dans le conduit mammaire de lapin et pour la visualisation de la livraison lui-même avec imagerie par ultrasons à haute résolution.
Introduction
La livraison intracanalaire d'agents thérapeutiques a été étudié dans des modèles de rongeurs et à un stade précoce des essais humains 3, 4, 5, 6, 11, 12. Une récente étude de phase I a démontré la sécurité et la faisabilité de carboplatine intracanalaire ou intracanalaire doxorubicine liposomale pégylée chez les femmes en attente d'une mastectomie pour le traitement du cancer invasif 2.
Protocoles précédents pour la livraison intracanalaire ont été développés pour la souris et mammaires de rat glandes 6, 7, 8, 9. À des fins de recherche, intracanalaires injections de cellules tumorales et de la délivrance de vecteur lentiviral d'oncogènes ont également été effectuées dans des modèles de rongeursref "> 13, 14, 15, 16. Cependant, un idéal modèle in vivo du processus de livraison intracanalaire devrait permettre le développement de nouvelles classes de composés thérapeutiques et de faciliter l' évaluation préclinique. Les différences anatomiques entre les rongeurs et les humains ont compliqué la traduction de ces études.
Contrairement aux souris, dans lequel chaque canal se termine à un trayon distinct, le sein humain est constitué de 5 à 9 canalaires systèmes indépendants, chacun avec une ouverture séparée qui se termine à la tétine. Lapin glandes mammaires abritent quatre systèmes canalaires indépendants, chacun accessible séparément par l'un des quatre orifices dans un seul trayon. Un modèle de lapin correspond plus étroitement l'anatomie humaine et permet l'étude de la délivrance du médicament intracanalaire dans un contexte plus pertinent.
Ici, nous utilisons deux techniques pour évaluer la prestation intracanalaire. La co-administration d'uncolorant vital permet la visualisation à travers la peau et donne une confirmation simple et rapide de la méthode. Pour certaines applications, la cartographie résolution plus élevée des canaux peut être préférée. Nous présentons ici un protocole d'imagerie par ultrasons des conduits grâce à la fourniture d'un réactif intracanalaire non ciblé contraste.
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Protocol
Les procédures utilisant des sujets animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université du Texas à Austin.
1. Préparation préopératoire
- Enregistrer le poids corporel de chaque lapin. Comme pour toutes les études précliniques, surveiller le poids des animaux régulièrement pour évaluer la toxicité potentielle.
- Avant anesthésier le lapin, remplir un tube de 50 ml conique disponible dans le commerce gel échographique et de spin à 500 g pendant 30 s; il n'y aura pas de bulles visibles dans le gel lors de l'achèvement de la centrifugation.
- Administrer le glycopyrrolate sous-cutanée à une dose de 0,1 mg / kg et acépromazine par voie intramusculaire à une dose de 0,75 mg / kg. Attendre 15-20 minutes pour le sédatif pour prendre effet, tout en surveillant les signes et les comportements vitaux.
REMARQUE: Le glycopyrrolate est un agent anti-cholinergique qui empêche la bradycardie et de réduire les sécrétions des voies respiratoires et gastro-intestinaux. Acépromazine est un sédatif qui sert premedicatipendant l'anesthésie. - Administrer 35 mg / kg de kétamine et de 5 mg / kg de xylazine par voie sous- cutanée comme anesthésique. Cependant, comme l'opérateur devient plus expérimenté et peut accomplir la livraison intracanalaire plus rapidement, diminuer les doses de médicaments à 15 mg / kg de kétamine et de 3 mg / kg de xylazine voie sous-cutanée; cela va raccourcir le temps d'anesthésie et le temps nécessaire à l'animal pour récupérer de l'anesthésie.
- Vérifier et documenter la fréquence cardiaque, SPO 2, température, fréquence respiratoire, et la couleur de la membrane de mucus toutes les 15 min. Appliquer un lubrifiant oculaire aux deux yeux.
NOTE: Seul le personnel ayant reçu une formation appropriée et ont été approuvés par IACUC de leur institution doit administrer ou contrôler l'anesthésie. L'utilisation d'un moniteur d'anesthésie vétérinaire peut aider à l'acquisition de signes vitaux et est recommandée. Le moniteur d'anesthésie vétérinaire, cependant, ne remplace pas la nécessité de vérifier manuellement toutes les 15 minutes l'animal. Voir les instructions du fabricant fou l'utilisation appropriée d'un moniteur vétérinaire. - Vérifier le début de l'anesthésie par un pincement de l'orteil douce; le lapin doit être non réactif avant de continuer.
- raser soigneusement l'abdomen caudale du lapin dans la zone autour des troisième et quatrième paires de mamelles inguinales.
- Avec la majorité des cheveux enlevés, appliquer une crème dépilatoire over-the-counter cheveux pour la zone rasée. Retirer la crème 10 min après l'application à l'aide du papier absorbant humide en contact avec de l'eau chaude.
REMARQUE: la peau de lapin est très fragile / sensible. La crème dépilatoire doit être utilisé pour pas plus de 10 min. En fait, il est plus sûr d'essayer un "spot test" à 5 min et ne laisser plus longtemps si spot test indique une durée plus longue période est nécessaire. - Essuyez la surface avec des tampons de gaze imbibé d'alcool pour nettoyer le site d'injection.
- Placez le lapin sur son dos dans une auge en forme de V bordée d'une couverture d'eau chaude à recirculation et un tampon absorbant.
2. Prde l'agent a séparation de contraste
- Reconstituer le réactif non ciblé contraste selon les instructions du fabricant. Pipeter haut et en bas doucement pour mélanger.
REMARQUE: L'agent de contraste utilisé dans ce protocole est stable à la température ambiante pendant 4 à 6 heures après la reconstitution. Agitez doucement le flacon entre chaque extraction.
REMARQUE: le volume de solution requis dépendra du nombre de conduits à injecter. Le lapin a 4 ouvertures canalaires par trayon, et 0,2 ml de solution est suffisante pour remplir un arbre canalaire d'un adulte en Nouvelle - Zélande White Rabbit (Oryctolaguscuniculus). Ainsi, un volume total de 0,8 ml peut être délivré à une glande mammaire.
3. Livraison Intracanalaire
- Repérez les trayons appropriées à injecter; les 3 e et 4 e paires de trayons inguinaux sont recommandés, car ils sont facilement visualisées lorsque l'animal est placé sur son dos.
- Charge 0,2 ml de solution stérile saline à 0,9% enune seringue de tuberculine 1 ml luer-lock avec une aiguille 22 G. Éliminer correctement l'aiguille 22 G, une fois la solution saline est dans la seringue et la remplacer par une aiguille de calibre 25 stérile. Essuyez doucement la zone avec 85% d'alcool isopropylique sur un tampon de gaze.
- Avec le biseau de l'aiguille et la seringue parallèlement au corps de l'animal, insérer le biseau de l'aiguille dans le côté de la tétine et injecter lentement 0,1 au 0,2 ml de solution saline; cela permettra une meilleure visualisation des ouvertures canalaires.
- Charge 0,2 ml de solution d'injection dans une seringue à tuberculine de 1 ml luer-lock.
- Tenir la tétine doucement avec le pouce et l'index et soulevez-le légèrement pour le positionner pour l'injection intra-canalaire; une loupe oculaire portable peut aider à visualiser les ouvertures canalaires.
- Tout en maintenant la position relevée de la tétine, canuler soigneusement le conduit d'intérêt en utilisant une aiguille émoussée de pointe 25 G.
- Après canulation, tourner doucement la seringue luer-lock sur le moyeu de la émoussée-taiguille de perfusion ip jusqu'à ce qu'il soit verrouillé en place.
- Soulevez la tétine et injecter lentement la solution pour minimiser les dommages potentiels causés par le déplacement rapide du fluide dans le conduit; à aucun moment il devrait y avoir une résistance lors de l'injection de la solution.
4. Ultrasound Imaging
- Appliquer une quantité généreuse de gel échographique centrifugé à la peau de la zone d'intérêt. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans le gel, car ceux-ci compromettre la qualité d'image.
- Régler la profondeur d'imagerie à 6 mm. Placer le transducteur 21 MHz en contact avec le gel, et balayer la zone d'intérêt en mode B. Observer le milieu de contraste dans la région balayée incluant l'ouverture du canal artériel et à travers le conduit.
REMARQUE: Ces paramètres ont été développés pour une utilisation avec une machine spécifique à ultrasons photoacoustique. Reportez-vous à la table des matières pour plus de détails. Il peut être nécessaire d'ajuster la puissance d'émission et la profondeur des autres systèmes d'imagerie d'imagerie mammaire pour optimiservisualisation de presse-étoupe. - Retirer le gel à ultrasons de la peau de l'animal avec un tampon de gaze.
5. Soins postopératoires
- Observer le site d'injection: il devrait y avoir aucun signe de traumatisme à la région du trayon ou aux tissus environnants, et un gonflement dans la zone entourant la tétine indique probablement une injection de coussinet adipeux mammaire plutôt qu'une injection intra-canalaire réussie.
- Placez le lapin dans une position sternale. Si besoin est, donner de 0,2 mg / kg de yohimbine par voie intraveineuse à la veine marginale de l'oreille; cela va inverser l'effet de la xylazine et de permettre à l'animal de récupérer plus rapidement de l'anesthésie.
- Surveiller le lapin toutes les 15 min pendant toute la période de récupération jusqu'à ce que l'animal est vigilant, réceptif, et maintient une position sternale.
REMARQUE: Cette procédure ne devrait pas entraîner des lésions tissulaires ou de l'enflure. Si une rougeur ou un gonflement sont observées, administrer une dose de meloxicam 0,1-0,2 mg / kg PO une fois que l'animal est alerte et capablede prendre des médicaments par voie orale. Contactez le personnel vétérinaire de l'établissement de nouvelles orientations.
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Representative Results
Ici, nous montrons que la distribution de contraste intracanalaire réactifs aux conduits mammaires de lapin peut être obtenue sans un traumatisme du tissu (figure 2). Chez les lapins, quatre systèmes canalaires distincts convergent à une tétine et peuvent donc être consultés et visualisés individuellement à l'aide de cette méthode. ouvertures canalaires individuels sont facilement visualisées; noter le marquage d' une deuxième ouverture du canal artériel adjacent à la gaine tubulée sur la figure 2B pointe de flèche.
Haute résolution de l'imagerie par ultrasons avec un réactif de contraste non ciblée dans le mode d'imagerie linéaire peut fournir une lecture en temps réel de la fourniture intracanalaire. Des images représentatives montrent la détection du réactif jusqu'à 45 min après l'accouchement (Figure 3). Cette technique peut également être utile pour surveiller la cinétique d'administration thérapeutique à travers les conduits.
(figure 4) , et si des canaux sont endommagés lors de la livraison.
Figure 1: Schéma du Lapin Mammaire Glands. Les deux paires inférieures de points représentent les trayons des ganglions inguinaux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Préparation et canulation du inguinale glande mammaire pour Intracanalaire livraison. (A) La tétine de la glande mammaire inguinale droite est montré ici immédiatement après la livraison de 0,2 ml de solution saline 0,9% stérile. Lors de l'injection, les ouvertures canalaires sont visualisées plus clairement. (B) Une ouverture canalaire dans la même tétine est ensuite canulée avec un blunt-pointe aiguille 25 G de perfusion. La flèche indique une ouverture canalaire sans une canule. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Non-ciblé Contraste Réactif visualisé dans le Mammaire Duct par ultrasons Iforgemagie. (A) Le réactif de contraste est localisé immédiatement après l' accouchement et est visualisé (B) après livraison 30 min et (C) 45 min après l'accouchement. La persistance du réactif à l'intérieur du conduit mammaire permet la visualisation pendant toute la durée de ce protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Une inguinale glande mammaire Injecté par la Tétine avec Evans Bleu Solution Saline. (A) L'aspect extérieur après l'injection intra - canalaire de 0,2 ml de solution de bleu d' Evans. (B) Lors de l' ouverture de la peau, le Blue Evans permet la visualisation de l'ensemble de l' arbre canalaire mammaire et confirme la structure canalaire intacte. (<strong> C) Le total monture spécimen d'une région de la glande mammaire inguinale après fixation et coloration avec le carmin alun. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cette méthode de livraison intracanalaire au lapin glande mammaire peut être utilisé pour des réactifs de contraste pour ultrasons et bien d'autres solutions aqueuses, y compris des colorants et des agents thérapeutiques vitaux. Des études antérieures ont démontré la fourniture intracanalaire des hormones 17, 18, 19. Chez les rongeurs, la livraison intracanalaire d'acides nucléiques 8, chimiothérapeutiques 6, 7, et les transporteurs de nanoparticules 8, 20 ont été réalisées. Le protocole décrit ici pourrait être adapté à ces applications.
Pour certaines applications, la confirmation de la livraison intracanalaire par colorant bleu Evans vital, comme visualisé à travers la peau, peut être suffisante. Cependant, la visualisation à travers la peau est diffuse, et conduits individuels ne sont pas bien démarcationted. Dans les études d'extrémité, colorant bleu Evans vital fournit une carte claire de l'arbre canalaire entier, mais cela nécessite l'isolement du tissu mammaire. Par conséquent, échocardiographie de contraste fournit une approche alternative pour visualiser la livraison intracanalaire à des conduits individuels dans les études d'animaux vivants. Nous notons que colorant bleu Evans mappe l'arbre canalaire entier, y compris les conduits de terminaux plus petit diamètre, tandis que le réactif de contraste et l'échographie cartes ne comprennent les conduits plus grands. Une autre distinction est la possibilité de contrôler la dynamique temporelle à l'échographie, alors que bleu Evans ne donne qu'une mesure de cliché unique.
Comme dans la méthode de livraison intracanalaire au conduit rongeur mammaire 9, le défi le plus important et la limitation à cette technique est susceptible d'être le recours à l' expertise de l' opérateur. Cependant, la plus grande taille des ouvertures canalaires dans un modèle de lapin simplifie la procédure élimine le besoin d'effectuertion de la technique à l'aide d'un stéréomicroscope, et raccourcit le temps nécessaire pour les nouveaux opérateurs pour développer ses compétences. Dans notre expérience, l'injection de 0,1-0,2 ml de solution saline sur le côté de la tétine avant la livraison intracanalaire est une étape cruciale qui permet la visualisation claire des ouvertures canalaires (étape 3.2, ci-dessus). Le positionnement précis et la levée du site de livraison est également essentielle; cela garantit que la solution circule dans le conduit (étapes 3.5 et 3.6 ci-dessus). Nous notons que la co-administration du réactif de contraste sera nécessairement réduire le volume disponible pour tester d'autres réactifs ou thérapeutiques. Cependant, la livraison intracanalaire peut également être effectuée sans l'imagerie ou avec une simple inspection par Evans bleu pour confirmer la livraison.
La lésion la plus courante non invasive du sein est le carcinome canalaire in situ (CCIS), dans laquelle les cellules prolifèrent épithéliales des canaux anormaux à l' intérieur du canal mammaire , mais ne pénètrent pas dans through la membrane basale du tissu adjacent. Avec les progrès de l'imagerie mammographique, les taux de DCIS de détection ont augmenté de façon spectaculaire. Aux États-Unis, environ 25% des lésions mammaires nouvellement diagnostiqués sont classés comme DCIS, et d'ici 2020, plus de 1 million de femmes va vivre avec DCIS aux États-Unis seulement 22, 23, 24, 25. Cependant, les lésions de nombreux DCIS restent dormantes, et la plupart des estimations constatent que seulement 15-40% 21, 22, 23, 24, 25 des lésions CCIS sera jamais évoluer vers un cancer invasif. Cependant, il n'y a actuellement aucun biomarqueurs prédictifs pour aider à l'identification des tumeurs qui vont devenir envahissantes.
Comme plus de femmes sont diagnostiquées avec cette lésion pré-cancéreuse, de sérieuses questions sur-diagnostic et de surtraitement ont émergé. Le traitement d'une maladie précancéreuse est généralement agressif. La plupart des patients souffrant de DCIS vont subir une chirurgie (tumorectomie ou une mastectomie), et beaucoup reçoivent également un rayonnement 25. Certains patients atteints de DCIS récepteurs hormonaux positifs recevront également 5 ans ou plus de la thérapie endocrinienne, qui a été montré pour réduire la récidive. Les effets secondaires de ce traitement peuvent inclure accident vasculaire cérébral, de caillots de sang, la perte osseuse et des risques élevés de l'utérus et de cancers de l'endomètre. Toutes ces options ont des effets secondaires graves systémique et impact sur la qualité de vie des patients. Il existe un besoin important pour les stratégies thérapeutiques moins invasives 25.
La fourniture intracanalaire d'agents chimiothérapeutiques dans les deux modèles de souris et chez des patients atteints de cancer du sein a été précédemment montré pour être efficace, sans aucun signe de toxicité systémique ou à long terme des changements histopathologiquesref "> 3, 4, 5, 6. L'administration intra - canalaire de la thérapeutique pourrait un jour offrir de nouvelles options pour les femmes diagnostiquées avec DCIS qui n'a pas encore évolué vers une lésion localement invasive. Le potentiel pour arrêter la tumorigenèse , tout en préservant la structure canalaire rend cette une stratégie thérapeutique séduisante 10. Fait important, l'approche de livraison localisée assure que le traitement atteigne les cellules anormales pertinentes tout en minimisant potentiellement des dommages collatéraux à d' autres tissus. alors que les modèles de lapin de tumeur ne sont pas disponibles, la glande mammaire normale de lapins peut fournir un modèle pertinent pour tester les localisées livraison, la sécurité, le transport et la cinétique de la thérapeutique absorption dans le conduit mammaire. Ces études in vivo permettront à l'essai et la validation des diagnostics candidats et thérapeutiques au sein d' un environnement tissulaire pertinent.
8, 9. Cependant, l'anatomie de la glande mammaire de souris diffère du sein humain dans un certain nombre d'aspects importants, y compris la composition des tissus et le nombre de canaux qui se terminent à chaque trayon. Ici, on étend cette technique à un modèle animal plus large dans lequel la structure de l' épithélium mammaire représente plus étroitement l'anatomie du sein humain 12, 14. Ceci ouvre la possibilité d'une surveillance prolongée par imagerie et pour doser la fourniture intracanalaire concomitante de divers réactifs au lapin mammaire canalaire épithélium. Les progrès de la livraison localisée à un modèle animal approprié, avec canalaire anatomie similaire à la glande humaine, devraient accélérer l'application de la non-invasive, ciblé des stratégies thérapeutiques chez l'homme.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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