Abstract
Intraductais tratamentos localizados para o cancro da mama oferecem vantagens potenciais, incluindo a entrega eficiente para o tumor e reduziu a toxicidade sistémica e efeitos adversos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. No entanto, vários desafios permanecem antes que esses tratamentos podem ser aplicados de forma mais ampla. O desenvolvimento e validação de terapêuticas intraductais em um modelo animal apropriado facilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas intraductais para os pacientes. Enquanto a glândula mamaria do rato tem sido amplamente utilizada como um sistema modelo de desenvolvimento mamário e a tumorigénese, a anatomia é distinta da glândula humano. Um modelo animal maior, tal como o coelho, pode servir como modelo para uma melhor estrutura de glândula mamaria e no desenvolvimento terapêutico intraductal. em cOntrast para ratos, em que dez árvores ductal são espacialmente distribuídos ao longo do eixo do corpo, cada uma terminando em uma teta separada, a glândula mamária de coelho mais se assemelha a glândula humana, com vários sistemas sobrepostos ductal que a saída através de aberturas separadas em uma teta. Aqui, apresentamos métodos minimamente invasivos para a entrega de reagentes diretamente no ducto mamário coelho e para visualização do próprio parto com a ultra-sonografia de alta resolução.
Introduction
A entrega intraductal de agentes terapêuticos tem sido estudada em modelos de roedores e em início de carreira testes em humanos 3, 4, 5, 6, 11, 12. A Fase I recente estudo demonstrou a segurança ea viabilidade de carboplatina intraductal ou intraductal doxorrubicina lipossomal peguilada em mulheres que aguardam mastectomia para o tratamento de câncer invasivo 2.
Protocolos anteriores para entrega intraductal foram desenvolvidos para rato e mamárias de ratos glândulas 6, 7, 8, 9. Para fins de investigação, as injecções de células de tumor intraductal e a entrega de vector lentiviral de oncogenes também foram realizados em modelos de roedoresref "> 13, 14, 15, 16. No entanto, um ideal em modelo vivo do processo de entrega intraductal deve permitir o desenvolvimento de novas classes de compostos terapêuticos e facilitar a avaliação pré-clínica. diferenças anatômicas entre roedores e humanos têm complicado a tradução destes estudos.
Ao contrário dos ratos, em que cada conduta termina a uma tetina separada, da mama humano consiste de 5 a 9 ductais sistemas independentes, cada um com uma abertura separada terminando na tetina. Coelho glândulas mamárias abrigar quatro sistemas ductais independentes, cada um separadamente, acessível através de um de quatro orifícios em uma única tetina. Um modelo de coelho corresponda melhor a anatomia humana e permite o estudo da entrega da droga intraductal em um contexto mais relevante.
Aqui, usamos duas técnicas para avaliar a prestação intraductal. A co-administração de umcorante vital permite a visualização através da pele e fornece uma confirmação simples e rápida do método. Para algumas aplicações, o mapeamento de resolução mais elevado dos ductos podem ser preferidos. Nós apresentamos aqui um protocolo para ultra-sonografia das condutas através da entrega intraductal de um reagente não-alvo contraste.
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Protocol
Procedimentos usando indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade do Texas em Austin.
1. Pré-operatório Preparação
- Registe o peso do corpo de cada coelho. Tal como acontece com todos os estudos pré-clínicos, monitorar os pesos dos animais regularmente para avaliar a toxicidade potencial.
- Antes de se anestesiar o coelho, encher um tubo de 50 mL cónico com gel de ultra-sons comercialmente disponível e de centrifugação a 500 xg durante 30 s; não deve haver bolhas visíveis no gel após a conclusão da centrifugação.
- Administrar glicopirrolato por via subcutânea numa dose de 0,1 mg / kg e acepromazina por via intramuscular numa dose de 0,75 mg / kg. Aguarde 15-20 minutos para o sedativo para entrar em vigor durante o acompanhamento de sinais e comportamentos vitais.
NOTA: O glicopirrolato é um agente anti-colinérgico que impede bradicardia e reduz respiratórias e secreções gastrointestinais. Acepromazina é um sedativo que serve como um premedicatipor anestesia. - Administrar 35 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina por via subcutânea como um anestésico. No entanto, como o operador torna-se mais experiente e pode realizar a entrega intraductal mais rapidamente, diminuir as doses de droga a 15 mg / kg de cetamina e 3 mg / kg de xilazina por via subcutânea; isto irá diminuir o tempo de anestesia e o tempo necessário para o animal a recuperar da anestesia.
- Verificar e documentar a frequência cardíaca, SPO 2, temperatura, frequência respiratória, e cor membrana mucosa a cada 15 minutos. Aplique lubrificante olho em ambos os olhos.
NOTA: Apenas pessoal que tenha recebido uma formação adequada e tenham sido aprovados pelo IACUC da sua instituição deve administrar ou controlar a anestesia. A utilização de um monitor de anestesia veterinária pode auxiliar na aquisição de sinais vitais, é recomendada. O monitor de anestesia veterinária, no entanto, não substitui a necessidade de verificar manualmente o animal a cada 15 minutos. Veja as instruções do fabricante fou o uso adequado de um monitor de veterinária. - Verifique se o início da anestesia por uma pitada toe suave; o coelho deve ser não-responsivo antes de continuar.
- Cuidadosamente raspar o abdome caudal do coelho na área em torno do terceiro e quarto pares de tetas inguinais.
- Com a maioria dos cabelos removidos, aplicar um creme de depilação over-the-counter à área rapada. Retire o creme de 10 min após a aplicação usar toalhas de papel húmidas molhadas com água morna.
NOTA: pele de coelho é muito frágil / sensível. O creme de depilação deve ser usado para não mais do que 10 min. De facto, é mais seguro para tentar um "ponto de teste" em 5 min e apenas deixar no local já não se teste indica um tempo mais longo é necessário período. - Limpe a área com compressas de gaze embebido em álcool para limpar o local da injeção.
- Coloque o coelho no seu dorso em uma calha em forma de v forrada com um cobertor água morna recirculação e uma almofada absorvente.
2. Preparation do agente de contraste
- Reconstituir o reagente não-alvo de contraste de acordo com as instruções do fabricante. Pipeta cima e para baixo suavemente para misturar.
NOTA: O agente de contraste utilizado na presente protocolo é estável à temperatura ambiente durante 4-6 h depois da reconstituição. Agite suavemente o frasco entre cada recuperação.
NOTA: O volume da solução requerida irá depender do número de condutas a ser injectada. O coelho tem aberturas 4 ductais por tetina, e 0,2 mL de solução é suficiente para preencher uma árvore ductal de um adulto coelho branco da Nova Zelândia (Oryctolaguscuniculus). Assim, um volume total de 0,8 mL pode ser entregue a uma glândula mamaria.
3. Entrega Intraductal
- Localize as tetas apropriadas a serem injetados; os 3º e 4º pares de tetas inguinais são recomendados, pois eles são facilmente visualizados quando o animal é posicionado sobre seu dorso.
- Carga 0,2 ml de solução salina estéril 0,9% emuma seringa de tuberculina de 1 ml de Luer-lock com uma agulha 22 G. Descarte a agulha G 22 uma vez que a solução salina é na seringa e substituí-lo com uma agulha de calibre 25 estéril. Limpe cuidadosamente a área com 85% de álcool isopropílico em uma gaze.
- Com o bisel da agulha para cima e a seringa paralela ao corpo do animal, inserir o bisel da agulha para o lado da tetina e injectar lentamente 0,1-0,2 mL de solução salina; isso vai permitir uma melhor visualização das aberturas ductal.
- Carregar 0,2 ml de solução de injecção para uma seringa de tuberculina de 1 ml de bloqueio Luer.
- Segure a tetina suavemente com o polegar eo dedo indicador e levante-o ligeiramente para posicioná-la para a injeção intraductal; uma lupa de ocular wearable pode ajudar a visualizar as aberturas ductal.
- Enquanto se mantém a posição elevada do teto, canular cuidadosamente a conduta de interesse usando uma agulha de ponta romba 25 G.
- Após punção, gire suavemente a seringa Luer-lock no cubo da franco-tagulha da infusão ip até travar no lugar.
- Levantar a tetina e injectar a solução lentamente para minimizar o dano potencial causado pelo movimento rápido do fluido no interior da conduta; em nenhum momento deve haver resistência ao injetar a solução.
4. Ecografia
- Aplique uma quantidade generosa de gel de ultra-som centrifugado para a pele da área de interesse. Certifique-se de que não existem bolhas no gel, como estes irão comprometer a qualidade da imagem.
- Defina a profundidade da imagem a 6 mm. Posicionar o transdutor de 21 MHz em contacto com o gel e digitalizar a área de interesse em modo-B. Observar o meio de contraste na região digitalizada, inclusive a abertura ductal e ao longo da conduta.
NOTA: Estas definições foram desenvolvidos para uso com uma máquina de ultra-som fotoacústica específico. Consulte a tabela de materiais para mais detalhes. Pode ser necessário ajustar a potência de transmissão e a profundidade da imagem de outros sistemas de imagem para optimizar mamáriavisualização glândula. - Remover o gel de ultra-som da pele do animal com uma almofada de gaze.
5. Cuidados no pós-operatório
- Observar o local da injecção: não deve haver sinais de trauma para a região da tetina ou para o tecido circundante, e inchaço na área circundante da tetina provavelmente indica uma injecção de almofada de gordura mamaria em vez de uma injecção intraductal bem sucedida.
- Coloque o coelho numa posição esternal. Se necessário, dar 0,2 mg / kg de ioimbina por via intravenosa na veia marginal da orelha; isto irá reverter o efeito da xilazina e permitir que o animal a recuperar mais rapidamente da anestesia.
- Monitorar o coelho a cada 15 min durante todo o período de recuperação até que o animal está alerta, ágil e mantém uma posição esternal.
NOTA: Este procedimento não deve resultar em danos nos tecidos ou inchaço. Se vermelhidão ou inchaço são observados, administrar uma dose de meloxicam de 0,1-0,2 mg / kg, PO, uma vez que o animal é alerta e capazde tomar a medicação por via oral. Entre em contato com o pessoal veterinário da instituição para obter mais orientações.
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Representative Results
Aqui, mostra-se que a entrega de reagentes intraductal contraste com as condutas mamarias de um coelho pode ser alcançado sem trauma para o tecido (Figura 2). Em coelhos, quatro sistemas ductais separadas convergem para uma tetina e, assim, podem ser acedidos individualmente e fotografada utilizando este método. aberturas ductal individuais são facilmente visualizado; Observe a marcação de uma segunda abertura ductal adjacente à conduta canulada na Figura 2B ponta de seta.
ultra-sonografia de alta resolução com o reagente contraste irrelevantes no modo de imagem linear pode fornecer uma leitura em tempo real da entrega intraductal. Imagens representativas mostram a detecção do reagente de até 45 min pós-parto (Figura 3). Esta técnica também pode ser útil para monitorizar a cinética da libertação terapêutica através das condutas.
(Figura 4) e se quaisquer condutas sejam danificadas durante o parto.
Figura 1: Esquema de coelho glândulas mamárias. Os dois pares inferiores de pontos representam as tetas dos gânglios inguinais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação e canulação da inguinal glândula mamária para Intraductal entrega. (A) A tetina da glândula mamaria inguinal direita é mostrado aqui, imediatamente após a entrega de 0,2 mL de 0,9% de solução salina estéril. Após a injecção, as aberturas ductais são visualizados mais claramente. (B) uma abertura na mesma ductal tetina é então canulado com uma agulha de infusão de ponta romba 25 L. A seta indica uma abertura ductal sem uma cânula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Não-alvo Reagente Contraste Visualizado dentro da mamária Duct por ultra-som Imaging. (A) O reagente de contraste é localizada imediatamente após o parto e é visualizado (B) 30 min pós-parto e (C) 45 min pós-parto. A persistência do reagente dentro do ducto mamário permite a visualização durante toda a duração deste protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Um inguinal glândula mamária injetado através do Teat com Evans Blue solução salina. (A) A aparência externa após a injecção intraductal de 0,2 ml de solução de azul de Evans. (B) Ao abrir a pele, o azul de Evans permite a visualização de todo o dutal mamaria e confirma a estrutura ductal intacta. (<strong> C) espécime de uma região da glândula mamária inguinal Todo-mount após fixação e coloração com alum carmim. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este método de entrega intraductal para a glândula mamaria de coelho pode ser utilizada para reagentes de contraste para ultrassons e muitas outras soluções aquosas, incluindo corantes vitais e terapêutica. Estudos anteriores demonstraram a entrega intraductal de hormônios 17, 18, 19. Em modelos de roedores, a entrega intraductal de ácidos nucleicos 8, quimioterápicos 6, 7, e transportadores de nanopartículas 8, 20 foram realizados. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado para estas aplicações também.
Para algumas aplicações, a confirmação da entrega intraductal por Azul de Evans corante vital, tal como visualizado através da pele, pode ser suficiente. No entanto, a visualização através da pele é difusa, e dutos individuais não são bem demarcated. Em estudos de ponto final, azul de Evans do corante vital fornece um mapa claro de toda a árvore ductal, mas este requer o isolamento do tecido mamário. Portanto, ultra-som com contraste proporciona uma abordagem alternativa para a visualização a entrega intraductal a condutas individuais em estudos com animais vivos. Notamos que corante azul de Evans mapeia toda a árvore ductal, incluindo os dutos do terminal menor diâmetro, enquanto reagente contraste e ultra-som mapas incluem apenas os dutos maiores. Outra distinção é a possibilidade de monitorar dinâmica temporal em ultra-sonografia, enquanto Evans Blue fornece apenas uma única medição instantâneo.
Tal como no método de entrega intraductal para a conduta de roedor mamária 9, o maior desafio e limitação a esta técnica é provavelmente a dependência da perícia do operador. No entanto, o maior tamanho das aberturas ductais num modelo de coelho simplifica o processo, elimina a necessidade de realizarção da técnica com o auxílio de um microscópio estereoscópico, e encurta o tempo necessário para novos operadores para desenvolver a proficiência. Na nossa experiência, a injecção de 0,1-0,2 mL de soro fisiológico para o lado da teta antes da entrega intraductal é um passo crítico que permite a visualização das aberturas ductal (passo 3.2, acima). posicionamento preciso e levantamento do local de entrega também é essencial; isto assegura que a solução flui para dentro da conduta (passos 3.5 e 3.6, supra). Fazemos notar que a co-administração do reagente de contraste irá necessariamente reduzir o volume disponível para testar outros reagentes ou agentes terapêuticos. No entanto, a entrega intraductal também pode ser realizada sem ou com imagem latente de inspecção simples por Azul de Evans para confirmar a entrega.
A lesão não invasiva mais comum da mama é o carcinoma ductal in situ (DCIS), em que as células epiteliais do dueto anormais proliferam no interior da conduta mamaria mas não penetram atravh, a membrana basal com o tecido adjacente. Com os avanços da imagem mamográfica, as taxas de detecção de DCIS têm aumentado dramaticamente. Nos Estados Unidos, aproximadamente 25% das lesões mamárias recém-diagnosticados são classificados como DCIS e, em 2020, mais de 1 milhão de mulheres estarão vivendo com DCIS nos Estados Unidos sozinho 22, 23, 24, 25. No entanto, lesões muitas DCIS permanecer dormente, ea maioria das estimativas encontrar que apenas 15-40% 21, 22, 23, 24, 25 de CDIS nunca vai evoluir para o câncer invasivo. No entanto, não existem actualmente biomarcadores preditivos para auxiliar na identificação de tumores que se tornará invasiva.
À medida que mais mulheres são diagnosticadas com esta lesão pré-cancerosa, sérias dúvidas quanto excesso de diagnóstico e tratamento excessivo têm surgido. O tratamento de doenças pré-malignas é tipicamente agressivos. A maioria dos pacientes com carcinoma ductal in situ serão submetidos à cirurgia (lumpectomia ou mastectomia), e muitos também recebem radiação 25. Alguns pacientes com carcinoma ductal in situ receptores hormonais positivos também irá receber 5 ou mais anos de terapia endócrina, o que foi mostrado para reduzir reincidência. Os efeitos colaterais desse tratamento pode incluir acidente vascular cerebral, a formação de coágulos sanguíneos, a perda óssea, e riscos elevados de uterino e cancros do endométrio. Todas estas opções têm sérios efeitos colaterais sistêmicos e afetar a qualidade de vida do paciente. Existe uma necessidade significativa de estratégias terapêuticas menos invasivas 25.
A entrega de agentes quimioterapêuticos intraductal em ambos os modelos de rato e em doentes com cancro da mama tem sido mostrado previamente para ser eficaz, sem evidência de toxicidade sistémica ou de longo prazo alterações histopatológicasref "> 3, 4, 5, 6. A administração intraductal da terapêutica poderá um dia oferecer novas opções para as mulheres diagnosticadas com DCIS que ainda não progrediu para uma lesão localmente invasivo. O potencial para travar tumorigênese e ao mesmo tempo preservando a estrutura ductal torna este uma estratégia terapêutica atractiva 10. Mais importante, a abordagem de entrega localizada garante que o tratamento alcança as células anormais relevantes enquanto potencialmente minimizar danos colaterais para outros tecidos. enquanto modelos de tumor de coelho não estão disponíveis, a glândula mamaria normal dos coelhos podem proporcionar um modelo relevante para testar as localizadas entrega, segurança, transporte e cinética de absorção terapêutica dentro do ducto mamário. Estes estudos in vivo irá permitir o teste e validação de diagnósticos e terapêutica candidatos dentro de um ambiente de tecido relevante.
8, 9. Contudo, a anatomia da glândula mamaria do rato difere da mama humano em vários aspectos importantes, incluindo a composição do tecido e o número de canais que terminam em cada teta. Aqui, nós estender esta técnica para um modelo animal maior, no qual a estrutura epitelial mamária representa mais de perto a anatomia da mama humano 12, 14. Isso abre a possibilidade de acompanhamento prolongado por imagem e para ensaiar a entrega intraductal concomitante de vários reagentes ao ductal epitélio mamário coelho. Os avanços na administração localizada para um modelo animal apropriado, com anatomia ductal semelhantes à glândula humano, deve acelerar a aplicação do não-invasive, orientada estratégias terapêuticas em seres humanos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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