Summary
我们描述了一种基于HPLC的方法，用于测定小鼠肝脏和牛奶中的N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸。
Abstract
CMAH（胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶）负责哺乳动物中胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸的氧化。然而，由于CMAH基因的主要外显子缺失，人类不能将胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸氧化为胞苷一磷酸-N-羟乙酰神经氨酸。为了更清楚地了解CMAH活动缺乏的影响和影响，小鼠中的Cmah敲除模型对基础和应用研究非常感兴趣。本文详细描述了确定该小鼠模型的表型的分析方法，并且基于在野生型和Cmah敲除小鼠的肝脏和牛奶中检测到N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸。内源性唾液酸被邻苯二胺释放并衍生，产生荧光衍生物，随后可用HPLC分析。所呈现的协议可以是也适用于各种其他来源的牛奶和组织样品的分析，可用于研究N-羟乙酰神经氨酸的营养和健康影响。
Introduction
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）是大多数哺乳动物中最常见的唾液酸1 。虽然能够内源性合成的Neu5Ac，人类不能产生Neu5Gc的由于对CMAH编码用于CMP-Neu5Ac的羟化酶2,3该基因的初级外显子缺失。然而，动物类食品产品可以Neu5Gc的4，5，6的饮食来源，导致产生抗Neu5Gc抗体，并因此触发朝向的Neu5Gc 7的免疫应答。 Neu5Gc的这一膳食效果被怀疑向慢性炎症和各种其它疾病8，9，10。为了全面了解Neu5Gc在h中的作用umans，一种用于系统研究食源性唾液酸影响的动物模型是非常需要的。虽然基于聚合酶链反应（PCR）分析敲除小鼠的方案已经很好地建立，并且是基因型评估的便捷方式，但代谢水平上表型的功能分析需要更具体的分析方法。可以通过分离和分析肝脏或牛奶样品中唾液酸的组成来评估Cmah敲除小鼠模型的表型。以前已经报道了几种用于检测动物组织中唾液酸的方法：唾液酸与间苯二酚11或硫代巴比妥酸12反应导致形成发色产物，并且可以使用基于平板印刷机的设置进行简单的分析，但只有总唾液酸可以测定酸含量。或者，也使用气相色谱法描述唾液酸的分析13 ，MALDI-ToF质谱法14或电流法15 。然而，最常用的唾液酸分析方法是基于水解释放，随后荧光衍生化和随后的高效液相色谱16，17，18。
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Protocol
涉及动物受试者的程序已经根据“国家实验动物福利准则”（中国科学技术部，2006年），南京农业大学实验动物中心伦理委员会批准，动物饲养在SPF设施（Permission ID：SYXK-J-2011-0037）。
Cmah敲出鼠标模型
- 使用扬州大学比较医学中心野生型C57Bl / 6小鼠（中国）。
注意：基于商业上使用CRISPR / Cas9 20战略来自先前CMAH敲除研究17，第 19和获得所提供的信息通过从所述CMAH基因，这也是外显子6中除去92个碱基对产生CMAH敲除小鼠在人CMAH基因中被删除19 。正F 0 </子> -mice（2个个体）与野生型小鼠杂交以获得杂合f 1的-mice。杂交F 1 -小鼠（5个个体）杂交后，可以成功获得纯合Cmah敲除F 2 -小鼠（3个个体）。 - 使用商业DNA纯化试剂盒，根据Zangala 21所示的方法，使用基因组DNA进行小鼠的基因分型。
- 通过使用商业DNA聚合酶和引物对5'gaaagggctcggctctgtatgaa3'和5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'扩增相应的Cmah基因DNA片段。使用34个PCR循环进行基因扩增，94个循环由94℃变性40秒，63℃退火40秒，72℃延伸1分钟。
- 在1％琼脂糖凝胶上显示PCR产物。应该观察野生型个体的单条带（0.5kb），双带（0.4和0.5kb）杂合敲除个体，以及纯合敲除个体的单条带（0.4kb）。
样品收集
- 使用Willingham 等人描述的方案收集小鼠牛奶22 。
- 使用Gonçalves 等人描述的方案收集小鼠肝组织23 ，并将样品储存在-80°C。
3.从牛奶中分离唾液酸
- 通过添加12毫升冰醋酸的制备100毫升2M的乙酸溶液加入到88毫升蒸馏水H 2 O的
- 将50μL牛奶转移到1.5 mL离心管中，加入1.2 mL制备的乙酸水溶液。
- 在80℃下将悬浮液孵育4小时，并以14,000xg离心10分钟。
- 将顶部1000μL的上清液转移到新鲜的1.5mL离心管中，在室温下通过离心蒸发除去溶剂以完成干燥（取决于所附的真空泵，这将需要4-20小时）。重新溶解在蒸馏水H 2 O的500μL的所述样品
- 制备微量阴离子交换柱。该步骤将特别富集阴离子化合物并从乳和肝样品中除去阳离子和中性化合物，因此增加了荧光OPD标记剂对唾液酸衍生化的选择性。
- 将每个样品200mg的阴离子交换树脂（Dowex 1X8）转移到具有连接的旋塞的空的3mL柱管中。
- 加入2mL在步骤3.1中制备的乙酸水溶液以用乙酸根离子代替树脂中的氯离子。一旦溶剂到达树脂顶部就关闭活塞。
- 轻轻加入2毫升蒸馏水2 O的，打开活塞，只要大部分溶剂达到的停止流动树脂的顶部。确保树脂总是被溶剂覆盖。
- 两次用2mL蒸馏水2 O的洗涤树脂柱以除去乙酸过量。
- 从步骤3.4转移所得的500μL样品溶剂。到树脂柱上并丢弃流通。轻轻用2mL蒸馏水H 2 O洗脱使用50 mM乙酸铵溶液的1毫升的树脂样品阴离子（386毫克乙酸铵溶解在100毫升蒸馏水2 O的）的洗涤树脂到1.5mL离心管。通过在室温下离心蒸发除去溶剂至干。
注意：干燥样品可以在4-6°C下储存长达12个月。
4.从肝组织中分离唾液酸
- 轻轻地解冻20 - 50毫克小鼠肝脏，并将其转移到Dounce组织研磨机（1 mL或2 mL体积）中。加入1.2mL乙酸水溶液在步骤3.1中制备并通过温和剪切将组织匀浆10秒。将所得悬浮液转移到1.5 mL离心管中。
- 按照步骤3.3。至3.6。
注意：干燥样品可以在4-6°C下储存长达12个月。
5.制备混合唾液酸标准品
- 将5-8mg N-乙酰神经氨酸在分析天平称重至1.5mL离心管中。注意准确的重量，并添加蒸馏水2 O的164μL每毫克（ 即 ，如果的Neu5Ac的重量为7.2毫克再加入7.2×164 = 1，蒸馏水2 O的181微升）。这产生20mM Neu5Ac储备溶液，其可以在-20℃下储存多达12个月。
- 以适量的价格获得较小量的N-羟乙酰神经氨酸，例如1mg等分试样。 2 O直接添加154μL蒸馏水到化合物中，以获得〜20mM的Neu5Gc的储备溶液。转移溶液加入1.5 mL离心管中。该溶液可以在-20°C储存长达12个月。
- 将来自步骤5.1和5.2的每种储备溶液中的5μL合并到新鲜的1.5mL离心管中，并通过在室温下离心蒸发除去溶剂至干。
注意：混合唾液酸标准品可以在4 - 6°C下储存长达12个月。
唾液酸荧光衍生化
- 制备10mL的OPD溶液，由100毫克邻苯二胺和在10mL的208毫克亚硫酸氢钠的蒸馏水H 2 O.
- 向来自小鼠乳（步骤3），小鼠肝脏（步骤4）或混合唾液酸标准品（步骤5）的唾液酸样品中加入20μLOPD溶液。涡流在80℃下在黑暗中大力进行30秒，并培育样品4小时（ 即包裹在铝箔微管）。
- 让样品冷却5分钟，加入80μ;蒸馏水2 O的L和在14,000×g离心试管1分钟。
- 将80μL的上清液转移到300μL高回收率的HPLC样品瓶中。衍生的唾液酸样品可以在4-6℃下储存长达一周。
7.唾液酸衍生物的HPLC分析
- 使用连接到在线荧光检测器的标准HPLC系统分析样品。
- 使用反相C18柱，标准尺寸为250 mm，直径为4.6 mm，用于分析。
- 通过用800mL的LCMS级水（LCMS-液相色谱质谱法）稀释200mL储备溶液来制备溶剂A.储备液本身可以制备如下：
- 加入46克甲酸至800毫升的LCMS级H 2 O.
- 通过滴加氢氧化铵溶液（puriss。pa）将pH调节至4.5。
- 将溶剂转移至量筒，并用LCMS级H 2 O填充至1000 mL。该储液可在4 - 6°C下储存3个月。
- 对于溶剂B，使用LCMS级乙腈。
- 以1 mL / min的流速与以下梯度洗脱分离唾液酸衍生物：
- 首先加入混合溶剂A的10％溶剂B.
- 从0分钟到15分钟，用线性梯度逐渐增加溶剂B的比例至60％。
- 从15分钟到16分钟，以60％至90％的线性梯度迅速增加溶剂B的比例。这启动了HPLC柱的洗涤。
- 为了进一步洗涤HPLC柱，将溶剂B的水平在16分钟和18分钟之间保持在90％，然后在18分钟和19分钟之间再次将溶剂B的水平再次降低到10％。
- 重新平衡HPLC色谱柱至10％B的起始条件为19至24分钟。
- 在将50μL样品注入HPLC系统。
- 使用荧光检测器的激发/发射波长为373/448nm监测洗脱液，衍生的唾液酸可以在9分钟的近似保留时间（对于Neu5Gc-OPD）和10分钟（对于Neu5Ac-OPD）来说是预期的。
- 从Neu5Ac（A Neu5Ac ）和Neu5Gc（A Neu5Gc ）的荧光峰面积计算Neu5Gc（F Neu5Gc ）的相对量如下：F Neu5Gc [％] = 100×A Neu5Gc /（A Neu5Ac + A Neu5Gc ）。在来自纯合Cmah敲除小鼠F Neu5Gc的牛奶和肝脏样品的情况下，杂合子和野生型小鼠的F Neu5Gc的值可以根据小鼠年龄和组织类型（2％和> 90％），预期误差幅度为±12％。
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Representative Results
所描述的分析方法的示意图如图1所示，包括从野生型和Cmah敲除突变小鼠的牛奶和肝脏样品中分离唾液酸，以及这些组分的荧光衍生化和HPLC分析。 图2和图3显示了来自同源和杂合敲除Cmah小鼠（ - / - 和+/-）和野生型小鼠的牛奶和肝脏样品的衍生唾液酸的代表性HPLC色谱图 。 图4显示从HPLC峰面积计算得到的分析的小鼠样品的N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）的相对量。
数字
图2 ： 衍生自均质和杂合性敲除Cmah小鼠（ - / - 和+/-）和野生型小鼠的乳样品的荧光标记唾液酸的HPLC色谱 图 。顶部色谱图是混合唾液酸标准品。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图3 ： 衍生自均质和杂合子敲除Cmah小鼠（ - / - 和+/-）和野生型小鼠的肝样品中荧光标记的唾液酸的HPLC色谱 图 。顶部色谱图是混合唾液酸标准品。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 ： 从HPLC峰面积计算的分析小鼠样品的N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）的相对量。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文提出的方案允许通过分析和定量牛奶和肝脏样品的Neu5Gc的相对量来对纯合Cmah敲除小鼠进行表型评估。使用具有荧光检测的标准HPLC装置进行分析。该方法最关键的步骤是制备阴离子交换柱并进行阴离子交换层析;妥善安置树脂并收集正确的洗涤和洗脱部分需要一些练习。
或者，本文使用的衍生化试剂OPD可以容易地用更昂贵的衍生剂DMB（1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基苯）代替。此外，对从步骤6.5获得的唾液酸衍生物进行分析。也可以使用质谱检测来代替荧光检测（ 即与Shim-zu Nexera UPLC系统结合MS-2020检测器）进行分析。一个使用步骤7.2-7.6，使用阳离子模式扫描直接检测唾液酸衍生物，m / z比为382.0和398.0（分别为Neu5Ac-OPD和Neu5Gc-OPD的H +加合物）。
该方法的一个限制是Neu5Gc含量只能相对于Neu5Ac量而定量，而不是绝对的量化。为了做到这一点，在样品制备的初始阶段需要添加不同的和可量化的唾液酸作为内标。另一个缺点是，只有纯合而不是杂合的Cmah敲除小鼠可以被明确地鉴别，因为Neu5Gc杂合敲除小鼠的相对量可能会根据个体小鼠的样品类型（ 即组织）和年龄而强烈变化。该方法的未来发展可能包括添加内标和唾液酸在小鼠中的绝对定量。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了中国自然科学基金资助（授权号31471703，合资和律师事务所A0201300537和31671854）以及100名外籍人才计划（授予合资公司JSB2014012）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
