Summary
Fare karaciğeri ve sütündeki N-asetilnöraminik asit ve N-glikolenüraminik asitin tayini için HPLC temelli bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
CMAH (sitidin monofosfat-N-asetilnöramin asit hidroksilaz), memelilerde sitidin monofosfat-N-asetilnöraminik asitlerin oksidasyonundan sorumludur. Bununla birlikte, insanlar CMAH geninin primer ekson silinmesi nedeniyle sitidin monofosfat-N-asetilnöraminik asiti sitidin monofosfat-N-glikoli-nöraminik asite oksitleyemezler . CMAH aktivitesinin eksikliğinin etkilerini ve etkilerini daha ayrıntılı olarak anlamak için, farelerde bir Cmah knock-out modeli, temel ve uygulamalı araştırmalara yoğun ilgi duymaktadır. Bu fare modelinin fenotipini belirlemek için analiz metodu burada detaylı olarak tarif edilmiş olup, vahşi tip ve Cmah nakavt farelerinin karaciğerindeki ve sütünün her ikisinde de N-asetilnöraminasit ve N-glikolenüraminik asitin saptanmasına dayanmaktadır. Endojen sialik asitler serbest bırakılır ve daha sonra HPLC ile analiz edilebilen flüorojenik türevler oluşturmak üzere o-fenilendiamin ile türevlendirilir. Sunulan protokol,Çeşitli başka kaynaklı süt ve doku örneklerinin analizi için de uygulanmış ve N-glikoli-nevüaminik asidin beslenme ve sağlık etkilerini araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
N-asetilnöraminik asit (Neu5Ac) ve N-glikoli-nöraminik asit (Neu5Gc), çoğu memelide en yaygın sialik asitlerdir 1 . Neu5Ac'yi endojen olarak sentezleyebiliyor olsa da, insanlar bir CMP-Neu5Ac hidroksilaz 2 , 3'ü kodlayan CMAH geni üzerinde birincil ekson silinmesi nedeniyle Neu5Gc üretemiyor. Bununla birlikte, hayvana dayalı gıda ürünleri Neu5Gc 4 , 5 , 6'nın diyet kaynaklı olabileceği gibi anti-Neu5Gc antikorlarının üretilmesine ve dolayısıyla Neu5Gc 7'ye karşı bir bağışıklık tepkisinin tetiklenmesine neden olur. Neu5Gc'nin bu besinsel etkisinin kronik inflamasyona ve diğer çeşitli hastalıklara 8 , 9 , 10 katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Neu5Gc'nin h üzerindeki etkilerini kapsamlı olarak anlamak içinUmans, gıda kaynaklı sialik asitlerin etkilerinin sistematik çalışması için bir hayvan modeli son derece arzu edilir. Nakavt farelerinin analizinde polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanan protokoller iyi belirlenmiş ve genotipik değerlendirme için uygun bir yol olmasına rağmen, fenotipin metabolik seviyedeki işlevsel analizi daha spesifik analiz yöntemleri gerektirir. Bir Cmah knock-out fare modelinin fenotipi, karaciğer veya süt örneklerinde sialik asitlerin kompozisyonunu izole ederek ve analiz ederek değerlendirilebilir. Hayvan dokularında sialik asitlerin saptanması için çeşitli yöntemler daha önce bildirilmiştir: sialik asitlerin resorsinol 11 ya da tiobarbitürik asit 12 ile reaksiyona sokulması, bir kromoforik ürünün oluşumuyla sonuçlanır ve basitçe bir platereader temelli kurulum kullanılarak analiz edilebilir ancak sadece toplam siyaliktir Asit içeriği belirlenebilir. Alternatif olarak, sialik asitlerin analizi de gaz kromatografisi13 , MALDI-ToF kitle spektrometrisi 14 veya amperometrik yöntemler 15 . Bununla birlikte, en yaygın olarak uygulanan sialik asit analiz yöntemleri, hidrolitik salıma, bunu takiben floresan türevlendirmeye ve daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisine ( 16 , 17 , 18) dayalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları ilgilendiren prosedürler, Nanjing Ziraat Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi Etik Kurulu tarafından Deneysel Hayvan Refahı Ulusal Rehberine (Çin Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Bakanlığı, 2006) uygun olarak, bir SPF'de barındırılan hayvanlarla onaylanmıştır Tesis (İzin KİMLİĞİ: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah Knock-out Fare Modeli
- Yangzhou Üniversitesi (Çin) Karşılaştırmalı Tıp Merkezi'nden alınan vahşi tip C57Bl / 6 farelerini kullanın.
Not: Cmah knock-out fareler de Cmah geninin ekson 6 92 baz çifti kaldırarak, ticari olarak bir CRISPR / Cas9 20 strateji kullanarak önceki Cmah nakavt çalışmaları 17, 19 ve elde edilen sağlanan bilgilere dayanarak oluşturulan Insan CMAH geninde silinmiş 19 . Pozitif F 0 </ alt> -mice (2 birey) heterozigot F 1 -mice elde etmek için, yabani tip fareler ile çaprazlanır. Heterozigot F 1- misli (beş birey) geçtikten sonra, homozigot CmA knock-out F 2- misli başarıyla elde edilebilir (3 kişi). - Ticari bir DNA saflaştırma kiti kullanarak Zangala 21 tarafından gösterilen yönteme göre genomik DNA kullanarak farelerin genotiplendirme yapın.
- Ticari DNA polimeraz ve primer çift 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 've 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3' kullanarak Cmah geninin ilgili bir DNA parçasını genişletin. 94 ° C'de 40 saniye, 63 ° C'de 40 saniye tavlama ve 1 dakika boyunca 72 ° C'de uzama içeren 34 PCR döngüsü kullanılarak gen amplifikasyonunu uygulayın.
- PCR ürünlerini% 1 agaroz jel üzerinde görselleştirin. Vahşi tip birey için tek bir bant (0.5 kb), çift bant (0.4 ve 0.5 kb) gözlemlenmelidir.Heterozigot knock-out bireyi ve homozigot nakavt bireyi için tek bir bant (0.4 kb) içermektedir.
2. Örnek Koleksiyon
- Willingham ve ark tarafından açıklanan protokolü kullanarak fare sütü toplayın . 22 .
- Gonçalves ve ark. Tarafından tarif edilen protokolü kullanarak fare karaciğer dokusunu toplayın . 23 ve örnekleri -80 ° C'de saklayın.
3. Sütten Sialik Asitlerin İzolasyonu
- Damıtılmış H2O 88 mL'lik buzlu asetik asit 12 ml ilave edilerek 2 M asetik asit solüsyonu, 100 mL hazırlanması
- 50 mL sütü bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve hazırlanan sulu asetik asit çözeltisinden 1.2 mL ekleyin.
- Süspansiyonu 80 ° C'de 4 saat inkübe edin ve numuneyi 14.000 xg'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatantın en iyi 1.000 μL'sini taze bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve remÇözücüyü oda sıcaklığında santrifüj buharlaştırmayla kurutun (bağlı vakum pompasına bağlı olarak 4-20 saat sürecektir). Yeniden çözülür damıtılmış H2O 500 uL numune
- Bir mikro-anyon değişim sütunu hazırlayın. Bu adım, özellikle anyonik bileşiklerin zenginleşmesine ve süt ve karaciğer örneklerinden katyonik ve nötr bileşiklerin uzaklaştırılmasına ve dolayısıyla florojenik OPD etiketleme maddesinin sialik asit türetilmesi için seçiciliğini arttırır.
- Her numune için, 200 mg anyon değişim reçinesi (Dowex 1X8), boş bir 3 ml sütun tüplerine, bağlı bir musluk ile aktarın.
- Reçinedeki klorür iyonlarını asetat iyonlarıyla değiştirmek için aşama 3.1'de hazırlanan sulu asetik asit çözeltisinin 2 mL'si ilave edin. Çözücü reçinenin üst kısmına ulaştığında musluğu kapatın.
- Damıtılmış H 2 O damla damla 2 mL hafifçe ilave edin, musluğu açın ve çözücünün çoğuna ulaştığında akışını durdurunReçinenin üstü. Reçinenin daima solvent ile kaplandığından emin olun.
- Fazla asetat çıkarılması için damıtılmış H2O 2 mL reçine sütun iki kez daha yıkanır.
- Elde edilen 500 μL örnek solven 3.4 adımından aktarılır. Reçine sütun üzerine yerleştirin ve akışı atın. Yavaşça 1.5 mL bir 50 mM amonyum asetat solüsyonu 1 ml kullanılarak reçineden örnek anyonlar (amonyum asetat 386 mg damıtılmış H2O, 100 mL) damıtılmış H2O Elute 2 mL reçine yıkama Santrifüj tüpü. Solvent, oda sıcaklığında kuruyana kadar santrifüj buharlaştırma ile çıkarılır.
NOT: Kuru numuneler en fazla 12 ay süreyle 4-6 ° C'de saklanabilir.
4. Karaciğer dokusundan Sialik Asitlerin İzolasyonu
- 20-50 mg fare karaciğeri yavaşça çözündürün ve bir Dounce doku öğütücüsüne (1 mL veya 2 mL hacim) aktarın. 1.2 mL sulu asetik asit çözeltisiAdım 3.1'de hazırlanan ve dokuyu 10 saniye boyunca hafifçe keserek homojenize edin. Nihai süspansiyon 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarılır.
- Adımları takip edin 3.3. 3.6'ya kadar.
NOT: Kuru numuneler en fazla 12 ay süreyle 4-6 ° C'de saklanabilir.
5. Karışık bir Sialik Asit Standardının Hazırlanması
- Analitik bir balansda 1-5 mg santrifüj tüpüne 5-8 mg N-asetilnöraminik asit tartılır. Kesin ağırlık not edin ve her mg için damıtılmış H2O 164 mcL (yani Neu5Ac ağırlığı 7.2 mg, sonra 7.2 = 1 x 164, damıtılmış H2O 181 mcL ise). Bu, -20 ° C'de 12 aya kadar depolanabilen 20 mM Neu5Ac stok solüsyonuyla sonuçlanır.
- N-glikolneukaminik asit, 1 mg'lık alikotlar gibi orta bir fiyatla daha küçük miktarlarda alın. Bir ~ 20 mM Neu5Gc stok solüsyonu elde etmek üzere bileşik 2 O direkt olarak distile H 154 uL ekleyin. AktarınSolüsyonu 1.5 mL'lik santrifüj tüpüne eklenir. Bu çözüm -20 ° C'de 12 aya kadar depolanabilir.
- Adım 5.1 ve 5.2'deki her stok solüsyondan 5 μL, taze bir 1.5 mL santrifüj tüpüne birleştirin ve kuruyana kadar oda sıcaklığında santrifüj buharlaştırarak çözücü çıkartın.
NOT: Karışık sialik asit standardı 4 - 6 ° C'de 12 aya kadar depolanabilir.
6. Sialik Asitlerin Flüoresan Türetilmesi
- O-fenilendiamin 100 mg ve 10 ml sodyum hidrojen sülfit 208 mg oluşan 10 ml OPD-solüsyonunun hazırlanması H2O damıtılmış
- Fare sütünün (adım 3), fare karaciğeri (adım 4) veya karışık sialik asit standardından (adım 5) türetilmiş sialik asit örneklerine 20 μL OPD çözeltisi ekleyin. 30 saniye boyunca şiddetle girdap edin ve örnekleri karanlıkta 80 ° C'de 4 saat inkübe edin ( yani mikro tüpleri alüminyum folyoya sarın).
- Örnekleri 5 dakika soğumaya bırakın, 80 μ ekleyinDamıtık H2O L ve 1 dakika boyunca 14,000 x g'de santrifüj tüpleri.
- Süpernatandan 80 μL, 300 μL'lik yüksek kurtarma HPLC şişesine aktarın. Türetilmiş sialik asit örnekleri, bir haftaya kadar 4-6 ° C'de saklanabilir.
7. Sialik Asit Türevlerinin HPLC Analizi
- Çevrimiçi flüoresan dedektörüne bağlı standart bir HPLC sistemi kullanarak numuneleri analiz edin.
- Analiz için 250 mm uzunluğunda ve 4.6 mm çaplı standart boyutlara sahip ters faz C18 sütun kullanın.
- 200 mL stok solüsyonunu 800 mL LCMS dereceli su (LCMS - sıvı kromatografi kütle spektrometresi) ile seyrelterek solvent A hazırlayın. Stok çözeltisinin kendisi aşağıdaki gibi hazırlanabilir:
- LCMS dereceli H2O 800 mL formik asidin 46 g 'ekleme
- Damla damla amonyum hidroksit çözeltisi (puriss. Pa) ilave ederek pH'ı 4.5'e ayarlayın.
- Solventi birLCMS dereceli H 2 O ile 1000 mL'ye kadar doldurun. Bu stok çözeltisi 4 - 6 ° C'de 3 aya kadar depolanabilir.
- B çözücüsü için LCMS dereceli asetonitril kullanın.
- Sialik asit türevlerini 1 mL / dakika akış oranında aşağıdaki gradyanlı elüsyon ile ayırın:
- Önce çözücü A'ya karıştırılmış B çözücüsü% 10 eklenerek başlanmalıdır.
- 0 dakikadan 15 dakikaya kadar, solvent B oranını yavaşça doğrusal bir gradyanla% 60'a yükseltin.
- 15 dakika ila 16 dakika arasında, solvent B oranını% 60 ila% 90 arasında doğrusal bir gradyanla hızla arttırın. Bu, HPLC kolonunun yıkanmasını başlatır.
- HPLC sütununu daha da yıkamak için, 18 dakika ile 19 dakika arasında çözücünün B düzeyini% 10'a kadar kademeli olarak düşürmeden önce, çözücünün B seviyesini 16 dakika ile 18 dakika arasında% 90 seviyesinde tutun.
- HPLC sütununu,% 19 B başlangıç koşullarına 19 ila 24 dakika arasında yeniden dengeleyin.
- İçinde50 μL numuneyi HPLC sistemine verin.
- 373/448 nm floresan dedektör uyarma / emisyon dalga boylarını kullanarak eluentleri izleyin ve türevlendirilmiş sialik asitlerin yaklaşık tutma süreleri 9 dakika (Neu5Gc-OPD için) ve 10 dakika (Neu5Ac-OPD için) beklenebilir.
- Neu5Ac (A Neu5Ac ) ve Neu5Gc'nin (A Neu5Gc ) floresan zirve bölgelerinden Neu5Gc'nin (F Neu5Gc ) göreli miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın: F Neu5Gc [100] = 100 x A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). Homozigot Cmah knock-out fare F Neu5Gc'den süt ve karaciğer örnekleri% 0 olmalı, oysa heterozigot ve vahşi tip F Neu5Gc değerleri fare yaşına ve doku türüne (2% Ve>% 90) ve beklenen hata marjları ±% 12'dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tanımlanan analiz yönteminin şematik bir görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir ve vahşi tip ve Cmah nakavt mutant farelerinin süt ve karaciğer numunelerinden sialik asitlerin izolasyonu ve bu bileşenlerin flüoresan türetilmesi ve HPLC analizini içerir. Şekil 2 ve Şekil 3 , homo- ve heterozigot nakavt Cmah farelerinden (- / - ve +/-) ve yabani tip farelerden süt ve karaciğer örneklerinin türetilmiş sialik asitlerinin temsili HPLC kromatogramlarını göstermektedir. Şekil 4 , HPLC pik alanlarından hesaplanan analiz fare numunelerinin N-glikolneuraminik asit (Neu5Gc) 'nin nispi miktarlarını göstermektedir.
şekil
Şekil 2 : Homo ve Heterozigot Knock-out Cmah Faresinden (- / - ve +/-) ve Yabani Tip Fareden Türetilmiş Süt Örneklerinden Flüoresan Etiketli Sialik Asitlerin HPLC Kromatogramları. En iyi kromatogram karışık sialik asit standardıdır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
"Src =" / files / ftp_upload / 56030 / 56030fig3.jpg "/>
Şekil 3 : Homo ve Heterozigot Knock-out Cmah Faresinden (- / - ve +/-) ve Vahşi Tip Fare Türeyen Karaciğer Örneklerinden Floresanla Etiketli Sialik Asitlerin HPLC Kromatogramları. En iyi kromatogram karışık sialik asit standardıdır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : HPLC Tepe Alanlarından Hesaplanan Analiz Edilen Fare Örneklerinde N-glikolneuraminik Asit (Neu5Gc) Bağıl Miktarları. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol, süt ve karaciğer numunelerinin Neu5Gc nispi miktarlarını analiz ederek ve nicelleştirerek homozigot Cmah nakavt farelerinin fenotipik değerlendirmesini sağlar. Analiz, floresans algılama özelliğine sahip standart bir HPLC ayarı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu prosedürün en kritik basamağı, anyon değişim sütunlarının hazırlanması ve anyon değişim kromatografisinin uygulanmasıdır; Reçineyi düzgün şekilde çöktürmek ve doğru yıkama ve elüsyon paylarını toplamak biraz pratik gerektirir.
Alternatif olarak, burada kullanılan derivatizasyon ajanı OPD, daha pahalı olan DMB (1,2-diamino-4,5-metilendioksibenzen) derivatizasyon ajanı ile kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, elde edilen sialik asit türevlerinin 6.5 aşamasından analizi. Ayrıca olmak kütle spektrometrik bulgulaması yerine floresans algılama (MS-2020 detektörü ile bağlanmıştır, yani Shimadzu Nexera UPLC sistemi) kullanılarak analiz edilebilir. birAdım 7.2 - 7.6 uygulandıktan sonra sialik asit türevleri, 382.0 ve 398.0 m / z oranları için pozitif iyonizasyon modu taramasını kullanarak doğrudan tespit edilir (bunlar sırasıyla Neu5Ac-OPD ve Neu5Gc-OPD'nin H + -uygulamalarıdır).
Bu yöntemin bir kısıtlaması, Neu5Gc içeriğinin sadece Neu5Ac miktarına kıyasla nicelleştirilebileceğini, ancak mutlak bir şekilde olmadığını belirtmektir. Bunu yapmak için, numune hazırlamanın ilk aşamasında, dahili bir standart olarak belirgin ve niceliksel bir sialik asidin eklenmesi gerekecektir. Başka bir kusuru Neu5Gc heterozigot knock-out fareler nispi miktarı, sadece homozigos ama heterozigot Cmah knock-out fareler açık bir şekilde tespit edilebilir tek tek farelerin örnek tipine (yani, doku) ve yaşa bağlı olarak güçlü bir şekilde değişebilir olmasıdır. Bu yöntemin gelecekteki gelişmeleri iç standartların eklenmesini ve farelerde sialik asitlerin mutlak miktar tayini içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Çin Doğal Bilimler Vakfı (JV ve LL'ye 31471703, A0201300537 ve 31671854 hibe numaraları) ve 100 Yabancı Talent Planı (JVB için JSB2014012 hibe numarası) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
