Summary
Мы описываем метод ВЭЖХ для определения N-ацетилнейраминовой кислоты и N-гликолиленураминовой кислоты в печени и молоке мыши.
Abstract
CMAH (гидроксилаза цитидин-моно-фосфат-N-ацетилнейраминовой кислоты) ответственна за окисление монофосфат-цитидин-N-ацетилнейраминовых кислот у млекопитающих. Однако люди не могут окислять монофосфат-N-ацетилнейраминовую кислоту цитидина до монофосфат-N-гликолинераминовой кислоты цитидина из-за первичной экзоновой делеции гена CMAH . Чтобы более подробно понять последствия и последствия отсутствия активности CMAH , модель нокаутов Cmah у мышей представляет большой интерес к фундаментальным и прикладным исследованиям. Метод анализа для определения фенотипа этой модели мыши подробно описан здесь и основан на обнаружении как N-ацетилнейраминовой кислоты, так и N-гликолиленураминовой кислоты в печени и молоке мышей с диким типом и Cmah . Эндогенные сиаловые кислоты высвобождаются и дериватизируются о-фенилендиамином для получения флуорогенных производных, которые затем могут быть проанализированы с помощью ВЭЖХ. Представленный протокол может бытьТакже применяется для анализа образцов молока и тканей из различных других источников и может быть полезен для исследования пищевых и медицинских эффектов N-гликолилнейраминовой кислоты.
Introduction
N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) и N-гликолилнеураминовая кислота (Neu5Gc) являются наиболее распространенными сиаловыми кислотами у большинства млекопитающих 1 . Несмотря на то, что эндогенно синтезируется Neu5Ac, люди не способны продуцировать Neu5Gc из-за первичной делеции экзона на ген CMAH , кодирующий гидроксилазу CMP-Neu5Ac 2 , 3 . Однако пищевые продукты на основе животных могут быть диетическими источниками Neu5Gc 4 , 5 , 6 , что приводит к получению антител против Neu5Gc и, следовательно, вызывает иммунный ответ на Neu5Gc 7 . Предполагается, что этот диетический эффект Neu5Gc способствует хроническому воспалению и различным другим заболеваниям 8 , 9 , 10 . Чтобы всесторонне понять эффекты Neu5Gc в hUmans, животная модель для систематического изучения эффектов сиаловых кислот пищевого происхождения весьма желательна. Хотя протоколы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа выбитых мышей, хорошо известны и являются удобным способом генотипической оценки, функциональный анализ фенотипа на метаболическом уровне требует более конкретных методов анализа. Фенотип модели выкатной мыши Cmah можно оценить, выделив и проанализировав состав сиаловых кислот в образцах печени или молока. Ранее сообщалось о нескольких методах обнаружения сиаловых кислот в тканях животных: реакция сиаловых кислот с резорцинолом 11 или тиобарбитуровой кислотой 12 приводит к образованию хромофорного продукта и может быть просто проанализирована с использованием установки на основе плиттера, но только общая сиалическая Содержание кислоты может быть определено. Альтернативно, анализ сиаловых кислот также описывался с использованием газовой хроматографии13 , масс-спектрометрия MALDI-TOF 14 или амперометрические методы 15 . Однако наиболее часто применяемые методы анализа сиаловой кислоты основаны на гидролитическом высвобождении с последующей дериватизацией флуоресценции и последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, связанные с животными, были одобрены Этическим комитетом экспериментального животного центра Нанкинского сельскохозяйственного университета в соответствии с Национальными руководящими принципами по обеспечению благополучия животных (Министерство науки и технологий, КНР, 2006 г.) с животными, содержащимися в SPF Объект (ID разрешения: SYXK-J-2011-0037).
1. Модель мышиной мыши Cmah
- Используйте мышей дикого типа C57Bl / 6 из Центра сравнительной медицины Университета Янчжоу (Китай).
ПРИМЕЧАНИЕ. Мышцы Cmah с нокаутом были созданы на основе информации, предоставленной в предыдущих исследованиях 17 , 19 Kmah , и коммерчески использовали стратегию CRISPR / Cas9 20 , удалив 92 пары оснований из экзона 6 гена Cmah , что также Удалены в человеческом CMAH- гене 19 . Положительный F 0 </ Sub> -mice (2 индивидуума) скрещивались с мышами дикого типа, чтобы получить гетерозиготную F 1 -мерную. После пересечения гетерозиготных F 1 -mice (5 особей), гомозиготные Cmah выбивание F 2 -mice может быть успешно получен (3 особей). - Выполните генотипирование мышей с использованием геномной ДНК в соответствии с методом, показанным Zangala 21, с использованием коммерческого набора для очистки ДНК.
- Усилить соответствующий фрагмент ДНК гена Cmah с использованием коммерческой ДНК-полимеразы и пары праймеров 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'и 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Выполните амплификацию гена с использованием 34 циклов ПЦР, состоящих из денатурации при 94 ° С в течение 40 с, отжига при 63 ° С в течение 40 с и удлинения при 72 ° С в течение 1 мин.
- Визуализируйте продукты ПЦР на 1% агарозном геле. Нужно наблюдать одиночную полосу (0,5 т.п.н.) для индивидуума дикого типа, двойную полосу (0,4 и 0,5 кб) дляГетерозиготный нокаутный индивидуум и одиночная полоса (0,4 т.п.н.) для гомозиготного нокаута.
2. Сбор образцов
- Собирайте мышечное молоко с использованием протокола, описанного Willingham et al. 22 .
- Собирайте ткань печени мыши, используя протокол, описанный Gonçalves et al. 23 и хранить образцы при -80 ° C.
3. Выделение сиаловых кислот из молока
- Подготовьте 100 мл 2 М раствора уксусной кислоты, добавив 12 мл ледяной уксусной кислоты в 88 мл дистиллированного H 2 O.
- Передайте 50 мкл молока в 1,5 мл центрифужную пробирку и добавьте 1,2 мл полученного водного раствора уксусной кислоты.
- Инкубировать суспензию в течение 4 ч при 80 ° С и центрифугировать образец при 14000 мкг в течение 10 мин.
- Перенесите верхние 1000 мкл надосадочной жидкости в свежую 1,5 мл центрифужную пробирку и запишитеРастворител центрифугированием при комнатной температуре до полного сухости (в зависимости от подключенного вакуумного насоса это займет 4-20 ч). Повторно растворите образец в 500 мкл дистиллированного H 2 O.
- Подготовьте колонку обмена микроанионом. Эта стадия специально обогащает анионные соединения и удаляет катионные и нейтральные соединения из образцов молока и печени и, следовательно, повышает селективность флюорогенного меченого агента OPD для дериватизации сиаловой кислоты.
- Перенесите для каждого образца 200 мг анионообменной смолы (Dowex 1X8) в пустые 3-миллилитровые колонки с прикрепленным краном.
- Добавить 2 мл водного раствора уксусной кислоты, полученного на стадии 3.1, для замены ионов хлорида в смоле ацетатными ионами. Закройте краном, как только растворитель достигнет вершины смолы.
- Аккуратно добавьте 2 мл дистиллированного H 2 O, откройте запорный кран и остановите поток, как только большая часть растворителя достигнетВерхняя часть смолы. Убедитесь, что смола всегда покрыта растворителем.
- Промойте колонку смолы еще два раза с помощью 2 мл дистиллированного H 2 O для удаления избытка ацетата.
- Перенесите полученные 500 мкл растворителя образца из стадии 3.4. На колонну смолы и отказаться от сквозного потока. Аккуратно промыть смолу 2 мл дистиллированного H 2 O. Элюировать образцы анионов из смолы, используя 1 мл 50 мМ раствора ацетата аммония (386 мг ацетата аммония, растворенного в 100 мл дистиллированной H 2 O), в 1,5 мл Центрифужная трубка. Удалите растворитель центробежным выпариванием при комнатной температуре досуха.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сухие образцы можно хранить при температуре 4-6 ° C в течение 12 месяцев.
4. Выделение сиаловых кислот из ткани печени
- Аккуратно оттереть 20 - 50 мг печени мыши и перенести его в тканевую дробилку Dounce (1 мл или 2 мл объема). Добавить 1,2 мл водного раствора уксусной кислотыПолученного на стадии 3.1, и гомогенизируют ткань путем осторожного сдвига в течение 10 с. Перенесите полученную суспензию в 1,5 мл центрифужную пробирку.
- Выполните шаги 3.3. До 3.6.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сухие образцы можно хранить при температуре 4-6 ° C в течение 12 месяцев.
5. Подготовка стандарта смешанной сиаловой кислоты
- Взвешивают между 5-8 мг N-ацетилнейраминовой кислоты на аналитическом балансе в 1,5 мл центрифужную пробирку. Обратите внимание на точный вес и добавьте 164 мкл дистиллированного H 2 O для каждого мг ( т.е. если масса Neu5Ac составляет 7,2 мг, затем добавьте 7,2 × 164 = 1, 181 мкл дистиллированного H 2 O). В результате получается 20 мМ исходного раствора Neu5Ac, который можно хранить при -20 ° C в течение 12 месяцев.
- Получают N-гликолилнейраминовую кислоту в меньших количествах по умеренной цене, например, в аликвотах по 1 мг. Добавьте 154 мкл дистиллированного H 2 O непосредственно к соединению для получения 20 мМ исходного раствора Neu5Gc. ПередайтеРаствор в 1,5 мл центрифужную пробирку. Этот раствор можно хранить при -20 ° C в течение 12 месяцев.
- Объедините 5 мкл из каждого исходного раствора с шага 5.1 и 5.2 в свежую пробирку с 1,5 мл центрифуги и удалите растворитель центробежным выпариванием при комнатной температуре досуха.
ПРИМЕЧАНИЕ. Смешанный стандарт сиаловой кислоты можно хранить при 4-6 ° C в течение 12 месяцев.
6. Флюоресцентная дериватизация сиаловых кислот
- Подготовьте 10 мл OPD-раствора, состоящего из 100 мг о-фенилендиамина и 208 мг гидросульфита натрия в 10 мл дистиллированного H 2 O.
- Добавьте 20 мкл OPD-раствора в образцы сиаловой кислоты, полученные из мышиного молока (стадия 3), печень мыши (стадия 4) или смешанный стандарт сиаловой кислоты (этап 5). Вихрь энергично в течение 30 с и инкубируйте образцы в течение 4 ч при 80 ° С в темноте ( т. Е. Оберните микропробирки в алюминиевой фольге).
- Пусть образцы остынут в течение 5 минут, добавьте 80 μ, L дистиллированного H 2 O и центрифугируют пробирки при 14000 xg в течение 1 мин.
- Передайте 80 мкл из супернатанта в 300 мкл высокоэффективного ВЭЖХ-ампулы. Образцы производных сиаловой кислоты можно хранить при 4-6 ° C в течение одной недели.
7. Анализ ВЭЖХ производных сиаловой кислоты
- Проанализируйте образцы, используя стандартную систему ВЭЖХ, подключенную к онлайн-детектору флуоресценции.
- Для анализа используйте колонку с обращенной фазой C18 с стандартными размерами 250 мм и диаметром 4,6 мм.
- Подготовьте растворитель А, разбавив 200 мл исходного раствора 800 мл воды LCMS (LCMS - жидкостная хроматографическая масс-спектрометрия). Сам исходный раствор можно приготовить следующим образом:
- Добавить 46 г муравьиной кислоты до 800 мл LCMS-класса H 2 O.
- Отрегулируйте pH до 4,5 путем добавления по каплям раствора гидроксида аммония (puriss. Pa).
- Перенесите растворитель вИзмерительный цилиндр и заполнить до 1000 мл LCMS-grade H 2 O. Этот исходный раствор можно хранить при 4-6 ° C в течение 3 месяцев.
- Для растворителя B используйте ацетонитрил LCMS.
- Отделите производные сиаловых кислот со скоростью потока 1 мл / мин со следующим градиентным элюированием:
- Начните с добавления 10% растворителя В, смешанного с растворителем А.
- От 0 мин до 15 мин постепенно увеличивают долю растворителя В с линейным градиентом до 60%.
- С 15 минут до 16 минут быстро увеличивайте долю растворителя B с линейным градиентом от 60% до 90%. Это инициирует промывку колонки ВЭЖХ.
- Для дальнейшей промывки колонки ВЭЖХ поддерживать уровень растворителя В на 90% между 16 и 18 мин, прежде чем постепенно снижать уровень растворителя В снова до 10% в течение 18 мин и 19 мин.
- Повторно уравновешивают колонку ВЭЖХ до начальных условий 10% В между 19 и 24 мин.
- В50 мкл образца в систему ВЭЖХ.
- Контролировать элюенты с использованием длин волн возбуждения / испускания флуоресцентного излучения 373/448 нм, а дериватизированные сиаловые кислоты можно ожидать при приблизительном времени удерживания 9 мин (для Neu5Gc-OPD) и 10 мин (для Neu5Ac-OPD).
- Вычислите относительное количество Neu5Gc (F Neu5Gc ) из областей пика флуоресценции Neu5Ac (A Neu5Ac ) и Neu5Gc (A Neu5Gc ) следующим образом: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). В случае образцов молока и печени из гомозиготной мышиной ножки Cmah F Neu5Gc должно быть 0%, тогда как значения для F Neu5Gc гетерозиготных и дикого типа мышей могут широко варьироваться в зависимости от возраста мыши и типа ткани (от 2% И> 90%) с ожидаемым пределом погрешности ± 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематический анализ описанного метода анализа показан на рисунке 1 и включает выделение сиаловых кислот из образцов молока и печени мутантных мышей дикого типа и Cmah , а также дериватизацию флуоресценции и анализ HPLC этих компонентов. На фиг. 2 и 3 показаны типичные хроматограммы ВЭЖХ дериватизированных сиаловых кислот молочных и печеночных образцов от гомо- и гетерозиготных нокаутных мышей Cmah (- / - и +/-) и мышей дикого типа. На рисунке 4 показаны полученные относительные количества N-гликолилнейраминовой кислоты (Neu5Gc) анализируемых образцов мыши, рассчитанных на участках пика ВЭЖХ.
фигура
Рисунок 2 : Хроматограммы ВЭЖХ флуоресцентных меченых сиаловых кислот из образцов молока, полученных из гомо- и гетерозиготных нокаутных мышей Cmah (- / - и +/-) и мышей дикого типа. Верхняя хроматограмма представляет собой смешанный стандарт сиаловой кислоты. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
"Src =" / files / ftp_upload / 56030 / 56030fig3.jpg "/>
Рисунок 3 : Хроматограммы ВЭЖХ флуоресцентных меченых сиаловых кислот из образцов печени, полученных из гомо- и гетерозиготных нокаутных мышей Cmah (- / - и +/-) и мышей дикого типа. Верхняя хроматограмма представляет собой смешанный стандарт сиаловой кислоты. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Относительные количества N-гликолилнейраминовой кислоты (Neu5Gc) анализируемых проб мыши, рассчитанных из пиковых областей ВЭЖХ. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь протокол позволяет фенотипическую оценку гомозиготных мышечных мышей Cmah , анализируя и количественно определяя относительные количества Neu5Gc образцов молока и печени. Анализ проводили с использованием стандартной установки ВЭЖХ с детектированием флуоресценции. Наиболее важным этапом этой процедуры является получение анионообменных колонок и проведение анионообменной хроматографии; Для правильной установки смолы и для сбора правильной фракции промывки и элюирования требуется немного практики.
В качестве альтернативы используемый здесь дериватизирующий агент OPD может быть легко заменен более дорогим дериватизационным агентом DMB (1,2-диамино-4,5-метилендиоксибензол). Кроме того, анализ полученных производных сиаловой кислоты на стадии 6.5. Могут быть также проанализированы с использованием масс-спектрометрического детектирования вместо обнаружения флуоресценции ( т.е. система UMLC Shimadzu Nexera ULCC, связанная с детектором MS-2020).Применяя шаги 7.2 - 7.6, производные сиаловой кислоты непосредственно обнаруживаются с использованием сканирования методом положительной ионизации для отношений m / z 382,0 и 398,0 (это H + -аддукты Neu5Ac-OPD и Neu5Gc-OPD соответственно).
Одно из ограничений этого метода заключается в том, что содержание Neu5Gc может быть количественно оценено по отношению к количеству Neu5Ac, но не в абсолютном порядке. Для этого на начальной стадии подготовки образца потребуется добавить отдельную и количественную сиаловую кислоту в качестве внутреннего стандарта. Другим недостатком является то, что только гомозиготные, но не гетерозиготные мышечные мыши Cmah могут быть однозначно идентифицированы, так как относительное количество гетерозиготных нокаутных мышей Neu5Gc может сильно варьироваться в зависимости от типа образца ( т. Е. Ткани ) и возраста отдельных мышей. Будущие разработки этого метода могут включать добавление внутренних стандартов и абсолютную количественную оценку сиаловых кислот у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук Китая (номера грантов 31471703, A0201300537 и 31671854 для СП и LL) и 100 иностранных планов талантов (номер гранта JSB2014012 для СП).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
