Summary
אנו מתארים שיטה מבוססת HPLC לקביעת חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד העכבר חלב.
Abstract
CMAH (cytidine monophosphate-N-Acetylneuraminic acid hydroxylase) הוא אחראי על החמצון של חומצות cytidine monophosphate-N- אצטילנורמין ב יונקים. עם זאת, בני אדם לא יכולים לחמצן cytidine monophosphate-N- חומצה אצטילנוראמית כדי cytidine monophosphate-N- חומצה glycolylneuraminic בשל מחיקת אקסון העיקרי של הגן CMAH . כדי להבין את ההשפעות ואת ההשלכות של חוסר פעילות CMAH בפירוט רב יותר, מודל Cmah לדפוק את העכברים הוא עניין רב במחקר בסיסי ויישומי. שיטת ניתוח כדי לקבוע את הפנוטיפ של מודל העכבר כאן הוא תיאר בפירוט, והוא מבוסס על זיהוי של שניהם חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד וחלב של wild-type ו- Cmah לדפוק את העכברים. חומצות sialic אנדוגניים משתחררים ו derivatized עם o-phenylenediamine לייצר נגזרות fluorogenic, אשר ניתן לנתח לאחר מכן על ידי HPLC. הפרוטוקול המוצג יכול להיותחל גם על ניתוח של דגימות חלב ורקמות ממקורות שונים אחרים, והוא עשוי להיות שימוש כדי לחקור את התזונתיים ואת ההשפעות הבריאותיות של N-glycolylneuraminic חומצה.
Introduction
N-Acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac) ו- N-glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc) הם חומצות sialic הנפוצים ביותר יונקים 1 . למרות יכולת סינתזה Neu5Ac endogenously, בני אדם אינם מסוגלים לייצר Neu5Gc בשל מחיקת אקסון העיקרי על קידוד הגן CMAH עבור הידרוקסילאז CMP-Neu5Ac 2 , 3 . עם זאת, מוצרי מזון המבוססים על בעלי חיים יכולים להיות מקורות תזונתיים של Neu5Gc 4 , 5 , 6 , המוביל לייצור נוגדנים נוגדי Neu5Gc ולכן מפעיל תגובה חיסונית כלפי Neu5Gc 7 . השפעה זו תזונתית של Neu5Gc חשוד לתרום דלקת כרונית ומחלות שונות 8 , 9 , 10 . על מנת להבין את ההשפעות של Neu5Gc ב חUmans, מודל חיה עבור המחקר השיטתי של ההשפעות של חומצות סיאליות במזון הוא רצוי מאוד. למרות פרוטוקולים המבוססים על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) לניתוח של נוק- out עכברים מבוססים היטב דרך נוחה להערכה genotypical, ניתוח פונקציונלי של פנוטיפ ברמה המטבולית דורש שיטות ניתוח ספציפי יותר. פנוטיפ של מודל Cmah לדפוק את העכבר ניתן להעריך על ידי בידוד וניתוח הרכב של חומצות sialic בדגימות כבד או חלב. מספר שיטות לאיתור חומצות סיאליות ברקמות בעלי חיים דווחו בעבר: תגובה של חומצות סיאליות עם רסורצינול 11 או חומצה thiobarbituric 12 לגרום להיווצרות של מוצר chromophoric וניתן פשוט ניתח באמצעות ההתקנה מבוסס platereader, אבל רק את סך sialic ניתן לקבוע תוכן חומצי. לחלופין, ניתוח של חומצות sialic תוארה גם באמצעות כרומטוגרפיה גז13 , MALDI-ToF ספקטרומטריית מסה 14 או שיטות אמפומטריות 15 . עם זאת, הנפוץ ביותר sialic החלים שיטות ניתוח מבוססים על שחרור hydrolytic, ואחריו derivatization פלואורסצנטי ואחריו ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים הקשורים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האתית של המרכז החינוכי הניסויי של נאנג 'ינג האוניברסיטה החקלאית בהתאם להנחיות הלאומיות לרווחת בעלי חיים ניסיוני (משרד המדע והטכנולוגיה, יחסי ציבור של סין, 2006) עם בעלי החיים השוכן SPF מתקן (מזהה הרשאה: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah לדפוק את העכבר דגם
- השתמש wild-type C57Bl / 6 עכברים מהמרכז הרפואי השוואתי של אוניברסיטת יאנגז 'ו (סין).
הערה: Cmah לדפוק את העכברים נוצרו על סמך המידע שסופק מן Cmah הקודם לדפוק- out מחקרים 17 , 19 ו שהושגו מסחרית באמצעות אסטרטגיה CRISPR / Cas9 20 על ידי הסרת 92 זוגות זוג מן אקסון 6 של הגן Cmah , שהוא גם נמחק בגן CMAH האנושי 19 . חיובי F 0/ Sub> -mice (2 אנשים) חצו עם עכברים מסוג בר כדי להשיג heterozygous F- 1 עכבר. לאחר חציית F הטרוזיגוטיים F- 1 (5 אנשים), הומוזיגיים Cmah לדפוק- F 2- עכברים ניתן להשיג בהצלחה (3 אנשים). - בצע genotyping של עכברים באמצעות DNA גנומי על פי השיטה המוצגת על ידי Zangala 21 באמצעות ערכת טיהור DNA מסחרי.
- להגביר את קטע ה- DNA המקביל של הגן Cmah באמצעות פולימראז דנ"א מסחרי ואת זוג primer 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'ו 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. בצע את הגברה הגן באמצעות 34 מחזורים PCR המורכב denaturation ב 94 מעלות צלזיוס במשך 40 s, חישול ב 63 מעלות צלזיוס במשך 40 שניות, התארכות ב 72 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות.
- דמיינו מוצרים PCR על ג'ל agarose 1%. יש לצפות בלהקה בודדת (0.5 קילו-בייט) עבור האדם מסוג wild wild, פס כפול (0.4 ו -0.5 קילו-בייט) עבורהטרוזיגוסית, ולהקה בודדת (0.4 קילו-בייט) לאדם ההומו-ציגי.
2. אוסף דוגמאות
- איסוף חלב עכבר באמצעות פרוטוקול המתואר על ידי Willingham et al. 22 .
- איסוף רקמת הכבד העכבר באמצעות פרוטוקול המתואר על ידי Gonçalves et al. 23 ו חנות דגימות ב -80 ° C.
3. בידוד של חומצות סיאליות מחלב
- הכן 100 מ"ל של פתרון 2 חומצה אצטית M על ידי הוספת 12 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני לתוך 88 מ"ל של מזוקק H 2 O.
- העברת 50 μL של חלב לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגה להוסיף 1.2 מ"ל של תמיסת חומצה מימית מוכן.
- לדגור את ההשעיה במשך 4 שעות ב 80 מעלות צלזיוס ו צנטריפוגה המדגם ב XG 14,000 במשך 10 דקות.
- מעבירים את μL 1000 העליון של supernatant לתוך צינור צנטריפוגות טרי 1.5 מ"ל רםOve ממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר כדי להשלים יובש (בהתאם משאבת ואקום המצורפת זה ייקח 4-20 שעות). Re- להמיס את המדגם μL 500 של מזוקקים H 2 O.
- הכן טור חילופי מיקרו אניון. שלב זה יהיה להעשיר תרכובות anionic במיוחד ולהסיר תרכובות קטיוני וניטרלי מן דגימות חלב וכבד, ולכן מגביר את הסלקטיביות של fluorogenic OPD סוכן תיוג עבור derivatization חומצה sialic.
- העברה עבור כל מדגם 200 מ"ג של שרף חילופי אניון (Dowex 1X8) לתוך צינורות ריק 3 מ"ל טור עם שסתום המצורפת.
- הוסף 2 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית מימית מוכן בשלב 3.1 כדי להחליף את יוני כלור שרף עם יונים אצטט. סגור את שסתום ברגע ממס מגיע לראש שרף.
- בעדינות להוסיף 2 מ"ל של מזוקק H 2 O, לפתוח את שסתום לעצור את הזרימה ברגע שרוב הממס מגיעהחלק העליון של השרף. ודא כי שרף תמיד מכוסה ממס.
- שטפו את שרף טור פעמיים נוספות עם 2 מ"ל של מזוקק H 2 O להסרת עודף אצטט.
- מעבירים את μL 500 וכתוצאה מכך ממס מדגם משלב 3.4. על העמוד שרף וזורקים את הזרימה דרך. בעדינות לשטוף את שרף עם 2 מ"ל של מזוקקים H 2 O. Elute אניונים מדגם מן שרף באמצעות 1 מ"ל של פתרון 50 מ"מ אמוניום אצטט (386 מ"ג של אצטט אמוניום מומס 100 מ"ל של מזוקק H 2 O) לתוך 1.5 מ"ל צינור צנטריפוגה. הסר את הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר ליובש.
הערה: דגימות יבשות ניתן לאחסן על 4-6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים.
4. בידוד של חומצות סיאליות מ רקמת כבד
- בעדינות להפשיר 20 - 50 מ"ג של הכבד העכבר ולהעביר אותו לתוך מטחנת רקמה Dounce (1 מ"ל או 2 מ"ל של נפח). הוסף 1.2 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית מימיתמוכן בשלב 3.1 ו homogenize הרקמה על ידי גז עדין במשך 10 s. מעבירים את ההשעיה וכתוצאה מכך צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
- בצע את השלבים 3.3. Solid
הערה: דגימות יבשות ניתן לאחסן על 4-6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים.
5. הכנת תקן חומצה Sialic מעורב
- שוקלים בין 5 - 8 מ"ג של חומצה N-acetylneuraminic על איזון אנליטית לתוך צינור 1.5 צנטריפוגות מ"ל. שים לב למשקל המדויק ולהוסיף 164 μL של H 2 מזוקק עבור כל מ"ג ( כלומר אם המשקל של Neu5Ac הוא 7.2 מ"ג ואז להוסיף 7.2 x 164 = 1, 181 μL של מזוקק H 2 O). התוצאה היא פתרון 20 מ"מ Neu5Ac המניות אשר ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 12 חודשים.
- השג N-glycolylneuraminic חומצה בכמויות קטנות במחיר מתון כגון 1 מ"ג aliquots. הוסף 154 μL של מזוקק H 2 O ישירות למתחם על מנת להשיג ~ 20 מ"מ Neu5Gc פתרון המניות. להעביר אתפתרון לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. פתרון זה ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 12 חודשים.
- שלב 5 μL מהפתרון כל המניות משלב 5.1 ו 5.2 לתוך צינור צנטריפוגה טרי 1.5 מ"ל ולהסיר את הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר ליובש.
הערה: תקן חומצה sialic מעורב יכול להיות מאוחסן על 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים.
6. הקרינה Derivatization של חומצות Sialic
- הכן 10 מ"ל של OPD פתרון, בהיקף של 100 מ"ג של o-phenylenediamine o ו 208 מ"ג של מימן sulfite נתרן 10 מ"ל של מזוקק H 2 O.
- הוסף 20 μL של OPD פתרון לדגימות חומצה sialic נגזר חלב העכבר (שלב 3), כבד העכבר (שלב 4), או תקן חומצה sialic מעורבת (שלב 5). וורטקס במרץ עבור 30 ד ו דגירה דגימות במשך 4 שעות ב 80 ° C בחושך ( כלומר לעטוף את microtubes רדיד אלומיניום).
- בואו הדגימות להתקרר במשך 5 דקות, להוסיף 80 μ, L מזוקקים H 2 O ו צנטריפוגה צינורות ב XG 14,000 במשך 1 דקות.
- העברת 80 μL מן supernatant לתוך בקבוקון 300 μL גבוהה התאוששות HPLC. הדגימות חומצה sialic derivatized ניתן לאחסן 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע אחד.
7. HPLC ניתוח של Sialic חומצה נגזרים
- ניתוח הדגימות באמצעות מערכת HPLC סטנדרטי מחובר גלאי פלואורסצנטי באינטרנט.
- השתמש טור שלב C18 הפוך עם ממדים סטנדרטיים של 250 מ"מ אורך ו 4.6 מ"מ קוטר לניתוח.
- הכן ממס על ידי דילול 200 מ"ל של פתרון המניות עם 800 מ"ל של מים כיתה LCMS (LCMS - כרומטוגרפיה כרומטוגרפית נוזלית מסה). פתרון המניות עצמו יכול להיות מוכן כדלקמן:
- הוסף 46 גרם של חומצה פורמית ל 800 מ"ל של LCMS כיתה H 2 O.
- התאם את pH 4.5 על ידי הוספת drop הוספת hydroxide אמוניום פתרון (purissa הרשות).
- מעבירים את הממס למדידת גליל ולמלא עד 1000 מ"ל עם LCMS כיתה H 2 O. פתרון זה המניות ניתן לאחסן 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
- עבור ממס B, השתמש אצטוניטריל LCMS בכיתה.
- להפריד את חומצות sialic נגזרים בקצב 1 מ"ל / דקות הזרימה עם elution הבאות gradient:
- התחל על ידי הוספת 10% של ממס ב 'מעורב א ממס א.
- מ 0 דקות עד 15 דקות, להגדיל בהדרגה את שיעור ממס B עם שיפוע ליניארי ל 60%.
- מ 15 דקות עד 16 דקות, להגדיל במהירות את שיעור ממס B עם שיפוע ליניארי מ 60% ל 90%. זה יוזם את הכביסה של העמוד HPLC.
- כדי לשטוף עוד את העמודה HPLC, לשמור על רמת ממס ב 90% בין 16 דקות ו 18 דקות לפני הפחתת בהדרגה את רמת ממס ממס שוב 10% בין 18 דקות ו 19 דקות.
- Re-equilibrate עמודות HPLC לתנאי ההתחלה של 10% B בין 19 ו 24 דקות.
- בJect 50 μL של המדגם לתוך מערכת HPLC.
- צג eluents באמצעות גלאי פלואורסצנטי עירור / פליטת גלים של 373/448 ננומטר, ואת חומצות sialic derivatized ניתן לצפות בשעה משוער פעמים של 9 דקות (עבור Neu5Gc-OPD) ו 10 דקות (עבור Neu5Ac-OPD).
- לחשב את הסכום היחסי של Neu5Gc (F Neu5Gc) מאזורי השיא הקרינה של Neu5Ac (א Neu5Ac) ו Neu5Gc (א Neu5Gc) כדלקמן: F Neu5Gc [%] = 100 × Neu5Gc / (א Neu5Gc Neu5Ac + A). במקרה של דגימות חלב וכבד מן העכבר Cmah לדפוק החוצה עכבר F Neu5Gc צריך להיות 0%, ואילו הערכים עבור F Neu5Gc של העכברים הטרוזיגיים wild-type עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לגיל העכבר ואת סוג הרקמה (בין 2% ו - 90%) עם שולי שגיאה צפויים של ± 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה סכמטית של שיטת הניתוח המתואר מוצג באיור 1 וכולל את הבידוד של חומצות sialic מדגימות חלב וכבד של wild-type ו- Cmah לדפוק- out עכברים מוטציה, ו derivatization פלואורסצנטי וניתוח HPLC של רכיבים אלה. איור 2 איור 3 להראות chromatograms HPLC נציג של חומצות sialic derivatized של חלב דגימות כבד מ הומו ו heterozygous לדפוק החוצה Cmah עכברים (- / - ו + / -) ועכברים סוג בר. איור 4 מראה את כמויות שהושגו יחסית של N-glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc) של דגימות העכבר ניתח מחושב מתוך אזורי שיא HPLC.
דמות
איור 2 : Chromatograms HPLC של פלואורסצנטי תווית חומצות סיאליות מדגימות חלב נגזר הומו ו הטרוזיגוס לדפוק- Cmah עכברים (- / - ו + / -) ו wild-type עכברים. כרומטוגרמה העליון הוא תקן חומצה sialic מעורבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Src =" / files / ftp_upload / 56030 / 56030fig3.jpg "/>
איור 3 : Chromatograms HPLC של פלואורסצנטי תווית חומצות סיאליות מ דוגמאות כבד נגזר הומו ו הטרוזיגוס לדפוק- Cmah עכברים (- / - ו + / -) ו wild-type עכברים. כרומטוגרמה העליון הוא תקן חומצה sialic מעורבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : כמויות יחסית של חומצה N-glycolylneuraminic (Neu5Gc) של דוגמאות עכבר Analyized מחושב על ידי אזורים HPLC שיא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר הערכה פנוטיפית של הומוזיגוס Cmah לדפוק את העכברים על ידי ניתוח וכימות כמויות יחסית של Neu5Gc של חלב ודגימות כבד. הניתוח בוצע באמצעות התקנה סטנדרטית HPLC עם זיהוי פלואורסצנטי. השלב הקריטי ביותר של הליך זה הוא הכנת העמודות חילופי אניון וביצוע כרומטוגרפיה אניון החליפין; כדי ליישב את שרף כראוי לאסוף את הכביסה הנכון שברים elution לוקח קצת תרגול.
לחלופין, כאן משמש נגזר הגזירה OPD ניתן להחליף בקלות עם סוכן הגזירה יקר יותר DMB (1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene). יתר על כן, ניתוח של נגזרות חומצה sialic המתקבל משלב 6.5. ניתן לנתח גם באמצעות גילוי המוני ספקטרומטריים במקום זיהוי הקרינה ( כלומר Shimadzu Nexera מערכת UPLC יחד עם גלאי MS-2020). אלאחר מכן, נגזרים חומצי סיאליק מזוהים באופן ישיר באמצעות מצב ינון חיובי סריקה עבור יחסי m / z של 382.0 ו 398.0 (אלה הם H + -adducts של Neu5Ac-OPD ו Neu5Gc-OPD, בהתאמה).
מגבלה אחת של שיטה זו היא כי התוכן Neu5Gc ניתן לכמת יחסית לכמות Neu5Ac, אבל לא באופן מוחלט. כדי לעשות זאת, תוספת של חומצה סיאלית ברורה לכימות כמו תקן פנימי יהיה צורך בשלב הראשוני של ההכנה המדגם. חסרון נוסף הוא כי רק הומוזיגוטים אבל לא heterozyos Cmah לדפוק את העכברים יכול להיות מזוהה באופן חד משמעי, כמו כמות יחסית של עכברים נוירוגיגיים נוקוזיגוט החוצה עשוי להשתנות מאוד בהתאם לסוג הדוגמה ( כלומר רקמות) ואת הגיל של עכברים בודדים. התפתחויות עתידיות של שיטה זו עשויות לכלול תוספת של תקנים פנימיים וכימות מוחלט של חומצות sialic בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (מענק מספרים 31471703, A0201300537 ו 31671854 ל JV ו LL), ואת 100 תוכנית כשרונות זרים (מענק מספר JSB2014012 ל JV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
