Summary
We beschrijven een HPLC-gebaseerde methode voor de bepaling van N-acetylneuraminezuur en N-glycolylenuraminezuur in muizenlever en melk.
Abstract
CMAH (cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuurhydroxylase) is verantwoordelijk voor de oxidatie van cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuren bij zoogdieren. Echter, mensen kunnen cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuur niet oxideren tot cytidine monofosfaat-N-glycolylneuraminezuur als gevolg van een primaire exon deletie van het CMAH gen. Om de effecten en implicaties van het ontbreken van CMAH-activiteit in meer detail te begrijpen, is een Cmah- knock- outmodel in muizen een grote interesse in basis en toegepast onderzoek. De analysemethode voor het bepalen van het fenotype van dit muismodel wordt hierin gedetailleerd beschreven en is gebaseerd op de detectie van zowel N-acetylneuraminezuur als N-glycolyleenzuurzuur in de lever en melk van wild-type en Cmah- knock- outmuizen . Endogene sialiczuren worden vrijgemaakt en afgeleid met o-fenylendiamine om fluorogene derivaten te genereren, die vervolgens met behulp van HPLC kan worden geanalyseerd. Het gepresenteerde protocol kan zijnOok aangevraagd voor de analyse van melk- en weefselmonsters uit verschillende andere herkomst, en kan van nut zijn om de voedings- en gezondheidseffecten van N-glycolylneuraminezuur te onderzoeken.
Introduction
N-acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en N-glycolylneuraminezuur (Neu5Gc) zijn de meest voorkomende sialinezuren bij de meeste zoogdieren 1 . Hoewel het mogelijk is om Neu5Ac endogeen te synthetiseren, kunnen mensen niet Neu5Gc produceren door een primaire exon deletie op het CMAH gen dat codeert voor een CMP-Neu5Ac hydroxylase 2 , 3 . Dierlijke voedingsmiddelen kunnen echter voedingsbronnen zijn van Neu5Gc 4 , 5 , 6 , wat leidt tot de productie van anti-Neu5Gc antilichamen en leidt daarom tot een immuunrespons tegen Neu5Gc 7 . Dit dieet effect van Neu5Gc wordt vermoedelijk bij te dragen aan chronische ontsteking en diverse andere aandoeningen 8 , 9 , 10 . Om de effecten van Neu5Gc in h te begrijpenUmans, is een diermodel voor de systematische studie van de effecten van voedselgedragen sialicuren zeer wenselijk. Hoewel protocols op basis van polymerase kettingreactie (PCR) voor het analyseren van knock-out muizen goed gevestigd zijn en een handige manier zijn voor de genotypische beoordeling, vereist de functionele analyse van fenotype op het metabolische niveau meer specifieke analysemethoden. Het fenotype van een Cmah knock-out muis model kan worden beoordeeld door het isoleren en analyseren van de samenstelling van sialinezuren in lever- of melkmonsters. Verscheidene methoden voor de detectie van sialinezuren in dierlijke weefsels zijn eerder gemeld: het reageren van sialzuren met resorcinol 11 of thiobarbituriczuur 12 resulteert in de vorming van een chromophorisch product en kan eenvoudig worden geanalyseerd met behulp van een platereader gebaseerde opstelling, maar alleen de totale sialische Zuurgehalte kan worden bepaald. Als alternatief werd ook de analyse van sialinezuren beschreven onder toepassing van gaschromatografie13 , MALDI-ToF-massaspectrometrie 14 of amperometrische methoden 15 . De meest gebruikelijke sialinezuuranalysemethoden zijn echter gebaseerd op hydrolytische afgifte, gevolgd door fluorescentiedivatisering en daaropvolgende vloeibare chromatografie 16 , 17 , 18 met hoge prestaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures waarbij dieren betrokken zijn, zijn goedgekeurd door het Ethisch Comité van het Experimentele Dierscentrum van de Landbouwuniversiteit van Nanjing overeenkomstig de nationale richtlijnen voor experimentele dierenwelzijn (Ministerie van Wetenschap en Technologie, PR van China, 2006) bij de dieren in een SPF Faciliteit (toestemming ID: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah Knock-out Muis Model
- Gebruik wildtype C57Bl / 6 muizen van het Comparative Medicine Center van Yangzhou University (China).
OPMERKING: Cmah knock-out muizen werden gegenereerd op basis van de informatie die werd verstrekt uit eerdere Cmah knock-out studies 17 , 19 en commercieel verkregen met behulp van een CRISPR / Cas9 20 strategie door 92 basisparen uit exon 6 van het Cmah gen te verwijderen, dat ook Verwijderd in het humane CMAH gen 19 . Positieve F 0 </ sub> -mice (2 personen) werden gekruist met wild type muizen heterozygote F1 -mice verkrijgen. Na het passeren heterozygote F1 -mice (5 personen) kan CMAH homozygote knock-out F2 -mice succes verkregen (3 individuen). - Voer genotypering van muizen uit door middel van genomisch DNA volgens de methode die wordt getoond door Zangala 21 onder gebruikmaking van een commerciële DNA zuiveringsset.
- Versterk een overeenkomstig DNA-fragment van het Cmah- gen door gebruik te maken van commercieel DNA-polymerase en het primerpaar 5'gaaagggctcggctctgtgtgaga3 'en 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Voer de genamplificatie uit met behulp van 34 PCR cycli die bestaan uit denaturatie bij 40 ° C bij 94 ° C, annealing bij 63 ° C gedurende 40 seconden en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 minuut.
- Visualiseer PCR-producten op een 1% agarosegel. Men zou een enkele band (0,5 kb) moeten observeren voor het wildtype individu, een dubbele band (0,4 en 0,5 kb) voor deHeterozygote knock-out individu en een enkele band (0,4 kb) voor het homozygote uitschakel-individu.
2. Sample Collection
- Verzamel muismelk met behulp van het protocol beschreven door Willingham et al. 22 .
- Verzamel de leverweefsel van de muis door gebruik te maken van het protocol beschreven door Gonçalves et al. 23 en monsters opslaan bij -80 ° C.
3. Isolatie van Sialic Acids uit Melk
- Bereiden 100 ml van een 2 M azijnzuur door toevoeging van 12 ml ijsazijn in 88 ml gedestilleerd H2O
- Breng 50 μl melk in een 1,5 ml centrifugebuis en voeg 1,2 ml van de bereide waterige azijnzuuroplossing toe.
- Incubeer de suspensie gedurende 4 uur bij 80 ° C en centrifugeer het monster bij 14.000 xg gedurende 10 minuten.
- Breng de bovenste 1000 μL van de supernatant over in een verse 1,5 ml centrifugebuis en remOve het oplosmiddel door middel van centrifugale verdamping bij kamertemperatuur om droogheid te voltooien (afhankelijk van de bijgevoegde vacuümpomp neemt dit 4 - 20 uur). Opnieuw oplossen van het monster in 500 pl gedestilleerd H2O
- Bereid een micro-anion uitwisselingskolom op. Deze stap zal specifiek anionische verbindingen verrijken en kationische en neutrale verbindingen uit de melk- en levermonsters verwijderen en verhoogt daarom de selectiviteit van het fluorogene OPD-etiketteringsmiddel voor sialzuur derivatisatie.
- Breng voor elk monster 200 mg van de anionuitwisselingshars (Dowex 1X8) in lege 3 ml kolombuizen met een bijgeleverde stopcock.
- Voeg 2 ml van de waterige azijnzuuroplossing bereid in stap 3.1 toe om de chloride-ionen in de hars te vervangen door acetaationen. Sluit de stopkraan zodra het oplosmiddel de bovenkant van de hars bereikt.
- Voeg 2 ml gedestilleerde H 2 O voorzichtig toe, open de stopcock en stop de stroom zodra het meeste oplosmiddel bereiktDe top van de hars. Zorg ervoor dat de hars altijd bedekt is met oplosmiddel.
- Was de harskolom twee maal met 2 ml gedestilleerd H2O ter verwijdering van de overmaat acetaat.
- Breng de resulterende 500 μl monsteroplosmiddel uit stap 3.4 over. Op de harskolom en verwijder de doorstroming. Voorzichtig te wassen van het hars met 2 ml gedestilleerd H2O Elueer de monster-anionen uit de hars met gebruik van 1 ml van een 50 mM ammoniumacetaatoplossing (386 mg ammoniumacetaat opgelost in 100 ml gedestilleerd H2 O) in een 1,5 mL Centrifuge buis. Verwijder het oplosmiddel door middel van centrifugale verdamping bij kamertemperatuur tot droogheid.
OPMERKING: Droge monsters kunnen tot 12 maanden bij 4-6 ° C worden opgeslagen.
4. Isolatie van Sialic Acids uit Leverweefsel
- Ontdooi 20 tot 50 mg muislever voorzichtig en verplaats het in een Dounce weefselmolen (1 ml of 2 ml volume). Voeg 1,2 ml van de waterige azijnzuuroplossing toeBereid in stap 3.1 en homogeniseren het weefsel door zacht scheren gedurende 10 s. Breng de resulterende suspensie over in een 1,5 ml centrifugebuis.
- Volg stappen 3.3. Naar 3.6.
OPMERKING: Droge monsters kunnen tot 12 maanden bij 4-6 ° C worden opgeslagen.
5. Bereiding van een Mixed Sialic Acid Standard
- Weeg tussen 5 - 8 mg N-acetylneuraminezuur op een analytische balans in een 1,5 ml centrifugebuis. Let op het exacte gewicht en voeg 164 μL gedestilleerde H 2 O toe voor elke mg ( dwz als het gewicht van Neu5Ac 7,2 mg is en voeg dan 7,2 x 164 = 1, 181 μl gedestilleerde H 2 O) toe. Dit resulteert in een 20 mM Neu5Ac voorraadoplossing die gedurende maximaal 12 maanden bij -20 ° C kan worden opgeslagen.
- Verkrijg N-glycolylneuraminezuur in kleinere hoeveelheden tegen een gematigde prijs, zoals in 1 mg porties. Voeg 154 ul gedestilleerd H2O direct naar verbinding om een ~ 20 mM Neu5Gc voorraadoplossing te verkrijgen. Verplaats deOplossing in een 1,5 ml centrifugebuis. Deze oplossing kan maximaal 12 maanden bij -20 ° C worden opgeslagen.
- Combineer 5 μl van elke voorraadoplossing van stap 5.1 en 5.2 in een verse 1,5 ml centrifugebuis en verwijder het oplosmiddel door middel van centrifugale verdamping bij kamertemperatuur tot droogheid.
OPMERKING: De gemengde sialinezuurstandaard kan maximaal 12 maanden bij 4 - 6 ° C worden opgeslagen.
6. Fluorescentie Derivatisatie van Sialic Acids
- Bereid 10 ml OPD-oplossing, bestaande uit 100 mg o-fenyleendiamine en 208 mg natriumwaterstofsulfiet in 10 ml gedestilleerd H2O
- Voeg 20 μL OPD-oplossing toe aan de siaalzuurmonsters afgeleid van muismelk (stap 3), muizenlever (stap 4) of de gemengde sialinezuurstandaard (stap 5). Vortex krachtig gedurende 30 s en incubateer monsters gedurende 4 uur bij 80 ° C in het donker ( dwz wikkel de microtubes in aluminiumfolie).
- Laat de monsters 5 minuten afkoelen, voeg 80 μm toe, L gedestilleerd H2O en centrifugeer de buizen bij 14.000 xg gedurende 1 minuut.
- Breng 80 μl van de supernatant over in een 300 μL HPLC-injectie met hoge herstelfunctie. De afgeleide sialinezuurmonsters kunnen gedurende maximaal een week bij 4 - 6 ° C worden opgeslagen.
7. HPLC Analyse van Sialic Acid Derivatives
- Analyseer de monsters met behulp van een standaard HPLC systeem aangesloten op een online fluorescentiedetector.
- Gebruik een omgekeerde fase C18 kolom met de standaard afmetingen van 250 mm lengte en 4,6 mm diameter voor de analyse.
- Bereid oplosmiddel A op door 200 ml voorraadoplossing te verdunnen met 800 ml LCMS-gehalte water (LCMS - vloeistofchromatografie massaspectrometrie). De voorraadoplossing zelf kan als volgt worden bereid:
- Voeg 46 g mierenzuur toe aan 800 ml LCMS-gehalte H 2 O.
- Pas de pH op bij 4,5 druppelsgewijs toevoeging van ammoniumhydroxideoplossing (puriss. Pa).
- Breng het oplosmiddel over naar aMeetcilinder en vul tot 1000 ml met LCMS-klasse H 2 O. Deze voorraadoplossing kan gedurende maximaal 3 maanden bij 4 - 6 ° C worden opgeslagen.
- Voor oplosmiddel B gebruik LCMS-gehalte acetonitril.
- De derivaten van sialiczuren scheiden bij een stroom van 1 ml / min met de volgende gradiëntelutatie:
- Begin door 10% van oplosmiddel B gemengd aan oplosmiddel A toe te voegen.
- Van 0 min tot 15 min verhoogt het percentage oplosmiddel B geleidelijk met een lineair gradiënt tot 60%.
- Van 15 min tot 16 min verhoogt het aandeel oplosmiddel B snel met een lineair gradiënt van 60% tot 90%. Dit initieert de was van de HPLC kolom.
- Om de HPLC-kolom verder te wassen, houd het niveau van oplosmiddel B op 90% tussen 16 minuten en 18 minuten voordat u het niveau van oplosmiddel B opnieuw tot 10% tussen 18 minuten en 19 minuten geleidelijk verlaagt.
- Herkwilibreer HPLC-kolom aan de startomstandigheden van 10% B tussen 19 en 24 min.
- In50 μL monster in het HPLC-systeem brengen.
- Monitor eluenten met behulp van de excitatie- / emissiegolflengten van de fluorescentiedetector van 373/448 nm, en de afgeleide sialinezuren kunnen worden verwacht bij de geschatte retentietijden van 9 minuten (voor Neu5Gc-OPD) en 10 minuten (voor Neu5Ac-OPD).
- Bereken de relatieve hoeveelheid Neu5Gc (F Neu5Gc ) van de fluorescentiepiekarea's van de Neu5Ac (A Neu5Ac ) en Neu5Gc (A Neu5Gc ) als volgt: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). Bij de melk- en levermonsters van de homozygote Cmah- knock-out muis F Neu5Gc dient 0% te zijn, terwijl de waarden voor F Neu5Gc van heterozygote en wilde-type muizen sterk kunnen variëren afhankelijk van de leeftijd van de muis en het weefseltype (tussen 2% En> 90%) met de verwachte foutmarges van ± 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematisch overzicht van de beschreven analysemethode is weergegeven in Figuur 1 en omvat de isolatie van sialinezuren uit melk- en levermonsters van wild-type en Cmah- knock-out mutantmuizen en de fluorescentiedivatisering en HPLC-analyse van deze componenten. Figuur 2 en Figuur 3 tonen representatieve HPLC chromatogrammen van afgeleide sialinezuren van melk- en levermonsters uit homo- en heterozygote knock-out Cmah- muizen (- / - en +/-) en wilde type muizen. Figuur 4 toont de verkregen relatieve hoeveelheden N-glycolylneuraminezuur (Neu5Gc) van de geanalyseerde muismonsters berekend uit de HPLC piek gebieden.
Figuur
Figuur 2 : HPLC-chromatogrammen van fluorescentie gelabelde sialiczuren uit melkmonsters afkomstig van homo- en heterosygote uitklapbare Cmah- muizen (- / - en +/-) en wilde-type muizen. Het bovenste chromatogram is de gemengde sialinezuurstandaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
"Src =" / files / ftp_upload / 56030 / 56030fig3.jpg "/>
Figuur 3 : HPLC-chromatogrammen van fluorescentie gelabelde sialiczuren uit levermonsters afgeleid van homo- en heterosygote uitklapbare Cmah- muizen (- / - en +/-) en wilde-type muizen. Het bovenste chromatogram is de gemengde sialinezuurstandaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Relatieve hoeveelheden van N-glycolylneuraminezuur (Neu5Gc) van de geanalyseerde muismonsters berekend uit de HPLC-peakgebieden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hierin gepresenteerde protocol laat de fenotypische beoordeling van homozygote Cmah- knock-out-muizen toe door de relatieve hoeveelheden Neu5Gc van melk- en levermonsters te analyseren en kwantificeren. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een standaard HPLC setup met fluorescentiedetectie. De meest kritische stap van deze procedure is de bereiding van de anionuitwisselingszolen en het uitvoeren van de anionuitwisselingschromatografie; Om de hars goed te regelen en de juiste was- en elueringsfracties te verzamelen, duurt een beetje oefening.
Als alternatief kan het hierin gebruikte derivatiseringsmiddel OPD gemakkelijk vervangen worden door het duurdere derivatiseringsmiddel DMB (1,2-diamino-4,5-methylendioxybenzeen). Verder is de analyse van de verkregen sialinezuurderivaten uit stap 6,5. Kan ook worden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrische detectie in plaats van de fluorescentiedetectie ( dwz Shimadzu Nexera UPLC-systeem gekoppeld aan MS-2020-detector). EENVoor het toepassen van stappen 7.2 - 7.6 worden de sialzuurderivaten direct gedetecteerd met behulp van positieve ionisatiemodusscanning voor de m / z-verhoudingen van 382,0 en 398,0 (dit zijn respectievelijk de H + -adducten van Neu5Ac-OPD en Neu5Gc-OPD).
Een beperking van deze methode is dat het Neu5Gc-gehalte alleen kan worden gekwantificeerd ten opzichte van de Neu5Ac-hoeveelheid, maar niet absoluut. Om dit te doen zou de toevoeging van een duidelijk en kwantificeerbaar sialinezuur als een interne standaard nodig zijn in de eerste fase van het monsterbereiding. Een andere tekortkoming is dat alleen homozygote maar niet heterozygote Cmah knock-out muizen ondubbelzinnig kunnen worden geïdentificeerd, aangezien de relatieve hoeveelheid Neu5Gc heterozygote knock-out muizen sterk kan variëren afhankelijk van het monstertype ( dwz weefsel) en de leeftijd van de individuele muizen. Toekomstige ontwikkelingen van deze methode kunnen de toevoeging van interne normen en de absolute kwantificering van siaalzuren in muizen omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natuurwetenschappelijke Stichting van China (subsidie nummers 31471703, A0201300537 en 31671854 voor JV en LL) en het 100 Foreign Talents Plan (subsidienummer JSB2014012 tot JV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
