Summary
Nous décrivons une méthode à base de HPLC pour la détermination de l'acide N-acétylneuraminique et de l'acide N-glycolylenuraminique dans le foie et le lait de souris.
Abstract
Le CMAH (cytidine monophosphate-N-acétylneuraminique acide hydroxylase) est responsable de l'oxydation des acides cytidine monophosphate-N-acétylurauraminiques chez les mammifères. Cependant, les humains ne peuvent pas oxyder l'acide cydaine monophosphate-N-acétylurauraminique en acide cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminique en raison d'une deletion primaire d'exon du gène CMAH . Pour comprendre plus en détail les effets et les implications du manque d'activité du CMAH, un modèle Cmah knock-out chez la souris présente un vif intérêt pour la recherche fondamentale et la recherche appliquée. Le procédé d'analyse pour déterminer le phénotype de ce modèle de souris est décrit ici en détail et est basé sur la détection à la fois de l'acide N-acétylneuraminique et de l'acide N-glycolylenuraminique dans le foie et du lait de souris de type sauvage et Cmah knock-out. Les acides sialiques endogènes sont libérés et dérivés avec de l'O-phénylènediamine pour générer des dérivés fluorogènes, qui peuvent ensuite être analysés par HPLC. Le protocole présenté peut êtreA également demandé l'analyse d'échantillons de lait et de tissus provenant de diverses autres origines et peut être utile pour étudier les effets nutritionnels et sanitaires de l'acide N-glycolylneuraminique.
Introduction
L'acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac) et l'acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) sont les acides sialiques les plus courants chez la plupart des mammifères 1 . Bien que capable de synthétiser Neu5Ac de manière endogène, les humains ne sont pas capables de produire Neu5Gc en raison d'une deletion primaire d'exon sur le gène CMAH codant pour une hydroxylase CMP-Neu5Ac 2 , 3 . Cependant, les produits alimentaires à base d'animaux peuvent être des sources alimentaires de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , conduisant à la production d'anticorps anti-Neu5Gc et déclenchent donc une réponse immunitaire envers Neu5Gc 7 . Cet effet diététique de Neu5Gc est suspecté de contribuer à l'inflammation chronique et à diverses autres maladies 8 , 9 , 10 . Afin de comprendre de façon compréhensive les effets de Neu5Gc en hUn modèle animal pour l'étude systématique des effets des acides sialiques d'origine alimentaire est hautement souhaitable. Bien que les protocoles basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour l'analyse de souris knock-out soient bien établis et constituent un moyen pratique pour l'évaluation génotypique, l'analyse fonctionnelle du phénotype sur le niveau métabolique nécessite des méthodes d'analyse plus spécifiques. Le phénotype d'un modèle de souris Cmah knock-out peut être évalué en isolant et en analysant la composition des acides sialiques dans des échantillons de foie ou de lait. Plusieurs méthodes pour la détection des acides sialiques dans les tissus animaux ont déjà été rapportées: la réaction des acides sialiques avec le résorcinol 11 ou l'acide thiobarbiturique 12 entraîne la formation d'un produit chromophore et peut être simplement analysée à l'aide d'une configuration basée sur platereader, mais seulement le sialique total La teneur en acide peut être déterminée. En variante, l'analyse des acides sialiques a également été décrite en utilisant une Chromatographie en phase gazeuse13 , la spectrométrie de masse MALDI-ToF 14 ou les méthodes ampérométriques 15 . Cependant, les méthodes d'analyse d'acide sialique les plus couramment appliquées sont basées sur la libération hydrolytique, suivie d'une dérivation de fluorescence et de la Chromatographie liquide 16 , 17 , 18 .
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Protocol
Les procédures impliquant des sujets d'animaux ont été approuvées par le Comité d'éthique du Centre animal expérimental de l'Université agricole de Nanjing conformément aux Lignes directrices nationales pour le bien-être animal expérimental (Ministère de la Science et de la Technologie, PR de Chine, 2006) avec les animaux hébergés dans un SPF Installation (ID d'autorisation: SYXK-J-2011-0037).
1. Modèle de souris Cmah Knock-out
- Utiliser des souris C57Bl / 6 de type sauvage du Centre de médecine comparée de l'Université de Yangzhou (Chine).
NOTE: Les souris Cmah knock-out ont été générées en fonction de l'information fournie par les précédentes études Cmah knock-out 17 , 19 et obtenues commercialement en utilisant une stratégie CRISPR / Cas9 20 en éliminant 92 paires de bases de l'exon 6 du gène Cmah , qui est également Supprimé dans le gène CMAH humain 19 . Positif F 0 </ Sub> -mice (2 individus) ont été croisés avec des souris de type sauvage pour obtenir un mélange F 1 hétérozygote. Après avoir traversé le mélange de F 1 hétérozygote (5 individus), on peut obtenir un homozygose à la souris F- 2 (3 individus). - Effectuer le génotypage de souris en utilisant de l'ADN génomique selon la méthode montrée par Zangala 21 en utilisant un kit commercial de purification d'ADN.
- Amplifier un fragment d'ADN correspondant du gène Cmah en utilisant une ADN polymérase commerciale et la paire d'amorces 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'et 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Effectuer l'amplification du gène en utilisant 34 cycles de PCR consistant en une dénaturation à 94 ° C pendant 40 s, un recuit à 63 ° C pendant 40 s et un allongement à 72 ° C pendant 1 min.
- Visualiser les produits de PCR sur un gel d'agarose à 1%. On devrait observer une seule bande (0,5 kb) pour l'individu de type sauvage, une bande double (0,4 et 0,5 kb) pour laIndividu hétérozygote knock-out, et une bande unique (0,4 kb) pour l'individu knock-out homozygote.
2. Collection d'échantillons
- Recueillir du lait de souris en utilisant le protocole décrit par Willingham et al. 22 .
- Recueillir du tissu hépatique de souris en utilisant le protocole décrit par Gonçalves et al. 23 et stockez les échantillons à -80 ° C.
3. Isolation des acides sialiques du lait
- Préparer 100 ml d'une solution d'acide acétique 2 M en ajoutant 12 ml d'acide acétique glacial dans 88 ml d'H 2 O distillé.
- Transférer 50 μL de lait dans un tube de centrifugation de 1,5 ml et ajouter 1,2 ml de la solution aqueuse d'acide acétique préparée.
- Incuber la suspension pendant 4 h à 80 ° C et centrifuger l'échantillon à 14 000 xg pendant 10 min.
- Transférer le dessus de 1000 μL du surnageant dans un tube de centrifugation de 1,5 mL frais et remDéposer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à la sécheresse complète (selon la pompe à vide ci-jointe, cela prendra de 4 à 20 h). Ré-dissoudre l'échantillon dans 500 ul de H 2 O distillé.
- Préparez une colonne d'échange de micro-anions. Cette étape va spécifiquement enrichir les composés anioniques et éliminer les composés cationiques et neutres des échantillons de lait et de foie, et augmente donc la sélectivité de l'agent d'étiquetage OPD fluorogène pour la dérivatisation de l'acide sialique.
- Transférer pour chaque échantillon 200 mg de la résine échangeuse d'anions (Dowex 1X8) dans des tubes de colonne de 3 mL vides avec un robinet d'arrêt attaché.
- Ajouter 2 ml de la solution aqueuse d'acide acétique préparée à l'étape 3.1 pour remplacer les ions chlorure dans la résine par des ions acétate. Fermez le robinet dès que le solvant atteint le haut de la résine.
- Ajoutez doucement 2 ml d'H 2 O distillé, ouvrez le robinet et arrête le débit dès que la majeure partie du solvant atteintLe dessus de la résine. Assurez-vous que la résine est toujours recouverte de solvant.
- Laver la colonne de résine deux fois de plus avec 2 ml d'H 2 O distillé pour éliminer l'excès d'acétate.
- Transférer les 500 μL résultants d'échantillon de solvant à partir de l'étape 3.4. Sur la colonne de résine et jeter l'écoulement. Laver délicatement la résine avec 2 ml d'H 2 O distillé. Eluer les échantillons d'anions de la résine en utilisant 1 ml d'une solution d'acétate d'ammonium 50 mM (386 mg d'acétate d'ammonium dissous dans 100 ml d'H 2 O distillé) dans un 1,5 ml Tube centrifuge. Retirer le solvant par evaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à la sécheresse.
REMARQUE: Les échantillons secs peuvent être conservés à 4-6 ° C pendant 12 mois maximum.
4. Isolation des acides sialiques à partir du tissu de foie
- Dégraisser doucement 20 à 50 mg de foie de souris et le transférer dans un moulin à papier Dounce (1 mL ou 2 mL de volume). Ajouter 1,2 ml de la solution aqueuse d'acide acétiquePréparé à l'étape 3.1 et homogénéiser le tissu par cisaillement doux pendant 10 s. Transférer la suspension résultante dans un tube de centrifugation de 1,5 ml.
- Suivez les étapes 3.3. À 3.6.
REMARQUE: Les échantillons secs peuvent être conservés à 4-6 ° C pendant 12 mois maximum.
5. Préparation d'un ester d'acide sialique mixte
- Peser entre 5 et 8 mg d'acide N-acétylneuraminique sur un bilan analytique dans un tube de centrifugation de 1,5 mL. Notez le poids exact et ajoutez 164 μL d'H 2 O distillé pour chaque mg ( c.-à - d. Si le poids de Neu5Ac est de 7,2 mg puis ajoutez 7,2 x 164 = 1, 181 μl d'H 2 O distillé). Il en résulte une solution mère de 20 mM Neu5Ac qui peut être stockée à -20 ° C pendant 12 mois.
- Obtenir de l'acide N-glycolylneuraminique à des quantités plus petites à un prix modéré tel que dans des aliquotes de 1 mg. Ajouter 154 μl d'H 2 O distillé directement au composé afin d'obtenir une solution mère de Neu5Gc ~ 20 mM. Transférer leSolution dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Cette solution peut être stockée à -20 ° C pendant 12 mois maximum.
- Mélanger 5 μL de chaque solution mère de l'étape 5.1 et 5.2 dans un tube centrifuge frais de 1,5 mL et éliminer le solvant par evaporation centrifuge à température ambiante jusqu'à la sécheresse.
REMARQUE: le standard d'acide sialique mélangé peut être conservé entre 4 et 6 ° C pendant 12 mois maximum.
6. Fluoréscence de la dérivation des acides sialiques
- Préparer 10 mL de solution OPD, consistant en 100 mg d'o-phénylènediamine et 208 mg d'hydrogénosulfite de sodium dans 10 ml d'H 2 O distillé.
- Ajouter 20 μL de solution OPD aux échantillons d'acide sialique dérivés du lait de souris (étape 3), du foie de souris (étape 4) ou du standard d'acide sialique mixte (étape 5). Vortex vigoureusement pendant 30 s et incuber les échantillons pendant 4 h à 80 ° C dans l'obscurité ( c.-à-d. Envelopper les microtubes dans du papier d'aluminium).
- Laisser refroidir les échantillons pendant 5 minutes, ajouter 80 μ; L d'H 2 O distillé et centrifuger les tubes à 14 000 xg pendant 1 min.
- Transférer 80 μL du surnageant dans un flacon HPLC à haute récupération de 300 μL. Les échantillons d'acide sialique dérivés peuvent être conservés entre 4 et 6 ° C pendant une semaine.
7. Analyse HPLC des dérivés de l'acide sialique
- Analyser les échantillons en utilisant un système HPLC standard connecté à un détecteur de fluorescence en ligne.
- Utilisez une colonne en phase inversée C18 avec les dimensions standard de 250 mm de longueur et 4,6 mm de diamètre pour l'analyse.
- Préparer le solvant A en diluant 200 ml de solution stock avec 800 ml d'eau de qualité LCMS (LCMS - spectrométrie de masse en chromatographie liquide). La solution stock elle-même peut être préparée comme suit:
- Ajouter 46 g d'acide formique à 800 ml d'H 2 O de qualité LCMS.
- Ajuster le pH à 4,5 en ajoutant goutte à goutte une solution d'hydroxyde d'ammonium (pur. Pa).
- Transférer le solvant à unMesurez le cylindre et remplissez jusqu'à 1000 mL avec H 2 O de qualité LCMS. Cette solution mère peut être conservée entre 4 et 6 ° C pendant 3 mois maximum.
- Pour le solvant B, utiliser de l'acétonitrile de qualité LCMS.
- Séparer les dérivés d'acides sialiques à un débit de 1 mL / min avec l'élution en gradient suivant:
- Commencez par ajouter 10% de solvant B mélangé au solvant A.
- De 0 min à 15 min, augmente progressivement la proportion de solvant B avec un gradient linéaire à 60%.
- De 15 min à 16 min, augmente rapidement la proportion de solvant B avec un gradient linéaire de 60% à 90%. Ceci initie le lavage de la colonne HPLC.
- Pour laver davantage la colonne HPLC, maintenir le niveau de solvant B à 90% entre 16 min et 18 min avant de réduire progressivement le taux de solvant B de nouveau à 10% entre 18 min et 19 min.
- Rééquilibrer la colonne HPLC aux conditions de départ de 10% B entre 19 et 24 minutes.
- DansJeter 50 μL d'échantillon dans le système HPLC.
- Surveiller les éluants en utilisant les longueurs d'onde d'excitation / émission du détecteur de fluorescence de 373/448 nm, et les acides sialiques dérivés peuvent être attendus aux temps de rétention approximatifs de 9 min (pour Neu5Gc-OPD) et 10 min (pour Neu5Ac-OPD).
- Calculer la quantité relative de Neu5Gc (F Neu5Gc ) des zones de pointe de fluorescence des Neu5Ac (A Neu5Ac ) et Neu5Gc (A Neu5Gc ) comme suit: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). Dans le cas des échantillons de lait et de foie de la souris homozygote Cmah knock-out, F Neu5Gc devrait être de 0%, alors que les valeurs de F Neu5Gc de souris hétérozygotes et de type sauvage peuvent varier considérablement en fonction de l'âge de la souris et du type de tissu (entre 2% Et> 90%) avec des marges d'erreur attendues de ± 12%.
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Representative Results
Une vue d'ensemble schématique du procédé d'analyse décrit est illustrée à la figure 1 et comprend l'isolement des acides sialiques à partir d'échantillons de lait et de foie de souris mutantes de type sauvage et Cmah knock-out et de la dérivation de fluorescence et de l'analyse HPLC de ces composants. La figure 2 et la figure 3 montrent des chromatogrammes HPLC représentatifs d'acides sialiques dérivés du lait et des échantillons de foie de souris Cmah knock-out homo et hétérozygotes (- / - et +/-) et de souris de type sauvage. La figure 4 montre les quantités relatives obtenues d'acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) des échantillons de souris analysés, calculés à partir des zones de crête HPLC.
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Figure 2 : Chromatogrammes HPLC d'acides sialiques étiquetés par fluorescence à partir d'échantillons de lait dérivés de souris Cmah knock-out homo et hétérozygotes (- / - et +/-) et de souris sauvages. Le chromatogramme supérieur est le standard d'acide sialique mixte. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3 : Chromatogrammes HPLC d'acides sialiques étiquetés par fluorescence à partir d'échantillons de foie dérivés de souris Cmah knock-out homo et hétérozygotes (- / - et +/-) et de souris de type sauvage. Le chromatogramme supérieur est le standard d'acide sialique mixte. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Quantités relatives d'acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) des échantillons de souris analysés calculés à partir des zones de pointe de HPLC. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole présenté ici permet l'évaluation phénotypique des souris homozygotes Cmah knock-out en analysant et en quantifiant les quantités relatives de Neu5Gc de lait et d'échantillons de foie. L'analyse a été effectuée en utilisant une configuration HPLC standard avec détection de fluorescence. L'étape la plus critique de cette procédure est la préparation des colonnes d'échange d'anions et la réalisation de la chromatographie d'échange d'anions; Régler correctement la résine et collecter les bonnes fractions de lavage et d'élution prend un peu de pratique.
En variante, l'agent de dérivation OPD utilisé ici peut être facilement remplacé par l'agent de dérivation DMB le plus coûteux (1,2-diamino-4,5-méthylènedioxybenzène). En outre, l'analyse des dérivés d'acide sialique obtenus à partir de l'étape 6.5. Peut également être analysé à l'aide de la détection spectrométrique de masse au lieu de la détection de fluorescence ( c.-à-d. Le système Shimadzu Nexera UPLC couplé au détecteur MS-2020). UNEAvant d'appliquer les étapes 7.2 à 7.6, les dérivés d'acide sialique sont directement détectés à l'aide d'un balayage en mode d'ionisation positive pour les rapports m / z de 382.0 et 398.0 (il s'agit des adjuvants H + de Neu5Ac-OPD et Neu5Gc-OPD, respectivement).
Une limitation de cette méthode est que le contenu de Neu5Gc ne peut être quantifié que par rapport au montant de Neu5Ac, mais pas de manière absolue. Pour ce faire, l'ajout d'un acide sialique distinct et quantifiable en tant que norme interne serait nécessaire au stade initial de la préparation de l'échantillon. Une autre lacune est que seules les souris homozygotes, mais pas hétérozygotes, Cmah knock-out peuvent être identifiées sans ambiguïté, car la quantité relative de souris knock-out hétérozygotes Neu5Gc peut varier fortement selon le type d'échantillon ( c'est-à-dire le tissu) et l'âge des souris individuelles. Les développements futurs de cette méthode peuvent inclure l'ajout de normes internes et la quantification absolue des acides sialiques chez la souris.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 31471703, A0201300537 et 31671854 à JV et LL) et au 100 Plan des talents étrangers (numéro de subvention JSB2014012 à JV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
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