Summary
Vi beskriver en HPLC-baserad metod för bestämning av N-acetylneuraminsyra och N-glykolylenuraminsyra i muslever och mjölk.
Abstract
CMAH (cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyrahydroxylas) är ansvarig för oxidationen av cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyror i däggdjur. Emellertid kan människor inte oxidera cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyra till cytidinmonofosfat-N-glykolylneuraminsyra på grund av en primär exon deletion av CMAH- genen. För att förstå effekterna och konsekvenserna av bristen på CMAH-aktivitet mer detaljerat är en Cmah- knock-out-modell hos möss av stort intresse för grundläggande och tillämpad forskning. Analysmetoden för bestämning av fenotypen hos denna musmodell beskrivs häri i detalj och baseras på detekteringen av både N-acetylneuraminsyra och N-glykolylenuraminsyra i levern och mjölken av vildtyps- och Cmah- knock-out-möss. Endogena sialinsyror frigörs och derivatiseras med o-fenylendiamin för att alstra fluorogena derivat, som därefter kan analyseras med HPLC. Det presenterade protokollet kan varaHar också ansökt om analys av mjölk- och vävnadsprover från olika andra ursprung och kan vara av nytta för att undersöka närings- och hälsoeffekterna av N-glykolylneuraminsyra.
Introduction
N-acetylneuraminsyra (Neu5Ac) och N-glykolylneuraminsyra (Neu5Gc) är de vanligaste sialinsyrorna hos de flesta däggdjur 1 . Även om det är möjligt att syntetisera Neu5Ac endogent, kan människor inte producera Neu5Gc på grund av en primär exon deletion på CMAH- genen som kodar för en CMP-Neu5Ac-hydroxylas 2 , 3 . Djurbaserade livsmedel kan dock vara kosttillskott för Neu5Gc 4 , 5 , 6 , vilket leder till produktion av anti-Neu5Gc-antikroppar och därför utlösa ett immunsvar mot Neu5Gc 7 . Denna diet effekt av Neu5Gc misstänks bidra till kronisk inflammation och olika andra sjukdomar 8 , 9 , 10 . För att fullständigt förstå effekterna av Neu5Gc i hOman är en djurmodell för den systematiska undersökningen av effekterna av matburna sialinsyror mycket önskvärt. Trots att protokoll baserade på polymeraskedjereaktion (PCR) för analys av knock-out-möss är väletablerade och ett lämpligt sätt för den genotypiska bedömningen kräver den funktionella analysen av fenotyp på metabolisk nivå mer specifika analysmetoder. Fenotypen av en Cmah- knock-out-musmodell kan bedömas genom att isolera och analysera sialinsyrans sammansättning i lever- eller mjölkprover. Flera metoder för detektering av sialinsyror i djurvävnader har tidigare rapporterats: Reaktion av sialinsyror med resorcinol 11 eller tiobarbitursyra 12 resulterar i bildning av en kromoforisk produkt och kan enkelt analyseras med en plattareaderbaserad inställning men endast den totala sialiska Syrahalten kan bestämmas. Alternativt beskrives även analysen av sialinsyror med användning av gaskromatografi13 , MALDI-ToF-masspektrometri 14 eller amperometriska metoder 15 . De mest använda sialsyraanalysmetoderna är emellertid baserade på hydrolytisk frisättning följt av fluorescensderivatisering och efterföljande högprestanda vätskekromatografi 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer för djurprofiler har godkänts av den etiska kommittén för Experimentell djurcentrum vid Nanjing lantbruksuniversitet i enlighet med de nationella riktlinjerna för experimentell djurskydd (Vetenskapsministeriet, PR i Kina, 2006) med djuren inrymda i en SPF Anläggning (tillstånds ID: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah knock-out musmodell
- Använd vildtyp C57Bl / 6-möss från Comparative Medicine Center i Yangzhou University (Kina).
OBS: Cmah knock-out-möss genererades baserat på den information som tillhandahålls från tidigare Cmah knock-out studier 17, 19 och som erhålles kommersiellt genom att använda en CRISPR / Cas9 20 strategi genom att avlägsna 92 baspar från exon 6 av Cmah genen, som också är Raderad i den humana CMAH- genen 19 . Positiv F 0 </ sub> -mice (2 personer) korsades med möss av vildtyp för att erhålla heterozygota F 1 -mice. Efter att ha korsat heterozygot F 1 -mice (5 personer), kunde homozygot Cmah knock-out F 2 -mice framgångsrikt erhållas (3 personer). - Utför genotypning av möss genom att använda genomiskt DNA enligt metoden som visas av Zangala 21 med användning av ett kommersiellt DNA-reningskit.
- Amplifiera ett motsvarande DNA-fragment av Cmah- genen med användning av kommersiellt DNA-polymeras och primerparet 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'och 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Utför genamplifiering med 34 PCR-cykler bestående av denaturering vid 94 ° C i 40 s, glödgning vid 63 ° C under 40 s och förlängning vid 72 ° C i 1 min.
- Visualisera PCR-produkter på en 1% agarosgel. Man bör observera ett enda band (0,5 kb) för vildtypen, ett dubbelband (0,4 och 0,5 kb) förHeterozygot knock-out-individ, och ett enda band (0,4 kb) för den homozygote knock-out-individen.
2. Provkollektion
- Samla musmjölk med hjälp av det protokoll som beskrivs av Willingham et al. 22 .
- Samla muslevervävnad med hjälp av det protokoll som beskrivits av Gonçalves et al. 23 och lagra prover vid -80 ° C.
3. Isolering av sialinsyror från mjölk
- Förbereda 100 ml av en 2 M ättiksyralösning genom att tillsätta 12 ml isättika i 88 ml destillerat H2O
- Överför 50 μl mjölk till ett 1,5 ml centrifugrör och tillsätt 1,2 ml av den beredda vattenhaltiga ättiksyralösningen.
- Inkubera suspensionen i 4 h vid 80 ° C och centrifugera provet vid 14 000 xg under 10 min.
- Överför den översta 1000 μL av supernatanten i ett nytt 1,5 ml centrifugrör och remLösningsmedlet genom centrifugalindunstning vid rumstemperatur för att slutföra torrhet (beroende på den bifogade vakuumpumpen kommer det att ta 4-20 h). Åter lösa upp provet i 500 | il destillerat H 2 O.
- Förbered en mikroanjonbytarkolonn. Detta steg kommer specifikt att berika anjoniska föreningar och avlägsna katjoniska och neutrala föreningar från mjölk- och leverproverna och ökar därför selektiviteten hos det fluorogena OPD-märkningsmedlet för sialsyraderivatisering.
- Överför för varje prov 200 mg av anjonbytarhartset (Dowex 1X8) i tomma 3 ml kolonnrör med en ansluten stopkock.
- Tillsätt 2 ml av den vattenhaltiga ättiksyralösningen framställd i steg 3.1 för att ersätta kloridjonerna i hartset med acetatjoner. Stäng stoppskruven så snart lösningsmedlet når toppen av hartset.
- Tillsätt försiktigt 2 ml destillerad H 2 O, öppna stoppskruven och stoppa flödet så fort det mesta av lösningsmedlet nårToppen av hartset. Se till att hartset alltid är täckt med lösningsmedel.
- Tvätta hartskolonnen ytterligare två gånger med 2 ml destillerat H2O för avlägsnande av överskott av acetat.
- Överför det resulterande 500 μl provlösningsmedlet från steg 3.4. På hartskolonnen och kassera genomströmningen. Tvätta försiktigt hartset med 2 ml destillerat H 2 O. Eluera provet anjoner från hartset med användning av 1 ml av en 50 mM ammoniumacetatlösning (386 mg ammoniumacetat upplöst i 100 ml destillerat H2O) i en 1,5 ml Centrifugrör. Avlägsna lösningsmedlet genom centrifugalindunstning vid rumstemperatur till torrhet.
OBS: Torkprover kan lagras vid 4-6 ° C i upp till 12 månader.
4. Isolering av sialinsyror från levervävnad
- Tina försiktigt 20 - 50 mg muslever och överför den till en Dounce tissue grinder (1 mL eller 2 mL volym). Tillsätt 1,2 ml av den vattenhaltiga ättiksyralösningenFramställd i steg 3.1 och homogenisera vävnaden genom försiktig skjuvning under 10 s. Överför den resulterande suspensionen i ett 1,5 ml centrifugrör.
- Följ steg 3.3. Till 3,6.
OBS: Torkprover kan lagras vid 4-6 ° C i upp till 12 månader.
5. Framställning av en blandad sialsyra-standard
- Väga mellan 5 - 8 mg N-acetylneuraminsyra på en analytisk balans i ett 1,5 ml centrifugrör. Observera den exakta vikten och tillsätt 164 μL destillerad H 2 O för varje mg ( dvs. om vikt Neu5Ac är 7,2 mg och sedan tillsätt 7,2 x 164 = 1, 181 μl destillerad H 2 O). Detta resulterar i en 20 mM Neu5Ac stamlösning som kan lagras vid -20 ° C i upp till 12 månader.
- Hämta N-glykolylneuraminsyra i mindre kvantiteter till ett måttligt pris, såsom i 1 mg alikvoter. Lägga 154 mikroliter destillerat H2O direkt till föreningen för att erhålla en ~ 20 mM Neu5Gc stamlösning. ÖverförLösning i ett 1,5 ml centrifugrör. Denna lösning kan förvaras vid -20 ° C i upp till 12 månader.
- Kombinera 5 μL från varje stamlösning från steg 5.1 och 5.2 till ett nytt 1,5 ml centrifugrör och avlägsna lösningsmedlet genom centrifugalindunstning vid rumstemperatur till torrhet.
OBS: Den blandade sialinsyrastandarden kan förvaras vid 4 - 6 ° C i upp till 12 månader.
6. Fluorescensderivatisering av sialinsyror
- Förbereda 10 ml OPD-lösning, bestående av 100 mg o-fenylendiamin och 208 mg natriumvätesulfit i 10 ml destillerat H2O
- Tillsätt 20 μL OPD-lösning till sialinsyraproverna härrörande från musmjölk (steg 3), muslever (steg 4) eller blandad sialinsyrastandard (steg 5). Vortex kraftigt under 30 s och inkubera prover i 4 timmar vid 80 ° C i mörkret ( dvs vik mikrotubes i aluminiumfolie).
- Låt proven svalna i 5 minuter, tillsätt 80 μ; L destillerat H2O och centrifugera rören vid 14 tusen xg under 1 min.
- Överför 80 μL från supernatanten till en 300 μL högåtervinnings HPLC-ampull. De derivatiserade sialinsyraproverna kan förvaras vid 4 - 6 ° C i upp till en vecka.
7. HPLC-analys av sialsyraderivat
- Analysera proven med ett standard HPLC-system anslutet till en online fluorescensdetektor.
- Använd en omvänd fas C18 kolonn med standarddimensionerna 250 mm längd och 4,6 mm diameter för analysen.
- Förbered lösningsmedel A genom att späda 200 ml stamlösning med 800 ml vatten av LCMS-kvalitet (LCMS-vätskekromatografi-masspektrometri). Selve stamlösningen kan framställas enligt följande:
- Lägga 46 g myrsyra till 800 ml av LCMS-grade H 2 O.
- Justera pH till 4,5 genom droppvis tillsats av ammoniumhydroxidlösning (puriss. Pa).
- Överför lösningsmedlet till aMätcylinder och fyll upp till 1000 ml med LCMS-kvalitet H 2 O. Denna stamlösning kan förvaras vid 4 - 6 ° C i upp till 3 månader.
- För lösningsmedel B använd LCMS-kvalitet acetonitril.
- Separera sialinsyrederivaten vid en flödeshastighet på 1 ml / min med följande gradienteluering:
- Börja med att tillsätta 10% lösningsmedel B blandat till lösningsmedel A.
- Från 0 min till 15 min ökar gradvis andelen lösningsmedel B med en linjär gradient till 60%.
- Från 15 min till 16 min ökar du snabbt andelen lösningsmedel B med en linjär gradient från 60% till 90%. Detta initierar tvätten av HPLC-kolonnen.
- För att ytterligare tvätta HPLC-kolonnen behåll nivået av lösningsmedel B vid 90% mellan 16 min och 18 min innan gradvis minskning av lösningsmedlet B igen till 10% mellan 18 min och 19 min.
- Återlikvibrera HPLC-kolonnen till utgångsvillkoren för 10% B mellan 19 och 24 min.
- ITa 50 μl prov i HPLC-systemet.
- Övervak eluenter med användning av fluorescensdetektorns exciterings- / utsläppsvåglängder på 373/448 nm och de derivatiserade sialinsyrorna kan förväntas vid approximativa retentionstider av 9 min (för Neu5Gc-OPD) och 10 min (för Neu5Ac-OPD).
- Beräkna den relativa mängden Neu5Gc (F Neu5Gc ) från fluorescens toppområdena i Neu5Ac (A Neu5Ac ) och Neu5Gc (A Neu5Gc ) enligt följande: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). Om mjölk- och leverproverna från den homozygote Cmah- knock- outmusen F Neu5Gc bör vara 0%, medan värdena för F Neu5Gc hos heterozygotiska och vildtypsmus kan variera kraftigt beroende på musålder och vävnadstyp (mellan 2% Och> 90%) med förväntade felmarginaler på ± 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk översikt över den beskrivna analysmetoden visas i figur 1 och innefattar isoleringen av sialinsyror från mjölk- och leverprover av vildtyps- och Cmah- knock-out-mutantmöss och fluorescensderivatiseringen och HPLC-analysen av dessa komponenter. Figur 2 och Figur 3 visar representativa HPLC-kromatogram av derivatiserade sialinsyror av mjölk- och leverprover från homo- och heterozygote utblåsande Cmah- möss (- / - och +/-) och vildtypsmus. Figur 4 visar de erhållna relativa mängderna N-glykolylneuraminsyra (Neu5Gc) hos de analyserade musproverna beräknade från HPLC-toppområdena.
Figur
Figur 2 : HPLC-kromatogram av fluorescensmärkta sialinsyror från mjölkprover härledda från homo- och heterosygotiska knock-out- Cmah- möss (- / - och +/-) och vildtypsmus. Det högsta kromatogrammet är blandad sialinsyrastandard. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
"Src =" / files / ftp_upload / 56030 / 56030fig3.jpg "/>
Figur 3 : HPLC-kromatogram av fluorescensmärkta sialinsyror från leverprover härledda från homo- och heterosygotiska knock-out- Cmah- möss (- / - och +/-) och vildtypsmus. Det högsta kromatogrammet är blandad sialinsyrastandard. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Relativa mängder N-glykolylneuraminsyra (Neu5Gc) hos de analyserade musproverna beräknade från HPLC-toppområdena. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här presenterade protokollet tillåter den fenotypiska bedömningen av homozygote Cmah- knock-out-möss genom att analysera och kvantifiera de relativa mängderna Neu5Gc av mjölk- och leverprover. Analysen utfördes med användning av en standard HPLC-inställning med fluorescensdetektering. Det mest kritiska steget i detta förfarande är framställning av anjonbytarkolonnerna och utförande av anjonbytarkromatografi; Att bestämma hartset ordentligt och att samla rätt tvätta och eluera fraktioner tar lite övning.
Alternativt kan det här använda derivatiseringsmedlet OPD lätt ersättas med det dyrare derivatiseringsmedlet DMB (1,2-diamino-4,5-metylendioxibensen). Vidare analyseras de erhållna sialinsyraderivaten från steg 6,5. Kan också analyseras med hjälp av masspektrometrisk detektering istället för fluorescensdetektering ( dvs Shimadzu Nexera UPLC-system kopplat till MS-2020-detektor). enFter som tillämpar steg 7,2-7,6, detekteras sialinsyraderivaten direkt med användning av positiv joniseringslägesskanning för m / z-förhållandena 382,0 och 398,0 (dessa är H + -addukterna av Neu5Ac-OPD respektive Neu5Gc-OPD).
En begränsning av denna metod är att Neu5Gc-innehållet endast kan kvantifieras i förhållande till Neu5Ac-mängden, men inte på ett absolut sätt. För att göra detta skulle tillsatsen av en distinkt och kvantifierbar sialinsyra som en intern standard behövas vid provberedningens inledande skede. En annan brist är att endast homozygote men inte heterozygotiska Cmah- knock-out-möss kan entydigt identifieras, eftersom den relativa mängden Neu5Gc-heterozygotiska knock-out-möss kan variera starkt beroende på provtyp ( dvs. vävnad) och ålder av de enskilda mössen. Framtida utveckling av denna metod kan innefatta tillsats av interna standarder och absolut kvantifiering av sialinsyror hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av Naturvetenskapsstiftelsen i Kina (bidragsnummer 31471703, A0201300537 och 31671854 till JV och LL) och 100 Foreign Talents Plan (bidragsnummer JSB2014012 till JV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
