Summary
Vi beskriver en HPLC-baseret metode til bestemmelse af N-acetylneuraminsyre og N-glycolylenuraminsyre i muselever og mælk.
Abstract
CMAH (cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyrehydroxylase) er ansvarlig for oxidationen af cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyrer i pattedyr. Imidlertid kan mennesker ikke oxidere cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyre til cytidinmonophosphat-N-glycolylneuraminsyre på grund af en primær exon deletion af CMAH genet. For at forstå virkningerne og konsekvenserne af manglen på CMAH-aktivitet mere detaljeret er en Cmah- knock-out-model i mus en stor interesse for grundlæggende og anvendt forskning. Analysemetoden til bestemmelse af fænotypen af denne musemodel er her beskrevet detaljeret og er baseret på påvisningen af både N-acetylneuraminsyre og N-glycolylenuraminsyre i leveren og mælken af vildtype- og Cmah- knock-out-mus. Endogene sialinsyrer frigives og derivatiseres med o-phenylendiamin for at danne fluorogene derivater, der efterfølgende kan analyseres ved HPLC. Den præsenterede protokol kan væreOgså ansøgt om analyse af mælke- og vævsprøver fra forskellige andre oprindelser og kan være til nytte for at undersøge nærings- og sundhedsvirkningerne af N-glycolylneuraminsyre.
Introduction
N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og N-glycolylneuraminsyre (Neu5Gc) er de mest almindelige sialinsyrer i de fleste pattedyr 1 . Selvom det er i stand til at syntetisere Neu5Ac endogent, er mennesker ikke i stand til at producere Neu5Gc på grund af en primær exon deletion på CMAH genet kodende for en CMP-Neu5Ac hydroxylase 2 , 3 . Dogbaserede fødevarer kan være kostkilder til Neu5Gc 4 , 5 , 6 , der fører til produktion af anti-Neu5Gc-antistoffer og derfor udløse et immunrespons mod Neu5Gc 7 . Denne diæt effekt af Neu5Gc formodes at bidrage til kronisk inflammation og forskellige andre sygdomme 8 , 9 , 10 . For fuldt ud at forstå virkningerne af Neu5Gc i hUmans, er en dyremodel til systematisk undersøgelse af virkningerne af fødevarebårne sialinsyrer meget ønskelig. Selv om protokoller baseret på polymerasekædereaktion (PCR) til analyse af knock-out-mus er veletablerede og en bekvem måde til den genotype vurdering, kræver den funktionelle analyse af fænotype på metabolisk niveau mere specifikke analysemetoder. Fænotypen af en Cmah- knock-out-musemodel kan vurderes ved at isolere og analysere sammensætningen af sialinsyrer i lever- eller mælkeprøver. Der er tidligere rapporteret om forskellige metoder til påvisning af sialinsyrer i dyrevæv. Reaktion af sialinsyrer med resorcinol 11 eller thiobarbitursyre 12 resulterer i dannelsen af et kromoforisk produkt og kan simpelthen analyseres ved hjælp af en platereaderbaseret opsætning, men kun den samlede sialiske Syreindhold kan bestemmes. Alternativt blev analysen af sialinsyrer også beskrevet under anvendelse af gaskromatografi13 , MALDI-ToF-massespektrometri 14 eller amperometriske metoder 15 . De mest anvendte sialinsyreanalysemetoder er imidlertid baseret på hydrolytisk frigivelse efterfulgt af fluorescensderivatisering og efterfølgende højtryksvæskekromatografi 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer for dyreforsøg er godkendt af Det Etiske Udvalg for Eksperimentelle Dyre Center ved Nanjing Landbrugsuniversitet i overensstemmelse med de nationale retningslinjer for eksperimentel dyrevelfærd (Ministeriet for Videnskab og Teknologi, PR i Kina, 2006) med dyrene i en SPF Facilitet (Tilladelses ID: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah Knock-out Mouse Model
- Brug vildtype C57Bl / 6 mus fra Comparative Medicine Center of Yangzhou University (Kina).
BEMÆRK: Cmah knock-out mus blev frembragt baseret på oplysninger fra tidligere Cmah knock-out undersøgelser 17, 19 og opnået kommercielt under anvendelse af en CRISPR / Cas9 20 strategi ved at fjerne 92 basepar fra exon 6 i Cmah genet, som også er Slettet i det humane CMAH- gen 19 . Positiv F 0 </ sub> -mus (2 individer) blev krydset med vildtypemus at opnå heterozygote F 1 -mus. Efter passage heterozygote F 1 -mus (5 individer), kunne homozygot Cmah knock-out F2 -mus med held opnået (3 individer). - Udfør genotyping af mus ved anvendelse af genomisk DNA ifølge metoden vist af Zangala 21 under anvendelse af et kommercielt DNA rensningssæt.
- Amplifere et tilsvarende DNA-fragment af Cmah- genet ved anvendelse af kommerciel DNA-polymerase og primerparet 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'og 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Udfør genamplifikation med 34 PCR-cyklusser bestående af denaturering ved 94 ° C i 40 s, annealing ved 63 ° C i 40 s og forlængelse ved 72 ° C i 1 min.
- Visualiser PCR-produkter på en 1% agarosegel. Man bør observere et enkelt bånd (0,5 kb) for vildtype-individet, et dobbeltbånd (0,4 og 0,5 kb) forHeterozygot knock-out individuel og et enkelt band (0,4 kb) for den homozygote udløsende individ.
2. Prøveopsamling
- Saml musemælk ved hjælp af protokollen beskrevet af Willingham et al. 22 .
- Saml muselevervæv under anvendelse af protokollen beskrevet af Gonçalves et al. 23 og opbevar prøver ved -80 ° C.
3. Isolering af sialsyre fra mælk
- Forbered 100 ml af en 2 M eddikesyre opløsning ved tilsætning af 12 ml iseddike i 88 ml destilleret H2O
- Overfør 50 μl mælk i et 1,5 ml centrifugerør og tilsæt 1,2 ml af den fremstillede vandige eddikesyreopløsning.
- Inkuber suspensionen i 4 timer ved 80 ° C og centrifuger prøven ved 14.000 xg i 10 minutter.
- Overfør den øverste 1000 μL af supernatanten i et frisk 1,5 ml centrifugerør og remOve opløsningsmidlet ved centrifugalinddampning ved stuetemperatur for at fuldføre tørhed (afhængig af den tilsluttede vakuumpumpe vil dette tage 4-20 timer). Re-opløse prøven i 500 pi destilleret H2O
- Forbered en mikro-anionbytningskolonne. Dette trin vil specifikt berige anioniske forbindelser og fjerne kationiske og neutrale forbindelser fra mælke- og leverprøverne og øger derfor selektiviteten af det fluorogene OPD-mærkningsmiddel til sialinsyrederivatisering.
- Overfør 200 mg af anionbytterharpiksen (Dowex 1X8) for hver prøve i tomme 3 ml søjlerør med en tilsluttet stoplåse.
- Tilsæt 2 ml af den vandige eddikesyreopløsning fremstillet i trin 3.1 for at erstatte chloridionerne i harpiksen med acetationer. Luk stopknappen, så snart opløsningsmidlet når toppen af harpiksen.
- Tilsæt forsigtigt 2 ml destilleret H 2 O, åbn stopknappen og stop strømmen, så snart det meste af opløsningsmidlet nårToppen af harpiksen. Sørg for, at harpiksen altid er dækket med opløsningsmiddel.
- Vaske harpikssøjlen yderligere to gange med 2 ml destilleret H2O til fjernelse af overskydende acetat.
- Overfør den resulterende 500 μl prøveopløsningsmiddel fra trin 3.4. På harpikskolonnen og kassere gennemstrømningen. Forsigtigt vaske harpiksen med 2 ml destilleret H2O Eluer prøve- anioner fra harpiksen ved anvendelse af 1 ml af en 50 mM ammoniumacetat-opløsning (386 mg ammoniumacetat opløses i 100 ml destilleret H2O) i et 1,5 ml Centrifugerør. Fjern opløsningsmidlet ved centrifugalinddampning ved stuetemperatur til tørhed.
BEMÆRK: Tørre prøver kan opbevares ved 4-6 ° C i op til 12 måneder.
4. Isolering af sialinsyrer fra levervæv
- Tør forsigtigt 20-50 mg muselever og overfør det til en Dounce tissue grinder (1 mL eller 2 mL volumen). Tilsæt 1,2 ml af den vandige eddikesyreopløsningFremstillet i trin 3.1 og homogenisere vævet ved forsigtig afskæring i 10 s. Overfør den resulterende suspension i et 1,5 ml centrifugerør.
- Følg trin 3.3. Til 3,6.
BEMÆRK: Tørre prøver kan opbevares ved 4-6 ° C i op til 12 måneder.
5. Fremstilling af en blandet sialsyre-standard
- Afvej mellem 5 - 8 mg N-acetylneuraminsyre på en analytisk balance i et 1,5 ml centrifugerør. Bemærk den nøjagtige vægt og tilsæt 164 μl destilleret H 2 O for hver mg ( dvs. hvis vægten af Neu5Ac er 7,2 mg, tilsæt derefter 7,2 x 164 = 1, 181 μl destilleret H 2 O). Dette resulterer i en 20 mM Neu5Ac stamopløsning, der kan opbevares ved -20 ° C i op til 12 måneder.
- Hent N-glycolylneuraminsyre i mindre mængder til en moderat pris, såsom i 1 mg alikvoter. Tilføj 154 pi destilleret H2O direkte til forbindelsen med henblik på at opnå en ~ 20 mM Neu5Gc stamopløsning. OverførOpløsning i et 1,5 ml centrifugerør. Denne opløsning kan opbevares ved -20 ° C i op til 12 måneder.
- Kombiner 5 μL fra hver stamopløsning fra trin 5.1 og 5.2 i et frisk 1,5 ml centrifugerør og fjern opløsningsmidlet ved centrifugalinddampning ved stuetemperatur til tørhed.
BEMÆRK: Den blandede sialinsyrestandard kan opbevares ved 4 - 6 ° C i op til 12 måneder.
6. Fluorescens Derivatisering af Sialic Acids
- Forbered 10 ml OPD-opløsning, bestående af 100 mg o-phenylendiamin og 208 mg natriumhydrogensulfit i 10 ml destilleret H2O
- Tilsæt 20 μL OPD-opløsning til sialinsyreprøverne afledt af musemælk (trin 3), muselever (trin 4) eller den blandede sialinsyrestandard (trin 5). Vortex kraftigt i 30 s og inkuber prøver i 4 timer ved 80 ° C i mørket ( dvs. vikle mikrotubes i aluminiumsfolie).
- Lad prøverne køle ned i 5 minutter, tilsæt 80 μL destilleret H2O og centrifugere rørene ved 14.000 xg i 1 min.
- Overfør 80 μL fra supernatanten til et 300 μL HPLC hætteglas med høj genvinding. De derivatiserede sialinsyreprøver kan opbevares ved 4 - 6 ° C i op til en uge.
7. HPLC-analyse af sialsyrederivater
- Analyser prøverne ved hjælp af et standard HPLC-system tilsluttet en online fluorescensdetektor.
- Brug en omvendt fase C18 kolonne med standard dimensioner på 250 mm længde og 4,6 mm diameter til analysen.
- Forbered opløsningsmiddel A ved at fortynde 200 ml stamopløsning med 800 ml vand af LCMS-kvalitet (LCMS - væskekromatografi massespektrometri). Selve stamopløsningen kan fremstilles som følger:
- Tilføje 46 g myresyre til 800 ml LCMS-grade H2O
- Juster pH til 4,5 ved dråbevis tilsætning af ammoniumhydroxidopløsning (puriss. Pa).
- Overfør opløsningsmidlet til aMålecylinder og fyld op til 1.000 ml med LCMS-klasse H 2 O. Denne stamopløsning kan opbevares ved 4 - 6 ° C i op til 3 måneder.
- For opløsningsmiddel B anvendes LCMS-grade acetonitril.
- Separat sialinsyrederivaterne ved en flowhastighed på 1 ml / min med den følgende gradienteluering:
- Start med at tilsætte 10% opløsningsmiddel B blandet til opløsningsmiddel A.
- Fra 0 min til 15 min øges mængden af opløsningsmiddel B gradvis med en lineær gradient til 60%.
- Fra 15 min til 16 min øges mængden af opløsningsmiddel B hurtigt med en lineær gradient fra 60% til 90%. Dette initierer vaskningen af HPLC-søjlen.
- For yderligere at vaske HPLC-søjlen holdes niveauet af opløsningsmiddel B ved 90% mellem 16 minutter og 18 minutter, før der gradvist reduceres niveauet af opløsningsmiddel B igen til 10% mellem 18 minutter og 19 minutter.
- Genækvilibrere HPLC-søjlen til startbetingelserne for 10% B mellem 19 og 24 minutter.
- I50 μL prøve ind i HPLC-systemet.
- Overvåg eluenter ved anvendelse af fluorescensdetektorens excitations / emissionsbølgelængder på 373/448 nm, og de derivatiserede sialinsyrer kan forventes ved de omtrentlige retentionstider på 9 minutter (for Neu5Gc-OPD) og 10 min (for Neu5Ac-OPD).
- Beregn den relative mængde Neu5Gc (F Neu5Gc ) fra fluorescens toppene i Neu5Ac (A Neu5Ac ) og Neu5Gc (A Neu5Gc ) som følger: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). I tilfælde af mælke- og leverprøver fra den homozygote Cmah- knock-out mus F Neu5Gc skal være 0%, mens værdierne for F Neu5Gc af heterozygotiske og vildtypede mus kan variere meget afhængigt af musens alder og vævstype (mellem 2% Og> 90%) med forventede fejlmarginer på ± 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skematisk overblik over den beskrevne analysemetode er vist i figur 1 og inkluderer isolering af sialinsyrer fra mælke- og leverprøver af vildtype- og Cmah- knock-out-mutantmus og fluorescensderivatiseringen og HPLC-analysen af disse komponenter. Figur 2 og Figur 3 viser repræsentative HPLC-kromatogrammer af derivatiserede sialinsyrer af mælke- og leverprøver fra homo- og heterozygotiske knock-out- Cmah- mus (- / - og +/-) og vildtype-mus. Figur 4 viser de opnåede relative mængder af N-glycolylneuraminsyre (Neu5Gc) af de analyserede museprøver beregnet ud fra HPLC-peakområderne.
Figur
Figur 2 : HPLC-kromatogrammer af fluorescensmærkede sialsyre fra mælkeprøver udledt fra homo- og heterosygote knock-out Cmah- mus (- / - og +/-) og wild-type mus. Det øverste kromatogram er den blandede sialinsyrestandard. Klik her for at se en større version af denne figur.
"Src =" / files / ftp_upload / 56030 / 56030fig3.jpg "/>
Figur 3 : HPLC-kromatogrammer af fluorescensmærkede sialinsyrer fra leverprøver afledt af homo- og heterosygote knock-out Cmah- mus (- / - og +/-) og wild-type mus. Det øverste kromatogram er den blandede sialinsyrestandard. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Relative mængder af N-glycolylneuraminsyre (Neu5Gc) af de analyserede musprøver beregnet fra HPLC-peakområderne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den heri præsenterede protokol tillader den fænotypiske vurdering af homozygote Cmah- knock-out-mus ved analyse og kvantificering af de relative mængder af Neu5Gc af mælke- og leverprøver. Analysen blev udført under anvendelse af en standard HPLC opsætning med fluorescensdetektion. Det mest kritiske trin i denne fremgangsmåde er fremstillingen af anionbytterkolonnerne og udførelse af anionbytningskromatografi; At afsætte harpiksen ordentligt og at samle de rigtige vaske- og elueringsfraktioner tager lidt øvelse.
Alternativt kan det heri anvendte derivatiseringsmiddel OPD let erstattes med det dyrere derivatiseringsmiddel DMB (1,2-diamino-4,5-methylendioxybenzen). Desuden blev analysen af de opnåede sialinsyrederivater fra trin 6.5. Kan også analyseres ved hjælp af massespektrometrisk detektion i stedet for fluorescensdetektering ( dvs. Shimadzu Nexera UPLC-system kombineret med MS-2020 detektor). ENFter, der anvender trin 7.2-7.6, er sialinsyrederivaterne påvist direkte ved anvendelse af positiv ioniseringsmodusscanning for m / z-forholdene 382,0 og 398,0 (disse er H + -addukteme af henholdsvis Neu5Ac-OPD og Neu5Gc-OPD).
En begrænsning af denne metode er, at Neu5Gc-indholdet kun kan kvantificeres i forhold til Neu5Ac-mængden, men ikke på en absolut måde. For at gøre dette ville tilsætningen af en særskilt og kvantificerbar sialinsyre som en intern standard være nødvendig i begyndelsesfasen af prøvepræparatet. En anden mangel er, at kun homozygote, men ikke heterozygote Cmah- knock-out-mus kan identificeres entydigt, da den relative mængde Neu5Gc-heterozygotiske knock-out-mus kan variere stærkt afhængigt af prøvetype ( dvs. væv) og alder af de enkelte mus. Fremtidige udviklinger af denne metode kan omfatte tilsætning af interne standarder og absolut kvantificering af sialinsyrer hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af Natural Science Foundation of China (tildelingsnumre 31471703, A0201300537 og 31671854 til JV og LL) og 100 Foreign Talents Plan (tildelingsnummer JSB2014012 til JV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
