Summary
يقدم هذا العمل طريقة المجهر التي تسمح بالتصوير الحي لخلية واحدة من الإشريكية القولونية لتحليل وتكميم السلوك العشوائي للدوائر الجينية الاصطناعية.
Abstract
يقدم البروتوكول الذي تم تطويره هنا أداة لتمكين تتبع الكمبيوتر لقسم الإشريكية القولونية ومستويات الفلورسنت على مدى عدة ساعات. تبدأ العملية بالفحص بحثا عن المستعمرات التي تعيش على الحد الأدنى من الوسائط ، على افتراض أن الإشريكية القولونية التي تؤوي البلازميد الصحيح هي وحدها القادرة على الازدهار في الظروف المحددة. وبما أن عملية بناء دوائر جينية كبيرة، تتطلب تجميع العديد من أجزاء الحمض النووي، فإن مكونات الدائرة غالبا ما توزع بين البلازميدات المتعددة بأعداد نسخ مختلفة تتطلب استخدام العديد من المضادات الحيوية. الطفرات في البلازميد يمكن أن تدمر نسخ جينات مقاومة المضادات الحيوية وتتداخل مع إدارة الموارد في الخلية مما يؤدي إلى نخر. يتم تعيين مستعمرة مختارة على طبق بيتري الزجاج القاع ويتم اختيار عدد قليل من الطائرات التركيز لتتبع المجهر في كل من المجال مشرق والمجالات الفلورية. يحافظ البروتوكول على تركيز الصورة لأكثر من 12 ساعة في ظل ظروف أولية لا يمكن تنظيمها ، مما يخلق بعض الصعوبات. على سبيل المثال، تبدأ الخلايا الميتة في التراكم في مجال تركيز العدسات بعد بضع ساعات من التصوير، مما يؤدي إلى تراكم السموم وطمس الإشارة وتسوسها. استنفاد المواد الغذائية يدخل عمليات التمثيل الغذائي الجديدة وتعيق الاستجابة المرجوة من الدائرة. درجة حرارة التجربة يقلل من تأثير الحث والمضادات الحيوية، والتي يمكن أن تلحق المزيد من الضرر موثوقية الإشارة. يتقلص الحد الأدنى من هلام الوسائط ويجفف ، ونتيجة لذلك يتغير التركيز البصري بمرور الوقت. طورنا هذه الطريقة للتغلب على هذه التحديات في الإشريكية القولونية، على غرار الأعمال السابقة التي تطور أساليب مماثلة للكائنات الدقيقة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الطريقة خوارزمية لتحديد إجمالي الضوضاء العشوائية في الخلايا غير المعدلة والمتغيرة ، حيث وجدت أن النتائج تتسق مع توقعات محلل التدفق كما هو موضح في معامل مماثل للاختلاف (CV).
Introduction
علم الأحياء التركيبي هو مجال متعدد التخصصات ظهر في العقد الماضي ويهدف إلى ترجمة مبادئ التصميم الهندسي إلى تصميم بيولوجي عقلاني1،2،3 ،فيمحاولةلتحقيق التكامل والمعالجة متعددة الإشارات في الخلايا الحية لفهم العلوم الأساسية4و5والتطبيقات التشخيصية والعلاجية والتكنولوجيا الحيوية6و7و8و9و10. لقد أحدثت قدرتنا على قياس استجابة المدخلات والمخرجات من دوائر الجينات الاصطناعية ثورة بسبب التقدم الأخير في تكنولوجيا الخلية الواحدة ، بما في ذلك محلل التدفق وتصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر الآلي الفاصل الزمني11. غالبا ما يستخدم محلل التدفق لقياس استجابة هذه الدوائر في الحالة الثابتة1،12، ويستخدم المجهر المقلوب لقياس الاستجابة الديناميكية للدوائر الجينية الاصطناعية على مستوى خلية واحدة3. على سبيل المثال، واحدة من الأعمال المبكرة في البيولوجيا الاصطناعية تنطوي على بناء شبكات المذبذب الجيني في الخلايا الحية باستخدام حلقات التغذية المرتدة السلبية مع تأخير3. في وقت لاحق ، تم تطبيق دوائر المذبذب الجيني لفهم التحكم الأيضي في البيئة الديناميكية للخلايا الحية4. المجهر الآلي الفاصل الزمني هو أحد الطرق لتوصيف مثل هذه الدوائر. نحن نفترض أن الخلايا المضيفة، الإشريكية القولونية،مزامنة عند تشكيل المستعمرات الصغيرة، مما يسمح لقياس إشارة وحساب الضوضاء دون تتبع العلاقات الدقيقة الأم وابنتها.
الضوضاء هي أحد الجوانب الأساسية المتأصلة في النظم البيولوجية التي تنشأ في كثير من الأحيان من مصادر متعددة. النظر على سبيل المثال، التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تنطوي على الإشارات التي تنشأ من نقل ناقلات عشوائية منفصلة مثل نشر البروتينات13. هذه الإشارات تنتشر مع تقلبات عشوائية14. مصادر الضوضاء الأخرى هي توافر الموارد، وتقسيم الخلايا والاختلافات في الظروف البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة والضغط. غالبا ما يكون للإشارات البيولوجية التي تنتشر في دوائر الجينات الاصطناعية نسبة إشارة منخفضة جدا إلى الضوضاء (SNR) ، مما يزعج أداء هذه الدوائر. لذلك ، لا يزال تصميم الدائرة الوراثية أحد الجوانب الأكثر تحديا في الهندسة الوراثية15. على سبيل المثال ، على النقيض من معظم النهج التي تحسب فقط متوسط التعبير الجيني (تقاس على مجموع سكان الخلية) ، ويعتبر الفرق في إشارة قياس من أجل هندسة السلوك يمكن التنبؤ بها من خلال شبكات الجينات الاصطناعية12. على هذا النحو ، فإن مستويات التباين أو الضوضاء في التعبير البروتين تلعب دورا مهيمنا في تصميم وأداء الدوائر الجينية التناظرية والرقمية1،16،17.
وقد تم تطوير العديد من النهج لتحديد التباين من خلية إلى خلية، بما في ذلك في الإشريكية القولونية 3،7،18. وغالبا ما تستخدم هذه الأساليب لدراسة تنشيط الجينات ومسارات التمثيل الغذائي، ولكن مع تركيز أقل على دراسة ديناميات الضوضاء العشوائية، مثل قياس وتفكيك مصادر ضوضاء محددة، وخاصة بالنسبة للدوائر الوراثية في الخلايا الحية حيث هذا هو التحدي الأساسي19،20،21. عدة عوامل، سواء الموروثة إلى الدائرة نفسها (الجوهرية) والمستمدة من الخلايا المضيفة (extrinsic)، يمكن أن تعكر صفو الأداء المستمر للدوائر الوراثية. في هذه الورقة ، وضعنا بروتوكولا يهدف إلى تحديد إجمالي الضوضاء في خلايا الإشريكية القولونية ، بما في ذلك مصادر الضوضاء الجوهرية والقشرية6و22. من خلال تحديد إجمالي الضوضاء ومن ثم تقييم SNR23، يمكن تحسين تصميم دوائر الجينات. يمكن تعديل هذه الطريقة لقياس مصادر الضوضاء المستقلة بشكل منفصل ، من خلال مراقبة العديد من البروتينات الفلورية6،20. بالنسبة للبروتوكول الموصوف هنا ، نحافظ على الظروف البيئية تحت رقابة جيدة ونقيس باستمرار نشاط الخلايا دون تأثير العوامل الخارجية. نقيس الإشارة من البروتينات الفلورية في خلايا واحدة مع مرور الوقت ونصورها في وقت واحد تحت ركيزة الآغاروز. يتم تحليل الصور الناتجة باستخدام MATLAB المخصصة للمختبر.
من الناحية المثالية ، فإن القياس المستمر للنشاط في الوقت الحقيقي للبروتينات الفلورية داخل الخلية سينتج بيانات دقيقة من خلال نمو الخلايا وتقسيمها. ومع ذلك، فإنه من الصعب الحصول على هذه البيانات. ويرجع ذلك إلى تدهور البروتينات الفلورية ، والمعروفة باسم تبييض الصور7، عندما يتعرضون للإشعاع في عملية الإثارة. وعلاوة على ذلك، خلايا الإشريكية القولونية هي أيضا حساسة للإثارة، والتي قد تؤدي إلى السمية الضوئية7. وتحد المسألتان من كمية إطارات الصور التي يمكن الحصول عليها والوقت بين عمليات الاستحواذ. الركيزة والأنواع المتوسطة (مثل مرق الليوجيني) التي تستخدم لزراعة الخلايا أثناء التصوير لها أيضا دور حاسم. نوصي بشدة باستخدام الحد الأدنى من الوسط ، مما يقلل من الخلفية غير الفلورية ويطيل وقت تقسيم الخلية.
وعلاوة على ذلك، يجب إعداد العينة بالنظر إلى المتطلبات التالية (1) يسمح انخفاض معدل انقسام الخلايا بالتعرض بشكل أقل تواترا للتصوير عن كثب لدورة التقسيم وتقليل احتمال السمية الضوئية والbleaching. وضعنا وقت الاستحواذ على حوالي نصف وقت الانقسام المتوقع (2) كثافة الخلايا المنخفضة في بداية التجربة تسمح بتوحيد أفضل وتتبع الانقسام. تتأثر كثافة الخلايا بنسبة تخفيف خلايا الإشريكية القولونية، وهي معلمة مهمة لنجاح هذا البروتوكول وتحتاج إلى تحديد لكل مختبر. من أجل تحديد النسبة، ينبغي أن تكون مزودة كل سلالة جديدة من الإشريكية القولونية أو وسائل الإعلام المستخدمة مع الرسوم البيانية معدل النمو(الشكل التكميلي 1). تم تحقيق نسبة مناسبة إذا كانت الخلايا يمكن أن تنمو دون اهتزاز إضافي بعد حضانة قصيرة من كثافة أولية تبلغ حواليOD 600nm = 0.1. سوف تنقسم الخلايا في هذه المرحلة وفقا لدرجة حرارة البيئة فقط (3) تقييد حركة الخلية: حركة الخلية تعتمد بقوة على صلابة الركيزة (لوحة الآغاروز). يعتمد ثبات الركيزة على مقدار إجمالي الآغاروز ووقت التصلب الجلي. لا يمكن ترك المواد الهلامية لترسيخ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، كما القولونية Escherichia سيخضع الانقسام. وتشمل العوامل الأخرى التي تؤثر على استقرار الركيزة كمية المياه في العينة والرطوبة. يتم مناقشة قضايا إضافية بالتفصيل في نتائج الممثل. يوفر هذا البروتوكول العديد من التفاصيل وينتقل تدريجيا من خطوة إلى أخرى. يوفر البروتوكول استقرار طويل لتجارب التصوير ويوفر أداة أساسية لمعالجة الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الإعلام والثقافة
- إعداد محلول المخزون من 1000x كاربينسيلين (50 ملغم / مل) أو المضادات الحيوية ذات الصلة.
- . وزن 0.5 غرام من كاربينسيلين. إضافة 10 مل من العقيم H2O. تذوب تماما.
- تعقيم الأسهم كاربينسيلين من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. Aliquot محلول المضادات الحيوية وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- لإعداد لوحات مرق الليسوجيني (LB)، اخلط 5 غرام من التريبتون، 5 غرام من NaCl، 2.5 غرام من مستخلص الخميرة و 7.5 غرام من باكتو أغار مع 0.5 لتر من H2O. Autoclave المعقم الحل عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- غمر جزئيا مزيج الجل المنصهر في حمام مائي 50 درجة مئوية. أضف 1000 ميكرولتر من كاربينسيلين (50 ملغم/مل).
- إعداد أطباق بيتري في بيئة معقمة. اتركي الصحون لوضعها قبل تخزينها في الثلاجة.
- لوسائط M9 الحد الأدنى، وإعداد حلول المخزون منفصلة من ما يلي: أملاح M9 5x (56.4 غرام / لتر)، 2 م الجلوكوز و 2٪ أحماض كازامينو خالية من البيوتين. أوتوكلاف الحلول في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- لإعداد 5 لوحات بيتري، مزيج 1125 ملغ من أجار ذوبان منخفضة و 400 ملغ من أجار مع 89.2 مل من الحد الأدنى من وسائل الإعلام (1x M9). إضافة 10 مل من 2٪ أحماض كازامينو (2٪ [فول/فول]) في قارورة إرلينماير سعة 250 مل.
ملاحظة: تأكد من صب الوسائط على الشفاه الداخلية للقارورة. - الميكروويف الحل في رشقات نارية قصيرة من 3 إلى 4 ثوان. كرر حتى يصبح الحل واضحا.
ملاحظة: تأكد من عدم الوصول إلى نقطة الغليان. - ضع قارورة Erlenmeyer التي تبلغ سعة 250 مل في حمام ماء ساخن (60 درجة مئوية) لمزيد من المزيج عن طريق الانتشار، واتركه ليبرد حتى تنخفض درجة حرارته إلى حوالي 45-50 درجة مئوية.
- أشعل الشعلة على مقعد صب اللوحة.
- إضافة بسرعة جميع الحلول بالترتيب التالي:
800 ميكرولتر من 50٪ جلسيرول (0.4٪ [فول/فول])
100 ميكرولتر من الثيامين (B1)
1100 ميكرولتر من الجلوكوز (2M)
100 ميكرولتر من كاربينسيلين (50 ملغم/مل). - قم بتدوير قارورة Erlenmeyer لضمان التوزيع حتى لجميع المكونات في جميع أنحاء أجار.
- فتح لوحة واحدة في وقت واحد بجانب اللهب والبدء في صب.
- اترك اللوحات على مقاعد البدلاء لبضع دقائق حتى التجسيد الأولي.
- بدوره لوحات رأسا على عقب لمنع تكثيف المياه من يقطر على هلام.
- ترك لوحات لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لحوالي 2 ساعة.
- بمجرد أن توطد اللوحات وتجفف ، يمكن تخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر تقريبا.
2. السلالات البكتيرية وبناء البلازميدات
ملاحظة: الدائرة الجينية تحتوي على جزء واحد; (أ) بروتين فلوري أخضر (GFP) يقوده مروجP tetO مما يؤدي إلى التعبير التأسيسي. تم بناء جميع البلازميدات في هذا العمل باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي الأساسية وتم تحويلها إلى الإشريكية القولونية 10β ، وذلك باستخدام بروتوكول صدمة الحرارة القياسية24. تم تحويل البناء النهائي إلى سلالة من النوع البري Escherichia coli MG1655 للاختبار.
- تحويل البلازميد المطلوب إلى خلايا الإشريكية القولونية MG1655 مع بروتوكول صدمة الحرارة القياسية24.
- تنمو الخلايا المحولة على لوحة أجار LB بين عشية وضحاها في 37°C.
ملاحظة: من الممكن الحفاظ على أطباق بيتري من الخطوة 2.2 حتى 3 أيام لاستخدام المجهر. - تلقيح مستعمرة واحدة في 5 مل من مرق LB تكملها المضادات الحيوية ذات الصلة في أنبوب زجاجي.
- زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع سرعة اهتزاز 250 دورة في الدقيقة في الحاضنة لمدة 2 ساعة حتى يصبح السائل غائما.
- إعداد 1 مل من محلول التخفيف على النحو التالي:
892 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط (1x M9)
8 ميكرولتر من 50٪ جلسيرول (0.4٪ [فول/فول])
100 ميكرولتر من 2٪ أحماض كازامينو (0.2٪ [wt/vol])
1 ميكرولتر من الثيامين (B1)
11 ميكرولتر من الجلوكوز (2 م)
1 ميكرولتر من المضادات الحيوية ذات الصلة- مزيج وتدور إلى أسفل.
- تمييع ثقافة الخلية (1:30) من الخطوة 2.4 إلى أنبوب 2 مل عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من نمو الإشريكية القولونية إلى 1000 ميكرولتر من محلول التخفيف (الخطوة 2.5).
- احتضان أنبوب لمدة 1 ساعة مع اهتزاز (250 دورة في الدقيقة) في 37 درجة مئوية.
- تنمو 40 ميكرولتر - 60 ميكرولتر على لوحات M9 أعدت في الخطوة 1.10. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يجب أن تكون الكثافة البصرية (OD600nm)للطلاء حوالي 0.1. - ضع ما يصل إلى ثلاث لوحات قاع زجاجية مقاس 35 ملم على مقاعد البدلاء.
ملاحظة: تأكد من أن زجاج اللوحة له السماكة الصحيحة لعدسات المجهر المستخدمة. - إعداد الثقافة للبذر على لوحات هلام، كرر الخطوات 2.3 إلى 2.6 للمستعمرات من لوحة أعدت في الخطوة 2.9 قياسات المجهر.
- إعداد الحل التالي لجعل ثلاثة لوحات المجهر.
- سخني حمام الماء إلى 60 درجة مئوية.
- مزيج 112.5 ملغ من أجار ذوبان منخفضة و 40 ملغ من أجار مع 8.92 مل من الحد الأدنى من وسائل الإعلام (1x M9) وإضافة 1 مل من 2٪ أحماض كازامينو (0.2٪ [فول / فول]) في قارورة إرلينماير 25 مل.
ملاحظة: تأكد من صب الوسائط على الشفاه الداخلية للقارورة.
- الميكروويف الحل في رشقات نارية قصيرة من 2 إلى 3 ثوان. كرر حتى يصبح الحل واضحا.
ملاحظة: تأكد من عدم الوصول إلى نقطة الغليان. - ضع قارورة Erlenmeyer سعة 25 مل في حمام ماء ساخن (60 درجة مئوية) لمزيد من الاختلاط عن طريق الانتشار ، واتركها تبرد على مقاعد البدلاء حتى تنخفض درجة حرارتها إلى حوالي 45-50 درجة مئوية.
3. إعداد منصات agarose
- مقاعد البدلاء نظيفة مع الإيثانول 70٪. شريط تمتد على مقاعد البدلاء تنظيفها. تأكد من أن الشريط ناعم ومستوي.
- إعداد اثنين من الأغطية: واحد على الشريط والثاني في مكان قريب. إعداد غطاء.
- إزالة قارورة (أعدت في الخطوة 2.14) من حمام الماء، ومسح الجزء الخارجي من قارورة نظيفة وتركها لتبرد حتى تنخفض درجة حرارتها إلى حوالي 45-50 درجة مئوية.
- لجعل الحل هلام، مزيج بسرعة جميع الحلول بالترتيب التالي:
80 ميكرولتر من 50٪ جلسيرول (0.4٪ [فول/فول])
1 مل من 2٪ أحماض كازامينو (0.2٪ [wt/vol])
10 ميكرولتر من الثيامين (B1)
110 ميكرولتر من الجلوكوز (2 م)
10 ميكرولتر من المضادات الحيوية ذات الصلة. - صب 1.5 مل من هلام على غطاء وتغطيتها مع قطعة الثانية صنع "ساندويتش".
- أعد الإرلينماير إلى حمام الماء الساخن. تغطية شطيرة مع غطاء وتعيين الموقت لمدة 20 دقيقة.
- في الوقت نفسه، احتضان الأنبوب من الخطوة 2.11 لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز (250 دورة في الدقيقة)
- بعد 20 دقيقة الوجه شطيرة (الخطوة 3.5)، وتغطية ذلك وترك للراحة لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: للحصول على نتائج أفضل ترك "ساندويتش" للراحة في 4 درجة مئوية لمدة الخطوة 3.8. - بذور Escherichia القولونية الثقافة من الخطوة 3.7 عن طريق الأنابيب العينة على طبق 35 ملم.
ملاحظة: Pipetting 6 ميكرولتر من الخلايا كما قطرات صغيرة منفصلة يعطي أفضل النتائج. - السماح لقطرات لتجف، لمدة 15 دقيقة على الأقل وحتى 30 دقيقة.
- فضح هلام متوطد من شطيرة من الخطوة 3.8 عن طريق انزلاق غطاء بعيدا.
- قطع شطيرة إلى منصات فردية صغيرة مع لكمة خزعة أو تلميح.
- العجاف بلطف على العينة (الخطوة 3.9). اترك الطبق لمدة 20 دقيقة على مقاعد البدلاء.
4. إعداد العينة للتصوير المجهري
- إزالة قارورة من حمام مائي من الخطوة 3.6. مسح الجزء الخارجي من قارورة نظيفة والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة (25 °C).
ملاحظة: إزالة القارورة في الخطوة 4.1 حوالي 3 دقائق قبل انتهاء المؤقت. - صب 3 مل من الجل باستمرار إلى محيط لوحة في حركة دائرية. يترك لترسيخ لبضع دقائق.
- ختم لوحات مع الشريط وثقب عدة ثقوب مع إبرة 25 G. الوجه جميع الأطباق لمنع تكثيف المياه يقطر على هلام.
- احتضان جميع الأطباق في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح التصلب الكامل مع منع الانقسام الخلوي.
ملاحظة: اترك العينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لإجراء قياسات متتالية، لا تزيد عن يوم واحد. - بدء تشغيل المجهر لكل إرشادات الشركة المصنعة.
- العثور على التركيز الأولي باستخدام عدسة التضخيم أدنى وإشراك نظام التركيز التلقائي (AFS).
- استخدام النفط إذا لزم الأمر، يغرق العدسة مع النفط ونشرها بعناية عن طريق تحريك لوحة مع وحدة تحكم منصة (وليس يدويا) وAFS يمكن أن تشارك مرة أخرى.
- استخدم المقطع العرضي النسبي في اتجاه Z، بعد الاقتراح الافتراضي للأقسام العرضية لخطوة Z.
ملاحظة: لقد أخذنا صورا ميدانية ساطعة كل 5 دقائق وصورا فلورية كل 20 دقيقة. في بعض الأحيان يجب تعديل التركيز خلال أول 30 دقيقة. تسخين صندوق حاضنة المجهر والزيت ، في حين أن تبريد العينة يميل إلى المساعدة في تقليل الخسارة الأولية للتركيز.
5. تحليل البيانات
ملاحظة: من أجل معالجة بيانات المجهر، قمنا بتصميم برنامج قائم على الكمبيوتر في MATLAB. هذا البرنامج يسهل تحديد حدود الخلية من الصور tiff حقل مشرق وشرائح وفرز الخلايا حسب المنطقة. يمكن استخدام إخراج تحليل الصورة هذا كقناع على صور tiff الفلورية لاشتقاق مستويات كثافة الخلية وإلغاء القطع الأثرية في مجال الفلورسنت مثل هالة الخلية بسبب حدود دقة المجهر. وقد استوحى البرنامج المطور من أعمال مماثلة7و25و26و27و28و29و30 ويوفر حلا أنيقا مصمما خصيصا للمختبر.
- أولا، حدد المعلمات التالية في main_code.m.
- تعريف مجلد الصور اكتساب.
- تحديد الفترة الزمنية للصورة - خطوة وقت قناة الحقل الساطع بالدقائق.
- تحديد تردد GFP - معدل الحصول على صور GFP.
- حدد دقة المجهر (أي عدد وحدات البكسل التي تساوي 1 ميكرومتر).
- تحديد نطاق بن المدرج التكراري - نطاق منطقة الخلية.
ملاحظة: عملية تصنيف البيانات وفقا لمنطقة الخلية مشابهة لمبادئ gating في تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي. يتم وضع البوابات حول مجموعات من الخلايا ذات الخصائص المشتركة ، وعادة ما تكون مبعثرة إلى الأمام وجانبية متناثرة ، لعزل وتحديد هذه المجموعات السكانية ذات الاهتمام. يسمح الفحص المجهري ببوابة العديد من مجموعات الخلايا والتحقيق فيها وتحديدها كميا. - تعريف نواة الالتواء (3،3) - هذه المعلمة بالكشف عن حدود الخلية عن طريق العتبات العمومية(count_cells.m).
ملاحظة: هذا الإعداد مطلوب فقط عند تغيير المختبر أو المجهر. يتطلب البرنامج قناة حقل مشرق الإدخال لتكون وصفت مع مؤشر c1، قناة مضان المسمى c2.
- تشغيل main_code.m، والتي سيتم تشغيل كافة البرامج النصية الأخرى تلقائيا (count_cells.m cell_growth_rate.m).
- يقوم البرنامج تلقائيا بتقسيم صور الحقول الساطعة (انظر الشكل التكميلي 2-4).
- اجمع بين صورة التقسيم والصورة الفلورية (GFP) لاستخراج مستوى الكثافة لكل خلية.
- حساب الرسم البياني لكمية الخلايا حسب الوقت وتناسب وفقا للنمو الأسي.
- حساب المتوسط والانحراف المعياري (STD) لكل نطاق منطقة الخلية.
- حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) لكل نطاق منطقة الخلية.
- رسم وتناسب توزيع كمية الخلايا حسب الكثافة.
- حساب معامل التباين (CV) ومقارنته ببيانات محلل التدفق.
ملاحظة: سوف تعطي البرامج كما إخراج الصور التجزئة النهائية لضبط conv_kernel في مجلد جديد "مجلد / مجزأة". سوف تعطي البرمجيات كما إخراج الرسوم البيانية في مجلد جديد "مجلد / الرسوم البيانية.
- للمقارنة بين التجارب، استخدم compare_experiments.m.
- تعريف الدلائل للرسومات البيانية المحفوظة وعنوان الدليل \CompareResult.
- تشغيل الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يقوم البرنامج بتحليل صور مجال المجال الساطعة التي تكون بيضاء وسوداء. فإن Escherichia القولونية تبدو وكأنها أشكال مستطيلة سوداء على خلفية بيضاء قبالة ومجموعة ديناميكية من الإنارة يجب أن تظهر ارتفاع في مركزها(الشكل 1). في صور الفلورسنت الخلايا قد يكون لها هالة صغيرة ولكن الخلايا الفردية مع الأشكال مستطيل لا يزال يمكن حلها. يجب الكشف عن حدث الداء العثي لأول مرة بعد 30 دقيقة. يجب أن يظل تركيز المجهر مستقرا بمرور الوقت ، وعلى الرغم من أن الخلايا قد تتحرك ببطء خلال تلك الدقائق الثلاثين ، إلا أنه من غير المرجح أن تغادر مجال الرؤية. مثل هذه التجربة سوف تعتبر جيدة ويمكن الاطلاع عليها في الشكل 2. قد يكون من الصعب اكتشاف الخلايا في مجال الحقل الساطع عند التكبير المنخفض. نوصي بتحديد متوسط مسافة التركيز مع عدد نسخة عالية (HCN) البلازميد، كما أنه من السهل أن نلاحظ في التكبير منخفضة. تعيين متوسط المسافة أثناء قياس عدد نسخة منخفضة (LCN) البلازميد في التكبير عالية مقدما. هذه المسافة التركيز يعتمد أساسا في لوحات، ونظام المجهر والنفط، وليس سمك هلام أو سلالة الإشريكية القولونية.
عند تكييف هذا البروتوكول مع مختبرات أخرى، قد تنشأ القضايا التالية (1) لوحات الإشريكية القولونية (عينات) أعدت في نسبة تخفيف غير صحيحة يمكن أن تظهر أعداد غير متغيرة من الخلايا (الشكل 3 والشكل 4) (2) عينات أعدت دون ختم لوحة يمكن أن تظهر انكماش مفرط. ويمكن ملاحظة ذلك كما الانجراف الخلايا (الشكل 3) أو يسبب فقدان التركيز ( الشكل 5 )(3)قد تظهر بعض العينات بطيئة التحول 'ثابتة' الخلايا (باللون الأسود) على خلفية من خلايا السباحة (باللون الأبيض). ومن المرجح أن هذا يرجع إلى عينة الرطب وعادة ما يستقر كما يتم امتصاص المياه الزائدة من قبل هلام(فيديو التكميلية 1) (4)العينات التي لا تظهر أي خلايا بعد بضع دقائق من الاحماء قد تم إعدادها بشكل غير صحيح، من المرجح أن يرجع ذلك إلى: (أنا) تم سكب جل في حين لا تزال ساخنة جدا، (الثاني) تم نسيان غطاء واقية، (III) وسائل الإعلام الحد الأدنى يفتقر إلى عنصر، (IV) كثافة الخلية غير صحيحة، و (V) تم ختم هلام بإحكام جدا. من المهم لكمة ثقوب للسماح تبادل الغاز على حساب انكماش هلام(الشكل 5)و (السادس) الخلايا يمكن أيضا المسافة البادئة هلام بحثا عن المواد الغذائية، التراص واحد على رأس الآخر، مما يعرض للخطر أحادية الخلية منع فعال الكشف عن الخلايا وقياس إشارة الفلورسنت موثوق بها (الشكل التكميلي 5).
لقد قمنا بقياس ثلاث دوائر في هذا العمل. أولا، الترويجي التأسيسي الذي ينظم GFP هو مبين في الشكل 6. ثانيا، الترويجي التأسيسي الذي ينظم فائقة أضعاف GFP31 (SFGFP) هو مبين في الشكل 7. تمت إضافة علامة تدهور SSRA (AAV) إلى SFGFP لتقليل عمرها إلى دقائق5. وتستند الدائرة الثالثة على دائرة التغذية المرتدة الإيجابية1، ويتم تحريضها من قبل acyl-homoserine-lactone (AHL). ينظم المروج PluxR SFGFP و LuxR ، وهو عامل نسخ ملزم مع AHL لتنشيط PluxR كما هو موضح في الشكل 8. يعرض الشكل 9 ديناميكيات نمو الخلية (أرقام الخلايا مقابل الوقت)، ويبين الشكل 10 ديناميكيات الإشارة المقاسة (متوسط الفلورسينس مقابل الوقت)، ويظهر الشكل 11 ديناميكيات الضوضاء الإجمالية المقيمة (الانحراف المعياري (STD) مقابل الوقت).
يستخدم على نطاق واسع SNR (أو السيرة الذاتية) في تصميم الدوائر الإلكترونية التناظرية للتعبير عن دقة وموثوقية الدائرة32. السيرة الذاتية تتعلق بتوزيع إشارة بين خلايا واحدة ويسمح مقارنة عبر الأساليب والمعدات المختلفة مثل المجاهر وتحليل التدفق. حساب SNR من صور المجهر يسمح لنا لمقارنة الدوائر عبر الزمن، يتم قياس الخلايا المجزأة في نفس الوقت الذي توفر قياسا للقرار محددة من الضوضاء مقارنة مع إشارة، أو فاصل زمني للضوضاء لفترة محددة وتركيز محفز. قد يشير هذا إلى ما إذا كانت خلايا الكاشف ستكون قادرة على حل استجابة الإشارة الدقيقة لتركيز المحرض. في هذا العمل، تم حساب السيرة الذاتية من خلال النظر في جميع القطع الأثرية المجزأة التي هي خلايا، بغض النظر عن تطور الخلية في دورة التقسيم. تم حساب SNR لنطاق خلية محددة مع مرور الوقت، ومن ثم تم متوسط لثلاث تجارب متكررة. ولا يمكن الاعتماد على الإشارة المكتسبة أو الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي وحدهما، لأنهما خاصان بالتجربة والمعدات المستخدمة. يتم قياس الإشارة مع وحدات التعسفي الذي يعتمد على الحصول على المعدات مسبقا، والكشف عن الصور ووقت التعرض. وتشير البيانات المعروضة في الشكل 10 إلى أن مرحلة الخلايا في دورة التقسيم لا تؤثر على مستوى الضوضاء، حيث تظهر نطاقات مختلفة من المساحة (نقاط في دورة التقسيم) نفس الاتجاه. قد تدعم هذه الملاحظة الادعاء بأنه يمكن تجنب تتبع العلاقات بين الأم وابنتها لقياس الضوضاء وهذا يمكن أن يحسن SNR للطريقة المعروضة. لم يلاحظ أي تغيير جوهري في SNR بين GFP إلى sfGFP كما هو موضح في الشكل 12. نحن حساب SNR (SNR = متوسط / الأمراض المنقولة جنسيا) وتقديمه في الشكل 12 والشكل 13.
ثم قمنا بحساب التباين والسيرة الذاتية بناء على المعادلات التالية31
1.1
1.2
حيث λ هو وقت طي البروتين، T هو وقت تقسيم الخلية، μ هي عدد البلازميدات قبل وبعد الانقسام، نسخة البلازميد رقم31. باستخدام المعادلات المذكورة أعلاه (1.1، و 1.2) يمكننا احتواء البيانات من إشارة محلل التدفق لتوزيع غاما.
ثم قارنا بين السيرة الذاتية ، والتي يتم قياسها وحسابها بواسطة محلل التدفق(الشكل 14)، وبالبروتوكول(الشكل 15).
الشكل 1: مشرق حقل التعرض صورة (أ) استقرت اقتناء في مجال مشرق (ب) صورة التقسيم ، والخلايا الملونة فقط تدخل حسابات(ج)بكسل خريطة سطوع اقتناء ، وارتفاع هو ضجيج الخلفية. العتبة من قبل أنه يقسم فقط الإشريكية القولونية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تظهر هذه التجربة خلايا صحية جيدة تنقسم وتتفاعل بعد 120 دقيقة. تم الحصول على الصور على التوالي على فترات 20 دقيقة. المستعمرات هي في التركيز، هلام مستقر بين أخذ العينات. تنقسم المستعمرات وتنتج إشارات قوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: آثار نسبة التخفيف غير صحيحة وانكماش هلام على صورة الفلورسنت. تم الحصول على الصور على فترات 20 دقيقة (أ) الفردية Escherichia القولونية محاطة باللون الأحمر (ب) نفس الخلية الانجرافات إلى يمين مجال الرؤية (ج) الخلية الانجرافات أبعد من ذلك. الخلايا أيضا لا تقسيم أو تغيير المواقف، وربما يرجع ذلك إلى انخفاض نسبة التخفيف وانكماش هلام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: في هذه التجربة لم يتم الكشف عن أي نشاط وتقريبا لم تكن هناك خلايا. الأسباب المحتملة هي هلام يجري حار جدا، وتجفيف العينة يجري عدوانية جدا أو عدم وجود غطاء واقية (أ) صور الفلورسنت التي اتخذت في 40 دقيقة(ب)صور الفلورسنت التي اتخذت في 60 دقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: فقدان التركيز وphotobleaching. تم الحصول على صورمتتاليةمن ( أ ) من خلال (د) في فترات زمنية 15 دقيقة باستخدام نظام التركيز التلقائي. انظر الفيديو التكميلي 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6:خريطة بلازميد من تيتو P الذي ينظم GFP. بدون مكبوت TetR ، يعمل مروج PtetO كمروج تأسيسي. يتم استنساخ الدائرة على عدد نسخة منخفضة plasmids. يعمل هذا البلازميد كأساس لقياس SNR لأي دائرة معدلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7:خريطة بلازميد من تيتو P الذي ينظم SFGFP. يتم دمج GFP sfإلى علامة تدهور AAV. يتم استنساخ الدائرة على عدد نسخة منخفضة plasmids. وSFGFP-AAV هو البديل أكثر قوة من GFP، في حين أن علامة AAV جعلها عرضة للتدهور عن طريق التدبير المنزلي proteases من القولونية Escherichia. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: خريطة بلازميد لدائرة التغذية المرتدة الإيجابية. يتم تحريض الدائرة من قبل محفز AHL ، الذي يربط عامل النسخ LuxR. ينشط مروج PluxR ، الذي ينظمه مجمع AHL-LuxR ، في إنتاج LuxR و SFGFP-AAV. يتم استنساخ الدائرة على عدد نسخة منخفضة plasmids. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9:ديناميات Escherichia القولونية MG1655 سلالة النمو في الحد الأدنى من وسائل الإعلام ويشمل (أ)PtetO-GFP، والنمو الأسي من حوالي 35 دقيقة. تظهر صور هذه التجربة في الشكل 2 (ب) PtetO-sfGFP، نمو أسي يبلغ حوالي 35 دقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: مستوى كثافة الفلورسنت، تطبيع لكل بكسل وحصل على فترات 20 دقيقة.
يتم binned الخلايا وفقا للمنطقة، من أجل تقليل القطع الأثرية. تنقسم الخلايا حسب مساحتها في مربع ميكرومتر(أ)Pteto-GFPالدائرة التكرار الأول لكثافة في 210 دقيقة هو 0.004 a.u (ب) PtetO-SFGFP الدائرة التكرار الأول للكثافة في 210 دقيقة هو 0.022 a.u (ج) إشارة قياس Pteto-GFP الدائرة (د) إشارة قياس PtetO-sfGFP الدائرة. وتمثل جميع البيانات التجريبية متوسط ثلاث تجارب. يمكن للبرنامج فرز مساحة الخلية إلى مجموعاتمختلفة( أ ) و (ب) إظهار الرسوم البيانية لأربع نطاقات منطقة الخلية التي تمثل دورة التقسيم. تمثل المنطقة الأولى من 14 ميكرومتر الخلايا بعد الانقسام على الأرجح أن الخلايا بعد الانقسام ستكون الأصغر. تمثل المنطقة الثانية من 21 ميكرومتر الخلايا قبل التقسيم. تمثل المنطقتان الثالثة والرابعة خلايا مقسمة حيث يتم ضرب المساحة الإجمالية بمقدار اثنين (29 و 36 ميكرومتر) من أجل النظر في الخلايا التي استغرقت وقتا أطول لتقسيمها. وقد تم اختيار المناطق من خلال تقييم البيانات التي تبحث في صور المجهر يدويا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11:الانحراف المعياري (STD) من شدة مضان الخلية الواحدة ل: (أ) PtetO- GFP الدائرة التكرار الأول للأمراض المنقولة جنسيا في 210 دقيقة هو 0.001865 a.u (ب) PtetSFGFP الدائرة التكرار الأول للأمراض المنقولة جنسيا في 210 دقيقة هو 0.01477 a.u (ج) STD من Pteto-GFP الدائرة (د) STD من PtetO-SFGFP الدائرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12:SNR من شدة مضان الخلية الواحدة. نحن حساب SNR = متوسط / STD (أ) PtetO- GFP الدائرة التكرار الأول لSNR في 210 دقيقة هو 1.309 a.u (ب) PtetO-SFGFP الدائرة التكرار الأول لSNR في 210 دقيقة هو 1.29 a.u (ج) ثلاثة تكرارات لقياس GFP (د) ثلاثة تكرارات لقياس GFP sf. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 13: SNR من خلية واحدة شدة الفلورسينس (أ)PluxR--SFGFP الدائرة SNR للاستجابة التشبع إلى AHL (ب) PluxR--SFGFP الدائرة SNR للاستجابة نصف الوقت ل AHL. وSNR من ردود الفعل الإيجابية AHL الدائرة المنظمة أعلى من SNR لدائرة GFP SFالتأسيسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 14: المدرجات التكرارية للدوائر الجينية استنادا إلى محلل التدفق: البيانات التجريبية (الأزرق) وبيانات النموذج العشوائي (الأحمر). يمثل المحور x وحدات الفلورسينس التعسفية من قياس التدفق الخلوي، ويمثل محور y تردد الخلايا المنتجة لمستوى الفلورسينس المقابل. تم قياس البيانات باستخدام محلل تدفق بعد ثلاث ساعات. تم قياس فلورة GFP كميا عن طريق الإثارة عند طول موجي قدره 484 نانومتر والانبعاثات عند طول موجي قدره 510 نانومتر. PE-TexasRed فلتر الفولتية استخدمت على العينات الإنتاجية العالية لقياس مستويات التعبير GFP. تم تعديل الفولتية محلل تدفق باستخدام البرمجيات بحيث يمكن قياس الحد الأقصى والحد الأدنى من مستويات التعبير مع إعدادات الجهد نفسه. وهكذا، تم استخدام الفولتية متسقة عبر كل تجربة بأكملها. واستخدمت نفس الفولتية لتكرار لاحقة من نفس التجربة. تم إجراء التركيب باستخدام توزيع غاما31. تفترض هذه الطريقة أن الإشارة تعتمد في الغالب على التوزيع العشوائي للبلازميدات(أ)قياس استنساخ Pteto-GFP على عدد النسخ المنخفض plasmid. CV التجريبية = 0.46 ، نموذج CV = 0.32 (ب) قياس Pتيتو--SFGFP - AAV المستنسخة على انخفاض عدد نسخة plasmid. السيرة الذاتية التجريبية = 0.86 ، نموذج السيرة الذاتية = 0.44. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 15: المدرجات التكرارية للدوائر الجينية على أساس المجهر: البيانات التجريبية (خطوط منقط) وبيانات النموذج العشوائي (خطوط صلبة). يمثل محور x وحدات مضان عشوائية من المجهر المقلوب ويمثل محور y تردد الخلايا المنتجة لمستوى الفلورسينس المقابل. تم إجراء تركيب باستخدام توزيع غاما MATLAB31،32 (أ) قياس PtetO- GFP استنساخ على نسخة منخفضة عدد plasmid (ب) قياس PtetO--SFGFP - AAV المستنسخة على عدد نسخة منخفضة. تظهر المقارنة أن بروتوكولنا يحصل على قيم سيرة ذاتية مماثلة كما هو الحال في تجربة محلل التدفق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1:أربع نسب تخفيف، بين 1:500 و 1:20، لسلالة MG1655. يوضح الرسم البياني أنه إذا كانت الكثافة الأولية عالية ، فإن العناصر الغذائية LB وفيرة مما يؤدي إلى انقسام الخلايا بشكل أسرع. لتمييع 1:500، ظلت كثافة الخلية ثابتة. لتمييع 1:100، زادت كثافة الخلية ببطء. لتخفيف 1:50، زادت كثافة الخلية بمعدل تقسيم معتدل دون تأخير كبير في حضانة 250 دورة في الدقيقة. لتمييع 1:20، وصلت كثافة الخلية التشبع بسرعة. اخترنا نسبة تخفيف 1:30 ، مما يسمح باحتضان قصير للوصول إلى نمو أسي ونطاق تقسيم كبير لتحقيق تشبع مرتفع بمعدل تقسيم معتدل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم
الشكل التكميلي 2:معالجة صور الحقل الساطع. (أ) صور كثافة البيانات الخام من قناة المجال الساطع من نظام المجهر. (ب) التلاعب تعزيز التباين للصورة لتحسين فصل كائنات الخلية من الخلفية. (ج) التعرف على حدود الخلية على أساس مرشح التواء33 و binarization على أساس العتبة العالمية34. (د)35 عمليات مورفولوجية من إغلاق وملء لتحديد حدود مستعمرة الخلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم
الشكل التكميلي 3: خلفية مستعمرة الخلية\تقسيم المقدمة. لتقليل تأثير الضوضاء نحاول تحديد حدود مستعمرة الخلية واستخراجها من ضوضاء الجل. (أ) عملية ثنائية الصورة على تحسين التباين على أساس عتبة التكيف للكشف عن كائنات الخلية36. (ب)مصفوفة متعددة من المصفوفات المقدمة في S2D و S3a بنجاح تصفية معظم الضوضاء والتمييز بين الضوضاء هلام من الخلايا. لم يتم حل بعض الحدود بشكل كامل. (ج) تحديد حدود الخلية باستخدام خوارزمية مستجمعات المياه37 على أساس تحويل المسافة38. (د) مصفوفة متعددة المستويات من المصفوفات المقدمة في S3b و S3c بنجاح حل الخلايا المفردة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم
الشكل التكميلي 4:تجزئة الخلية الواحدة. (أ) منتج مجزأ لصورة الحقل الساطع. يتم تشكيل المزيد من التنظيف مسبقا استنادا إلى منطقة الخلية وشكلها ، والتخلص من الفقاعات المستديرة. (ب)صور إشارة الفلورسينس المكتسبة من المجهر. (ج) مصفوفة متعددة البسط من المصفوفات المقدمة في S4a و S4b بنجاح استخراج إشارة خلايا واحدة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم
الشكل التكميلي 5:فقدان طبقة أحادية. (أ)صورة حقل مشرق من طبقة الخلية في 840 دقيقة (14 ساعة) من Pteto الذي ينظم الدائرة GFP هو مبين في الشكل 2 في هذه المادة كتجربة جيدة. في الجانب الأيمن من فقدان صورة المجهر من monolayer يمكن الكشف عنها. (ب) صورة تقسيم البرامجيات. بسبب فقدان خلايا أحادية الطبقات مجزأة وسيتم تنظيف قاعدة على منطقة gating. (ج) صورة فلورسينس تبين أنه على الجانب الأيمن من الصورة لا يمكن حل الخلايا وإشارة منخفضة من الخلايا على الجانب الأيسر من الصورة بسبب فقدان طبقة واحدة. (د)صورة تجزئة جنبا إلى جنب مع صورة مضان. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم
فيديو تكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو
الفيديو التكميلي 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو
فيديو تكميلي 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو
cell_growth_rate_fit.m. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف
compare_experiments.m. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف
Count_Cells.m. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف
main_code.m. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل، قمنا بتطوير بروتوكول يمكن تتبع الكمبيوتر من الخلايا الحية الإشريكية القولونية، بعد مستويات الانقسام والفلورسنت على مدى فترة من الساعات. يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد الديناميكيات العشوائية للدوائر الجينية في الإشريكية القولونية من خلال قياس السيرة الذاتية وSNR في الوقت الحقيقي. في هذا البروتوكول، قارنا السلوكيات العشوائية لدارتين مختلفتين كما هو موضح في الشكل 10. وقد ثبت أن البلازميدات ذات الأرقام المنخفضة هي أكثر عرضة للآثار العشوائية وأقل تأثرا بانقسام الخلايا. الدائرة الأولى التي أعرب عنها تشكيليا GFP (الشكل 10a)، والدائرة الثانية أعرب تشكيليا SFGFP تنصهر على علامة تدهور ssrA (الشكل 10b). من أجل تحديد السلوك العشوائي للبروتينات الفلورية ، سجلنا أيضا صورا ميدانية ساطعة. تظهر النتائج أن التعبير عن GFP ، وتحديدا فينضوجه 39، هو مصدر الضوضاء المهيمن. يمكن تفسير نمط سلوك الأسنان الدوري الذي لوحظ في الشكل 10a من خلال العملية العشوائية لتقسيم الخلايا والنطاق الطويل لنضج GFP (~ 50 دقيقة). وعلى النقيض من ذلك، استقرت إشارة SFGFP للدائرة الثانية أثناء القياس، وذلك لأن وقت النضج القصير جدا ل SFGFP (~ 6 دقائق). طورنا صيغة بسيطة تصف مستوى GFP في كلا الحلبتين عندما ننظر فقط في عملية تقسيم الخلايا ووقت نضوج GFP. في وقت معين، ر،ونحن نفترض أن هناك أرقام نسخة x من البروتينات، μ أرقام نسخة من البلازميدات. يمكن وصف رقم نسخة البروتين من خلال:
1.3
1.4
عند النظر في أحداث التقسيم فقط؛ 
بعد نضوج البروتين وذلك لplasmids محددة نحصل على:
ل GFP ( 
): 1.5
لSFGFP 
(): 1.6
ثم، وضعت سلسلة من SFGFP:
1.7
في حالة 
حصولنا على 
. ويمكن تفسير هذه النتيجة على النحو التالي. عندما تكون x صغيرة، تزداد مستويات GFP sfبمقدار صغير. عندما تكون x كبيرة، يتم تدهور GFP sfإلى حالة ثابتة. وبالمثل ، بالنسبة لدائرة GFP ، تحتوي كل خلية على حوالي 10 وحدات من GFP ، ولكن نظرا لأن وقت نضج GFP أطول من الانقسام ، لوحظت أنماط الأسنان المهينة من شدة الفلورسينس. في النموذج ، افترضنا أن تكرار البلازميد سريع بما يكفي بحيث يظل توزيع البلازميد ثابتا قبل وبعد الانقسام. غالبا ما تقلل علامة تدهور ssrA من وقت نصف عمر البروتين من ساعات إلى أقل من ساعة5 وتؤدي إلى حالة ثابتة سريعة. أظهرنا أن الطريقة توفر أيضا توزيعا مشابها لذلك الذي تم قياسه بتحليل تدفق سكاني مرتفع وأن السيرة الذاتية لهذا التوزيع تساوي أو أصغر من السيرة الذاتية لتحليل التدفق.
في حين تم تطوير العديد من الطرق3،7،18 لتصوير الخلايا الحية ، فإن الطريقة المعروضة هنا مصممة خصيصا ل Escherichia coli. هذه البكتيريا تتطلب وسائل الإعلام الخاصة ونهج مختلف قليلا. البروتوكول له السمات الهامة التالية: (1) إنشاء نسبة تخفيف محددة للبكتيريا والإجهاد في بداية النمو الأسي بدلا من المرحلة الوسطى (النمو الأسي دون اهتزاز) (2) Escherichia coli أفضل تقسيم في 37 درجة مئوية، ولكن في 37 درجة مئوية هلام وسائل الإعلام الحد الأدنى يفقد الماء بسرعة مما يؤدي إلى انكماش وعدم الاستقرار. البروتوكول هنا يتغلب على هذا التحدي (3) نحن أولا تطبيق عينة البكتيريا ومن ثم ختمها مع هلام السائل. وبما أن العينة محصورة بين القاع الزجاجي والجل ، فإننا نحتاج إلى هلام يسمح (I) بتبادل الغاز لتجنب قطع جيوب الهواء ، (II) يبقى سائلا في درجات حرارة منخفضة حيث أن الإشريكية القولونية حساسة للحرارة و (III) تتأكد من عدم خلط العينة داخل الجل السائل. الجل لا يزال سائلا عند 37 درجة مئوية، ومع ذلك ، نوصي باستخدام غطاء وقائي فوق العينة لتجنب الحرارة المفرطة وخلط العينات داخل الجل (4) يتطلب هذا النهج معدات عامة بسيطة (5) يمكن قياس العينات مباشرة دون التسخين المسبق ، لذلك لا يوجد فقدان لأحداث التقسيم (6) يمكن استخدام البروتوكول ، الذي يتضمن خطوات المختبر الرطب والبرامج الآلية المخصصة ، لدراسة السلوك العشوائي للدوائر الجينية مثل تحديد SNR و CV لإشارات الدائرة. قارنا طريقة الفحص المجهري بنتائج محلل التدفق من أجل التحقق من صحة استخدام مجموعات صغيرة من الخلايا ووضع خط أساس للمقارنة وفقا لسيرة ذاتية (7) يسمح لنا البرنامج بالكشف عن الخلايا على الطبقة الأحادية دون تدخل بشري وتحليل إجمالي الضوضاء. تتطلب أدوات البرامج مثل ImageJ18 أو Schnitzcells التعرف اليدوي على الخلايا وهي صعبة للتعديلات.
عند التصوير المستمر لمستعمرات الخلايا الحية ، قم بتصميم التجربة مع النظر في العديد من المعلمات الفيزيائية المعقدة ، مثل الإجهاد الخلوي والسمية ، ومعدل نضوب الموارد ، ونخر وتدهور وقت الحث والمواد الكيميائية. يسمح البروتوكول بقياس موثوق لمدة تصل إلى خمس ساعات. تشير تجاربنا إلى أن الإشريكية القولونية تتزامن عند تقسيمها في مستعمرات صغيرة أحادية الطبقة(فيديو تكميلي 3). نحن نفترض أن الجل موحد من حيث الموارد والصلابة ، والخلايا لديها سلوك مماثل ، ومجال الإضاءة أكبر قليلا من مجال الرؤية. وبالتالي، يجب أن تنتج كل خلية نفس الإشارة والبيانات الإحصائية، والتي يمكن جمعها كما أظهرنا من خلال مقارنة السيرة الذاتية التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة للقياس مع محلل التدفق. من أجل قياس الضوضاء في الظروف الأولية الثابتة لفترات أطول من الزمن، وسوف ننظر في استخدام رقائق microfluidic في المستقبل. فوائد أخرى من هذا الجهاز هي الحفاظ على مواقف ثابتة من الخلايا والتركيزمستقرة 10. ومع ذلك ، فإن التصميم وتصنيع رقائق microfluidic والتجهز للتجارب تتطلب التدريب ومعدات محددة (مصنوعة خصيصا في بعض الأحيان) والوقت. لهذا السبب، من المفيد استخدام المجهر الفاصل الزمني كما هو مبين في هذا البروتوكول للحصول على فهم عام للدائرة.
ويسمح البروتوكول المقترح والبرنامج الحاسوبي المطور بإجراء قياسات قابلة للاستنساخ، يسهل من خلالها اشتقاق الرسوم البيانية. كما أنه يسمح باختبار ومقارنة إجمالي الضوضاء ويمكن تعديله لقياس الضوضاء الجوهرية والكثرية. وتستند هذه الطريقة على مواد عامة أو سهلة الطلب، مشتركة علنا، وسهلة الاستخدام البرمجيات ولا تتطلب تدريبا محددا. لقد أظهرنا أن السكان الذين يقاسون بالفحص المجهري كبيرون بما يكفي للحصول على بيانات ذات مغزى من خلال مقارنة الطريقة CV بتلك التي تم الحصول عليها مع محلل التدفق. لذلك، يمكننا بنجاح إنشاء خط أساس SNR باستخدام هذا البروتوكول ومقارنته بالدوائر الجينية الأكثر تعقيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر السيد جيل غيلبرت (كلية الهندسة الكهربائية، تكنيون) على مساعدته في قانون MATLAB. نشكر الدكتور Ximing لي (كلية الهندسة الطبية الحيوية ، Technion) للمساعدة في التدقيق في هذه المقالة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل مؤسسة عائلة نيوباور ووزارة العلوم الإسرائيلية، منحة 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al.
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V.
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E.
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
