Summary
Detta arbete presenterar en mikroskopimetod som möjliggör levande avbildning av en enda cell av Escherichia coli för analys och kvantifiering av stokastiskt beteende hos syntetiska genkretsar.
Abstract
Protokollet som utvecklats här erbjuder ett verktyg för att möjliggöra datorspårning av Escherichia coli-divisionen och fluorescerande nivåer under flera timmar. Processen börjar med screening för kolonier som överlever på minimala medier, förutsatt att endast Escherichia coli som hyser rätt plasmid kommer att kunna frodas under de specifika förhållandena. Eftersom processen att bygga stora genetiska kretsar, som kräver montering av många DNA-delar, är utmanande, distribueras kretskomponenter ofta mellan flera plasmider vid olika kopieringsnummer som kräver användning av flera antibiotika. Mutationer i plasmid kan förstöra transkription av antibiotikaresistensgenerna och interject med resurshantering i cellen som leder till nekros. Den valda kolonin är inställd på en petriskål med glasbotten och några fokusplan väljs ut för mikroskopispårning i både ljusa fält- och fluorescerande domäner. Protokollet bibehåller bildfokus i mer än 12 timmar under inledande förhållanden som inte kan regleras, vilket skapar några svårigheter. Till exempel börjar döda celler ackumuleras i linsernas fokusfält efter några timmars avbildning, vilket gör att toxiner byggs upp och signalen suddas ut och förfaller. Utarmning av näringsämnen introducerar nya metaboliska processer och hindrar det önskade svaret från kretsen. Experimentet temperatur sänker effektiviteten hos inducerare och antibiotika, vilket ytterligare kan skada signalens tillförlitlighet. Den minimala mediegelen krymper och torkar, och som ett resultat förändras det optiska fokuset med tiden. Vi utvecklade denna metod för att övervinna dessa utmaningar i Escherichia coli, liknande tidigare verk som utvecklar analoga metoder för andra mikroorganismer. Dessutom erbjuder denna metod en algoritm för att kvantifiera det totala stokastiska bruset i oförändrade och förändrade celler, och finner att resultaten överensstämmer med flödesanalysförutsägelser som visas av en liknande variationskoefficient (CV).
Introduction
Syntetisk biologi är ett tvärvetenskapligt område som har dykt upp under det senaste decenniet och syftar till att översätta tekniska designprinciper till rationell biologisk design1,2,3, i ett försök att uppnå multi-signal integration och bearbetning i levande celler för att förstå grundvetenskapen4,5, diagnostiska, terapeutiska och bioteknologiskatillämpningar 6,7,8,9,10. Vår förmåga att kvantifiera inmatningsutgångssvaret hos syntetiska genkretsar har revolutionerats av de senaste framstegen inom encellsteknik, inklusive flödesanalysatorn och levande cellavbildning med hjälp av automatiserad tidsfördröjningsmikroskopi11. En flödesanalysator används ofta för att mäta svaret från dessa kretsar vid steady state1,12, och inverterad mikroskopi används för att mäta det dynamiska svaret hos syntetiska genkretsar på nivån för en enda cell3. Till exempel involverade ett av de tidiga verken inom syntetisk biologi byggandet av genetiska oscillatornätverk i levande celler med hjälp av negativa återkopplingsslingor med enfördröjning 3. Senare tillämpades de genetiska oscillatorkretsarna för att förstå metabolisk kontroll i den dynamiska miljön hos levande celler4. Automatiserad tidsfördröjningsmikroskopi är en metod för att karakterisera sådana kretsar. Vi antar att värdcellerna, Escherichia coli, synkroniserar när de bildar mikrokolonier, vilket möjliggör mätning av signal och beräkning av buller utan att spåra exakta mor-dotter-relationer.
Buller är en grundläggande, inneboende aspekt av biologiska system som ofta härrör från flera källor. Tänk till exempel på biokemiska reaktioner som involverar signaler som härrör från transport av diskreta slumpmässiga bärare som diffusion av proteiner13. Dessa signaler sprider sig med slumpmässiga fluktuationer14. Andra bullerkällor är resurstillgänglighet, celldelning och variationer i miljöförhållanden som temperatur, luftfuktighet och tryck. Biologiska signaler som sprids i syntetiska genkretsar har ofta ett mycket lågt signal-till-brusförhållande (SNR), vilket stör prestandan hos sådana kretsar. Därför är genkretsdesign fortfarande en av de mest utmanande aspekterna av genteknik15. Till exempel, i motsats till de flesta metoder som beräknar endast det genomsnittliga genuttrycket (mätt över hela cellpopulationen), beaktas variansen hos den uppmätta signalen för att konstruera förutsägbart beteende genom syntetiska gennätverk12. Som sådan spelar nivåerna av variabilitet eller buller i proteinuttrycket en dominerande roll i utformningen och prestandan hos analoga och digitala genkretsar1,16,17.
Många metoder har utvecklats för att kvantifiera cell-till-cell variabilitet, inklusive i Escherichia coli3,7,18. Dessa metoder används ofta för att studera genaktivering och metaboliska vägar, men med mindre fokus på studier av stokastisk bullerdynamik, som att mäta och lossa specifika bullerkällor, särskilt för genetiska kretsar i levande celler där detta är en grundläggande utmaning19,20,21. Flera faktorer, både ärvda till själva kretsen (inneboende) och härledda från värdcellerna (extrinsiska), kan störa den kontinuerliga prestandan hos genetiska kretsar. I detta dokument utvecklade vi ett protokoll som syftar till att kvantifiera det totala bullret i Escherichia coli-celler, inklusive de inneboende och extrinsiska bullerkällorna6,22. Genom att kvantifiera det totala bruset och sedan utvärdera SNR23kan utformningen av genkretsar förbättras. Denna metod kan modifieras för att mäta oberoende bullerkällor separat, genom att övervaka flera fluorescerandeproteiner 6,20. För protokollet som beskrivs här håller vi miljöförhållandena väl kontrollerade och mäter kontinuerligt cellernas aktivitet utan påverkan av yttre faktorer. Vi mäter signalen från fluorescerande proteiner i enstaka celler över tid och avbildar dem samtidigt under ett agarose substrat. De resulterande bilderna analyseras med hjälp av laboratoriets anpassade MATLAB.
Helst kommer kontinuerlig mätning av realtidsaktiviteten hos fluorescerande proteiner inuti en cell att producera exakta data genom cellernas tillväxt och delning. Det är dock utmanande att få sådana uppgifter. Detta beror på nedbrytning av fluorescerande proteiner, känd som fotoblekning7, när de utsätts för strålning i excitationsprocessen. Dessutom är Escherichia coli-celler också känsliga för excitationen, vilket kan leda till fototoxicitet7. Båda frågorna begränsar mängden fotoramar som kan förvärvas och tiden mellan förvärven. De substrat och medelstora typer (t.ex. lysogen buljong) som används för att odla cellerna under avbildning har också en kritisk roll. Vi rekommenderar starkt att du använder minimalt medium, vilket minimerar icke-fluorescerande bakgrund och förlänger celldelningstiden.
Dessutom måste provet förberedas med hänsyn till följande krav (1) Låg celldelningshastighet möjliggör mindre frekvent exponering för att noggrant avbilda delningscykeln och minska sannolikheten för fototoxicitet och fotoblekning. Vi ställer in förvärvstiden till ungefär hälften av den förväntade mitostiden (2) Låg celltäthet i början av experimentet möjliggör bättre enhetlighet och spårbarhet för uppdelningen. Celldensiteten påverkas av utspädningsförhållandet för Escherichia coli-cellerna, vilket är en viktig parameter för att detta protokoll ska lyckas och måste bestämmas för varje labb. För att fastställa förhållandet bör varje ny Escherichia coli-stam eller media som används förses med tillväxthastighetsdiagram(kompletterande figur 1). Ett lämpligt förhållande har uppnåtts om celler kan växa utan ytterligare skakningar efter en kort inkubation från en initial densitet på caOD 600nm = 0, 1. Celler i denna fas kommer endast att dividera enligt miljötemperaturen (3) Begränsning av cellrörelser: cellrörelser beror starkt på substrat (agarose pad) fasthet. Substratet fasthet beror på mängden total agarose och geléns stelningstid. Geler kan inte lämnas att stelna över natten vid rumstemperatur, eftersom Escherichia coli kommer att genomgå mitos. Andra faktorer som påverkar substratstabiliteten är mängden vatten i provet och luftfuktigheten. Ytterligare frågor diskuteras i detalj i de representativa resultaten. Det här protokollet innehåller många detaljer och flyttas gradvis från ett steg till ett annat. Protokollet ger lång stabilitet för bildexperiment och ger ett grundläggande bildbehandlingsverktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medie- och kulturförberedelser
- Bered stamlösning av 1000x Carbenicillin (50 mg/mL) eller relevant antibiotika.
- . Väg 0,5 g karbinicillin. Tillsätt 10 ml steril H2O. Lös upp helt.
- Sterilisera karbinenicillinbuljongen genom ett sprutfilter på 0,22 μm. Aliquot antibiotikalösningen och lagra vid -20 °C.
- För att förbereda lysogena buljongplattor (LB), blanda 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2,5 g jästextrakt och 7,5 g Bacto-agar med 0,5 L steril H2O. Autoklavera lösningen vid 121 °C i 20 min.
- Delvis nedsänkt den smälta gelblandningen i ett 50 °C vattenbad. Tillsätt 1 000 μL karbinicillin (50 mg/ml).
- Förbered petriskålar i steril miljö. Låt tallrikarna ställas in innan du förvarar dem i kylskåpet.
- För M9 minimal media, förbered separata lagerlösningar av följande: 5x M9 salter (56,4 g/ L), 2 M glukos och 2% biotinfria casaminosyror. Autoklavera lösningarna vid 121 °C i 20 min.
- För att förbereda 5 Petri-plattor, blanda 1125 mg lågsmältning och 400 mg agar med 89,2 ml minimalt medium (1x M9). Tillsätt 10 ml 2% casaminosyror (2% [vol/vol]) i en 250 ml Erlenmeyerkolv.
OBS: Se till att hälla mediet på kolvens inre läppar. - Mikrovåg lösningen i korta skurar på 3 till 4 sekunder. Upprepa tills lösningen är klar.
OBS: Se till att du inte når kokpunkten. - Placera 250 ml Erlenmeyerkolven i ett varmvattenbad (60 °C) för att ytterligare blanda genom diffusion och låt den svalna tills temperaturen sjunker till ca 45-50 °C.
- Tänd lågan vid den plåthällande bänken.
- Lägg snabbt till alla lösningar i följande ordning:
800 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
100 μL tiamin (B1)
1100 μL glukos (2M)
100 μL karbinicillin (50 mg/ml). - Snurra Erlenmeyerkolven för att säkerställa jämn fördelning av alla ingredienser i hela agarn.
- Öppna en tallrik i taget bredvid lågan och börja hälla.
- Lämna plattorna på bänken i några minuter tills den första stelningen.
- Vänd plattorna upp och ner för att förhindra att vattenkondens droppar på gelén.
- Låt plattorna stelna vid rumstemperatur i ca 2 timmar.
- När plattorna har stelnat och torkats kan de förvaras vid 4 °C i ca 3 månader.
2. Bakteriestammar och plasmider konstruktion
OBS: Den genetiska kretsen innehåller en del; ett grönt fluorescerande protein (GFP) som drivs av en PtetO-promotor som resulterar i konstituerande uttryck. Alla plasmider i detta arbete konstruerades med hjälp av grundläggande molekylär kloningstekniker och omvandlades till Escherichia coli 10β, med hjälp av ett standardprotokollför värmechock 24. Den slutliga konstruktionen omvandlades till Escherichia coli MG1655 vild typ stam för testning.
- Omvandla önskad plasmid till Escherichia coli MG1655 celler med standard värmechock protokoll24.
- Odla de omvandlade cellerna på en LB-agarplatta över natten vid 37°C.
OBS: Det är möjligt att hålla petriskålarna från steg 2,2 upp till 3 dagar för mikroskopianvändning. - Inokulera en enda koloni i 5 ml LB-buljong kompletterad med relevanta antibiotika i ett glasrör.
- Odla celler vid 37 °C med skakningar på 250 varv/min i inkubatorn i 2 timmar tills vätskan är grumlig.
- Bered 1 ml utspädningslösning enligt följande:
892 μL minimalt medium (1x M9)
8 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
100 μL av 2% Casamino syror (0,2% [wt/vol])
1 μL tiamin (B1)
11 μL glukos (2 M)
1 μL relevant antibiotika- Blanda och snurra ner.
- Späd cellkulturen (1:30) från steg 2,4 till ett 2 ml-rör genom att tillsätta 30 μL Escherichia coli-tillväxt till 1000 μL utspädningslösning (steg 2,5).
- Inkubera röret i 1 timme med skakningar (250 varv/min) vid 37 °C.
- Odla 40 μL - 60 μL på M9-plattor beredda i steg 1.10. Inkubera plattan vid 37 °C över natten.
OBS: Den optiska densiteten (OD600nm)för plätering bör vara cirka 0,1. - Placera upp till tre 35 mm glasbottenplattor på bänken.
OBS: Se till att plattans glas har rätt tjocklek för de mikroskoplinser som används. - Förbered kulturen för sådd på gelplattor, upprepa steg 2.3 till 2.6 för kolonier från platta beredda vid steg 2.9 mikroskopmätningar.
- Förbered följande lösning för att göra tre mikroskopplattor.
- Förvärm vattenbadet till 60 °C.
- Blanda 112,5 mg lågsmält agar och 40 mg agar med 8,92 ml minimalt medium (1x M9) och tillsätt 1 ml 2% casaminosyror (0,2% [vol/vol]) i en 25 mL Erlenmeyerkolv.
OBS: Se till att hälla mediet på kolvens inre läppar.
- Mikrovåg lösningen i korta skurar på 2 till 3 sekunder. Upprepa tills lösningen är klar.
OBS: Se till att du inte når kokpunkten. - Placera 25 ml Erlenmeyerkolven i ett varmvattenbad (60 °C) för ytterligare blandning genom diffusion och låt den svalna på bänken tills temperaturen sjunker till ca 45–50 °C.
3. Beredning av agarose pads
- Rengör bänken med 70% etanol. Stretch tejp på den rengjorda bänken. Se till att tejpen är jämn och utjämnad.
- Förbered två täcken: en på bandet och en andra i närheten. Förbered en täcklock.
- Avlägsna kolven (beredd i steg 2.14) från vattenbadet, torka av kolvens utsida ren och låt den svalna tills temperaturen sjunker till ca 45–50 °C.
- För att göra gellösningen, blanda snabbt alla lösningar i följande ordning:
80 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
1 ml 2% casaminosyror (0,2% [wt/vol])
10 μL tiamin (B1)
110 μL glukos (2 M)
10 μL relevant antibiotika. - Häll 1,5 ml gel på täckglaset och täck det med den andra biten som gör en "smörgås".
- Lämna tillbaka Erlenmeyer till varmvattenbadet. Täck smörgåsen med locket och ställ in timern i 20 minuter.
- Inkubera samtidigt röret från steg 2.11 i 1 timme vid 37 °C med skakningar (250 varv/min)
- Efter 20 minuter vänd smörgåsen (steg 3.5), täck den och låt vila i 1 timme.
OBS: För bättre resultat låt "smörgåsen" vila vid 4 °C under hela steg 3.8. - Frö Escherichia coli kultur från steg 3.7 genom att pipetting provet på 35 mm skålen.
OBS: Pipetting 6 μL celler som separata små droppar ger bäst resultat. - Låt dropparna torka i minst 15 minuter och upp till 30 minuter.
- Exponera smörgåsens stelnade gel från steg 3.8 genom att skjuta bort täcket.
- Skär smörgåsen i små enskilda kuddar med biopsi stans eller spets.
- Luta det försiktigt på provet (steg 3.9). Lämna skålen i 20 minuter på bänken.
4. Förbereda provet för mikroskopiavbildning
- Ta bort kolven från vattenbadet från steg 3.6. Torka av kolvens utsida och låt svalna till rumstemperatur (25 °C).
OBS: Ta bort kolven i steg 4.1 ca 3 minuter innan timern slutar. - Häll 3 ml gelen ständigt till plattans omkrets i en cirkulär rörelse. Låt stelna i några minuter.
- Försegla plattorna med tejp och genomborra flera hål med 25 G nål. Vänd alla rätter för att förhindra att vattenkondens droppar på gelén.
- Inkubera alla rätter vid 4 °C i 30 min för att möjliggöra full stelning samtidigt som cellmidos förhindras.
OBS: Lämna proverna vid 4 °C för på varandra följande mätningar, högst en dag. - Starta mikroskopet enligt tillverkarens instruktioner.
- Hitta det ursprungliga fokuset med hjälp av lägsta förstärkningslins och aktivera automatiskt fokussystem (AFS).
- Använd olja om det behövs, dränk linsen med olja och sprid den försiktigt genom att flytta plattan med en plattformsregulator (inte manuellt) och AFS kan aktiveras igen.
- Använd relativt tvärsnitt i Z-riktning enligt standardförslaget för Z-stegs tvärsnitt.
OBS: Vi tog ljusa fältbilder var 5: e minut och fluorescerande bilder var 20: e minut. Ibland måste fokus justeras under de första 30 minuterna. Förvärmning av mikroskopets inkubatorlåda och olja, medan kylning av provet tenderar att bidra till att minska den ursprungliga förlusten av fokus.
5. Dataanalys
OBS: För att bearbeta mikroskopidata designade vi en datorbaserad programvara i MATLAB. Denna programvara underlättar identifiering av cellgränser från ljusa fält tiff bilder och segment och sorterar celler efter område. Utdata från den här bildanalysen kan användas som en mask på fluorescerande tiffbilder för att härleda cellintensitetsnivåer och avbryta artefakter i den fluorescerande domänen, till exempel cell halo på grund av mikroskopupplösningsgränser. Programvaran som utvecklades inspirerades av liknande verk7,25,26,27,28,29,30 och ger en elegant lösning skräddarsydd för labbet.
- Definiera först följande parametrar i main_code.m.
- Definiera mappen för anskaffningsbilderna.
- Definiera bildtidsperioden - tidssteg för ljusa fält kanaliserar i minuter.
- Definiera GFP-frekvensen - förvärvshastighet för GFP-bilder.
- Definiera mikroskopupplösningen (dvs. hur många pixlar är lika med 1 μm).
- Definiera histogramlagerplatsområde - cellområdesområde.
OBS: Processen att klassificera data efter cellområde liknar principerna för gating i flödescytometridataanalys. Grindar placeras runt populationer av celler med gemensamma egenskaper, vanligtvis framåt spridda och sida spridda, för att isolera och kvantifiera dessa populationer av intresse. Mikroskopi gör det möjligt att gate, undersöka och kvantifiera flera cellgrupper. - Definiera faltningskärna (3,3) – den här parametern identifierar cellgränser genom globaltröskel( count_cells.m ).
Obs: Den här inställningen behövs endast när du byter labb eller mikroskop. Programvara kräver att indataljusfältskanalen är märkt med index c1, fluorescenskanal märkt som c2.
- Kör main_code.m, som kör alla andra skript automatiskt (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Ljusfältsbilder segmenteras automatiskt (se kompletterande figur 2-4).
- Kombinera segmenteringsbilden med fluorescerande bild (GFP) för att extrahera intensitetsnivån per cell.
- Beräkna diagrammet över mängden celler efter tid och passform enligt exponentiell tillväxt.
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen (STD) för varje cellområdesområde.
- Beräkna förhållandet mellan signal och brus (SNR) för varje cellområdesområde.
- Rita och passa fördelningen av mängden celler efter intensitet.
- Beräkna varianskoefficienten (CV) och jämför med flödesanalysdata.
OBS: Programvara kommer att ge som utgång de slutliga segmenteringsbilderna för conv_kernel i en ny mapp "yourfolder /Segmented". Programvara kommer att ge som utdata graferna i en ny mapp "dinfolder / grafer.
- För att jämföra mellan experiment, använd compare_experiments.m.
- Definiera kataloger för de sparade diagrammen och adressen till katalogen \CompareResult.
- Kör filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Programvaran analyserar ljusa fältdomänbilder som är off-white och svarta. Escherichia coli kommer att se ut som svarta avlånga former på en off-white bakgrund och dynamiskt intervall av luminans bör visa en spik i mitten (Bild 1). I fluorescerande bilder kan celler ha en liten halo men enskilda celler med avlånga former kan fortfarande lösas. En mitoshändelse bör först upptäckas efter 30 minuter. Mikroskopfokus bör förbli stabilt över tid och även om cellerna kan röra sig långsamt under dessa 30 minuter, är det osannolikt att de lämnar synfältet. Ett sådant experiment kommer att betraktas som bra och kan ses i figur 2. Celler kan vara svåra att identifiera i den ljusa fältdomänen vid låg förstoring. Vi rekommenderar att du fastställer det genomsnittliga fokusavståndet med en hög kopieringsnummer (HCN) plasmid, eftersom det är lätt att märka vid låg förstoring. Ställ in det genomsnittliga avståndet medan du mäter ett lågt kopieringsnummer (LCN) plasmid vid den höga förstoringen i förväg. Detta fokusavstånd beror främst på plattorna, mikroskopisystemet och oljan, och inte tjockleken på gel eller Escherichia coli-stam.
Vid anpassning av detta protokoll till andra laboratorier kan följande problem uppstå (1) Escherichia coli-plattor (prover) som framställs vid ett felaktigt utspädningsförhållande kan visa oföränderligt antal celler (figur 3 och figur 4) (2) Prover som bereds utan att plattan förseglas kan upp visa överdriven krympning. Detta kan observeras när celler driver (figur 3) eller orsakar förlust av fokus (Figur 5) (3) Vissa prover kan uppvisa långsamt skiftande "fasta" celler (i svart) på en bakgrund av simceller (i vitt). Detta beror sannolikt på ett vått prov och det stabiliseras vanligtvis eftersom överskottet av vatten absorberas av gelén (Kompletterande video 1) (4) Prover som inte uppvisar några celler efter några minuters uppvärmning kan ha förberetts felaktigt, sannolikt på grund av: (I) Gel hälldes medan fortfarande för varmt, (II) skyddslock glömdes bort, (III) minimal media saknar en ingrediens, (IV) felaktig celltäthet och (V) gel förseglades för hårt. Det är viktigt att stansa hål för att möjliggöra gasutbyte på bekostnad av gelkrympning (figur 5) och (VI) celler kan också dra in gelén på jakt efter näringsämnen, stapla den ena ovanpå den andra, kompromissa med cellmonalayern effektivt förhindra detektering av celler och mäta tillförlitlig fluorescerande signal (kompletterande figur 5).
Vi har mätt tre kretsar i det här arbetet. För det första en konstituerande promotor som reglerar GFP som visas i figur 6. För det andra, en konstituerande promotor som reglerar superfaldig GFP31 (sfGFP) som visas i figur 7. En ssrA nedbrytningstaggar (AAV) lades till sfGFP för att minska desshalf-livslängd till minuter5. Den tredje kretsen är baserad på en positivåterkopplingskrets 1, och induceras av acyl-homosin-lakonton (AHL). PluxR-promotorn reglerar sfGFP och LuxR, en transkriptionsfaktorbindning med AHL för att aktivera PluxR som visas i figur 8. Figur 9 visar dynamiken i celltillväxten (celltal kontra tid), figur 10 visar dynamiken hos den uppmätta signalen (genomsnittlig fluorescens kontra tid) och figur 11 visar dynamiken i utvärderat totalbrus (standardavvikelse (STD) jämfört med tid).
SNR (eller CV) används ofta vid utformningen av analoga elektroniska kretsar för att uttrycka precisionen och tillförlitligheten hoskretsen 32. CV avser distribution av signal mellan enstaka celler och möjliggör jämförelse mellan metoder och olika utrustningar som mikroskop och flödesanalysatorer. Genom att beräkna SNR från mikroskopbilder kan vi jämföra kretsar över tid, segmenterade celler mäts samtidigt som det ger ett mått på brusets specifika upplösning jämfört med signalen eller ett brusintervall under en viss tid och inducerkoncentration. Detta kan tyda på om detektorcellerna kommer att kunna lösa det exakta signalsvaret på inducerkoncentrationen. I det här arbetet beräknades CV: t genom att överväga alla segmenterade artefakter som är celler, oavsett cellprogressionen i divisionscykeln. SNR beräknades för specifika cellområdesområde över tid, och sedan var det i genomsnitt för tre upprepade experiment. Varken den förvärvade signalen eller köns könsföringen är tillförlitliga, eftersom de är specifika för det experiment och den utrustning som används. Signalen mäts med godtyckliga enheter som beror på utrustningsförinställning, fotodetektor och exponeringstid. De data som presenteras i figur 10 tyder på att cellernas fas i delningscykeln inte påverkar bullernivån, eftersom olika områdesintervall (punkter i indelningscykeln) visar samma trend. Denna iakttagelse kan stödja påståendet att spårning av exakta mor - dotterrelationer kan undvikas för att mäta buller och detta kan förbättra SNR för den presenterade metoden. Ingen väsentlig förändring av SNR observerades mellan GFP och sfGFP, vilket framgår av figur 12. Vi beräknar SNR (SNR= medelvärde/ STD) och presenterar det i figur 12 och figur 13.
Vi beräknade sedan variansen och CV:t baserat på följande ekvationer31
1.1
1.2
Om λ är proteinvikningstid är T celldelningstid, θ och μ är antalet plasmider före och efter uppdelningen, plasmidkopian nummer31. Med hjälp av ovanstående ekvationer (1.1 och 1.2) kan vi passa in data från flödesanalysatorns signal för gammafördelning.
Sedan jämförde vi mellan CV:t, som mäts och beräknas med flödesanalysator (figur 14), och med protokollet (Figur 15).
Bild 1: Ljus fältexponeringsbild (a) Stabiliserad anskaffning i ljust fält (b) Segmenteringsbild, endast färgade celler angerberäkningarna( c ) Pixel ljusstyrka karta över förvärvet, spik är bakgrundsljudet. Tröskelvärde av det segmenterar endast Escherichia coli. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Detta experiment visar bra friska celler som delar och reagerar efter 120 minuter. Bilderna förvärvades successivt med 20 minuters mellanrum. Kolonier är i fokus, gelen är stabil mellan provtagningarna. Kolonier delar upp sig och ger starka signaler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Effekter av felaktig utspädningsförhållande och gelkrymp på fluorescerande bild. Bilder förvärvades med 20 minuters mellanrum (a) Individuell Escherichia coli inringad i rött (b) Samma cell driver till höger om synfältet (c) Cellen driver vidare. Cellerna delar inte heller eller ändrar positioner, förmodligen på grund av ett lågt utspädningsförhållande och gel krympning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: I detta experiment upptäcktes ingen aktivitet och nästan inga celler fanns. Möjliga orsaker är att gelén är för varm, torkningen av provet är för aggressiv eller har inget skyddande lock (a) Fluorescerande bilder tagna vid 40 minuter (b) Fluorescerande bilder tagna vid 60 minuter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5:Fokusförlust och fotoblekning. På varandra följande bilderav ( a) till (d) förvärvades med 15 minuters tidsintervall med hjälp av autofokussystem. Se kompletterande video 2. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Plasmidkarta över Pteto som reglerar GFP. Utan TetR-repressorn fungerar PtetO-promotorn som en konstituerande promotor. Kretsen klonas på låga kopieringsnummerplasmider. Denna plasmid fungerar som grund för SNR-mätning för alla modifierade kretsar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:Plasmidkarta över Pteto som reglerar sfGFP. SfGFP är smält till en AAV-nedbrytningstag. Kretsen klonas på låga kopieringsnummerplasmider. Sf GFP-AAV är en mer robust variant av GFP, medan AAV-taggen gör den mottaglig för nedbrytning genom hushållningsproteaser av Escherichia coli. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 8:Plasmidkarta över positiv återkopplingskrets. Kretsen induceras av en AHL-inducerare, som binder LuxR-transkriptionsfaktor. P luxR-promotorn, som regleras av AHL-LuxR-komplexet, är aktiv i produktionen av LuxR och sfGFP-AAV. Kretsen klonas på låga kopieringsnummerplasmider. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9:Dynamiken i Escherichia coli MG1655 stamtillväxt i minimala medier inkluderar (a) PtetO-GFP, exponentiell tillväxt på cirka 35 minuter. Bilderna av detta experiment visas i figur 2 (b) PtetO-sfGFP, exponentiell tillväxt på cirka 35 minuter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 10:Fluorescerande intensitetsnivå, normaliserad per pixel och förvärvad med 20 minuters mellanrum.
Celler är lagerplatser enligt område för att minimera artefakter. Cellerna divideras med sitt område i en mikrometer kvadrat (a) Pteto-GFP krets förstaupprepning för intensitet vid 210 minuter är 0.004 a.u (b) PtetO-sfGFP krets första upprepning för intensitet vid 210 minuter är 0.022 a.u (c) Uppmätt signal av Pteto-GFP krets (d) Uppmätt signal av PtetO-sfGFP krets. Alla experimentella data representerar genomsnittet av tre experiment. Programvaran kan sortera cellområdet till olika grupper (a) och (b) visa grafer för fyra cellområdesintervall som representerar delningscykeln. Det första området på 14 mikrometer representerar celler efter uppdelning som mest sannolikt att celler efter uppdelning kommer att vara de minsta. Det andra området på 21 μm representerar celler före delning. Tredje och fjärde området representerar celler i divisionen eftersom den totala areapen multipliceras med två (29 och 36 μm) för att överväga celler som tog längre tid att dela. Områdena valdes genom att manuellt bedöma data som tittade på mikroskopibilder. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 11:Standardavvikelse (STD) för encellsfluorescensintensiteter för: a) PtetO-GFP-krets första upprepningen för könsceller vid 210 minuter är 0,001865 a.u (b) PtetO-sfGFP-krets första upprepningen för STD vid 210 minuter är 0.01477 a.u (c) STD av Pteto-GFP krets (d) STD av PtetO-sfGFP krets. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 12:SNR för encelliga fluorescensintensiteter. Vi beräknar SNR=Mean/STD (a) PtetO-GFP krets första upprepning för SNR vid 210 minuter är 1.309 a.u (b) PtetO-sfGFP krets första upprepning för SNR vid 210 minuter är 1.29 a.u (c) Tre repetitioner av GFP-mätning (d) Tre repetitioner av sfGFP-mätning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 13:SNR för encellsfluorescensintensiteter (a)PluxR-sfGFP-krets SNR för mättnadsrespons på AHL (b) PluxR-sfGFP-krets SNR för halvtidssvar på AHL. SNR för positiv feedback AHL-reglerad krets är högre än SNR för konstituerande sfGFP-krets. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 14: Histogram av genkretsarna baserade på flödesanalysatorn: experimentella data (blå) och stokastiska modelldata (röda). X-axeln representerar godtyckliga fluorescensenheter från flödescytometri, och y-axeln representerar frekvensen av celler som producerar motsvarande fluorescensnivå. Data mättes med hjälp av en flödesanalysator efter tre timmar. GFP fluorescens kvantifierades genom excitation vid en våglängd på 484 nm och utsläpp vid en våglängd på 510 nm. PE-TexasRed filterspänningar användes på en hög genomströmningsprovtagare för att mäta GFP-uttrycksnivåer. Flödesanalysatorspänningarna justerades med hjälp av programvara så att de maximala och lägsta uttrycksnivåerna kunde mätas med samma spänningsinställningar. Således användes konsekventa spänningar över varje hela experiment. Samma spänningar användes för efterföljande upprepningar av samma experiment. Monteringen gjordes med hjälp av gammafördelning31. Denna metod förutsätter att signalen främst beror på slumpmässig fördelning av plasmider (a) Mätning av Pteto-GFP-klon på låg kopieringsnummerplasmid. Experimentellt CV=0,46, Modell CV=0,32 (b) Mätning av Pteto-sfGFP-AAV klonad på lågt kopieringsnummer plasmid. Experimentellt CV=0,86, Modell CV=0,44. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 15: Histogram av genkretsarna baserade på mikroskop: experimentella data (prickade linjer) och stokastiska modelldata (heldragna linjer). X-axeln representerar godtyckliga fluorescensenheter från inverterat mikroskop och y-axeln representerar frekvensen av celler som producerar motsvarande fluorescensnivå. Monteringen gjordes med MATLAB gammafördelning31,32 (a) Mätning av PtetO-GFP klon på lågt kopieringsnummer plasmid (b) Mätning av PtetO-sfGFP-AAV klonad på lågt kopieringsnummer. Jämförelsen visar att vårt protokoll erhåller liknande CV-värden som i flödesanalysatorexperiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Fyra utspädningsförhållanden, mellan 1:500 och 1:20, för MG1655-stammen. Diagrammet visar att om den initiala densiteten är hög är LB-näringsämnen rikliga vilket resulterar i att celler delar sig snabbare. För en utspädning på 1:500 förblev celltätheten konstant. För en utspädning på 1:100 ökade celltätheten långsamt. För en utspädning på 1:50 ökade celltätheten med måttlig delningshastighet utan betydande dröjsmål vid inkubation av varvtal. För en utspädning på 1:20 nådde celltätheten mättnad snabbt. Vi valde ett utspädningsförhållande på 1:30, vilket möjliggör kort inkubation för att nå exponentiell tillväxt och betydande divisionsintervall för att uppnå hög mättnad i måttlig divisionshastighet. Klicka här för att ladda ner den här siffran
Kompletterande figur 2: Bearbetning av ljusa fältbilder. a)Bilder av rå dataintensitet från den ljusa fältkanalen från mikroskopsystemet. b) Kontrastförstärkning av bilden för att förbättra separationen av cellobjekt från bakgrunden. c)Cellgränsigenkänning baserad på faltningsfilter33 och binariseringsbaserat globalt tröskelvärde34. d)Morfologiska35 åtgärder för att stänga och fylla för att identifiera cellkolonigränser. Klicka här för att ladda ner den här siffran
Kompletterande figur 3: Cellkolonibakgrund\förgrundssegmentering. För att minimera påverkan av bullret försöker vi identifiera cellkolonigränser och extrahera dem från gelljudet. (a) Avbildnings binariseringsåtgärd på kontrastförbättring baserad på adaptiv tröskel för att identifiera cellobjekt36. b)Matrisförmultning av matriser som presenteras vid S2d och S3a och som framgångsrikt filtrerar bort de flesta ljud och differentierar gelljud från celler. Vissa gränser är inte helt lösta. c)Identifiering av cellgränser med hjälp av en vattendelarealgoritm 37 baserad på avståndstransform38. d)Matrismultiplikation av matriser som presenteras vid S3b och S3c och som framgångsrikt löser enstaka celler. Klicka här för att ladda ner den här siffran
Kompletterande figur 4: Segmentering av en cell. a)Segmenterad produkt med ljusfältsbild. Ytterligare rengöring är förformad baserat på cellområdesging och form, kasserar runda bubblor. b)Fluorescenssignalbilder från mikroskop. c)Matris multiplation av matriser som presenteras vid S4a och S4b framgångsrikt extrahera signalen av enstaka celler. Klicka här för att ladda ner den här siffran
Kompletterande figur 5: Förlust av monoskikt. a)Ljus fältbild av ett celllager på 840 minuter (14 timmar) Pteto som reglerar GFP-kretsen som visas i figur 2 i artikeln som ett bra experiment. På höger sida av mikroskopibild kan förlust av monoskikt detekteras. (b) Bild av programvarusegmentering. På grund av förlust av monolayerceller är fragmenterade och kommer att rengöras bas på område gating. (c)Fluorescensbild som visar att på bildens högra sida kan inga celler lösas och en låg signal av celler på bildens vänstra sida på grund av förlust av monoskikt. (d) Segmenteringsbild kombinerad med fluorescensbild. Klicka här för att ladda ner den här siffran
Kompletterande video 1. Klicka här för att ladda ner den här videon
Kompletterande video 2. Klicka här för att ladda ner den här videon
Kompletterande video 3. Klicka här för att ladda ner den här videon
cell_growth_rate_fit.m. Klicka här för att ladda ner den här filen
compare_experiments.m. Klicka här för att ladda ner den här filen
Count_Cells.m. Klicka här för att ladda ner den här filen
main_code.m. Klicka här för att ladda ner den här filen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete utvecklade vi ett protokoll som möjliggör datorspårning av Escherichia coli levande celler, efter uppdelning och fluorescerande nivåer under en period av timmar. Detta protokoll gör det möjligt för oss att kvantifiera den stokastiska dynamiken hos genetiska kretsar i Escherichia coli genom att mäta CV och SNR i realtid. I det här protokollet jämförde vi stokastiska beteenden hos två olika kretsar som visas i figur 10. Det har visat sig att plasmider med låga kopieringsnummer är mer benägna att stokastiska effekter och mindre påverkade av celldelning. Den första kretsen uttrycks konstituerande GFP (figur 10a) och den andra kretsen uttrycks konstituerande sfGFP smält till en ssrA-nedbrytningstag(figur 10b). För att kvantifiera det stokastiska beteendet hos fluorescerande proteiner spelade vi också in de ljusa fältbilderna. Resultaten visar att GFP: s uttryck, särskilt vid mognaden39, är den dominerande bullerkällan. Det periodiska sågtandsbeteendemönstret som observerats i figur 10a kan förklaras av den slumpmässiga processen för celldelning och den långvariga skalan av GFP-mognad (~ 50 minuter). Däremot stabiliserades sfGFP-signalen för den andra kretsen under mätningen, eftersom den mycket korta mognadstiden för sfGFP (~ 6 minuter). Vi utvecklade en enkel formel som beskriver nivån av GFP i båda kretsarna när vi bara överväger processen för celldelning och GFP mognadstid. Vid en given tidpunkt, t, antar vi att det finns x kopieringsnummer av proteiner och μ kopierar antal plasmider. Proteinkopienumret kan beskrivas av:
1.3
1.4
När man endast överväger divisionshändelser; 
efter proteinmognad och så för de specifika plasmiderna får vi:
För GFP ( 
): 1,5
För sfGFP ( 
):1.6
Sedan den utvecklade serien av sfGFP:
1.7
I det fallet 
får vi 
. Detta resultat kan förklaras på följande sätt. När x är litet ökar sfGFP-nivåerna med en liten mängd. När x är stort försämras sfGFP till ett stabilt tillstånd. På samma sätt, för kretsen av GFP, innehåller varje cell cirka 10 enheter GFP, men eftersom mognadstiden för GFP är längre än mitosen observeras förnedrande sågtandmönster av fluorescensintensiteter. I modellen antog vi att replikeringen av plasmiden är tillräckligt snabb för att plasmidfördelningen förblir konstant före och efter uppdelningen. SsrA-nedbrytningstaggen minskar ofta proteinhaltiden från timmar till mindre än en timme5 och leder till ett snabbt stabilt tillstånd. Vi visade att metoden också ger en fördelning som liknar den som mäts med en hög populationsflödesanalysator och att CV:t för denna distribution är lika med eller mindre än flödesanalysatorn CV.
Medan flera metoder3,7,18 utvecklades för levande cellavbildning, är metoden som presenteras här skräddarsydd specifikt för Escherichia coli. Denna bakterie kräver ett speciellt medium och ett något annorlunda tillvägagångssätt. Protokollet har följande viktiga egenskaper: (1) Fastställande av ett utspädningsförhållande som är specifikt för bakterierna och stammen i början av exponentiell tillväxt snarare än i mitten (exponentiell tillväxt utan skakningar) (2) Escherichia coli bäst dela vid 37 °C, men vid 37 °C förlorar den minimala mediegelen vatten snabbt vilket leder till krympning och instabilitet. Protokollet här övervinner denna utmaning (3) Vi applicerar först bakterieprovet och förseglar det sedan med flytande gel. Eftersom provet är instängt mellan glasbotten och gelen behöver vi en gel som (I) tillåter gasutbyte för att undvika att skära luftfickor, (II) förblir flytande vid låga temperaturer eftersom Escherichia coli är känsliga för värme och (III) ser till att provet inte blandas inuti vätskegelen. Gelén förblir flytande vid 37 °C, men vi rekommenderar användning av ett skyddslock ovanpå provet för att undvika överdriven värme- och provblandning inuti gelén (4) Detta tillvägagångssätt kräver enkel, generisk utrustning (5) Prover kan mätas direkt utan förvärmning, så det finns ingen förlust av divisionshändelser (6) Protokollet, som inkluderar våtlabbstegen och den anpassade automatiserade programvaran, kan användas för att studera det stokastiska beteendet hos genetiska kretsar som kvantifiering av SNR och CV för kretssignaler. Vi jämförde mikroskopimetoden med flödesanalysresultat för att validera användningen av små populationer av celler och upprätta en baslinje för jämförelse enligt CV (7) Programvaran gör det möjligt för oss att upptäcka celler på monoskiktet utan mänsklig inblandning och analysera totalt buller. Programvaruverktyg som ImageJ18 eller Schnitzcells kräver manuell identifiering av celler och är utmanande för justeringar.
När du kontinuerligt avbildar levande cellkolonier, utforma experimentet samtidigt som du överväger flera komplexa fysiska parametrar, såsom cellulär stress och toxicitet, resursbrist, nekros och nedbrytningstid för inducerare och kemikalier. Protokollet möjliggör tillförlitlig mätning på upp till fem timmar. Våra experiment tyder på att Escherichia coli synkroniseras när man delar i mikro, monolayer kolonier (Kompletterande Video 3). Vi antar att gelén är enhetlig när det gäller resurser och seghet, cellerna har liknande beteende och belysningsområdet är något större från synfältet. Således bör varje cell producera samma signal och statistiska data, som kan samlas in som vi har visat genom att jämföra CV som erhållits på detta sätt till mätning med en flödesanalysator. För att mäta buller vid konstanta initiala förhållanden under längre tidsperioder kommer vi att överväga att använda mikrofluidchips i framtiden. Ytterligare fördelar med en sådan anordning är att upprätthålla fasta positioner av celler och stabilt fokus10. Ändå kräver design, tillverkning av mikrofluidiska chips och priming för experiment utbildning, specifik utrustning (skräddarsydd ibland) och tid. Av denna anledning är det fördelaktigt att använda tidsfördröjningsmikroskopi som visas i detta protokoll för att få en allmän förståelse för kretsen.
Det föreslagna protokollet och den utvecklade programvaran möjliggör reproducerbara mätningar, från vilka det är enkelt att härleda grafer. Det möjliggör också testning och jämförelse av totalt buller och kan modifieras för att mäta inneboende och extrinsiskt buller. Metoden är baserad på generiskt eller lättbeställningsmaterial, öppet delat, lättanvänd programvara och kräver ingen specifik utbildning. Vi har visat att populationen mätt med mikroskopi är tillräckligt stor för att få meningsfulla data genom att jämföra metod-CV med den som erhålls med en flödesanalysator. Därför kan vi framgångsrikt upprätta en SNR-baslinje med hjälp av detta protokoll och jämföra det med mer komplexa genkretsar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Gil Gelbert (Fakulteten för elektroteknik, Technion) för att ha hjälpt till med MATLAB-koden. Vi tackar Dr. Ximing Li (Fakulteten för biomedicinsk teknik, Technion) för att ha hjälpt till med att bevisa den här artikeln. Denna forskning stöddes delvis av Neubauer Family Foundation och Israel Ministry of Science, grant 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al.
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V.
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E.
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
