Summary
Dit werk presenteert een microscopiemethode die live beeldvorming van een enkele cel Escherichia coli mogelijk maakt voor analyse en kwantificering van het stochastische gedrag van synthetische gencircuits.
Abstract
Het hier ontwikkelde protocol biedt een hulpmiddel om computertracking van Escherichia coli-deling en fluorescerende niveaus gedurende meerdere uren mogelijk te maken. Het proces begint met het screenen op kolonies die overleven op minimale media, ervan uitgaande dat alleen Escherichia coli die de juiste plasmide herbergt, in staat zal zijn om te gedijen in de specifieke omstandigheden. Omdat het proces van het bouwen van grote genetische circuits, waarvoor de assemblage van veel DNA-onderdelen vereist is, een uitdaging is, worden circuitcomponenten vaak verdeeld over meerdere plasmiden op verschillende kopieernummers die het gebruik van verschillende antibiotica vereisen. Mutaties in de plasmide kunnen transcriptie van de antibioticaresistentiegenen vernietigen en interject met middelenbeheer in de cel die leidt tot necrose. De geselecteerde kolonie is ingesteld op een petrischaal met glazen bodem en een paar focusvlakken zijn geselecteerd voor microscopietracking in zowel heldere veld- als fluorescerende domeinen. Het protocol handhaaft de beeldfocus gedurende meer dan 12 uur onder initiële omstandigheden die niet kunnen worden gereguleerd, waardoor een paar problemen ontstaan. Dode cellen beginnen zich bijvoorbeeld op te hopen in het scherpstelgebied van de lenzen na een paar uur beeldvorming, waardoor gifstoffen zich ophopen en het signaal vervaagt en vervaagt. Uitputting van voedingsstoffen introduceert nieuwe metabolische processen en belemmert de gewenste reactie van het circuit. De temperatuur van het experiment verlaagt de effectiviteit van inductoren en antibiotica, wat de betrouwbaarheid van het signaal verder kan schaden. De minimale mediagel krimpt en droogt, waardoor de optische focus in de loop van de tijd verandert. We ontwikkelden deze methode om deze uitdagingen in Escherichia colite overwinnen , vergelijkbaar met eerdere werken die analoge methoden voor andere micro-organismen ontwikkelden. Bovendien biedt deze methode een algoritme om de totale stochastische ruis in ongewijzigde en gewijzigde cellen te kwantificeren, waarbij wordt vastgesteld dat de resultaten consistent zijn met voorspellingen van stroomanalysatoren, zoals aangetoond door een vergelijkbare variatiecoëfficiënt (CV).
Introduction
Synthetische biologie is een multidisciplinair gebied dat in het afgelopen decennium is ontstaan en tot doel heeft technische ontwerpprincipes te vertalen naar rationeel biologisch ontwerp1,2,3, in een poging om multi-signaalintegratie en -verwerking in levende cellen te bereiken voor het begrijpen van de basiswetenschap4,5, diagnostische, therapeutische en biotechnologische toepassingen6,7,8,9,10. Ons vermogen om de input-output respons van synthetische gencircuits te kwantificeren is revolutionair veranderd door recente vooruitgang in eencellige technologie, waaronder de flow analyzer en live cell imaging met behulp van geautomatiseerde time-lapse microscopie11. Een stroomanalysator wordt vaak gebruikt om de respons van deze circuits in de steady state1,12te meten , en omgekeerde microscopie wordt gebruikt om de dynamische respons van synthetische gencircuits op het niveau van een enkele cel te meten3. Een van de vroege werken in de synthetische biologie betrof bijvoorbeeld de bouw van genetische oscillatornetwerken in levende cellen met behulp van negatieve feedbacklussen met een vertraging3. Later werden de genetische oscillatorcircuits toegepast om de metabolische controle in de dynamische omgeving van levende cellen te begrijpen4. Geautomatiseerde time-lapse microscopie is een methode om dergelijke circuits te karakteriseren. We veronderstellen dat de gastheercellen, Escherichia coli,synchroniseren bij het vormen van microkolonies, waardoor het meten van signaal en berekening van ruis mogelijk is zonder exacte moeder-dochterrelaties te volgen.
Lawaai is een fundamenteel, inherent aspect van biologische systemen die vaak uit meerdere bronnen voortkomen. Denk bijvoorbeeld aan biochemische reacties met signalen die afkomstig zijn van het transport van discrete willekeurige dragers, zoals diffusie van eiwitten13. Deze signalen verspreiden zich met willekeurige fluctuaties14. Andere geluidsbronnen zijn de beschikbaarheid van hulpbronnen, celdeling en variaties in omgevingsomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid en druk. Biologische signalen die zich voortplanten in synthetische gencircuits hebben vaak een zeer lage signaal-ruisverhouding (SNR), wat de prestaties van dergelijke circuits verstoort. Daarom blijft het ontwerp van genetische circuits een van de meest uitdagende aspecten van genetische manipulatie15. In tegenstelling tot de meeste benaderingen die alleen de gemiddelde genexpressie berekenen (gemeten over de gehele celpopulatie), wordt bijvoorbeeld de variantie van het gemeten signaal overwogen om voorspelbaar gedrag te ontwikkelen via synthetische gennetwerken12. Als zodanig spelen de variabiliteits - of ruisniveaus in de eiwitexpressie een dominante rol bij het ontwerp en de prestaties van analoge en digitale gencircuits1,16,17.
Er zijn vele benaderingen ontwikkeld om de variabiliteit tussen cellen te kwantificeren, onder meer in Escherichia coli3,7,18. Deze methoden worden vaak gebruikt om genactivatie en metabole routes te bestuderen, maar met minder focus op de studie van stochastische geluidsdynamica, zoals het meten en ontwarren van specifieke geluidsbronnen, vooral voor genetische circuits in levende cellen waar dit een fundamentele uitdaging is19,20,21. Verschillende factoren, zowel overgeërfd aan het circuit zelf (intrinsiek) als afgeleid van de gastheercellen (extrinsiek), kunnen de continue prestaties van genetische circuits verstoren. In dit artikel hebben we een protocol ontwikkeld dat tot doel heeft het totale geluid in Escherichia coli-cellen te kwantificeren, inclusief de intrinsieke en extrinsieke geluidsbronnen6,22. Door het totale geluid te kwantificeren en vervolgens de SNR23te evalueren, kan het ontwerp van gencircuits worden verbeterd. Deze methode kan worden aangepast om onafhankelijke geluidsbronnen afzonderlijk te meten, door verschillende fluorescerende eiwitten6,20temonitoren . Voor het hier beschreven protocol houden we de omgevingsomstandigheden goed onder controle en meten we continu de activiteit van cellen zonder invloed van externe factoren. We meten het signaal van fluorescerende eiwitten in enkele cellen in de loop van de tijd en stellen ze tegelijkertijd in beeld onder een agarosesubstraat. De resulterende beelden worden geanalyseerd met behulp van het aangepaste MATLAB van het laboratorium.
Idealiter zal continue meting van de real-time activiteit van fluorescerende eiwitten in een cel nauwkeurige gegevens produceren door de groei en deling van de cellen. Het is echter een uitdaging om dergelijke gegevens te verkrijgen. Dit komt door afbraak van fluorescerende eiwitten, bekend als fotobleken7, wanneer ze worden blootgesteld aan straling in het excitatieproces. Bovendien zijn Escherichia coli-cellen ook gevoelig voor de excitatie, wat kan leiden tot fototoxiciteit7. Beide kwesties beperken de hoeveelheid fotolijsten die kunnen worden verkregen en de tijd tussen verwervingen. Ook het substraat en de mediumtypes (bijv. lysogeney bouillon) die worden gebruikt om de cellen tijdens beeldvorming te laten groeien, spelen een cruciale rol. We raden ten zeerste aan om minimaal medium te gebruiken, dat de niet-fluorescerende achtergrond minimaliseert en de celdelingstijd verlengt.
Bovendien moet het monster worden bereid met inachtneming van de volgende vereisten (1) Een lage celdelingsgraad maakt minder frequente blootstellingen mogelijk om de delingcyclus nauwkeurig in beeld te brengen en de kans op fototoxiciteit en fotobleaching te verminderen. We hebben de acquisitietijd ingesteld op ongeveer de helft van de voorspelde mitosetijd (2) Lage celdichtheid aan het begin van het experiment zorgt voor een betere uniformiteit en trackability van deling. De celdichtheid wordt beïnvloed door de verdunningsverhouding van de Escherichia coli-cellen, wat een belangrijke parameter is voor het succes van dit protocol en voor elk laboratorium moet worden bepaald. Om de verhouding vast te stellen, moet elke nieuwe Escherichia coli-stam of -medium die wordt gebruikt, worden uitgerust met groeisnelheidsgrafieken (aanvullende figuur 1). Een geschikte verhouding is bereikt als cellen kunnen groeien zonder extra schudden na een korte incubatie van een initiële dichtheid van ongeveer OD600nm = 0,1. Cellen in deze fase zullen zich alleen delen afhankelijk van de omgevingstemperatuur (3) Beperking van celbeweging: celbeweging is sterk afhankelijk van de stevigheid van substraat (agarose pad). De stevigheid van het substraat hangt af van de hoeveelheid totale agarose en de gelstollingstijd. Gels kunnen niet 's nachts bij kamertemperatuur worden gestold, omdat de Escherichia coli mitose zal ondergaan. Andere factoren die de substraatstabiliteit beïnvloeden, zijn de hoeveelheid water in het monster en de vochtigheid. Aanvullende kwesties worden in detail besproken in de representatieve resultaten. Dit protocol biedt veel details en gaat geleidelijk van de ene stap naar de andere. Het protocol biedt lange stabiliteit voor beeldvormingsexperimenten en biedt een basistool voor beeldverwerking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media- en cultuurvoorbereiding
- Bereid stamoplossing van 1.000x carbenicilline (50 mg/ml) of relevant antibioticum.
- . Weeg 0,5 g carbenicilline. Voeg 10 ml steriel H2O. Volledig oplossen toe.
- Steriliseer de carbenicillinevoorraad via een spuitfilter van 0,22 μm. Aliquot de antibiotica-oplossing en bewaar bij -20 °C.
- Voor het bereiden van lysogene bouillon (LB) platen, meng 5 g trypton, 5 g NaCl, 2,5 g gistextract en 7,5 g Bacto agar met 0,5 L steriel h2O. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C gedurende 20 minuten.
- Dompel de gesmolten gelmix gedeeltelijk onder in een waterbad van 50 °C. Voeg 1.000 μL carbenicilline (50 mg/ml) toe.
- Bereid Petrischalen in een steriele omgeving. Laat de borden inzetten voordat je ze in de koelkast bewaart.
- Bereid voor minimale M9-media afzonderlijke voorraadoplossingen van het volgende: 5x M9-zouten (56,4 g/L), 2 M glucose en 2% biotinevrije casaminozuren. Autoclaaf de oplossingen bij 121 °C gedurende 20 min.
- Om 5 Petri-platen te bereiden, mengt u 1125 mg laagsmeltende agar en 400 mg agar met 89,2 ml minimale media (1x M9). Voeg 10 ml 2% casaminozuren (2% [vol/vol]) toe in een Erlenmeyerkolf van 250 ml.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de media op de binnenlippen van de kolf giet. - Magnetron de oplossing in korte bursts van 3 tot 4 seconden. Herhaal dit totdat de oplossing duidelijk is.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het kookpunt niet bereikt. - Plaats de Erlenmeyerkolf van 250 ml in een warmwaterbad (60 °C) om verder te mengen door diffusie en laat afkoelen tot de temperatuur daalt tot ongeveer 45-50 °C.
- Steek de vlam aan op de bord-gietbank.
- Voeg snel alle oplossingen toe in de volgende volgorde:
800 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
100 μL thiamine (B1)
1100 μL glucose (2 M)
100 μL carbenicilline (50 mg/ml). - Wervel de Erlenmeyer om een gelijkmatige verdeling van alle ingrediënten door de agar te garanderen.
- Open één bord tegelijk naast de vlam en begin te gieten.
- Laat de platen een paar minuten op de bank liggen tot de eerste stolling.
- Draai de platen ondersteboven om te voorkomen dat er watercondensatie op de gel druipt.
- Laat de platen ongeveer 2 uur stollen bij kamertemperatuur.
- Zodra de platen gestold en gedroogd zijn, kunnen ze ongeveer 3 maanden bij 4 °C worden bewaard.
2. Bacteriestammen en plasmiden constructie
OPMERKING: Het genetische circuit bevat één deel; een groen fluorescerend eiwit (GFP) aangedreven door een PtetO promotor resulterend in constitutieve expressie. Alle plasmiden in dit werk werden geconstrueerd met behulp van basismoleculaire kloontechnieken en werden omgezet in Escherichia coli 10β, met behulp van een standaard hitteschokprotocol24. De uiteindelijke constructie werd omgevormd tot Escherichia coli MG1655 wilde type stam om te testen.
- Transformeer de gewenste plasmide in Escherichia coli MG1655 cellen met het standaard hitteschokprotocol24.
- Kweek de getransformeerde cellen 's nachts op een LB-agarplaat bij 37°C.
OPMERKING: Het is mogelijk om de Petrischalen vanaf stap 2.2 tot 3 dagen te bewaren voor gebruik met microscopie. - Ent een enkele kolonie in 5 ml LB bouillon aangevuld met de relevante antibiotica in een glazen buis.
- Kweek cellen bij 37 °C met een schudsnelheid van 250 tpm in de incubator gedurende 2 uur totdat de vloeistof troebel is.
- Bereid 1 ml verdunningsoplossing als volgt:
892 μL minimale media (1x M9)
8 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
100 μL 2% Casamino zuren (0,2% [wt/vol])
1 μL thiamine (B1)
11 μL glucose (2 M)
1 μL relevante antibiotica- Mix en draai naar beneden.
- Verdun de celkweek (1:30) van stap 2.4 in een buis van 2 ml door 30 μL Escherichia coli-groei toe te voegen aan 1000 μL verdunningsoplossing (stap 2.5).
- Incubeer de buis gedurende 1 uur met schudden (250 tpm) bij 37 °C.
- Kweek 40 μL - 60 μL op M9 platen bereid in stap 1.10. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
OPMERKING: De optische dichtheid (OD600nm)voor beplating moet ongeveer 0,1 zijn. - Plaats tot drie glazen bodemplaten van 35 mm op de bank.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het glas van de plaat de juiste dikte heeft voor de gebruikte microscooplenzen. - Bereid de kweek voor op zaaien op gelplaten, herhaal stap 2.3 tot 2.6 voor kolonies van plaat bereid bij stap 2.9 microscoopmetingen.
- Bereid de volgende oplossing voor om drie microscoopplaten te maken.
- Verwarm het waterbad voor op 60 °C.
- Meng 112,5 mg laagsmeltende agar en 40 mg agar met 8,92 ml minimale media (1x M9) en voeg 1 ml 2% casaminozuren (0,2% [vol/vol]) toe in een Erlenmeyerkolf van 25 ml.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de media op de binnenlippen van de kolf giet.
- Magnetron de oplossing in korte bursts van 2 tot 3 seconden. Herhaal dit totdat de oplossing duidelijk is.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het kookpunt niet bereikt. - Plaats de Erlenmeyerkolf van 25 ml in een warmwaterbad (60 °C) om verder te mengen door diffusie en laat afkoelen op de bank totdat de temperatuur daalt tot ongeveer 45-50 °C.
3. Bereiding van agarose pads
- Schone bank met 70% ethanol. Stretch tape op de schoongemaakte bank. Zorg ervoor dat de tape glad en waterpas staat.
- Bereid twee coverslips voor: een op de tape en een tweede in de buurt. Maak een deksel klaar.
- Haal de kolf (bereid bij stap 2.14) uit het waterbad, veeg de buitenkant van de kolf schoon en laat afkoelen tot de temperatuur daalt tot ongeveer 45-50 °C.
- Om de geloplossing te maken, mengt u snel alle oplossingen in de volgende volgorde:
80 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
1 ml 2% casaminozuren (0,2% [wt/vol])
10 μL thiamine (B1)
110 μL glucose (2 M)
10 μL relevante antibiotica. - Giet 1,5 ml van de gel op de afdeklip en bedek deze met het tweede stuk dat een "sandwich" maakt.
- Breng de Erlenmeyer terug naar het warmwaterbad. Bedek de sandwich met het deksel en stel de timer in op 20 minuten.
- Incubeer tegelijkertijd de buis vanaf stap 2.11 gedurende 1 uur bij 37 °C met schudden (250 tpm)
- Draai na 20 minuten de sandwich (stap 3.5) om, dek af en laat 1 uur rusten.
OPMERKING: Laat de "sandwich" voor een beter resultaat rusten op 4 °C voor de duur van stap 3.8. - Zaad Escherichia coli kweek vanaf stap 3.7 door het monster op de 35 mm schaal te pipetten.
OPMERKING: 6 μL cellen als afzonderlijke kleine druppels pipetten geeft de beste resultaten. - Laat de druppels minstens 15 minuten en maximaal 30 minuten drogen.
- Stel de gestolde gel van de sandwich vanaf stap 3.8 bloot door de deksels weg te schuiven.
- Snijd sandwich in kleine individuele pads met biopsie punch of tip.
- Leun het voorzichtig op het monster (stap 3.9). Laat het gerecht 20 minuten op de bank staan.
4. Voorbereiding van het monster voor microscopie beeldvorming
- Haal de kolf uit het waterbad vanaf stap 3.6. Veeg de buitenkant van de kolf schoon en laat afkoelen tot kamertemperatuur (25 °C).
OPMERKING: Verwijder de kolf bij stap 4.1 ongeveer 3 minuten voordat de timer eindigt. - Giet 3 ml van de gel constant in een cirkelvormige beweging naar de omtrek van de plaat. Laat een paar minuten stollen.
- Sluit platen af met tape en prik verschillende gaten met een naald van 25 G. Draai alle borden om te voorkomen dat er watercondensatie op de gel druipt.
- Incubeer alle gerechten gedurende 30 minuten op 4 °C om volledige stolling mogelijk te maken en tegelijkertijd cel mitose te voorkomen.
OPMERKING: Laat monsters bij 4 °C voor opeenvolgende metingen, niet meer dan één dag. - Start de microscoop volgens de instructies van de fabrikant.
- Zoek de initiële scherpstelling met behulp van de laagste versterkingslens en schakel het automatische scherpstelsysteem (AFS) in.
- Gebruik indien nodig olie, verdrink de lens met olie en spreid deze voorzichtig uit door de plaat met een platformcontroller (niet handmatig) te verplaatsen en AFS kan weer worden ingeschakeld.
- Gebruik relatieve doorsnede in Z-richting, volgens de standaardsuggestie voor Z-stapdoorsneden.
OPMERKING: We maakten elke 5 minuten heldere veldafbeeldingen en elke 20 minuten fluorescerende beelden. Soms moet de focus gedurende de eerste 30 minuten worden aangepast. Het voorverwarmen van de microscoop incubator box en olie, terwijl het koelen van het monster heeft de neiging om te helpen verminderen het aanvankelijke verlies van focus.
5. Gegevensanalyse
OPMERKING: Om microscopiegegevens te verwerken, hebben we een computergebaseerde software in MATLAB ontworpen. Deze software vergemakkelijkt de identificatie van celgrenzen van heldere veld tiff afbeeldingen en segmenten en sorteert cellen per gebied. De uitvoer van deze beeldanalyse kan worden gebruikt als een masker op fluorescerende tiff-afbeeldingen om celintensiteitsniveaus af te leiden en artefacten in het fluorescerende domein te annuleren, zoals celhalo vanwege de beperkingen van de microscoopresolutie. De ontwikkelde software is geïnspireerd op vergelijkbare werken7,25,26,27,28,29,30 en biedt een elegante oplossing op maat van het lab.
- Definieer eerst de volgende parameters in main_code.m.
- Definieer de map van de acquisitieafbeeldingen.
- Definieer de beeldtijdperiode - heldere veldkanaaltijd stap in minuten.
- Definieer de GFP-frequentie - snelheid van verwerving van GFP-afbeeldingen.
- Definieer de microscoopresolutie (d.w.z. hoeveel pixels gelijk is aan 1 μm).
- Definieer histogram bin range - cell area range.
OPMERKING: Het proces van het classificeren van de gegevens op basis van het celgebied is vergelijkbaar met de principes van gating in flow cytometrie data-analyse. Poorten worden geplaatst rond populaties van cellen met gemeenschappelijke kenmerken, meestal naar voren verspreid en zij verspreid, om deze populaties van belang te isoleren en te kwantificeren. Microscopie maakt het mogelijk om verschillende celgroepen te gaten, te onderzoeken en te kwantificeren. - Convolutie kernel definiëren (3,3) - deze parameter detecteert celgrenzen door globale drempelwaarden (count_cells.m).
OPMERKING: Deze opstelling is alleen nodig bij het veranderen van het lab of de microscoop. Software vereist dat het ingangs heldere veldkanaal wordt gelabeld met index c1, fluorescentiekanaal gelabeld als c2.
- Voer main_code.muit , waarmee alle andere scripts automatisch worden uitgevoerd(count_cells.m cell_growth_rate.m).
- Programma segmenteert automatisch heldere veldafbeeldingen (zie aanvullende figuur 2-4).
- Combineer de segmentatieafbeelding met fluorescerende afbeelding (GFP) om het intensiteitsniveau per cel te extraheren.
- Bereken de grafiek van het aantal cellen op tijd en fit op basis van exponentiële groei.
- Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie (SOA) voor elk celgebiedsbereik.
- Bereken de signaal-ruisverhouding (SNR) voor elk celgebiedsbereik.
- Plot en pas de verdeling van de hoeveelheid cellen op intensiteit.
- Bereken de variantiecoëfficiënt (CV) en vergelijk met flow analyzer data.
OPMERKING: Software geeft als uitvoer de uiteindelijke segmentatieafbeeldingen voor het aanpassen van conv_kernel in een nieuwe map "yourfolder/Segmented". Software geeft als uitvoer de grafieken in een nieuwe map "yourfolder/Graphs.
- Gebruik compare_experiments.mom tussen experimenten te vergelijken.
- Definieer mappen voor de opgeslagen grafieken en het adres voor de map \CompareResult.
- Voer het bestand uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De software analyseert heldere velddomeinafbeeldingen die niet wit en zwart zijn. De Escherichia coli zal eruit zien als zwarte langwerpige vormen op een off-white achtergrond en dynamisch luminantiebereik moet een piek in het midden laten zien (Figuur 1). In fluorescerende beelden kunnen cellen een kleine halo hebben, maar individuele cellen met langwerpige vormen kunnen nog steeds worden opgelost. Een mitosegebeurtenis moet eerst na 30 minuten worden gedetecteerd. De focus van de microscoop moet na verloop van tijd stabiel blijven en hoewel cellen in die 30 minuten langzaam kunnen bewegen, is het onwaarschijnlijk dat ze het gezichtsveld verlaten. Een dergelijk experiment zal als goed worden beschouwd en kan worden bekeken in figuur 2. Cellen zijn mogelijk moeilijk te detecteren in het heldere velddomein bij een lage vergroting. We raden aan om de gemiddelde scherpstelafstand vast te stellen met een hoog kopieergetal (HCN) plasmide, omdat het gemakkelijk op te merken is bij een lage vergroting. Stel vooraf de gemiddelde afstand in terwijl u een laag kopieergetal (LCN) plasmide meet bij de hoge vergroting. Deze scherpstelafstand hangt voornamelijk af van de platen, het microscopiesysteem en olie, en niet van de dikte van gel of Escherichia coli-stam.
Bij de aanpassing van dit protocol aan andere laboratoria kunnen de volgende problemen optreden (1) Escherichia coli-platen (monsters) die met een onjuiste verdunningsverhouding zijn bereid, kunnen onveranderlijke aantallen cellen vertonen (Figuur 3 en Figuur 4) (2) Monsters die zijn bereid zonder de plaat af te dichten, kunnen overmatige krimp vertonen. Dit kan worden waargenomen als cellen afdrijven (figuur 3) of een verlies van focus veroorzaken (figuur 5) (3) Sommige monsters kunnen langzaam verschuivende 'vaste' cellen (in zwart) vertonen op een achtergrond van zwemcellen (in wit). Dit is waarschijnlijk te wijten aan een nat monster en het stabiliseert meestal als het overtollige water wordt geabsorbeerd door de gel (Aanvullende Video 1) (4) Monsters die geen cellen vertonen na een paar minuten opwarmen, kunnen verkeerd zijn bereid, waarschijnlijk als gevolg van: (I) Gel werd gegoten terwijl het nog te warm was, (II) beschermkap werd vergeten, (III) minimale media mist een ingrediënt, (IV) onjuiste celdichtheid en (V) gel werd te strak verzegeld. Het is belangrijk om gaten te ponsen om gasuitwisseling mogelijk te maken ten koste van gelkrimp (figuur 5) en (VI) cellen kunnen de gel ook inspringen op zoek naar voedingsstoffen, de ene bovenop de andere stapelen, de celmonolaag effectief in gevaar brengen om detectie van cellen te voorkomen en betrouwbaar fluorescerend signaal te meten (Aanvullende figuur 5).
We hebben drie circuits gemeten in dit werk. Ten eerste, een constitutieve promotor die GFP reguleert zoals weergegeven in figuur 6. Ten tweede, een constitutieve promotor die supervouwen GFP31 (sfGFP) reguleert, weergegeven in figuur 7. Een ssrA-degradatietag (AAV) werd toegevoegd aan sfGFP om dehalflevensduur te verkorten tot minuten5. Het derde circuit is gebaseerd op een positief feedbackcircuit1en wordt geïnduceerd door acyl-homoserine-lactone (AHL). De PluxR promotor reguleert sfGFP en LuxR, een transcriptiefactorbinding met AHL om PluxR te activeren zoals weergegeven in figuur 8. Figuur 9 toont de dynamiek van celgroei (celgetallen versus tijd), figuur 10 toont de dynamiek van het gemeten signaal (gemiddelde fluorescentie versus tijd) en figuur 11 toont de dynamiek van geëvalueerde totale ruis (standaarddeviatie (SOA) versus tijd).
De SNR (of CV) wordt veel gebruikt bij het ontwerpen van analoge elektronische schakelingen om de precisie en betrouwbaarheid van het circuit uit te drukken32. CV heeft betrekking op de verdeling van signaal tussen afzonderlijke cellen en maakt vergelijking mogelijk tussen methoden en verschillende apparatuur zoals microscopen en stroomanalysatoren. Door SNR te berekenen aan de hand van microscoopbeelden kunnen we circuits in de tijd vergelijken, gesegmenteerde cellen worden tegelijkertijd gemeten en bieden een maat voor de specifieke resolutie van het geluid in vergelijking met het signaal, of een ruisinterval voor een specifieke tijd en inductorconcentratie. Dit kan erop wijzen of detectorcellen in staat zullen zijn om de exacte signaalrespons op de inductorconcentratie op te lossen. In dit werk werd het CV berekend door rekening te houden met alle gesegmenteerde artefacten die cellen zijn, ongeacht de celprogressie in de delingscyclus. SNR werd berekend voor specifiek celgebiedsbereik in de loop van de tijd, en vervolgens werd het gemiddeld voor drie herhaalde experimenten. Noch het verkregen signaal, noch de SOA zijn alleen betrouwbaar, omdat ze specifiek zijn voor het experiment en de gebruikte apparatuur. Het signaal wordt gemeten met willekeurige eenheden die afhankelijk zijn van de vooraf ingestelde versterking van de apparatuur, de fotodetector en de belichtingstijd. Uit de gegevens in figuur 10 blijkt dat het celstadium in de delingscyclus geen invloed heeft op het geluidsniveau, aangezien verschillende oppervlaktebereiken (punten in de delingscyclus) dezelfde trend vertonen. Deze observatie zou de bewering kunnen ondersteunen dat het volgen van exacte moeder- dochterrelaties kan worden vermeden voor het meten van lawaai en dit zou de SNR voor de gepresenteerde methode kunnen verbeteren. Er werd geen substantiële verandering in SNR waargenomen tussen GFP en sfGFP , zoals weergegeven in figuur 12. We berekenen de SNR (SNR= gemiddelde/ SOA) en presenteren deze in figuur 12 en figuur 13.
Vervolgens berekenden we de variantie en het CV op basis van de volgende vergelijkingen31
1.1
1.2
Waar λ eiwitvouwtijd is, is T celdelingstijd, θ en μ het aantal plasmiden voor en na deling zijn, het plasmide-exemplaar nummer31. Met behulp van de bovenstaande vergelijkingen (1.1 en 1.2) kunnen we de gegevens van het stroomanalysatorsignaal aanpassen voor gammaverdeling.
Vervolgens vergeleken we tussen het CV, dat wordt gemeten en berekend door flow analyzer (Figuur 14), en door het protocol (Figuur 15).
Figuur 1: Helder veldbelichtingsbeeld (a) Gestabiliseerde acquisitie in helder veld (b) Segmentatieafbeelding, alleen gekleurde cellen voeren de berekeningen in (c) Pixelhelderheidskaart van de aanwinst, spike is het achtergrondgeluid. Drempeling door het segmenteert slechts Escherichia coli. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Dit experiment toont goede gezonde cellen die zich na 120 minuten delen en reageren. Beelden werden achtereenvolgens met tussenpozen van 20 minuten verkregen. Kolonies zijn in focus, gel is stabiel tussen bemonsteringen. Kolonies verdelen zich en produceren sterke signalen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Effecten van onjuiste verdunningsverhouding en gelkrimp op fluorescerend beeld. Beelden werden verkregen met intervallen van 20 minuten (a) Individuele Escherichia coli omcirkeld in rood (b) Dezelfde cel drijft naar rechts van het gezichtsveld (c) De cel drijft verder. De cellen delen of veranderen ook niet van positie, waarschijnlijk als gevolg van een lage verdunningsverhouding en gelkrimp. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: In dit experiment werd geen activiteit gedetecteerd en waren er bijna geen cellen aanwezig. Mogelijke redenen zijn dat de gel te heet is, het drogen van het monster te agressief is of geen beschermkap heeft (a) Fluorescerende beelden genomen op 40 minuten (b) Fluorescerende beelden genomen op 60 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Focusverlies en fotobleaching. Opeenvolgende beelden van (a) tot en met (d) werden met tijdsintervallen van 15 minuten verkregen met behulp van het autofocussysteem. Zie aanvullende video 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6:Plasmide kaart van Pteto die GFP reguleert. Zonder de TetR-repressor treedt de PtetO-promotor op als constitutieve promotor. Het circuit is gekloond op lage kopie nummer plasmiden. Deze plasmide fungeert als basis voor SNR-meting voor elk gewijzigd circuit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7:Plasmide kaart van Pteto die sfGFP reguleert. De sfGFP is gefuseerd met een AAV-degradatietag. Het circuit is gekloond op lage kopie nummer plasmiden. De sfGFP-AAV is een robuustere variant van GFP, terwijl de AAV-tag hem vatbaar maakt voor afbraak door huishoudelijke proteasen van de Escherichia coli. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Plasmide kaart van positieve feedback circuit. Het circuit wordt geïnduceerd door een AHL-inductor, die luxr-transcriptiefactor bindt. De PluxR promotor, die wordt gereguleerd door AHL-LuxR complex, activeert de productie van LuxR en sfGFP-AAV. Het circuit is gekloond op lage kopie nummer plasmiden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9:Dynamiek van Escherichia coli MG1655 stamgroei in minimale media omvat (a)PtetO-GFP, exponentiële groei van ongeveer 35 minuten. De beelden van dit experiment zijn weergegeven in figuur 2 (b) PtetO-sfGFP, exponentiële groei van ongeveer 35 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: Fluorescerend intensiteitsniveau, genormaliseerd per pixel en verworven met intervallen van 20 minuten.
Cellen worden gerangschikt op gebied, om artefacten te minimaliseren. Cellen worden gedeeld door hun gebied in een micrometer vierkant (a) Pteto-GFP circuiteerste herhaling voor intensiteit bij 210 minuten is 0.004 a.u (b) PtetO-sfGFP circuit eerste herhaling voor intensiteit bij 210 minuten is 0.022 a.u (c) Gemeten signaal van Pteto-GFP circuit (d) Gemeten signaal van PtetO-sfGFP circuit. Alle experimentele gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie experimenten. De software kan het celgebied sorteren op verschillende groepen (a) en (b) grafieken weergeven voor vier celgebiedsbereiken die de delingscyclus vertegenwoordigen. Het eerste gebied van 14 micrometer vertegenwoordigt cellen na deling, omdat de kans het grootst is dat cellen na deling de kleinste zijn. Het tweede gebied van 21 μm vertegenwoordigt cellen vóór deling. Derde en vierde gebied vertegenwoordigen cellen bij deling omdat het totale gebied wordt vermenigvuldigd met twee (29 en 36 μm) om cellen te overwegen die langer nodig waren om te delen. De gebieden werden gekozen door handmatig de gegevens te beoordelen die op microscopiebeelden kijken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 11:Standaarddeviatie (SOA) van eencellige fluorescentieintensiteiten voor: (a) PtetO-GFP circuit eerste herhaling voor SOA bij 210 minutenis 0,001865 a.u (b) PtetO-sfGFP circuit eerste herhaling voor SOA bij 210 minuten is 0,01477 a.u (c) STD van Pteto-GFP circuit (d) STD Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 12:SNR van eencellige fluorescentieintensiteiten. We berekenen de SNR=Mean/STD (a) PtetO-GFP circuit eerste herhaling voor SNR bij 210 minuten is 1.309 a.u (b) PtetO-sfGFP circuit eerste herhaling voor SNR bij 210 minuten is 1.29 a.u (c) Drie herhalingen van GFP meting (d) Drie herhalingen van sfGFP meting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 13:SNR van eencellige fluorescentieintensiteiten (a)PluxR-sfGFP circuit SNR voor verzadigingsrespons op AHL (b) PluxR-sfGFP circuit SNR voor halftijdse respons op AHL. De SNR van positieve feedback AHL gereguleerd circuit is hoger dan SNR voor constitutieve sfGFP circuit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 14: Histogrammen van de gencircuits op basis van de stroomanalysator: experimentele gegevens (blauw) en stochastische modelgegevens (rood). De x-as vertegenwoordigt willekeurige fluorescentie-eenheden uit flowcytometrie en de y-as vertegenwoordigt de frequentie van cellen die het overeenkomstige fluorescentieniveau produceren. De gegevens werden na drie uur gemeten met behulp van een flow analyzer. GFP fluorescentie werd gekwantificeerd door excitatie op een golflengte van 484 nm en emissie op een golflengte van 510 nm. PE-TexasRed filterspanningen werden gebruikt op een sampler met hoge doorvoer om GFP-expressieniveaus te meten. De spanningen van de stroomanalysator werden met behulp van software aangepast, zodat de maximale en minimale expressieniveaus met dezelfde spanningsinstellingen konden worden gemeten. Zo werden consistente spanningen gebruikt voor elk heel experiment. Dezelfde spanningen werden gebruikt voor latere herhalingen van hetzelfde experiment. De montage vond plaats door gebruik te maken van gammaverdeling31. Deze methode gaat ervan uit dat het signaal meestal afhankelijk is van de willekeurige verdeling van plasmiden (a) Meting van Pteto-GFP kloon op laag kopieernummer plasmide. Experimenteel CV=0,46, Model CV=0,32 (b) Meting van Pteto-sfGFP-AAV gekloond op laag kopieergetal plasmide. Experimenteel CV=0,86, Model CV=0,44. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 15: Histogrammen van de gencircuits op basis van microscoop: experimentele gegevens (stippellijnen) en stochastische modelgegevens (vaste lijnen). De x-as vertegenwoordigt willekeurige fluorescentie-eenheden van omgekeerde microscoop en de y-as vertegenwoordigt de frequentie van cellen die het overeenkomstige fluorescentieniveau produceren. Fitting werd gemaakt met behulp van de MATLAB gammaverdeling31,32 (a) Meting van PtetO-GFP kloon op laag kopieernummer plasmide (b) Meting van PtetO-sfGFP-AAV gekloond op laag kopieernummer. Vergelijking toont aan dat ons protocol vergelijkbare CV-waarden verkrijgt als in flow analyzer experiment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Vier verdunningsverhoudingen, tussen 1:500 en 1:20, voor de MG1655-stam. De grafiek laat zien dat als de initiële dichtheid hoog is, LB-voedingsstoffen overvloedig zijn, wat resulteert in cellen die sneller delen. Voor een verdunning van 1:500 bleef de celdichtheid constant. Bij een verdunning van 1:100 nam de celdichtheid langzaam toe. Voor een verdunning van 1:50 nam de celdichtheid met matige deling toe zonder significante vertraging in incubatie van 250 RPM. Voor een verdunning van 1:20 bereikte de celdichtheid snel verzadiging. We kozen voor een verdunningsverhouding van 1:30, waardoor korte incubatie mogelijk was voor het bereiken van exponentiële groei en een aanzienlijk delingsgebied voor het bereiken van een hoge verzadiging bij matige deling. Klik hier om deze afbeelding te downloaden
Aanvullende figuur 2: Verwerking van heldere veldafbeeldingen. (a) Ruwe gegevensintensiteitsbeelden van het heldere veldkanaal van het microscoopsysteem. (b) Contrastverbeteringsmanipulatie van de afbeelding om de scheiding van celobjecten van de achtergrond te verbeteren. c) Celgrensherkenning op basis van convolutiefilter33 en op binarisatie gebaseerde globale drempel34. d) Morfologische35 bewerkingen van sluiten en vullen om de grenzen van de celkolonie te identificeren. Klik hier om deze afbeelding te downloaden
Aanvullende figuur 3: Celkolonie achtergrond\voorgrondsegmentatie. Om de impact van het geluid te minimaliseren, proberen we celkoloniegrenzen te identificeren en ze uit het gelgeluid te halen. (a) Afbeeldings binarisatiebewerking op basis van contrastverbetering op basis van adaptieve drempeling om celobjecten te detecteren36. (b) Matrix multiplatie van matrixen gepresenteerd op S2d en S3a met succes filteren van de meeste geluiden en differentiëren gel ruis van cellen. Sommige boundries zijn niet volledig opgelost. c) Identificatie van celgrenzen met behulp van een waterscheidingsalgoritme37 op basis van afstandstransformatie38. d) Matrix multiplatie van matrixen gepresenteerd op S3b en S3c met succes oplossen van enkele cellen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden
Aanvullend figuur 4: Segmentatie van één cel. (a) Gesegmenteerd product van helder veldbeeld. Verdere reiniging wordt voorgevormd op basis van celgebied gating en vorm, waarbij ronde bubbels worden weggegooid. (b) Fluorescentiesignaalbeelden verkregen van microscoop. (c) Matrix multiplatie van matrixen gepresenteerd op S4a en S4b met succes extraheren van het signaal van enkele cellen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden
Aanvullend figuur 5: Verlies van monolaag. (a) Helder veldbeeld van een cellaag met 840 minuten (14 uur) Pteto die het GFP-circuit in figuur 2 in het artikel reguleert als een goed experiment. Aan de rechterkant van microscopie kan beeldverlies van monolayer worden gedetecteerd. (b) Softwaresegmentatieafbeelding. Als gevolg van verlies van monolaag cellen zijn gefragmenteerd en zal worden gereinigd basis op gebied gating. (c) Fluorescentiebeeld dat aan de rechterkant van het beeld laat zien dat er geen cellen kunnen worden opgelost en een laag signaal van cellen aan de linkerkant van het beeld als gevolg van verlies van monolaag. (d) Segmentatiebeeld in combinatie met fluorescentiebeeld. Klik hier om deze afbeelding te downloaden
Aanvullende video 1. Klik hier om deze video te downloaden
Aanvullende video 2. Klik hier om deze video te downloaden
Aanvullende video 3. Klik hier om deze video te downloaden
cell_growth_rate_fit.m. Klik hier om dit bestand te downloaden
compare_experiments.m. Klik hier om dit bestand te downloaden
Count_Cells.m. Klik hier om dit bestand te downloaden
main_code.m. Klik hier om dit bestand te downloaden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk hebben we een protocol ontwikkeld dat computertracering van Escherichia coli levende cellen mogelijk maakt, na deling en fluorescerende niveaus over een periode van uren. Dit protocol stelt ons in staat om de stochastische dynamiek van genetische circuits in Escherichia coli te kwantificeren door het CV en SNR in realtime te meten. In dit protocol vergeleken we het stochastische gedrag van twee verschillende circuits zoals weergegeven in figuur 10. Het is aangetoond dat plasmiden met lage kopieeraantallen meer vatbaar zijn voor stochastische effecten en minder worden beïnvloed door celdeling. Het eerste circuit constitutief uitgedrukt GFP (figuur 10a), en het tweede circuit constitutief uitgedrukt sfGFP gesmolten tot een ssrA degradatie tag (Figuur 10b). Om het stochastische gedrag van de fluorescerende eiwitten te kwantificeren, hebben we ook de heldere veldbeelden opgenomen. De resultaten tonen aan dat de expressie van GFP, met name bij de rijping39,de dominante geluidsbron is. Het periodieke zaagtandgedragspatroon waargenomen in figuur 10a kan worden verklaard door het willekeurige proces van celdeling en de lange tijdschaal van GFP-rijping (~ 50 minuten). Daarentegen werd het sfGFP-signaal van het tweede circuit tijdens de meting gestabiliseerd, omdat de zeer korte rijpingstijd van de sfGFP (~ 6 minuten). We hebben een eenvoudige formule ontwikkeld die het niveau van GFP in beide circuits beschrijft als we alleen kijken naar het proces van celdeling en GFP-rijpingstijd. Op een gegeven moment, t, gaan we ervan uit dat er x kopienummers van eiwitten zijn, en μ kopienummers van plasmiden. Het eiwitkopienummer kan worden beschreven door:
1.3
1.4
Bij het overwegen van alleen divisiegebeurtenissen; 
na eiwitrijping en dus voor de specifieke plasmiden krijgen we:
Voor GFP ( 
): 1,5
Voor sfGFP ( 
):1.6
Vervolgens de ontwikkelde serie van sfGFP:
1.7
In het geval dat 
, verkrijgen we 
. Dit resultaat kan als volgt worden verklaard. Wanneer x klein is, nemen de sfGFP-niveaus met een kleine hoeveelheid toe. Wanneer x groot is, wordt sfGFP gedegradeerd tot een stabiele toestand. Evenzo bevat elke cel voor het circuit van GFP ongeveer 10 eenheden GFP, maar omdat de rijpingstijd voor GFP langer is dan de mitose, worden vernederende zaagtandpatronen van fluorescentieintensiteiten waargenomen. In het model gingen we ervan uit dat replicatie van de plasmide snel genoeg is dat plasmideverdeling constant blijft voor en na deling. De ssrA degradatie tag vermindert vaak de eiwit halfwaardetijd van uren tot minder dan een uur5 en leidt tot een snelle steady state. We hebben laten zien dat de methode ook een verdeling biedt die vergelijkbaar is met die gemeten met een hoge populatiestroomanalysator en dat het CV van deze verdeling gelijk is aan of kleiner is dan het flow analyzer CV.
Hoewel verschillende methoden3,7,18 zijn ontwikkeld voor live cell imaging, is de hier gepresenteerde methode specifiek afgestemd op Escherichia coli. Deze bacterie vereist een speciaal medium en een iets andere aanpak. Het protocol heeft de volgende belangrijke kenmerken: (1) Het vaststellen van een verdunningsverhouding die specifiek is voor de bacteriën en stam aan het begin van exponentiële groei in plaats van in het middenstadium (Exponentiële groei zonder schudden) (2) Escherichia coli kan het beste worden verdeeld bij 37 °C, maar bij 37 °C verliest de minimale mediagel snel water, wat leidt tot krimp en instabiliteit. Het protocol hier overwint deze uitdaging (3) We brengen eerst het bacteriemonster aan en sluiten het vervolgens af met vloeibare gel. Omdat het monster tussen de glasbodem en gel zit, hebben we een gel nodig die (I) gasuitwisseling mogelijk maakt om het snijden van luchtzakken te voorkomen, (II) vloeibaar blijft bij lage temperaturen omdat Escherichia coli gevoelig is voor warmte en (III) ervoor zorgt dat het monster niet in de vloeibare gel wordt gemengd. De gel blijft vloeibaar bij 37 °C, maar we raden aan om een beschermkap bovenop het monster te gebruiken om overmatige hitte en monstermenging in de gel te voorkomen (4) Deze aanpak vereist eenvoudige, generieke apparatuur (5) Monsters kunnen direct worden gemeten zonder voorverwarmen, dus er is geen verlies van delingsgebeurtenissen (6) Het protocol, dat de wet-lab-stappen en de aangepaste geautomatiseerde software omvat, kan worden gebruikt om het stochastische gedrag van genetische circuits te bestuderen, zoals het kwantificeren van de SNR. We vergeleken de microscopiemethode met flow analyzer resultaten om het gebruik van kleine populaties cellen te valideren en een basislijn vast te stellen voor vergelijking volgens CV (7) De software stelt ons in staat om cellen op de monolaag te detecteren zonder menselijke tussenkomst en totale ruis te analyseren. Softwaretools zoals ImageJ18 of Schnitzcells vereisen handmatige identificatie van cellen en zijn een uitdaging voor aanpassingen.
Ontwerp bij het continu in beeld brengen van levende celkolonies het experiment met inachtneming van verschillende complexe fysieke parameters, zoals cellulaire stress en toxiciteit, uitputtingssnelheid van hulpbronnen, necrose en afbraaktijd van inductoren en chemicaliën. Het protocol maakt een betrouwbare meting van maximaal vijf uur mogelijk. Onze experimenten suggereren dat Escherichia coli synchroniseren bij het verdelen in micro- en eenlaagse kolonies (Aanvullende Video 3). We gaan ervan uit dat de gel uniform is in termen van middelen en taaiheid, de cellen hebben vergelijkbaar gedrag en het verlichtingsveld is iets groter vanuit het gezichtsveld. Elke cel moet dus dezelfde signaal- en statistische gegevens produceren, die kunnen worden verzameld zoals we hebben aangetoond door cv op deze manier te vergelijken met meting met een stroomanalysator. Om geluid gedurende langere tijd onder constante beginomstandigheden te meten, zullen we in de toekomst overwegen om microfluïdische chips te gebruiken. Verdere voordelen van een dergelijk apparaat zijn het handhaven van vaste posities van cellen en stabiele focus10. Toch vereisen ontwerp, fabricage van microfluïdische chips en priming voor experimenten training, specifieke apparatuur (soms op maat gemaakt) en tijd. Om deze reden is het nuttig om timelapsemicroscopie te gebruiken zoals weergegeven in dit protocol om een algemeen begrip van het circuit te verkrijgen.
Het voorgestelde protocol en de ontwikkelde software maken reproduceerbare metingen mogelijk, waaruit eenvoudig grafieken kunnen worden afgeleid. Het maakt het ook mogelijk om het totale geluid te testen en te vergelijken en kan worden aangepast voor het meten van intrinsieke en extrinsieke ruis. De methode is gebaseerd op generieke of eenvoudig te bestellen materialen, openlijk gedeelde, gebruiksvriendelijke software en vereist geen specifieke training. We hebben aangetoond dat de populatie gemeten door microscopie groot genoeg is om zinvolle gegevens te verkrijgen door de methode CV te vergelijken met die verkregen met een stroomanalysator. Daarom kunnen we met succes een SNR-basislijn vaststellen met behulp van dit protocol en deze vergelijken met complexere gencircuits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Wij danken de heer Gil Gelbert (Faculteit Elektrotechniek, Technion) voor het assisteren bij de MATLAB code. We danken Dr. Ximing Li (Faculty of bio-medical Engineering, Technion) voor het helpen bewijzen van dit artikel. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Neubauer Family Foundation en het Israëlische ministerie van Wetenschap, subsidie 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al.
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V.
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E.
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
