Summary
Este trabalho apresenta um método de microscopia que permite a imagem viva de uma única célula de Escherichia coli para análise e quantificação do comportamento estocástico de circuitos genéticos sintéticos.
Abstract
O protocolo desenvolvido aqui oferece uma ferramenta para permitir o rastreamento computacional da divisão Escherichia coli e níveis fluorescentes ao longo de várias horas. O processo começa por triagem de colônias que sobrevivem em meios mínimos, assumindo que apenas Escherichia coli abrigando o plasmídeo correto será capaz de prosperar nas condições específicas. Uma vez que o processo de construção de grandes circuitos genéticos, exigindo a montagem de muitas partes de DNA, é desafiador, os componentes do circuito são frequentemente distribuídos entre vários plasmídeos em diferentes números de cópias que requerem o uso de vários antibióticos. Mutações no plasmídeo podem destruir a transcrição dos genes de resistência a antibióticos e interjeição com o gerenciamento de recursos na célula que leva à necrose. A colônia selecionada é definida em uma placa de Petri de fundo de vidro e alguns planos de foco são selecionados para rastreamento de microscopia em domínios de campo brilhante e fluorescentes. O protocolo mantém o foco da imagem por mais de 12 horas em condições iniciais que não podem ser reguladas, criando algumas dificuldades. Por exemplo, as células mortas começam a se acumular no campo de foco das lentes após algumas horas de imagem, o que faz com que as toxinas se acumulem e o sinal desfoque e decadeia. O esgotamento dos nutrientes introduz novos processos metabólicos e dificulta a resposta desejada do circuito. A temperatura do experimento reduz a eficácia dos indutores e antibióticos, o que pode danificar ainda mais a confiabilidade do sinal. O gel de mídia mínimo encolhe e seca, e como resultado o foco óptico muda ao longo do tempo. Desenvolvemos esse método para superar esses desafios na Escherichia coli,semelhante aos trabalhos anteriores que desenvolvem métodos análogos para outros microrganismos. Além disso, este método oferece um algoritmo para quantificar o ruído estocástico total em células não alteradas e alteradas, descobrindo que os resultados são consistentes com previsões de analisador de fluxo, como mostrado por um coeficiente semelhante de variação (CV).
Introduction
A biologia sintética é um campo multidisciplinar que surgiu na última década e tem como objetivo traduzir princípios de design de engenharia em design biológico racional1,2,3, em um esforço para alcançar a integração multiprofissional e o processamento em células vivas para a compreensão da ciência básica4,5, aplicações diagnósticas, terapêuticas e biotecnológicas6,7,8,9,10. Nossa capacidade de quantificar a resposta de entrada-saída de circuitos genéticos sintéticos foi revolucionada pelos recentes avanços na tecnologia unicelular, incluindo o analisador de fluxo e imagens de células vivas usando microscopia automatizada de lapso de tempo11. Um analisador de fluxo é frequentemente usado para medir a resposta desses circuitos no estado estável1,12, e a microscopia invertida é usada para medir a resposta dinâmica de circuitos genéticos sintéticos ao nível de uma única célula3. Por exemplo, um dos primeiros trabalhos em biologia sintética envolveu a construção de redes osciladoras genéticas em células vivas usando loops de feedback negativos com um atraso3. Posteriormente, os circuitos osciladores genéticos foram aplicados para entender o controle metabólico no ambiente dinâmico das células vivas4. A microscopia de lapso de tempo automatizado é um método para caracterizar tais circuitos. Temos a hipótese de que as células hospedeiras, Escherichia coli,sincronizam ao formar micro colônias, permitindo a medição do sinal e o cálculo do ruído sem rastrear relações exatas entre mãe e filha.
O ruído é um aspecto fundamental e inerente dos sistemas biológicos, muitas vezes decorrentes de múltiplas fontes. Considere, por exemplo, reações bioquímicas envolvendo sinais originários do transporte de portadores aleatórios discretos, como a difusão de proteínas13. Estes sinais se propagam com flutuações aleatórias14. Outras fontes de ruído são disponibilidade de recursos, divisão celular e variações em condições ambientais como temperatura, umidade e pressão. Sinais biológicos que se propagam em circuitos genéticos sintéticos muitas vezes têm uma relação sinal-ruído muito baixa (SNR), o que perturba o desempenho de tais circuitos. Portanto, o design do circuito genético continua sendo um dos aspectos mais desafiadores da engenharia genética15. Por exemplo, ao contrário da maioria das abordagens que calculam apenas a expressão genética média (medida sobre toda a população celular), a variância do sinal medido é considerada para projetar comportamentos previsíveis através de redes genéticas sintéticas12. Como tal, os níveis de variabilidade ou ruído na expressão proteica desempenham um papel dominante no design e desempenho dos circuitos genéticos analógicos e digitais1,16,17.
Muitas abordagens foram desenvolvidas para quantificar a variabilidade célula-celular, inclusive em Escherichia coli3,7,18. Esses métodos são frequentemente usados para estudar a ativação genética e vias metabólicas, porém com menos foco no estudo da dinâmica do ruído estocástico, como medir e desembaraçar fontes específicas de ruído, especialmente para circuitos genéticos em células vivas onde este é um desafio fundamental19,20,21. Vários fatores, ambos herdados ao próprio circuito (intrínseco) e derivados das células hospedeiras (extrínsecos), podem perturbar o desempenho contínuo dos circuitos genéticos. Neste artigo, desenvolvemos um protocolo que visa quantificar o ruído total nas células Escherichia coli, incluindo as fontes de ruído intrínsecas e extrínsecas6,22. Quantificando o ruído total e avaliando o SNR23,o design dos circuitos genéticos pode ser melhorado. Este método pode ser modificado para medir fontes de ruído independentes separadamente, monitorando várias proteínas fluorescentes6,20. Para o protocolo aqui descrito, mantemos as condições ambientais bem controladas e medimos continuamente a atividade das células sem a influência de fatores externos. Medimos o sinal de proteínas fluorescentes em células únicas ao longo do tempo e simultaneamente as imagem sob um substrato agarose. As imagens resultantes são analisadas usando o MATLAB personalizado do laboratório.
Idealmente, a medição contínua da atividade em tempo real de proteínas fluorescentes dentro de uma célula produzirá dados precisos através do crescimento e divisão das células. No entanto, é desafiador adquirir tais dados. Isso se deve à degradação das proteínas fluorescentes, conhecidas como foto-branqueamento7,quando são expostas à radiação no processo de excitação. Além disso, as células Escherichia coli também são sensíveis à excitação, o que pode levar à fototoxicidade7. Ambas as questões limitam a quantidade de quadros fotográficos que podem ser adquiridos e o tempo entre as aquisições. Os tipos de substrato e médio (por exemplo, caldo de lysogeny) que é usado para cultivar as células durante a imagem também têm um papel crítico. Recomendamos fortemente o uso de meio mínimo, que minimiza o fundo não fluorescente e amplia o tempo de divisão celular.
Além disso, a amostra precisa ser preparada considerando os seguintes requisitos (1) A baixa taxa de divisão celular permite exposições menos frequentes para imagens próximas do ciclo de divisão e redução da probabilidade de fototoxicidade e fotobleaching. Estabelecemos o tempo de aquisição para cerca de metade do tempo de mitose previsto (2) A baixa densidade celular no início do experimento permite uma melhor uniformidade e rastreabilidade da divisão. A densidade celular é afetada pela razão de diluição das células Escherichia coli, que é um parâmetro significativo para o sucesso deste protocolo e precisa ser determinada para cada laboratório. Para estabelecer a razão, cada nova cepa de Escherichia coli ou mídia utilizada deve ser equipada com gráficos de taxa de crescimento(Figura Suplementar 1). Uma razão apropriada foi alcançada se as células podem crescer sem agitação adicional após uma curta incubação de uma densidade inicial de cerca de OD600nm = 0,1. As células nesta fase se dividirão de acordo com a temperatura do ambiente apenas (3) Restrição do movimento celular: o movimento celular depende fortemente da firmeza do substrato (agarose pad). A firmeza do substrato depende da quantidade de agarose total e do tempo de solidificação do gel. Os géis não podem ser deixados para solidificar durante a noite à temperatura ambiente, pois a Escherichia coli sofrerá mitose. Outros fatores que afetam a estabilidade do substrato incluem a quantidade de água na amostra e a umidade. Questões adicionais são discutidas detalhadamente nos Resultados Representativos. Este protocolo fornece muitos detalhes e gradualmente passa de um passo para outro. O protocolo oferece estabilidade longa para experimentos de imagem e fornece uma ferramenta básica de processamento de imagens.
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Protocol
1. Preparação de mídia e cultura
- Prepare a solução de estoque de 1.000x Carbenicillin (50 mg/mL) ou antibiótico relevante.
- . Pesar 0,5 g de carbenicilina. Adicione 10 mL de estéril H2O. Dissolva completamente.
- Esterilize o estoque de carbenicilina através de um filtro de seringa de 0,22 μm. Aliquot a solução antibiótica e armazene a -20 °C.
- Para preparar placas de caldo de lysogeny (LB), misture 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extrato de levedura e 7,5 g de ágar Bacto com 0,5 L de estéril H2O. Autoclave a solução a 121 °C por 20 min.
- Submerse parcialmente a mistura de gel derretido em um banho de água de 50 °C. Adicione 1.000 μL de carbenicilina (50 mg/mL).
- Prepare pratos de Petri em um ambiente estéril. Deixe os pratos para definir antes de guardá-los na geladeira.
- Para a mídia mínima M9, prepare soluções separadas de estoque dos seguintes: sais 5x M9 (56,4 g/L), 2 M de glicose e 2% de casaminoás sem biotina. Autoclave as soluções a 121 °C por 20 min.
- Para preparar 5 placas de Petri, misture 1125 mg de ágar de baixa fusão e 400 mg de ágar com 89,2 mL de mídia mínima (1x M9). Adicione 10 mL de 2% de casaminoácidos (2% [vol/vol]) em um frasco de 250 mL Erlenmeyer.
NOTA: Certifique-se de derramar a mídia nos lábios internos do frasco. - Micro-ondas a solução em rajadas curtas de 3 a 4 segundos. Repita até que a solução esteja clara.
NOTA: Certifique-se de não atingir o ponto de ebulição. - Coloque o frasco de 250 mL Erlenmeyer em um banho de água quente (60 °C) para misturar ainda mais por difusão, e deixe esfriar até que sua temperatura caia para cerca de 45-50°C.
- Acenda a chama no banco de rolar pratos.
- Adicione rapidamente todas as soluções na seguinte ordem:
800 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
100 μL de tiamina (B1)
1100 μL de glicose (2M)
100 μL de Carbenicilina (50 mg/mL). - Gire o frasco de Erlenmeyer para garantir a distribuição uniforme de todos os ingredientes em todo o ágar.
- Abra uma placa de cada vez ao lado da chama e comece a derramar.
- Deixe as placas no banco por alguns minutos até a solidificação inicial.
- Vire as placas de cabeça para baixo para evitar que a condensação da água escorra sobre o gel.
- Deixe as placas solidificarem à temperatura ambiente por cerca de 2h.
- Uma vez que as placas tenham solidificado e seco, elas podem ser armazenadas a 4 °C por cerca de 3 meses.
2. Estirpes bacterianas e plasmídeos construção
NOTA:O circuito genético contém uma parte; uma Proteína Fluorescente Verde (GFP) impulsionada por um promotor PtetO resultando em expressão constitutiva. Todos os plasmídeos deste trabalho foram construídos utilizando técnicas básicas de clonagem molecular e foram transformados em Escherichia coli 10β, utilizando um protocolo padrão de choque térmico24. A construção final foi transformada em escherichia coli MG1655 para testes.
- Transforme o plasmídeo desejado em células Escherichia coli MG1655 com o protocolo de choque térmico padrão24.
- Cresça as células transformadas em uma placa de ágar LB durante a noite a 37°C.
NOTA: É possível manter as placas de Petri da etapa 2.2 até 3 dias para uso de microscopia. - Inocular uma única colônia em 5 mL de caldo LB complementado com os antibióticos relevantes em um tubo de vidro.
- Cresça células a 37 °C com velocidade de agitação de 250 rpm na incubadora por 2h até que o líquido esteja nublado.
- Prepare 1 mL de solução de diluição da seguinte forma:
892 μL de mídia mínima (1x M9)
8 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
100 μL de 2% de ácidos Casamino (0,2% [wt/vol])
1 μL de tiamina (B1)
11 μL de glicose (2 M)
1 μL de antibióticos relevantes- Misture e gire para baixo.
- Diluir a cultura celular (1:30) da etapa 2.4 em um tubo de 2 mL adicionando 30 μL de crescimento de Escherichia coli a 1000 μL de solução de diluição (passo 2.5).
- Incubar o tubo por 1h com agitação (250 rpm) a 37 °C.
- Cresça 40 μL - 60 μL em placas M9 preparadas na etapa 1.10. Incubar a placa a 37 °C durante a noite.
NOTA: A Densidade Óptica (OD600nm) para chapeamento deve ser em torno de 0,1. - Coloque até três placas de fundo de vidro de 35 mm no banco.
NOTA: Certifique-se de que o vidro da placa tenha a espessura correta das lentes do microscópio utilizadas. - Prepare a cultura para semeadura em placas de gel, repita as etapas 2.3 a 2.6 para colônias de chapas preparadas nas medições do microscópio passo 2.9.
- Prepare a seguinte solução para fazer três placas de microscópio.
- Pré-aqueça o banho de água a 60 °C.
- Misture 112,5 mg de ágar de baixa fusão e 40 mg de ágar com 8,92 mL de mídia mínima (1x M9) e adicione 1 mL de 2% de álinoácidos (0,2% [vol/vol]) em um frasco Erlenmeyer de 25 mL.
NOTA: Certifique-se de derramar a mídia nos lábios internos do frasco.
- Micro-ondas a solução em rajadas curtas de 2 a 3 segundos. Repita até que a solução esteja clara.
NOTA: Certifique-se de não atingir o ponto de ebulição. - Coloque o frasco de 25 mL Erlenmeyer em um banho de água quente (60 °C) para misturar ainda mais por difusão, e deixe esfriar no banco até que sua temperatura caia para cerca de 45-50 °C.
3. Preparação de almofadas de agarose
- Banco limpo com 70% de etanol. Estique a fita no banco limpo. Certifique-se de que a fita está lisa e nivelada.
- Prepare dois coverlips: um na fita e outro nas proximidades. Prepare um coverlid.
- Retire o frasco (preparado na etapa 2.14) do banho de água, limpe o exterior do frasco limpo e deixe esfriar até que sua temperatura caia para cerca de 45-50 °C.
- Para fazer a solução de gel, misture rapidamente todas as soluções na seguinte ordem:
80 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
1 mL de 2% de casaminoácidos (0,2% [wt/vol])
10 μL de tiamina (B1)
110 μL de glicose (2 M)
10 μL de antibióticos relevantes. - Despeje 1,5 mL do gel na tampa e cubra-o com a segunda peça fazendo um "sanduíche".
- Devolva o Erlenmeyer ao banho de água quente. Cubra o sanduíche com a tampa e reserve o temporizador por 20 minutos.
- Ao mesmo tempo, incubar o tubo da etapa 2.11 para 1 h a 37 °C com agitação (250 rpm)
- Depois de 20 minutos vire o sanduíche (passo 3.5), cubra-o e deixe descansar por 1h.
NOTA: Para melhores resultados deixe o "sanduíche" descansar a 4 °C durante a etapa 3.8. - Semente Escherichia coli cultura a partir do passo 3.7 por pipetting a amostra para o prato de 35 mm.
NOTA: A tubulação de 6 μL de células como pequenas gotas separadas dá os melhores resultados. - Deixe as gotas secarem, por pelo menos 15 minutos e até 30 minutos.
- Exponha o gel solidificado do sanduíche do passo 3.8 deslizando o deslizamento de tampas para longe.
- Corte o sanduíche em pequenas almofadas individuais com soco ou ponta de biópsia.
- Incline-o suavemente sobre a amostra (passo 3.9). Deixe o prato por 20 minutos no banco.
4. Preparando a amostra para imagens de microscopia
- Retire o frasco do banho de água do passo 3.6. Limpe o lado de fora do frasco limpo e deixe esfriar até a temperatura ambiente (25 °C).
NOTA: Remova o frasco na etapa 4.1 cerca de 3 minutos antes do temporizador terminar. - Despeje 3 mL do gel constantemente para o perímetro da placa em um movimento circular. Deixe se solidificar por alguns minutos.
- Placas de vedação com fita adesiva e furar vários furos com agulha de 25 G. Vire todos os pratos para evitar que a condensação da água escorra no gel.
- Incubar todos os pratos a 4 °C por 30 min para permitir a solidificação total, evitando a mitose celular.
NOTA: Deixe as amostras a 4 °C para medições sucessivas, não mais do que um dia. - Inicie o microscópio por instruções do fabricante.
- Encontre o foco inicial usando a lente de amplificação mais baixa e engaje o sistema de foco automático (AFS).
- Use óleo se necessário, afogue a lente com óleo e espalhe-a cuidadosamente movendo a placa com um controlador de plataforma (não manualmente) e o AFS pode ser ativado novamente.
- Use seção transversal relativa na direção Z, seguindo a sugestão padrão para seções transversais de etapaS Z.
NOTA: Tiramos imagens de campo brilhantes a cada 5 minutos e imagens fluorescentes a cada 20 minutos. Às vezes, o foco precisa ser ajustado durante os primeiros 30 minutos. Pré-aquecimento da caixa da incubadora de microscópio e óleo, enquanto a refrigeração da amostra tende a ajudar a reduzir a perda inicial de foco.
5. Análise de dados
NOTA: Para processar dados de microscopia, projetamos um software baseado em computador no MATLAB. Este software facilita a identificação de limites celulares a partir de imagens e segmentos de tiff de campo brilhante e classifica as células por área. A saída desta análise de imagem pode ser usada como uma máscara em imagens de tiff fluorescentes para derivar níveis de intensidade celular e cancelar artefatos no domínio fluorescente, como halo celular devido a limites de resolução de microscópio. O software desenvolvido foi inspirado em trabalhos similares7,25,26,27,28,29,30 e fornece uma solução elegante sob medida para o laboratório.
- Primeiro, defina os seguintes parâmetros em main_code.m.
- Defina a pasta das imagens de aquisição.
- Defina o período de tempo da imagem - passo de tempo do canal de campo brilhante em minutos.
- Defina a frequência GFP - taxa de aquisição de imagens GFP.
- Defina a resolução do microscópio (ou seja, quantos pixels são iguais a 1 μm).
- Defina o alcance da caixa de histograma - alcance da área celular.
NOTA: O processo de classificação dos dados de acordo com a área celular é semelhante aos princípios de gating na análise de dados de citometria de fluxo. Os portões são colocados ao redor de populações de células com características comuns, geralmente dispersas e laterais dispersas, para isolar e quantificar essas populações de interesse. A microscopia permite portão, investigar e quantificar vários grupos celulares. - Definir o kernel de convolução (3,3) - este parâmetro detecta limites celulares por limiar global(count_cells.m).
NOTA: Esta configuração só é necessária ao alterar o laboratório ou o microscópio. O software requer que o canal de campo brilhante de entrada seja rotulado com índice c1, canal de fluorescência rotulado como c2.
- Execute main_code.m, que executará todos os outros scripts automaticamente(count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Programa segmenta automaticamente imagens de campo brilhante (ver Figura Suplementar 2-4).
- Combine a imagem de segmentação com imagem fluorescente (GFP) para extrair nível de intensidade por célula.
- Calcule o gráfico da quantidade de células por tempo e encaixe de acordo com o crescimento exponencial.
- Calcule a média e o desvio padrão (DST) para cada faixa de área celular.
- Calcule a relação sinal/ruído (SNR) para cada faixa de área celular.
- Plote e encaixe a distribuição da quantidade de células por intensidade.
- Calcule o coeficiente de Variância (CV) e compare com os dados do analisador de fluxo.
NOTA: O software dará como saída as imagens finais de segmentação para ajustar conv_kernel em uma nova pasta "sua pasta/Segmentada". O software dará como saída os gráficos em uma nova pasta "sua pasta/gráficos.
- Para comparar entre experimentos, use compare_experiments.m.
- Defina diretórios para os gráficos salvos e o endereço do diretório \CompareResult.
- Execute o arquivo.
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Representative Results
O software analisa imagens de domínio de campo brilhante que são off-white e preto. A Escherichia coli vai parecer formas oblongas pretas em um fundo off-white e alcance dinâmico de luminância deve mostrar um pico em seu centro(Figura 1). Em imagens fluorescentes, as células podem ter um pequeno halo, mas células individuais com formas oblongas ainda podem ser resolvidas. Um evento de mitose deve ser detectado pela primeira vez após 30 minutos. O foco do microscópio deve permanecer estável ao longo do tempo e, embora as células possam se mover lentamente durante esses 30 minutos, é improvável que elas deixem o campo de visão. Tal experimento será considerado bom e pode ser visto na Figura 2. As células podem ser difíceis de detectar no domínio de campo brilhante em baixa ampliação. Recomendamos estabelecer a distância média de foco com um número de cópia elevado (HCN) plasmid, pois é fácil notar em baixa ampliação. Defina a distância média enquanto mede um plasmídeo de número de cópia baixo (LCN) com antecedência na alta ampliação. Esta distância de foco depende principalmente das placas, do sistema de microscopia e do óleo, e não da espessura da cepa gel ou Escherichia coli.
Ao adaptar este protocolo a outros laboratórios, podem surgir os seguintes problemas (1) placas de Escherichia coli (amostras) preparadas em uma proporção de diluição incorreta podem mostrar números imutáveis de células(Figura 3 e Figura 4) (2)Amostras preparadas sem vedar a placa podem mostrar encolhimento excessivo. Isso pode ser observado à medida que as células derivam(Figura 3) ou causam uma perda de foco(Figura 5) (3) Algumas amostras podem apresentar células 'fixas' de mudança lenta (em preto) em um fundo de células de natação (em branco). Isso é provável devido a uma amostra molhada e geralmente se estabiliza à medida que o excesso de água é absorvido pelo gel (Vídeo Suplementar 1) (4) Amostras que não exibem células após alguns minutos de aquecimento podem ter sido preparadas incorretamente, provavelmente devido a: (I) Gel foi derramado enquanto ainda muito quente, (II) a tampa protetora foi esquecida, (III) a mídia mínima carece de um ingrediente, (IV) densidade celular incorreta, e (V) gel foi selado muito firmemente. É importante fazer furos para permitir a troca de gás em detrimento do encolhimento do gel(Figura 5) e (VI) as células também podem perfurar o gel em busca de nutrientes, empilhando um em cima do outro, comprometendo a monocamada celular efetivamente impedindo a detecção de células e a medição de sinal fluorescente confiável(Figura Suplementar 5).
Medimos três circuitos neste trabalho. Primeiro, um promotor constitutivo que regula o GFP mostrado na Figura 6. Em segundo lugar, um promotor constitutivo que regula o GFP31 (sfGFP) superposto mostrado na Figura 7. Uma tag de degradação ssrA (AAV) foi adicionada ao SFGFP para reduzir sua vida útil para minutos5. O terceiro circuito é baseado em um circuito de feedback positivo1, e é induzido por acicl-homoserina-lactona (AHL). O promotor PluxR regula o SFGFP e o LuxR, um fator de transcrição vinculante com a AHL para ativar o PluxR, conforme mostrado na Figura 8. A Figura 9 apresenta a dinâmica do crescimento celular (números de células versus tempo), a Figura 10 mostra a dinâmica do sinal medido (fluorescência média versus tempo) e a Figura 11 mostra dinâmica do ruído total avaliado (desvio padrão (DST) versus tempo).
O SNR (ou CV) é amplamente utilizado na concepção de circuitos eletrônicos analógicos para expressar a precisão e confiabilidade do circuito32. O CV refere-se à distribuição de sinal entre células únicas e permite a comparação entre métodos e diferentes equipamentos, como microscópios e analisadores de fluxo. O cálculo do SNR a partir de imagens de microscópio nos permite comparar circuitos ao longo do tempo, as células segmentadas são medidas ao mesmo tempo em que fornecem uma medida para a resolução específica do ruído em comparação com o sinal, ou um intervalo de ruído para um tempo específico e concentração de indutor. Isso pode indicar se as células detectoras serão capazes de resolver a resposta exata do sinal à concentração do indutor. Neste trabalho, o CV foi calculado considerando todos os artefatos segmentados que são células, independentemente da progressão celular no ciclo de divisão. O SNR foi calculado para o alcance específico da área celular ao longo do tempo, e então foi mediado para três experimentos repetidos. Nem o sinal adquirido nem a DST são confiáveis sozinhos, pois são específicos para o experimento e equipamentos utilizados. O sinal é medido com unidades arbitrárias que dependem do ganho de equipamento, detector de fotos e tempo de exposição. Os dados apresentados na Figura 10 sugerem que o estágio das células no ciclo de divisão não afeta o nível de ruído, pois diferentes faixas de área (pontos no ciclo de divisão) mostram a mesma tendência. Esta observação pode apoiar a alegação de que o rastreamento exato das relações mãe - filha pode ser evitado para medir o ruído e isso poderia melhorar o SNR para o método apresentado. Não foi observada nenhuma alteração substancial no SNR entre o GFP e o SFP, como mostrado na Figura 12. Calculamos o SNR (SNR= média/ DST) e apresentamos-no na Figura 12 e Figura 13.
Em seguida, calculamos a variância e cv com base nas seguintes equações31
1.1
1.2
Onde λ é tempo de dobramento de proteína, T é tempo de divisão celular, φ e μ são o número de plasmídeos antes e depois da divisão, a cópia plasmida número31. Usando as equações acima (1.1 e 1.2) podemos encaixar os dados do sinal analisador de fluxo para distribuição gama.
Em seguida, comparamos-se entre o CV, que é medido e calculado por analisador de fluxo(Figura 14),e pelo protocolo(Figura 15).
Figura 1: Imagem de exposição de campo brilhante (a) Aquisição estabilizada em campo brilhante (b) Imagem de segmentação, apenas células coloridas entram nos cálculos(c) Mapa de brilho de pixel da aquisição, o pico é o ruído de fundo. O limiar por ele segmenta apenas Escherichia coli. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Este experimento mostra boas células saudáveis se dividindo e reagindo após 120 minutos. As imagens foram adquiridas sucessivamente em intervalos de 20 minutos. Colônias estão em foco, o gel é estável entre as amostras. Colônias se dividem e produzem sinais fortes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos da razão de diluição incorreta e encolhimento do gel na imagem fluorescente. As imagens foram adquiridas em intervalos de 20 minutos(a) Escherichia coli individual circulada em vermelho (b) A mesma célula deriva para a direita do campo de visão (c) A célula deriva ainda mais. As células também não dividem ou mudam de posição, provavelmente devido a uma baixa taxa de diluição e encolhimento do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Neste experimento não foi detectada atividade e quase nenhuma célula estava presente. As possíveis razões são o gel estar muito quente, a secagem da amostra ser muito agressiva ou não ter tampa protetora(a)Imagens fluorescentes tiradas a 40 minutos(b) Imagens fluorescentes tiradas a 60 minutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Perda de foco e fotobleaching. Imagens sucessivas de (a) através (d) foram adquiridas em intervalos de tempo de 15 minutos usando sistema de foco automático. Ver Vídeo Suplementar 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Mapaplasmídeo de teto P que regula gfp. Sem o repressor TetR, o promotor PtetO atua como promotor constitutivo. O circuito é clonado em plasmídeos de número baixo. Este plasmídeo atua como base para a medição de SNR para qualquer circuito modificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Mapaplasmídeo de Pteto que regula a SFGFP. O SFGFP é fundido a uma etiqueta de degradação AAV. O circuito é clonado em plasmídeos de número baixo. O sfGFP-AAV é uma variante mais robusta do GFP, enquanto a tag AAV torna-a suscetível à degradação por proteases de limpeza da Escherichia coli. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Mapa plasmídeo do circuito de feedback positivo. O circuito é induzido por um indutor AHL, que liga o fator de transcrição luxr. O promotor PluxR, que é regulado pelo complexo AHL-LuxR, ativa a produção de LuxR e sfGFP-AAV. O circuito é clonado em plasmídeos de número baixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9:A dinâmica do crescimentoda cepa Escherichia coli MG1655 em mídia mínima inclui (a) PtetO-GFP, crescimento exponencial de cerca de 35 minutos. As imagens deste experimento são mostradas na Figura 2 (b) PtetO-sfGFP, crescimento exponencial de cerca de 35 minutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Nível de intensidade fluorescente, normalizado por pixel e adquirido em intervalos de 20 minutos.
As células são escandaladas de acordo com a área, a fim de minimizar artefatos. As células são divididas por sua área em um quadrado de micrômetro (a) Pteto-GFPprimeiro repetição para intensidade em 210 minutos é 0,004 a.u (b) PtetO-sfGFP primeiro circuito de intensidade em 210 minutos é 0,022 a.u (c) Sinal medido do circuito Pteto-GFP(d) Sinal medido de PtetO-circuito SFGFP. Todos os dados experimentais representam a média de três experimentos. O software pode classificar a área celular para diferentes grupos (a) e (b) mostrar gráficos para quatro faixas de área celular representando o ciclo de divisão. A primeira área de 14 micrômetros representa células após divisão, como é mais provável que as células após a divisão sejam as menores. A segunda área de 21 μm representa células antes da divisão. A terceira e quarta áreas representam células em divisão, pois a área total é multiplicada por duas (29 e 36 μm) para considerar células que demoraram mais tempo para se dividir. As áreas foram escolhidas avaliando manualmente os dados que analisam imagens de microscopia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11:Desvio padrão (DST) de intensidades de fluorescência de células únicas para: (a) PtetO-GFP primeiro repetição do circuito de DST em 210 minutos é 0,001865 a.u(b) PtetO-circuito SFGFP primeira repetição para DST em 210 minutos é 0,01477 a.u(c) DST do circuito Pteto-GFP(d) D ) DST de PtetO- circuitoSFGFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12:SNR de intensidades de fluorescência celular única. Calculamos a primeira repetição do circuito SNR=Mean/STD(a) PtetO-GFP para SNR em 210 minutos é de 1,309 a.u(b) PtetO-sfGFP primeiro repetição para SNR em 210 minutos é de 1,29 a.u(c)Três repetições de medição GFP(d)Três repetições de medição sfFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13:SNR de intensidades de fluorescência de células únicas (a)PluxR- circuitoSFGFP SNR para resposta de saturação à AHL (b) PluxR-sfGFP circuito SNR para resposta ao intervalo da AHL. O SNR de feedback positivo circuito regulado AHL é maior que o SNR para circuito sfGFP constitutivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14: Histogramas dos circuitos genéticos com base no analisador de fluxo: dados experimentais (azul) e dados do modelo estocástico (vermelho). O eixo x representa unidades arbitrárias de fluorescência a partir da citometria de fluxo, e o eixo y representa a frequência das células que produzem o nível correspondente de fluorescência. Os dados foram medidos por meio de um analisador de fluxo após três horas. A fluorescência de GFP foi quantificada pela excitação em um comprimento de onda de 484 nm e emissão a um comprimento de onda de 510 nm. As tensões do filtro PE-TexasRed foram usadas em um sampler de alto rendimento para medir os níveis de expressão de GFP. As tensões do analisador de fluxo foram ajustadas utilizando-se software para que os níveis máximos e mínimos de expressão pudessem ser medidos com as mesmas configurações de tensão. Assim, foram utilizadas tensões consistentes em cada experimento inteiro. As mesmas tensões foram utilizadas para repetições subsequentes do mesmo experimento. A montagem foi feita por meio da distribuição gama31. Este método pressupõe que o sinal depende principalmente da distribuição aleatória de plasmídeos(a) Medição do clone Pteto-GFP em plasmídeo de número de cópia baixa. CV experimental=0,46, Modelo CV=0,32 (b) Medição dotetoP -sfGFP-AAV clonado em plasmídeo de número de cópia baixa. CV experimental=0,86, Modelo CV=0,44. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 15: Histogramas dos circuitos genéticos baseados em microscópio: dados experimentais (linhas pontilhadas) e dados de modelos estocásticos (linhas sólidas). O eixo x representa unidades de fluorescência arbitrária do microscópio invertido e o eixo y representa a frequência das células que produzem o nível correspondente de fluorescência. A montagem foi feita utilizando-se a distribuição gama MATLAB31,32 (a) Medição do clone PtetO-GFP em número de cópia baixa plasmid(b) Medição de PtetO-sfGFP-AAV clonado em número de cópia baixa. A comparação mostra que nosso protocolo obtém valores de CV semelhantes ao do experimento do analisador de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Quatro razões de diluição, entre 1:500 e 1:20, para a cepa MG1655. O gráfico mostra que se a densidade inicial é alta, os nutrientes LB são abundantes, resultando em células se dividindo mais rapidamente. Para uma diluição de 1:500, a densidade celular permaneceu constante. Para uma diluição de 1:100, a densidade celular aumentou lentamente. Para uma diluição de 1:50, a densidade celular aumentou a uma taxa de divisão moderada sem atraso significativo na incubação de 250 RPM. Para uma diluição de 1:20, a densidade celular atingiu a saturação rapidamente. Optamos por uma taxa de diluição de 1:30, permitindo uma incubação curta para alcançar crescimento exponencial e faixa de divisão substancial para alcançar alta saturação a uma taxa de divisão moderada. Clique aqui para baixar este número
Figura suplementar 2: Processamento de imagens de campo brilhantes. aImagens de intensidade de dados brutos do canal de campo brilhante do sistema de microscópio. (b) Manipulação de aprimoramento de contraste da imagem para melhorar a separação de objetos celulares do fundo. (c) Reconhecimento de limite de células com base no filtro de convolução33 e limiar global baseado em binarização34. d35 operações morfológicas de fechamento e enchimento para identificar limites de colônias celulares. Clique aqui para baixar este número
Figura suplementar 3: Antecedentes da colônia celular\segmentação em primeiro plano. Para minimizar o impacto do ruído, tentamos identificar os limites das colônias celulares e extraí-las do ruído do gel. (a) Operação de binarização de imagem no aprimoramento do contraste com base no limiar adaptativo para detectar objetoscelulares 36. (b) Multiplação matricial de matrizes apresentadas em S2d e S3a filtrando com sucesso a maioria dos ruídos e diferenciando o ruído do gel das células. Alguns limites não estão totalmente resolvidos. (c) Identificação dos limites celulares usando um algoritmo de bacia hidrográfica37 baseado na mudança de distância38. dMultiplação matricial de matrizes apresentadas em S3b e S3c com sucesso resolvendo células únicas. Clique aqui para baixar este número
Figura suplementar 4: Segmentação de células únicas. (a) Produto segmentado de imagem de campo brilhante. A limpeza adicional é pré-formada com base na gengização e forma da área celular, descartando bolhas redondas. (b) Imagens de sinal de fluorescência adquiridas a partir de microscópio. (c) Multiplação matricial de matrizes apresentadas em S4a e S4b extraindo com sucesso o sinal de células únicas. Clique aqui para baixar este número
Figura suplementar 5: Perda de monocamadas. (a) Imagem de campo brilhante de uma camada celular a 840 minutos (14 horas) deteto P que regula o circuito GFP mostrado na figura 2 no artigo como um bom experimento. No lado direito da microscopia a perda de imagem da monocamadas pode ser detectada. b Imagem de segmentação de software. Devido à perda de células monocamadas são fragmentadas e serão limpas base em gating de área. (c) Imagem de fluorescência mostrando que no lado direito da imagem nenhuma célula pode ser resolvida e um baixo sinal de células no lado esquerdo da imagem devido à perda de monocamada. dImagem de segmentação combinada com imagem de fluorescência. Clique aqui para baixar este número
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Discussion
Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo que permite o rastreamento computacional de células vivas Escherichia coli, seguindo níveis de divisão e fluorescentes durante um período de horas. Este protocolo nos permite quantificar a dinâmica estocástica dos circuitos genéticos em Escherichia coli medindo o CV e o SNR em tempo real. Neste protocolo, comparamos os comportamentos estocásticos de dois circuitos diferentes, como mostrado na Figura 10. Foi demonstrado que plasmídeos com baixo número de cópias são mais propensos a efeitos estocásticos e menos afetados pela divisão celular. O primeiro circuito expressa constitutivamente GFP (Figura 10a), e o segundo circuito expresso constitutivamente sfGFP fundido a uma tag de degradação ssrA(Figura 10b). Para quantificar o comportamento estocástico das proteínas fluorescentes, também registramos as imagens de campo brilhante. Os resultados mostram que a expressão de GFP, especificamente em sua maturação39,é a fonte de ruído dominante. O padrão periódico de comportamento dentário da serra observado na Figura 10a pode ser explicado pelo processo aleatório de divisão celular e pela escala de longo tempo da maturação do GFP (~50 minutos). Em contrapartida, o sinal sfGFP do segundo circuito foi estabilizado durante a medição, pois o tempo de maturação muito curto do SFGFP (~6 minutos). Desenvolvemos uma fórmula simples que descreve o nível de GFP em ambos os circuitos quando consideramos apenas o processo de divisão celular e tempo de maturação do GFP. Em um dado momento, t, assumimos que há x copiar números de proteínas, e μ copiar números de plasmídeos. O número da cópia da proteína pode ser descrito por:
1.3
1.4
Quando se considera apenas eventos de divisão; 
após a maturação da proteína e assim para os plasmídeos específicos que temos:
Para GFP ( 
): 1.5
Para sfGFP ( 
):1.6
Em seguida, a série desenvolvida de sfGFP:
1.7
No caso 
disso, 
obtemos. Este resultado pode ser explicado da seguinte forma. Quando x é pequeno, os níveis de GFP sfaumentam em uma pequena quantidade. Quando x é grande, o SFGFP é degradado a um estado estável. Da mesma forma, para o circuito de GFP, cada célula contém cerca de 10 unidades de GFP, mas como o tempo de maturação para GFP é maior que a mitose, padrões dentários degradantes de intensidades de fluorescência são observados. No modelo, assumimos que a replicação do plasmídeo é rápida o suficiente para que a distribuição plasmida permaneça constante antes e depois da divisão. A etiqueta de degradação ssrA muitas vezes reduz o tempo de meia-vida da proteína de horas para menos de uma hora5 e leva a um estado estável rápido. Mostramos que o método também fornece uma distribuição semelhante à medida com um analisador de fluxo populacional elevado e que o CV dessa distribuição é igual ou menor do que o analisador de fluxo CV.
Enquanto vários métodos3,7,18 foram desenvolvidos para imagens de células vivas, o método aqui apresentado é adaptado especificamente à Escherichia coli. Esta bactéria requer uma mídia especial e uma abordagem ligeiramente diferente. O protocolo tem as seguintes características importantes: (1) Estabelecer uma taxa de diluição específica para as bactérias e a tensão no início do crescimento exponencial em vez de no estágio médio (crescimento exponencial sem agitação) (2) Escherichia coli melhor dividir em 37 °C, mas a 37 °C o gel de mídia mínimo perde água rapidamente que leva ao encolhimento e instabilidade. O protocolo aqui supera esse desafio (3) Primeiro aplicamos a amostra de bactérias e depois aslamos com gel líquido. Como a amostra está presa entre o fundo de vidro e o gel, exigimos um gel que (I) permite a troca de gás para evitar cortar bolsas de ar, (II) permanece líquido a baixas temperaturas, pois Escherichia coli é sensível ao calor e (III) garante que a amostra não será misturada dentro do gel líquido. O gel permanece líquido a 37 °C, no entanto, recomendamos o uso de uma tampa protetora em cima da amostra para evitar calor excessivo e mistura de amostras dentro do gel (4) Esta abordagem requer simples, equipamento genérico (5) As amostras podem ser medidas diretamente sem pré-aquecimento, portanto não há perda de eventos de divisão (6) O protocolo, que inclui as etapas de laboratório molhado e o software automatizado personalizado, pode ser usado para estudar o comportamento estocástico de circuitos genéticos como quantificação do SNR e cv de sinais de circuito. Comparamos o método de microscopia aos resultados do analisador de fluxo, a fim de validar o uso de pequenas populações de células e estabelecer uma linha de base para comparação de acordo com cv (7) O software permite detectar células na monocamada sem intervenção humana e analisar o ruído total. Ferramentas de software como ImageJ18 ou Schnitzcells exigem identificação manual de células e são desafiadoras para ajustes.
Ao fotografar continuamente colônias de células vivas, projete o experimento considerando vários parâmetros físicos complexos, como estresse celular e toxicidade, taxa de esgotamento de recursos, necrose e tempo de degradação de indutores e produtos químicos. O protocolo permite uma medição confiável de até cinco horas. Nossos experimentos sugerem que Escherichia coli sincroniza ao se dividir em micro colônias de monocamadas(Vídeo Suplementar 3). Assumimos que o gel é uniforme em termos de recursos e dureza, as células têm comportamento semelhante, e o campo de iluminação é ligeiramente maior do campo de visão. Assim, cada célula deve produzir o mesmo sinal e dados estatísticos, que podem ser coletados como mostramos comparando cv obtidos desta forma à medição com um analisador de fluxo. A fim de medir o ruído em condições iniciais constantes por períodos mais longos de tempo, consideraremos usar chips microfluidos no futuro. Outros benefícios desse dispositivo são a manutenção de posições fixas das células e o foco estável10. Ainda assim, design, fabricação de chips microfluidos e priming para experimentos exigem treinamento, equipamentos específicos (feitos sob medida às vezes) e tempo. Por essa razão, é benéfico usar microscopia de lapso de tempo, como mostrado neste protocolo para adquirir uma compreensão geral do circuito.
O protocolo proposto e o software desenvolvido permitem medições reprodutíveis, das quais é simples derivar gráficos. Também permite testes e comparação de ruído total e pode ser modificado para medir ruídos intrínsecos e extrínsecos. O método é baseado em materiais genéricos ou fáceis de encomendar, abertamente compartilhados, fácil de usar software e não requer treinamento específico. Mostramos que a população medida pela microscopia é grande o suficiente para obter dados significativos, comparando o método CV com o obtido com um analisador de fluxo. Portanto, podemos estabelecer com sucesso uma linha de base SNR usando este protocolo e compará-la com circuitos genéticos mais complexos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Sr. Gil Gelbert (Faculdade de Engenharia Elétrica, Technion) por ajudar com o código MATLAB. Agradecemos ao Dr. Ximing Li (Faculdade de Engenharia Biomédica, Technion) por auxiliar na comprovação deste artigo. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada pela Fundação Da Família Neubauer e pelo Ministério da Ciência de Israel, bolsa 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
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