Summary
Bu çalışma, sentetik gen devrelerinin stokastik davranışının analizi ve nicelleştirilmesi için tek bir Escherichia coli hücresinin canlı görüntülenmesini sağlayan bir mikroskopi yöntemi sunun.
Abstract
Burada geliştirilen protokol, Escherichia coli bölümünün ve floresan seviyelerinin birkaç saat boyunca bilgisayar takibini sağlamak için bir araç sunmaktadır. Süreç, sadece doğru plazmidi barındıran Escherichia coli'nin belirli koşullarda gelişebileceğini varsayarak, minimum medyada hayatta kalan kolonileri tarayarak başlar. Birçok DNA parçasının montajını gerektiren büyük genetik devreler oluşturma süreci zor olduğundan, devre bileşenleri genellikle birkaç antibiyotik kullanılmasını gerektiren farklı kopya numaralarında birden fazla plazmid arasında dağıtılır. Plazmiddeki mutasyonlar antibiyotik direnci genlerinin transkripsiyonunu yok edebilir ve nekroza yol açan hücredeki kaynak yönetimi ile kesişebilir. Seçilen koloni cam tabanlı bir Petri kabına ayarlanır ve hem parlak alanda hem de floresan etki alanlarında mikroskopi takibi için birkaç odak düzlemi seçilir. Protokol, düzenlenemeyen ilk koşullar altında görüntü odağını 12 saatten fazla tutar ve birkaç zorluk yaratır. Örneğin, ölü hücreler birkaç saatlik görüntülemeden sonra lenslerin odak alanında birikmeye başlar, bu da toksinlerin birikmesine ve sinyalin bulanıklaşmasına ve çürümesine neden olur. Besinlerin tükenmesi yeni metabolik süreçleri tanıtır ve devrenin istenen yanıtını engeller. Deneyin sıcaklığı indükleyicilerin ve antibiyotiklerin etkisini düşürür ve bu da sinyalin güvenilirliğine daha fazla zarar verebilir. Minimum ortam jeli küçülür ve kurur ve sonuç olarak optik odak zamanla değişir. Bu yöntemi geliştirdik Escherichia coliDiğer mikro organizmalar için benzer yöntemler geliştiren önceki çalışmalara benzer. Buna ek olarak, bu yöntem değişmemiş ve değiştirilmiş hücrelerdeki toplam stokastik gürültüyü ölçmek için bir algoritma sunar ve sonuçların benzer bir değişim katsayısı (CV) ile gösterildiği gibi akış analizörü tahminleri ile tutarlı olduğunu bulur.
Introduction
Sentetik biyoloji, son on yılda ortaya çıkan ve mühendislik tasarım ilkelerini rasyonel biyolojik tasarım 1 , 2,3, temel bilimi anlamak için canlı hücrelerde çok sinyalli entegrasyon ve işlemeyi sağlamak amacıyla 4,5, tanısal, terapötik ve biyoteknolojik uygulamalar6,7,8,9,10'a çevirmeyi amaçlayan multidisipliner bir alandır. Sentetik gen devrelerinin giriş-çıkış tepkisini ölçme yeteneğimiz, otomatik zaman atlamalı mikroskopi11kullanılarak akış analizörü ve canlı hücre görüntüleme de dahil olmak üzere tek hücreli teknolojideki son gelişmelerle devrime uğradı. Bir akış analizörü genellikle bu devrelerin tepkisini sabit durumda ölçmek için kullanılır1,12ve ters mikroskopi, sentetik gen devrelerinin dinamik tepkisini tek bir hücre düzeyinde ölçmek için kullanılır3. Örneğin, sentetik biyolojideki ilk çalışmalardan biri, gecikmeli negatif geri bildirim döngüleri kullanılarak canlı hücrelerde genetik osilatör ağlarının inşasını içeriyordu3. Daha sonra, canlı hücrelerin dinamik ortamında metabolik kontrolü anlamak için genetik osilatör devreleri uygulandı4. Otomatik zaman atlamalı mikroskopi, bu tür devreleri karakterize etmek için bir yöntemdir. Konak hücrelerin, Escherichia coli, mikro koloniler oluştururken senkronize olduğunu, tam anne-kız ilişkilerini izlemeden sinyal ölçümüne ve gürültünün hesaplanmasına izin verdiğini vardır.
Gürültü, biyolojik sistemlerin genellikle birden fazla kaynaktan kaynaklanan temel, doğal bir yönüdür. Örneğin, proteinlerin difüzyonu gibi ayrık rastgele taşıyıcıların taşınmasından kaynaklanan sinyalleri içeren biyokimyasal reaksiyonları düşünün13. Bu sinyaller rastgele dalgalanmalarla yayılır14. Diğer gürültü kaynakları kaynak kullanılabilirliği, hücre bölünmesi ve sıcaklık, nem ve basınç gibi çevresel koşullardaki farklılıklardır. Sentetik gen devrelerinde yayılan biyolojik sinyaller genellikle gürültü oranına (SNR) çok düşük bir sinyale sahiptir ve bu da bu tür devrelerin performansını bozmaktadır. Bu nedenle, genetik devre tasarımı genetik mühendisliğinin en zorlu yönlerinden biri olmaya devam etmektedir15. Örneğin, yalnızca ortalama gen ekspresyonunun hesapladığı çoğu yaklaşımın aksine (tüm hücre popülasyonu üzerinden ölçülür), sentetik gen ağları aracılığıyla öngörülebilir davranışı tasarlamak için ölçülen sinyalin varyansı dikkate alınır12. Bu nedenle, protein ifadesindeki değişkenlik veya gürültü seviyeleri, analog ve dijital gen devrelerinin tasarımında ve performansında baskın bir rol oynar1,16,17.
Escherichia coli3,7,18dahil olmak üzere hücreden hücreye değişkenliği ölçmek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntemler genellikle gen aktivasyonunu ve metabolik yolları incelemek için kullanılır, ancak özellikle bunun temel bir zorluk olduğu canlı hücrelerdeki genetik devreler için belirli gürültü kaynaklarını ölçmek ve dağıtmak gibi stokastik gürültü dinamiklerinin incelenmesine daha az odaklanarak19,20,21. Hem devrenin kendisine miras kalan (içsel) hem de konak hücrelerden (dışsal) türetilen çeşitli faktörler genetik devrelerin sürekli performansını bozabilir. Bu yazıda, içsel ve dışsal gürültü kaynakları da dahil olmak üzere Escherichia coli hücrelerindeki toplam gürültüyü ölçmeyi amaçlayan bir protokol geliştirdik6,22. Toplam gürültüyü ölçerek ve daha sonra SNR23'ü değerlendirerek gen devrelerinin tasarımı geliştirilebilir. Bu yöntem, birkaç floresanproteiniizleyerek bağımsız gürültü kaynaklarını ayrı ayrı ölçmek için değiştirilebilir 6,20. Burada açıklanan protokol için çevre koşullarını iyi kontrol altında tutuyor ve dış faktörlerin etkisi olmadan hücrelerin aktivitesini sürekli ölçüyoruz. Floresan proteinlerden gelen sinyali zaman içinde tek hücrelerde ölçtük ve aynı anda bir agarose substratı altında görüntüleyeceğiz. Elde edilen görüntüler laboratuvarın özel MATLAB'ı kullanılarak analiz edilir.
İdeal olarak, bir hücre içindeki floresan proteinlerin gerçek zamanlı aktivitesinin sürekli ölçümü, hücrelerin büyümesi ve bölünmesi yoluyla doğru veriler üretecektir. Ancak, bu tür verileri elde etmek zordur. Bunun nedeni, foto-ağartma7olarak bilinen floresan proteinlerin, heyecanlanma sürecinde radyasyona maruz kaldıklarında bozulmasıdır. Ayrıca, Escherichia coli hücreleri de fototoksiteye yol açabilecek heyecan için hassastır7. Her iki sorun da elde edilebilen fotoğraf karelerinin miktarını ve satın almalar arasındaki süreyi sınırlar. Görüntüleme sırasında hücreleri büyütmek için kullanılan substrat ve orta tipler (örneğin, lysogeny et suyu) da kritik bir role sahiptir. Floresan olmayan arka planı en aza indiren ve hücre bölünme süresini uzatan minimum ortam kullanmanızı öneririz.
Ayrıca, numunenin aşağıdaki gereksinimler göz önünde bulundurularak hazırlanması gerekir (1) Düşük hücre bölünme oranı, bölme döngüsünü yakından görüntülemek ve fototoksiklik ve fotobleaching olasılığını azaltmak için daha az sıklık pozlama sağlar. Edinme süresini öngörülen mitoz süresinin yaklaşık yarısına ayarladık (2) Deneyin başındaki düşük hücre yoğunluğu, bölünmenin daha iyi homojenliğini ve izlenebilirliğini sağlar. Hücre yoğunluğu, bu protokolün başarısı için önemli bir parametre olan ve her laboratuvar için belirlenmesi gereken Escherichia coli hücrelerinin seyreltme oranından etkilenir. Oranı belirlemek için, kullanılan her yeni Escherichia coli suşu veya ortamı büyüme hızı grafikleri ile donatılmalıdır(Tamamlayıcı Şekil 1). Hücreler yaklaşık600nm = 0.1 başlangıç yoğunluğundan kısa bir inkübasyondan sonra ek titreme olmadan büyüyebiliyorsa uygun bir oran elde edilmiştir. Bu aşamadaki hücreler sadece ortam sıcaklığına göre bölünür (3) Hücre hareketinin kısıtlanması: hücre hareketi güçlü bir şekilde substrat (agarose pad) sıkılığına bağlıdır. Substrat sıkılığı toplam agarose miktarına ve jel katılaşma süresine bağlıdır. Escherichia coli mitoz geçireceğinden, jeller oda sıcaklığında bir gecede katılaşmaya bırakılamaz. Substrat stabilitesini etkileyen diğer faktörler arasında numunedeki su miktarı ve nem sayar. Ek konular Temsilci Sonuçları 'nda ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Bu protokol birçok ayrıntı sağlar ve yavaş yavaş bir adımdan diğerine geçer. Protokol, görüntüleme deneyleri için uzun kararlılık sunar ve temel bir görüntü işleme aracı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medya ve kültür hazırlığı
- 1.000x Karbenisilin (50 mg/mL) veya ilgili antibiyotik stok çözeltisi hazırlayın.
- . 0,5 g karbenisilin ağırlığında. 10 mL steril H2O ekleyin.
- Karbenisilin stoğunu 0,22 μm şırınna filtresi ile sterilize edin. Antibiyotik çözeltisini aliquot ve -20 ° C'de saklayın.
- Lysogeny et suyu (LB) plakaları hazırlamak için, 5 g tripto, 5 g NaCl, 2,5 g maya özü ve 7,5 g Bacto agar'ı 0,5 L steril H2O ile karıştırın.
- Erimiş jel karışımını 50 °C'lik bir su banyosuna kısmen batırın. 1.000 μL karbenisilin (50 mg/mL) ekleyin.
- Petri yemeklerini steril bir ortamda hazırlayın. Tabakları buzdolabında saklamadan önce ayarlamak için bırakın.
- M9 minimal ortam için aşağıdakilerin ayrı stok çözümlerini hazırlayın: 5x M9 tuzları (56,4 g/L), 2 M glikoz ve% 2 biyotin içermeyen casamino asitleri. Çözümleri 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın.
- 5 Petri plakası hazırlamak için, 1125 mg düşük eriyen agar ve 400 mg agar'ı 89,2 mL minimum ortamla (1x M9) karıştırın. 250 mL Erlenmeyer şişeye %2 casamino asitlerinin 10 mL'sini (%2 [vol/vol]) ekleyin.
NOT: Ortamı şişenin iç dudaklarına döktüklerinden emin olun. - Çözeltiyi 3 ila 4 saniyelik kısa aralıklarla mikrodalgaya koyun. Çözüm net olana kadar tekrarlayın.
NOT: Kaynama noktasına ulaşmamaya dikkat edin. - Difüzyonla daha fazla karıştırmak için 250 mL Erlenmeyer şişesini sıcak bir su banyosuna (60 °C) yerleştirin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar soğumaya bırakın.
- Plaka döken bankta alevi yak.
- Tüm çözümleri aşağıdaki sırayla hızla ekleyin:
%50 gliserol 800 μL (%0,4 [vol/vol])
100 μL tiamin (B1)
1100 μL Glikoz (2M)
100 μL Karbenisilin (50 mg/mL). - Agar boyunca tüm bileşenlerin eşit dağılımını sağlamak için Erlenmeyer şişesini döndürün.
- Alevin yanında her seferinde bir tabak açın ve dökülmeye başlayın.
- Plakaları ilk katılaşmaya kadar birkaç dakika tezgahta bırakın.
- Su yoğuşmasının jel üzerine damlamasını önlemek için plakaları ters çevirin.
- Tabakları oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat katılaşmak üzere bırakın.
- Plakalar katılaştıktan ve kuruduktan sonra, yaklaşık 3 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. Bakteri suşları ve plazmidler yapımı
NOT: Genetik devre bir bölüm içerir; bir PtetO promotörü tarafından yönlendirilen ve constitutive ifade ile sonuçlanan bir Yeşil Floresan Protein (GFP). Bu çalışmadaki tüm plazmidler temel moleküler klonlama teknikleri kullanılarak inşa edildi ve standart bir ısı şoku protokolü 24 kullanılarak Escherichia coli 10β'yedönüştürüldü. Son yapı, test için Escherichia coli MG1655 vahşi tip suşuna dönüştürüldü.
- Standart ısı şoku protokolü24ile istenen plazmidi Escherichia coli MG1655 hücrelerine dönüştürün.
- Dönüştürülmüş hücreleri 37°C'de bir LB agar plakasında bir gecede büyütün.
NOT: Petri yemeklerini mikroskopi kullanımı için 2,2 adımdan 3 güne kadar saklamak mümkündür. - Tek bir koloniyi cam bir tüpte ilgili antibiyotiklerle desteklenmiş 5 mL LB suyuna aşıla.
- Sıvı bulanık olana kadar 2 saat boyunca inkübatörde 250 rpm sallama hızı ile 37 °C'de hücreleri büyütün.
- Aşağıdaki gibi 1 mL seyreltme çözeltisi hazırlayın:
892 μL minimum ortam (1x M9)
%50 gliserol 8 μL (%0,4 [vol/vol])
%2 Casamino asitlerinin 100 μL'si (%0,2 [wt/vol])
1 μL tiamin (B1)
11 μL Glikoz (2 M)
1 μL ilgili antibiyotik- Karıştırın ve aşağı çevirin.
- 1000 μL seyreltme çözeltisine (adım 2.5) 30 μL Escherichia coli büyümesi ekleyerek hücre kültürünü (1:30) adım 2.4'ten 2 mL tüpe seyreltin.
- Tüpü 37 °C'de sallama (250 rpm) ile 1 saat kuluçkaya yaslanın.
- Adım 1.10'da hazırlanan M9 plakalarda 40 μL - 60 μL büyüyün. Plakayı gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Kaplama için Optik Yoğunluk (OD600nm)0,1 civarında olmalıdır. - Tezgaha en fazla üç 35 mm cam alt plaka yerleştirin.
NOT: Plakanın camının kullanılan mikroskop lensleri için doğru kalınlıkta olduğundan emin olun. - Jel plakalarda tohumlama için kültürü hazırlayın, adım 2.9 mikroskop ölçümlerinde hazırlanan plakadan koloniler için 2.3 ila 2.6 adımlarını tekrarlayın.
- Üç mikroskop plakası yapmak için aşağıdaki çözümü hazırlayın.
- Su banyoyu önceden 60 °C'ye ısıtın.
- 112,5 mg düşük eritme agar ve 40 mg agar'ı 8,92 mL minimum ortamla (1x M9) karıştırın ve 25 mL Erlenmeyer şişesinde% 2 casamino asitlerinin (% 0,2 [vol/vol]) 1 mL'sini ekleyin.
NOT: Ortamı şişenin iç dudaklarına döktüklerinden emin olun.
- Çözeltiyi 2 ila 3 saniyelik kısa aralıklarla mikrodalgaya koyun. Çözüm net olana kadar tekrarlayın.
NOT: Kaynama noktasına ulaşmamaya dikkat edin. - 25 mL Erlenmeyer şişesini difüzyonla daha fazla karıştırmak için sıcak su banyosuna (60 °C) yerleştirin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar bankta soğumaya bırakın.
3. Agarose pedlerinin hazırlanması
- % 70 etanol ile temiz tezgah. Temizlenmiş bankta bant ger. Bandın pürüzsüz ve düz olduğundan emin olun.
- İki kapak hazırlayın: biri bantta ve ikincisi yakınlarda. Bir kapak hazırlayın.
- Şişeyi (adım 2.14'te hazırlanan) su banyosundan çıkarın, şişenin dışını temizleyin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar soğumaya bırakın.
- Jel çözümünü yapmak için, tüm çözümleri aşağıdaki sırayla hızlı bir şekilde karıştırın:
%50 gliserol 80 μL (%0,4 [vol/vol])
%2 casamino asitlerinin 1 mL'si (%0,2 [wt/vol])
10 μL tiamin (B1)
110 μL glikoz (2 M)
10 μL ilgili antibiyotik. - Jelin 1,5 mL'lik kısmını kapak kapağına dökün ve ikinci parça ile "sandviç" yaparak örtün.
- Erlenmeyer'i sıcak su banyosuna geri verin. Sandviçi kapakla örtün ve zamanlayıcıyı 20 dakika ayarlayın.
- Aynı zamanda, tüpü 37 °C'de 1 saat boyunca 2.11 adımından sallanarak kuluçkaya yatırın (250 rpm)
- 20 dakika sonra sandviçi çevirin (adım 3.5), örtün ve 1 saat dinlenmeye bırakın.
NOT: Daha iyi sonuçlar için "sandviçi" adım 3.8 süresince 4 °C'de dinlenmeye bırakın. - Tohum Escherichia coli kültürü adım 3.7 örnek pipetleme ile 35 mm çanak.
NOT: Ayrı küçük damlalar olarak 6 μL hücre pipetleme en iyi sonuçları verir. - Damlaların en az 15 dakika ve 30 dakikaya kadar kurumasını bekleyin.
- Kapak kapağını kaydırarak sandviçin katılaşmış jelini adım 3.8'den itibaren ortaya çıkarın.
- Sandviçi biyopsi zımbası veya ucu ile küçük bireysel pedler halinde kesin.
- Numuneye hafifçe yaslayın (adım 3.9). Yemeği bankta 20 dakika bekletin.
4. Numunenin mikroskopi görüntüleme için hazırlanması
- Matarayı su banyosundan adım 3.6'dan çıkarın. Şişenin dışını temizleyin ve oda sıcaklığına (25 °C) soğumaya bırakın.
NOT: Zamanlayıcı bitmeden yaklaşık 3 dakika önce 4.1. - Jelin 3 mL'lik kısmını dairesel bir hareketle plaka çevresine sürekli olarak dökün. Birkaç dakika katılaşmaya bırakın.
- Plakaları bantla kapatın ve 25 G iğne ile birkaç delik delin. Jel üzerine su yoğuşmasını önlemek için tüm bulaşıkları çevirin.
- Hücre mitozini önlerken tam katılaşmaya izin vermek için tüm bulaşıkları 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Art arda ölçümler için numuneleri en fazla bir gün olmak üzere 4 °C'de bırakın. - Üretici başına mikroskobu başlatın yönergeleri.
- En düşük amplifikasyon lensini kullanarak ilk odağı bulun ve otomatik odak sistemini (AFS) devreye sokun.
- Gerekirse yağ kullanın, lensi yağ ile boğun ve plakayı bir platform denetleyicisiyle (manuel olarak değil) hareket ettirerek dikkatlice yayın ve AFS tekrar devreye sokabilir.
- Z adım kesitleri için varsayılan öneriyi izleyerek Z yönünde göreli kesit kullanın.
NOT: Her 5 dakikada bir parlak alan görüntüleri ve 20 dakikada bir floresan görüntüler çektik. Bazen odağın ilk 30 dakika boyunca ayarlanması gerekir. Mikroskop inkübatör kutusunu ve yağı önceden ısıtmak, numuneyi soğutmak ise ilk odak kaybını azaltmaya yardımcı olma eğilimindedir.
5. Veri analizi
NOT: Mikroskopi verilerini işlemek için MATLAB'da bilgisayar tabanlı bir yazılım tasarladık. Bu yazılım, parlak alan tiff görüntülerinden ve segmentlerinden hücre sınırlarının tanımlanmasını kolaylaştırır ve hücreleri alana göre sıralar. Bu görüntü analizinin çıktısı, hücre yoğunluğu seviyelerini türetmek ve mikroskop çözünürlük sınırları nedeniyle hücre halesi gibi floresan etki alanındaki yapıtları iptal etmek için floresan tiff görüntülerinde maske olarak kullanılabilir. Geliştirilen yazılım benzer çalışmalardan esinlenmiştir7,25,26,27,28,29,30 ve laboratuvar için özel zarif bir çözüm sağlar.
- İlk olarak, main_code.maşağıdaki parametreleri tanımlayın.
- Edinme görüntülerinin klasörünü tanımlayın.
- Görüntü süresi süresini tanımlayın - parlak alan kanalı zaman adımı dakika olarak.
- GFP sıklığını tanımlayın - GFP görüntülerinin alım oranı.
- Mikroskop çözünürlüğünü tanımlayın (yani, kaç pikselin 1 μm'ye eşit olduğu).
- Histogram kutusu aralığını tanımla - hücre alanı aralığı.
NOT: Verilerin hücre alanına göre sınıflandırılması işlemi, akış sitometrisi veri analizinde gating ilkelerine benzer. Kapılar, bu ilgi popülasyonlarını izole etmek ve ölçmek için genellikle ileri dağınık ve yan dağınık ortak özelliklere sahip hücre popülasyonlarının etrafına yerleştirilir. Mikroskopi, birkaç hücre grubuna geçit, araştırma ve ölçme sağlar. - Konilüs çekirdeğini tanımla (3,3) - bu parametre hücre sınırlarını genel eşik(count_cells.m)ile algılar.
NOT: Bu kurulum yalnızca laboratuvar veya mikroskobu değiştirirken gereklidir. Yazılım, giriş parlak alan kanalının c1 dizini, floresan kanalı c2 olarak etiketlenmesini gerektirir.
- Diğer tüm komut dosyalarını otomatik olarak çalıştıracak main_code.m çalıştırın (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Program parlak alan görüntülerini otomatik olarak segmentlere ayırır (bkz. Ek Şekil 2-4).
- Hücre başına yoğunluk düzeyi ayıklamak için segmentasyon görüntüsünü floresan görüntü (GFP) ile birleştirin.
- Hücrelerin miktarının grafiğini zamana göre hesaplayın ve üstel büyümeye göre sığdırın.
- Her hücre alanı aralığı için ortalama ve standart sapmayı (STD) hesaplayın.
- Her hücre alanı aralığı için sinyali gürültü oranına (SNR) hesaplayın.
- Hücre miktarının yoğunluğa göre dağılımını çizin ve sığdırın.
- Varyans (CV) katsayısını hesaplayın ve akış çözümleyicisi verileriyle karşılaştırın.
NOT: Yazılım, "klasörünüz/Segmentli" yeni bir klasördeki conv_kernel ayarlamak için son segmentasyon görüntülerini çıktı olarak verecektir. Yazılım, yeni bir klasördeki grafikleri çıktı olarak verecektir "klasörünüz/Grafikleriniz.
- Deneyler arasında karşılaştırma yapmak için compare_experiments.mkullanın.
- Kaydedilen grafikler için dizinler ve \CompareResult dizininin adresini tanımlayın.
- Dosyayı çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yazılım, beyaz ve siyah olmayan parlak alan adı görüntülerini analiz eder. Escherichia coli, beyaz olmayan bir arka plan üzerinde siyah dikdörtgen şekillere benzeyecek ve dinamik parlaklık aralığı merkezinde bir artış göstermelidir (Şekil 1). Floresan görüntülerde hücreler küçük bir haleye sahip olabilir, ancak dikdörtgen şekillere sahip bireysel hücreler hala çözülebilir. Bir mitoz olayı ilk olarak 30 dakika sonra tespit edilmelidir. Mikroskop odağı zaman içinde sabit kalmalıdır ve hücreler bu 30 dakika boyunca yavaş hareket etse de, görüş alanını terk etmeleri olası değildir. Böyle bir deney iyi olarak kabul edilecektir ve Şekil 2'de görüntülenebilir. Düşük büyütmede parlak alan etki alanında hücreleri tespit etmek zor olabilir. Düşük büyütmede fark edilmesi kolay olduğu için ortalama odak mesafesini yüksek kopya numarası (HCN) plazmid ile belirlemenizi öneririz. Düşük kopya numarası (LCN) plazmidini önceden yüksek büyütmede ölçerken ortalama mesafeyi ayarlayın. Bu odak mesafesi esas olarak jel veya Escherichia coli suşunun kalınlığına değil, plakalara, mikroskopi sistemine ve yağa bağlıdır.
Bu protokolü diğer laboratuvarlara uyarlarken aşağıdaki konular ortaya çıkabilir (1) Yanlış seyreltme oranında hazırlanan Escherichia coli plakaları (numuneler) değişmeyen sayıda hücre gösterebilir (Şekil 3 ve Şekil 4) (2)Plaka kapatılmadan hazırlanan numuneler aşırı büzülme gösterebilir. Bu, hücrelerin sürüklenmesi (Şekil 3) veya odak kaybına neden olduğu gözlenebilir (Şekil 5) (3) Bazı örnekler yüzme hücrelerinin arka planında (beyaz) yavaş değişen 'sabit' hücreler (siyah) gösterebilir. Bu muhtemelen ıslak bir numuneden kaynaklanmaktadır ve genellikle fazla su jel tarafından emildiğinden stabilize olur (Ek Video 1) (4) Birkaç dakikalık ısınmadan sonra hiçbir hücre sergileyen örnekler yanlış hazırlanmış olabilir, muhtemelen nedeniyle: (I) Jel hala çok sıcakken döküldü, (II) koruyucu kapak unutuldu, (III) minimal ortam bir bileşenden yoksun, (IV) yanlış hücre yoğunluğu ve (V) jel çok sıkı bir şekilde mühürlendi. Jel büzülmesi pahasına gaz değişimine izin vermek için delik açmak önemlidir (Şekil 5) ve (VI) hücreler ayrıca besin arayışında jeli girintileyebilir, birini diğerinin üzerine yığabilir, hücre monolayerini tehlikeye atarak hücrelerin algılanmasını etkili bir şekilde önleyebilir ve güvenilir floresan sinyalin ölçülmesi (Ek Şekil 5).
Bu çalışmada üç devre ölçtük. İlk olarak, Şekil 6'da gösterilen GFP'yi düzenleyen bir constitutive promotör . İkincisi, Şekil 7'degösterilen süper kat GFP31'i (sfGFP) düzenleyen bir constitutive promotör . Sf GFP'ye, ad ömrünüdakika 5'edüşürmek için bir ssrAbozulma etiketi (AAV) eklendi. Üçüncü devre pozitif geri besleme devresi1'edayanır ve acyl-homoserine-lactone (AHL) tarafından indüklenmiştir. PluxR promotörü, Şekil 8'degösterildiği gibi P luxR'yi etkinleştirmek için AHL ile bağlayıcı bir transkripsiyon faktörü olan sf GFP veLuxR'yi düzenler. Şekil 9 hücre büyümesinin dinamiklerini (hücre sayıları zamana karşı), Şekil 10 ölçülen sinyalin dinamiklerini gösterir (ortalama floresan zamana karşı) ve Şekil 11 değerlendirilen toplam gürültünün dinamiklerini gösterir (standart sapma (STD) zamana karşı).
SNR (veya CV), devrenin hassasiyetini ve güvenilirliğini ifade etmek için analog elektronik devrelerin tasarımında yaygın olarak kullanılmaktadır32. CV, sinyalin tek hücreler arasındaki dağılımıyla ilgilidir ve mikroskoplar ve akış analizörleri gibi yöntemler ve farklı ekipmanlar arasında karşılaştırmaya izin verir. Mikroskop görüntülerinden SNR'yi hesaplamak, devreleri zaman içinde karşılaştırmamızı sağlar, parçalanmış hücreler, sinyale kıyasla gürültünün spesifik çözünürlüğü için bir ölçü veya belirli bir zaman ve indükleyici konsantrasyon için bir gürültü aralığı sağlamakla aynı zamanda ölçülür. Bu, dedektör hücrelerin indükleyici konsantrasyonuna tam sinyal yanıtını çözüp çözemeyeceğini gösterebilir. Bu çalışmada, bölünme döngüsündeki hücre ilerlemesine bakılmaksızın hücre olan tüm segmentlere ayrılmıştır. SNR zaman içinde belirli hücre alanı aralığı için hesaplandı ve daha sonra tekrarlanan üç deney için ortalama alındı. Ne edinilen sinyal ne de STD, kullanılan deneye ve ekipmana özgü olduğu için tek başına güvenilir değildir. Sinyal, ekipman kazanç ön ayarına, foto-dedektöre ve pozlama süresine bağlı olan rastgele birimlerle ölçülür. Şekil 10'da sunulan veriler, farklı alan aralıkları (bölme döngüsündeki noktalar) aynı eğilimi gösterdiğinden, bölme döngüsündeki hücre aşamasının gürültü seviyesini etkilemediğini göstermektedir. Bu gözlem, gürültüyü ölçmek için tam anne - kız ilişkilerinin izlenmesinin önlenebileceği ve bu da sunulan yöntem için SNR'yi geliştirebileceği iddiasını destekleyebilir. Şekil 12'degösterildiği gibi GFP ile sfGFP arasında SNR'de önemli bir değişiklik gözlenmedi. SNR'yi (SNR= ortalama/ STD) hesaplıyoruz ve Şekil 12 ve Şekil 13'te sunuyoruz.
Daha sonra aşağıdaki denklemlere dayanarak varyans ve CV'yi hesapladık31
1.1
1.2
Burada protein katlama süresi, T hücre bölünme süresi, φ ve μ bölünmeden önce ve sonra plazmid sayısı, plazmid kopya numarası31. Yukarıdaki denklemleri (1.1 ve 1.2) kullanarak gama dağılımı için akış analizörü sinyalinden gelen verileri sığdırabiliriz.
Daha sonra akış analizörü (Şekil 14) ve protokol ( Şekil15) ile ölçülen ve hesaplanan CV arasında karşılaştırdık.
Şekil 1: Parlak alan pozlama görüntüsü (a) Parlak alanda stabilize alım (b) Segmentasyon görüntüsü, sadece renkli hücreler hesaplamalara girer (c) Alımın piksel parlaklık haritası, ani artış arka plan gürültüsüdür. Eşik tarafından segmentler sadece Escherichia coli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bu deney, 120 dakika sonra bölünen ve reaksiyona alan iyi sağlıklı hücreleri göstermektedir. Görüntüler 20 dakika aralıklarla art arda elde edildi. Koloniler odaktadır, jel örneklemeler arasında kararlıdır. Koloniler bölünür ve güçlü sinyaller üretir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yanlış seyreltme oranı ve jel büzülmenin floresan görüntü üzerindeki etkileri. Görüntüler 20 dakika aralıklarla elde edildi (a) Kırmızı daire içine alınmış bireysel Escherichia coli (b) Aynı hücre görüş alanının sağında sürüklenir (c) Hücre daha da sürüklenir. Hücreler ayrıca, muhtemelen düşük seyreltme oranı ve jel büzülmesi nedeniyle pozisyonları bölmez veya değiştirmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bu deneyde herhangi bir aktivite tespit edilmiş ve neredeyse hiç hücre bulunmamıştır. Olası nedenler jelin çok sıcak olması, numunenin kuruması çok agresif olması veya koruyucu kapağı olmaması (a) 40 dakikada çekilen floresan görüntüler (b) 60 dakikada çekilen floresan görüntülerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Odak kaybı ve fotobleaching. (a) ile (d) arasında ardışık görüntüler, otomatik odaklama sistemi kullanılarak 15 dakikalık zaman aralıklarında elde edildi. Bkz. Ek Video 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: GFP'ye düzenleyen Pteto plazmid haritası. TetR represörü olmadan, PtetO organizatörü bir constitutive organizatör olarak hareket eder. Devre düşük kopya numarası plazmidleri üzerinde klonlanmıştır. Bu plazmid, herhangi bir modifiye devre için SNR ölçümü için bir temel görevi görür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7:SfGFP'yi düzenleyen Pteto plazmid haritası. SfGFP, bir AAV bozunma etiketiyle kaynaşmıştır. Devre düşük kopya numarası plazmidleri üzerinde klonlanmıştır. SfGFP-AAV, GFP'nin daha sağlam bir çeşididir, AAV etiketi ise Escherichia coli'nintemizlik proteazları tarafından bozulmaya duyarlı hale getirir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8:Pozitif geribildirim devresinin plazmid haritası. Devre, LuxR transkripsiyon faktörünü bağlayan bir AHL indükleyicisi tarafından indüklenmiştir. AHL-LuxR kompleksi tarafından düzenlenen PluxR promotörü, LuxR ve sfGFP-AAV üretimini aktif hale getirendir. Devre düşük kopya numarası plazmidleri üzerinde klonlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Escherichia coli MG1655'in dinamikleri minimum ortamda gerinim büyümesini içerir (a)PtetO-GFP, yaklaşık 35 dakikalık üstel büyüme. Bu deneyin görüntüleri Şekil 2 (b) PtetO-sfGFP, yaklaşık 35 dakikalık üstel büyümede gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Floresan yoğunluk seviyesi, piksel başına normalleştirilmiş ve 20 dakika aralıklarla elde edilir.
Hücreler, eserleri en aza indirmek için alana göre binned edilir. Hücreler bir mikrometre karesinde alanlarına bölünür (a) Pteto-GFPdevresi 210 dakikada yoğunluk için ilk tekrar 0.004 a.u (b) PtetO- sf GFP'dir 210 dakikada yoğunluk için devre ilk tekrarı 0.022 a.u (c) Pteto-GFP devresinin ölçülen sinyali (d) PtetO-sfGFP devresinin ölçülen sinyalidir. Tüm deneysel veriler üç deneyin ortalamasını temsil eder. Yazılım, hücre alanını farklı gruplara sıralayabilir (a) ve (b) bölme döngüsünü temsil eden dört hücre alanı aralığı için grafikler gösterebilir. 14 mikrometrenin ilk alanı, bölünmeden sonraki hücreleri temsil eder, büyük olasılıkla bölünmeden sonraki hücreler en küçük olacaktır. 21 μm'lik ikinci alan bölünmeden önceki hücreleri temsil eder. Üçüncü ve dördüncü alanlar, bölünmesi daha uzun süren hücreleri göz önünde bulundurmak için toplam alan iki (29 ve 36 μm) ile çarpıldığı için bölmedeki hücreleri temsil eder. Alanlar, mikroskopi görüntülerine bakan veriler manuel olarak değerlendirilerek seçildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11:Tek hücreli floresan yoğunluklarının standart sapması (STD) : (a) PtetO-GFP devresi 210 dakikada STD için ilk tekrar 0.001865 a.u (b) PtetO- 210 dakikada STD içinsfGFP devresi ilk tekrarı 0.01477 a.u (c) Pteto-GFP devresinin STD'si (d) PtetOSTD -sfGFP devresidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 12:Tek hücreli floresan yoğunluklarında SNR. SNR=Ortalama/STD (a) PtetO-GFP devresini 210 dakikada SNR için ilk tekrarı 1.309 a.u (b) PtetO-sfolduğunu hesaplıyoruz 210 dakikada SNR için GFP devresi ilk tekrarı 1.29 a.u (c) GFP ölçümünün üç tekrarı (d) SfGFP ölçümünün üç tekrarıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 13:Tek hücreli floresan yoğunluklarının SNR'si (a)PluxR- AHL'ye doygunluk tepkisi içinsfGFP devre SNR (b) PluxR- Sf GFP devre SNR AHL'ye yarım zamanlı yanıt için. Pozitif geri bildirim SNR'si AHL düzenlenmiş devre, constitutive sfGFP devresi için SNR'den daha yüksektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 14: Akış analizörüne dayalı gen devrelerinin histogramları: deneysel veriler (mavi) ve stokastik model verileri (kırmızı). x ekseni akış sitometrisinden rasgele floresan birimlerini temsil eder ve y ekseni karşılık gelen floresan seviyesini üreten hücrelerin sıklığını temsil eder. Veriler üç saat sonra bir akış çözümleyicisi kullanılarak ölçüldü. GFP floresan, 484 nm dalga boyunda ekscitasyon ve 510 nm dalga boyunda emisyon ile ölçüldü. PE-TexasRed filtre gerilimleri, GFP ifade seviyelerini ölçmek için yüksek verimli bir örnekleyicide kullanılmıştır. Akış analizörü gerilimleri, maksimum ve minimum ifade seviyelerinin aynı voltaj ayarlarıyla ölçülebilmesi için yazılım kullanılarak ayarlandı. Böylece, her deneyde tutarlı voltajlar kullanıldı. Aynı gerilimler, aynı deneyin sonraki tekrarları için de kullanılmıştır. Gama dağılımı kullanılarak montaj yapıldı31. Bu yöntem, sinyalin çoğunlukla plazmidlerin rastgele dağılımına bağlı olduğunu varsayar (a) Düşük kopya numarası plazmidinde Pteto-GFP klonunun ölçümü. Deneysel CV=0.46, Model CV=0.32 (b) Ptetoölçümü -sfGFP-AAV düşük kopya numarası plazmid üzerinde klonlanmış. Deneysel CV=0.86, Model CV=0.44. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 15: Mikroskop bazlı gen devrelerinin histogramları: deneysel veriler (noktalı çizgiler) ve stokastik model verileri (katı çizgiler). x ekseni ters mikroskoptan rasgele floresan birimlerini temsil eder ve y ekseni karşılık gelen floresan seviyesini üreten hücrelerin sıklığını temsil eder. Montaj, MATLAB gama dağılımı31,32 (a) Düşük kopya numarası plazmidinde PtetO-GFP klonunun ölçümü (b) Düşük kopya numarasında klonlanmış PtetOölçümü -sfGFP-AAV kullanılarak yapılmıştır. Karşılaştırma, protokolümüzün akış analizörü deneyindekine benzer CV değerleri elde ettiğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: MG1655 suşu için 1:500 ile 1:20 arasında dört seyreltme oranı. Grafik, ilk yoğunluk yüksekse, LB besin maddelerinin bol miktarda bulunduğunu ve hücrelerin daha hızlı bölünmesine neden olduğunu göstermektedir. 1:500'lük bir seyreltme için hücre yoğunluğu sabit kaldı. 1:100 seyreltme için hücre yoğunluğu yavaşça arttı. 1:50'lik bir seyreltme için, hücre yoğunluğu 250 RPM inkübasyonunda önemli bir gecikme olmadan orta bölünme hızında arttı. 1:20'lik bir seyreltme için hücre yoğunluğu doygunluğa hızlı ulaştı. 1:30'luk bir seyreltme oranı seçtik, üstel büyümeye ulaşmak için kısa inkübasyona ve ılımlı bölme hızında yüksek doygunluk elde etmek için önemli bölünme aralığına izin verdik. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız
Tamamlayıcı Şekil 2: Parlak alan görüntülerinin işlenmesi. (a) Mikroskop sisteminden parlak alan kanalından ham veri yoğunluğu görüntüleri. (b) Hücre nesnelerinin arka plandan ayrılmasını iyileştirmek için görüntünün kontrast geliştirme manipülasyonu. (c) Konvolüsyon filtresi33 ve binarizasyon tabanlı genel eşik34tabanlı hücre sınırı tanıma . (d) Hücre kolonisi sınırlarını belirlemek için morfolojik35 kapatma ve doldurma işlemi. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız
Tamamlayıcı Şekil 3: Hücre kolonisi arka planı\ön plan segmentasyonu. Gürültünün etkisini en aza indirmek için hücre kolonisi sınırlarını belirlemeye ve jel gürültüsünden çıkarmaya çalışıyoruz. (a) Hücre nesnelerini algılamak için uyarlanabilir eşiğe dayalı kontrast geliştirmede görüntü binarizasyon işlemi36. (b) S2d ve S3a'da sunulan matrislerin matris çarpanı, çoğu sesi başarıyla filtre eder ve jel gürültüsünü hücrelerden ayırır. Bazı sınırlar tam olarak çözülmedi. (c) Uzaklık dönüşümüne dayalı bir havza algoritması37 kullanılarak hücre sınırlarının tanımlanması38. (d) S3b ve S3c'de sunulan matrislerin matris çarpanı tek hücreleri başarıyla çözerek. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız
Tamamlayıcı Şekil 4: Tek hücreli segmentasyon. (a) Parlak alan görüntüsünün parçalı ürünü. Daha fazla temizlik, hücre alanı gating ve şekline göre önceden biçimlendirilir ve yuvarlak kabarcıklar atılır. (b) Mikroskoptan elde edilen floresan sinyal görüntüleri. (c) S4a ve S4b'de sunulan matrislerin matris çarpanı tek hücrelerin sinyalini başarıyla çıkarır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız
Ek Şekil 5: Monolayer kaybı. (a)Makalede şekil 2'de gösterilen GFP devresini iyi bir deney olarak düzenleyen 840 dakika (14 saat) Pteto'daki bir hücre katmanının parlak alan görüntüsü. Mikroskopinin sağ tarafında monolayer görüntü kaybı tespit edilebilir. (b) Yazılım segmentasyon görüntüsü. Monolayer hücre kaybı nedeniyle parçalanmış ve alan gating üzerinde temel temizlenecektir. (c) Görüntünün sağ tarafında hiçbir hücrenin çözülemeyeceğini ve monolayer kaybı nedeniyle görüntünün sol tarafındaki hücrelerin düşük bir sinyalini gösteren floresan görüntü. (d) Floresan görüntü ile birlikte segmentasyon görüntüsü. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız
Ek Video 1. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız
Ek Video 2. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız
Tamamlayıcı Video 3. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız
cell_growth_rate_fit.m. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız
compare_experiments.m. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız
Count_Cells.m. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız
main_code.m. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, Escherichia coli canlı hücrelerinin bilgisayar izlemesini sağlayan, bir saat boyunca bölünme ve floresan seviyelerini takip eden bir protokol geliştirdik. Bu protokol, CV ve SNR'yi gerçek zamanlı olarak ölçerek Escherichia coli'deki genetik devrelerin stokastik dinamiklerini ölçmemizi sağlar. Bu protokolde şekil 10'dagösterildiği gibi iki farklı devrenin stokastik davranışlarını karşılaştırdık. Düşük kopya numaralarına sahip plazmidlerin stokastik etkilere daha yatkın olduğu ve hücre bölünmesinden daha az etkilendiği gösterilmiştir. İlk devre tam olarak ifade edilen GFP (Şekil 10a) ve ikinci devre sf GFP'yibir ssrA bozulma etiketine kaynaşmış olarak ifade eder (Şekil 10b). Floresan proteinlerin stokastik davranışını ölçmek için parlak alan görüntülerini de kaydettik. Sonuçlar, GFP'nin özellikleolgunlaşması 39'daki ifadesinin baskın gürültü kaynağı olduğunu göstermektedir. Şekil 10a'da gözlenen periyodik testere diş davranışı deseni, hücre bölünmesinin rastgele süreci ve GFP olgunlaşmasının uzun süreli ölçeği (~50 dakika) ile açıklanabilir. Bunun aksine, ikinci devrenin sfGFP sinyali ölçüm sırasında stabilize edildi, çünkü sf GFP'ninçok kısa olgunlaşma süresi (~6 dakika). Sadece hücre bölünmesi sürecini ve GFP olgunlaşma süresini göz önünde bulundurduğunuzda her iki devredeki GFP seviyesini açıklayan basit bir formül geliştirdik. Belirli bir zamanda, t, proteinlerin x kopya numaraları olduğunu varsayıyoruz ve plazmidlerin kopya numaralarını μ. Protein kopya numarası şu şekilde açıklanabilir:
1.3
1.4
Sadece bölüm olayları göz önüne alındığında; 
protein olgunlaşma sonra ve böylece belirli plazmidler için biz almak:
GFP için ( 
): 1.5
SfGFP için ( 
):1.6
Daha sonra, geliştirilen sfGFP serisi:
1.7
Durumunda, 
elde 
ediyoruz. Bu sonuç aşağıdaki gibi açıklanabilir. x küçük olduğunda, sfGFP düzeyleri küçük bir miktar artar. x büyük olduğunda, sfGFP sabit bir duruma düşürülir. Benzer şekilde, GFP devresi için, her hücre yaklaşık 10 birim GFP içerir, ancak GFP için olgunlaşma süresi mitozdan daha uzun olduğundan, floresan yoğunluklarında bozunma testere diş desenleri gözlenir. Modelde, plazmid replikasyonunun plazmid dağılımının bölünmeden önce ve sonra sabit kalacağı kadar hızlı olduğunu varsaydık. SsrA bozunma etiketi genellikle proteinin yarı ömür süresini saatlerden bir saat5'in altına düşürır ve hızlı bir sabit duruma yol açar. Yöntemin aynı zamanda yüksek popülasyon akış analizörü ile ölçülene benzer bir dağılım sağladığını ve bu dağılımın CV'sinin akış analizörü CV'ye eşit veya daha küçük olduğunu gösterdik.
Canlı hücre görüntüleme için çeşitli yöntemler3,7,18 geliştirilirken, burada sunulan yöntem özellikle Escherichia coli' ye özel olarak uyarlanmıştır. Bu bakteri özel bir ortam ve biraz farklı bir yaklaşım gerektirir. Protokol aşağıdaki önemli özelliklere sahiptir: (1) Orta aşamada değil üstel büyümenin başlangıcında bakteri ve suşa özgü bir seyreltme oranı oluşturmak (Titremeden üstel büyüme) (2) Escherichia coli en iyi 37 ° C'de bölünür, ancak 37 ° C'de minimum medya jeli hızla su kaybeder ve bu da büzülmeye ve istikrarsızlığa yol açar. Buradaki protokol bu zorluğun üstesinden gelir (3) Bakteri örneğini önce uygularız, sonra sıvı jel ile kapatırız. Numune cam dip ve jel arasına sıkıştığından, (I) hava ceplerinin kesilmesini önlemek için gaz değişimine izin veren, (II) Escherichia coli ısıya duyarlı olduğu ve (III) numunenin sıvı jelin içine karıştırılmayacağından emin olduğu için düşük sıcaklıklarda sıvı olarak kalan bir jel gerektiririz. Jel 37 ° C'de sıvı kalır, ancak jelin içinde aşırı ısı ve numune karıştırmasını önlemek için numunenin üzerine koruyucu bir kapak kullanılmasını öneririz (4) Bu yaklaşım basit gerektirir, jenerik ekipman (5) Numuneler önceden ısınmadan doğrudan ölçülebilir, bu nedenle bölünme olaylarında kayıp olmaz (6) Islak laboratuvar adımlarını ve özelleştirilmiş otomatik yazılımı içeren protokol, devre sinyallerinin SNR ve CV'sini ölçmek gibi genetik devrelerin stokastik davranışını incelemek için kullanılabilir. Küçük hücre popülasyonlarının kullanımını doğrulamak ve CV'ye göre karşılaştırma için bir taban çizgisi oluşturmak için mikroskopi yöntemini akış analizörü sonuçlarıyla karşılaştırdık (7) Yazılım, insan müdahalesi olmadan monolayer üzerindeki hücreleri tespit etmemizi ve toplam gürültüyü analiz etmemizi sağlar. ImageJ18 veya Schnitzcells gibi yazılım araçları hücrelerin manuel olarak tanımlanmasıni gerektirir ve ayarlamalar için zorludur.
Canlı hücre kolonilerini sürekli olarak görüntülerken, hücresel stres ve toksisite, kaynakların tükenme hızı, nekroz ve indükleyicilerin ve kimyasalların bozulma süresi gibi çeşitli karmaşık fiziksel parametreleri göz önünde bulundurarak deneyi tasarlayın. Protokol, beş saate kadar güvenilir ölçüme izin verir. Deneylerimiz, Escherichia coli'nin mikro, monolayer kolonilerde bölünürken senkronize olduğunu göstermektedir (Ek Video 3). Jelin kaynaklar ve tokluk açısından tekdüze olduğunu, hücrelerin benzer davranışlara sahip olduğunu ve aydınlatma alanının görüş alanından biraz daha büyük olduğunu varsayıyoruz. Bu nedenle, her hücre, bu şekilde elde edilen CV'yi bir akış analizörü ile ölçümle karşılaştırarak gösterdiğimiz gibi toplanabilecek aynı sinyal ve istatistiksel verileri üretmelidir. Gürültüyü daha uzun süre sabit başlangıç koşullarında ölçmek için gelecekte mikroakışkan çipler kullanmayı düşüneceğiz. Böyle bir cihazın diğer faydaları, hücrelerin sabit konumlarını ve istikrarlı odak10'larını korumaktır. Yine de, tasarım, mikroakışkan çiplerin imalatı ve deneyler için astarlama eğitim, özel ekipman (zaman zaman özel yapım) ve zaman gerektirir. Bu nedenle devrenin genel bir anlayışını elde etmek için bu protokolde gösterildiği gibi zaman atlamalı mikroskopi kullanılmasında fayda vardır.
Önerilen protokol ve geliştirilen yazılım, grafikleri türetmenin basit olduğu tekrarlanabilir ölçümlere izin verir. Ayrıca toplam gürültünün test edilmesine ve karşılaştırılılmasına izin verir ve içsel ve dışsal gürültüyü ölçmek için değiştirilebilir. Yöntem, genel veya sipariş etmesi kolay malzemelere, açıkça paylaşılan, kullanımı kolay yazılımlara dayanır ve belirli bir eğitim gerektirmez. Mkroskopi ile ölçülen popülasyonun, CV yöntemini bir akış analizörü ile elde edilen yöntemle karşılaştırarak anlamlı veriler elde edecek kadar büyük olduğunu göstermiş olduk. Bu nedenle, bu protokolü kullanarak başarılı bir şekilde bir SNR taban çizgisi oluşturabilir ve daha karmaşık gen devreleriyle karşılaştırabiliriz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Matlab koduna yardımcı olduğu için Bay Gil Gelbert'e (Elektrik Mühendisliği Fakültesi, Technion) teşekkür ederiz. Dr. Ximing Li'ye (Technion Biyo-Tıp Mühendisliği Fakültesi) bu makalenin kanıtlanmasına yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Neubauer Aile Vakfı ve İsrail Bilim Bakanlığı tarafından kısmen desteklendi, grant 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al.
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V.
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E.
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
