Summary
这项工作提出了一种显微镜方法，允许对 大肠杆菌 的单个细胞进行活成像，以便分析和量化合成基因电路的随机行为。
Abstract
这里开发的协议提供了一个工具，使计算机跟踪 大肠杆菌 分裂和荧光水平在几个小时内。这个过程开始于筛选在最少的媒体上生存的殖民地，假设只有窝藏正确质粒的 大肠杆菌 才能在特定条件下茁壮成长。由于构建大型基因电路（需要组装许多DNA部分）的过程具有挑战性，因此电路组件通常以不同的拷贝数分布在多个质粒之间，需要使用多种抗生素。质粒中的突变会破坏抗生素耐药基因的转录，并与细胞中的资源管理相交，导致坏死。选定的殖民地设置在玻璃底培养皿上，并选择几个焦点平面在明亮的领域和荧光域进行显微镜跟踪。该协议在无法监管的初始条件下将图像焦点保持在 12 小时以上，造成一些困难。例如，经过几个小时的成像后，死细胞开始积聚在透镜的聚焦领域，这会导致毒素积聚，信号变得模糊和衰变。营养物质的消耗引入了新的代谢过程，阻碍了电路的预期反应。实验的温度降低了诱导剂和抗生素的疗效，这会进一步损害信号的可靠性。最小的介质凝胶收缩和干燥，因此光学对焦会随着时间而改变。我们开发了这种方法来克服 大肠杆菌的这些挑战，类似于以前为其他微生物开发类似方法的工作。此外，该方法还提供了一种算法来量化未改变和改变的细胞中的总随机噪声，发现结果与类似变异系数 （CV） 所示的流量分析仪预测一致。
Introduction
合成生物学是近十年来出现的一个多学科领域，旨在将工程设计原理转化为合理的生物设计1、2、3，努力实现活细胞的多信号集成和处理，以理解基础科学4、5、诊断、治疗和生物技术应用6、7、8、9、10。我们量化合成基因电路输入输出响应的能力已经随着单细胞技术的最新进展而发生了革命性进展，包括使用自动延时显微镜11的流动分析仪和活细胞成像。流分析仪常用于测量这些电路在稳定状态1、12的反应，倒显微镜用于测量合成基因回路在单细胞3水平上的动态反应。例如，合成生物学的早期工作之一涉及利用负反馈回路在活细胞中建立遗传振荡器网络，延迟3。后来，基因振荡器回路被应用于了解活细胞4的动态环境中的代谢控制。自动延时显微镜是描述此类电路的一种方法。我们假设宿主细胞，大肠杆菌，在形成微殖民地时同步，允许测量信号和计算噪音，而无需跟踪确切的母女关系。
噪音是生物系统的基本固有方面，通常由多种来源产生。例如，生化反应涉及来自分离随机载体的传输的信号，如蛋白质的扩散13。这些信号以随机波动14传播。其他噪声源包括资源可用性、细胞分裂和环境条件的变化，如温度、湿度和压力。在合成基因电路中传播的生物信号通常具有非常低的信号与噪声比（SNR），这扰乱了这些电路的性能。因此，基因电路设计仍然是基因工程15最具挑战性的方面之一。例如，与大多数只计算平均基因表达的方法（测量整个细胞群）相比，考虑测量信号的方差，以便通过合成基因网络12来设计可预测的行为。因此，蛋白质表达中的变异性或噪声水平在模拟和数字基因电路1、16、17的设计和性能中起着主导作用。
已经开发出许多方法来量化细胞对细胞的变异性，包括在大肠杆菌3，7，18。这些方法通常用于研究基因活化和代谢通路，但较少侧重于随机噪声动力学的研究，如测量和分离特定的噪声源，特别是活细胞中的遗传回路，这是一个根本的挑战19，20，21。几个因素，既继承到电路本身（内在的），又从宿主细胞（外在）中衍生出来，可以扰乱遗传电路的连续性能。在本文中，我们制定了一个协议，旨在量化大肠杆菌细胞的总噪声，包括内在和外在噪声源6，22。通过量化总噪声，然后评估SNR23，基因电路的设计可以改进。通过监测几种荧光蛋白6、20，可以修改这种方法，分别测量独立的噪声源。对于此处描述的协议，我们保持良好的环境条件控制，并不断测量细胞的活性，而不受外部因素的影响。随着时间的推移，我们测量单个细胞中荧光蛋白发出的信号，并同时在蔗糖基板下对它们进行成像。使用实验室的自定义 MATLAB 分析生成的图像。
理想情况下，连续测量细胞内荧光蛋白的实时活性将通过细胞的生长和分裂产生准确的数据。然而，获取此类数据是具有挑战性的。这是由于荧光蛋白的退化，称为光漂白7，当他们暴露在辐射的兴奋过程中。此外， 大肠杆菌 细胞对兴奋也很敏感，这可能导致光毒性7。这两个问题都限制了可获取的相框数量和收购之间的时间。用于在成像过程中生长细胞的基质和中等类型（如溶酶肉汤）也具有关键作用。我们强烈建议使用最小的介质，最大限度地减少非荧光背景，延长细胞分裂时间。
此外，需要根据以下要求（1） 低细胞分裂率来准备样本，以便减少频繁的暴露，从而密切成像分裂周期并降低光毒性和光漂白的概率。我们在实验开始时将采集时间设定为预测的线粒体时间 （2） 低细胞密度的一半左右，从而能够提高分裂的均匀性和可跟踪性。细胞密度受 大肠杆菌 细胞稀释比的影响，大肠杆菌是该协议成功的一个重要参数，需要为每个实验室确定。为了确定这一比率，使用的每一个新的 大肠杆菌 菌株或介质应安装增长率图（补充图1）。如果细胞在初始密度约为600nm = 0.1 的短暂孵化后无需额外摇晃即可生长，则已实现适当的比率。处于这一阶段的细胞将仅根据环境温度（3） 限制细胞运动而分裂：细胞运动在很大程度上取决于基板（糖垫）的牢固性。基板的硬度取决于总糖量和凝胶凝固时间。凝胶不能在室温下过夜凝固，因为 大肠杆菌 将经历线粒体。影响基板稳定性的其他因素包括样品中的水量和湿度。代表结果中详细讨论了其他问题。此协议提供了许多详细信息，并逐渐从一个步骤移动到另一个步骤。该协议为成像实验提供了长期稳定性，并提供了一个基本的图像处理工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.媒体和文化准备
- 准备1000x卡本西林（50毫克/mL）或相关抗生素的库存溶液。
- .重 0.5 克卡苯甲酸林。添加10毫升无菌H2O.完全溶解。
- 通过 0.22μm 注射器过滤器对苯甲酸素库存进行灭菌。阿里引用抗生素溶液，储存在-20°C。
- 要准备溶酶肉汤 （LB） 板， 混合 5 克 tryptone， 5 克 NaCl， 2.5 克酵母提取物和 7.5 克 Bacto agar 与 0.5 升无菌 H2O. 自动解体溶液在 121 °C 20 分钟.
- 将熔融凝胶混合部分浸入 50 °C 的水浴中。添加1，000微升的苯甲酸素（50毫克/千升）。
- 在无菌环境中准备培养皿。在将盘子存放在冰箱前，先将盘子放在一起。
- 对于 M9 最小介质，请编写以下单独的库存解决方案：5x M9 盐（56.4 g/L）、2 M 葡萄糖和 2% 无生物素卡萨米诺酸。在 121 °C 下自动解密解决方案 20 分钟。
- 要准备 5 个 Petri 板，混合 1125 毫克低熔化 agar 和 400 毫克的 agar 与 89.2 mL 的最小介质 （1x M9）。在 250 mL 埃伦迈尔烧瓶中加入 10 mL 的 2% 卡萨米诺酸（2% [vol/vol]）。
注意：请务必将介质倒在烧瓶的内唇上。 - 在 3 到 4 秒的短时间内微波解决方案。重复，直到解决方案清晰。
注意：确保不要达到沸点。 - 将 250 mL Erlenmeyer 烧瓶放在热水浴池 （60 °C） 中，通过扩散进一步混合，使其冷却，直到温度降至约 45-50°C。
- 在倒板的长凳上点燃火焰。
- 按以下顺序快速添加所有解决方案：
800 μL 的 50% 甘油 （0.4% [vol/vol]）
100微升硫胺 （B1）
1100微升葡萄糖 （2M）
100微升卡本西林（50毫克/升）。 - 旋转埃伦迈尔烧瓶，以确保在整个阿加所有成分的均匀分布。
- 在火焰旁边一次打开一个盘子，开始浇注。
- 将盘子放在长凳上几分钟，直到初始凝固。
- 将盘子倒置，防止水凝结滴到凝胶上。
- 让盘子在室温下凝固约2小时。
- 一旦板已经凝固和干燥，他们可以存储在4°C约3个月。
2.细菌菌株和质粒结构
注：遗传回路包含一个部分：由 PtetO促进器驱动的绿色荧光蛋白 （GFP） 可产生构成表达。这项工作中所有的质粒都是使用基本的分子克隆技术建造的，并利用标准的热冲击协议24转化为大肠杆菌10+。最终结构被改造成大肠杆菌MG1655野生型菌株进行测试。
- 将所需的质粒转换为大肠杆菌MG1655细胞与标准的热冲击协议24。
- 在 LB agar 板上以 37°C 的通宵生长转化的细胞。
注意：可以将培养皿从步骤 2.2 保留至 3 天，以便进行显微镜检查。 - 将单个菌落接种到 5 毫升的 LB 汤中，并在玻璃管中补充相关抗生素。
- 在 37 °C 下生长细胞，在孵化器中以 250 rpm 的摇晃速度生长 2 小时，直到液体多云。
- 准备 1 mL 稀释解决方案如下：
892微升的最小介质（1x M9）
8 微升 50% 甘油 （0.4% [卷/卷]）
100 μL 的 2% 卡萨米诺酸 （0.2% [wt/vol]）
1 微升硫胺 （B1）
11 微升葡萄糖 （2 M）
相关抗生素的1μL- 混合并旋转下来。
- 将细胞培养（1：30）从步骤 2.4 稀释到 2 mL 管中，将 30 μL 的 大肠杆菌 生长添加到 1000 μL 的稀释溶液（步骤 2.5）中。
- 在 37 °C 处将管子孵化 1 小时，震动 （250 rpm）。
- 在第 1.10 步准备的 M9 板上增长 40 μL - 60 μL。在 37 °C 的夜间孵化板。
注：电镀的光学密度（OD 600nm）应在0.1左右。 - 将多达三个 35 毫米玻璃底板放在长凳上。
注意：确保板的玻璃具有用于显微镜片的正确厚度。 - 准备在凝胶板上播种的培养物，重复步骤 2.3 到 2.6，用于在步骤 2.9 显微镜测量时准备的板菌落。
- 准备以下解决方案，制作三个显微镜板。
- 将水浴预热至60°C。
- 将 112.5 毫克低熔化 agar 和 40 毫克的 agar 与 8.92 mL 的最小介质 （1x M9） 混合，并在 25 mL Erlenmeyer 烧瓶中加入 1 mL 的 2% 卡萨米诺酸（0.2% [vol/vol]）。
注意：请务必将介质倒在烧瓶的内唇上。
- 微波溶液在短短的2到3秒内。重复，直到解决方案清晰。
注意：确保不要达到沸点。 - 将 25 mL Erlenmeyer 烧瓶放在热水浴池 （60 °C） 中，通过扩散进一步混合，并让它在长凳上冷却，直到温度降至约 45-50 °C。
3.准备糖垫
- 用70%乙醇清洁长凳。在清洁的长凳上拉伸胶带。确保磁带光滑且平平。
- 准备两个盖子：一个在磁带上，另一个在附近。准备一个盖子。
- 从水浴中取出烧瓶（在第2.14步准备），擦干净烧瓶的外部，使其冷却，直到温度降至约45-50°C。
- 要制作凝胶溶液，可以快速按以下顺序混合所有解决方案：
80 μL 的 50% 甘油 （0.4% [卷/卷]）
1 mL 的 2% 卡萨米诺酸 （0.2% [wt/vol]）
10 微升硫胺 （B1）
110微升葡萄糖 （2 M）
10微升相关抗生素。 - 将 1.5 mL 的凝胶倒在盖片上，用第二块做"三明治"盖住。
- 将埃伦迈尔送回热水浴场。用盖子盖住三明治，定时器20分钟。
- 同时，在37°C处将管子从步骤2.11孵育为1小时，震动（250 rpm）
- 20分钟后翻转三明治（步骤3.5），盖上它，离开休息1小时。
注意：为了获得更好的结果，请将"三明治"在第 3.8 步的持续时间内在 4 °C 下休息。 - 种子 大肠杆菌 培养从步骤3.7通过管道样品到35毫米菜。
注意：将 6 μL 的细胞作为单独的小滴管提供最佳结果。 - 让滴水干燥，至少15分钟，最多30分钟。
- 通过滑动盖滑移，从步骤 3.8 中暴露三明治的凝固凝胶。
- 用活检冲床或小费将三明治切成小的单独垫子。
- 轻轻地将其靠在样品上（第 3.9 步）。把盘子放在长凳上20分钟。
4.为显微镜成像准备样品
- 从步骤 3.6 中取出水浴中的烧瓶。将烧瓶外部擦干净，冷却至室温（25 °C）。
注意：在分时器结束前约 3 分钟，在步骤 4.1 中取出烧瓶。 - 以圆形运动将 3 mL 的凝胶不断倒入板周围。离开凝固几分钟。
- 用胶带密封板，用25G针刺穿几个孔。翻转所有菜肴，防止水凝结滴到凝胶上。
- 在 4 °C 下孵化所有菜肴 30 分钟，以允许完全凝固，同时防止细胞间质疏松。
注意：将样品保持在 4 °C，以进行连续测量，不超过一天。 - 根据制造商的说明启动显微镜。
- 使用最小放大镜头查找初始对焦，并采用自动对焦系统 （AFS）。
- 如果需要，使用油，用油淹没镜头，并通过使用平台控制器（不是手动）移动板小心地展开，AFS 可以再次接合。
- 按照 Z 步横截面的默认建议，在 Z 方向上使用相对横截面。
注：我们每5分钟拍摄一次明亮的现场图像，每20分钟拍摄一次荧光图像。有时，焦点需要在前 30 分钟内调整。预热显微镜培养箱和油，同时冷藏样品往往有助于减少最初失去焦点。
5.数据分析
注意：为了处理显微镜数据，我们在MATLAB中设计了一个基于计算机的软件。该软件便于从明亮的场蒂夫图像和段中识别细胞边界，并按区域对单元格进行排序。由于显微镜分辨率限制，此图像分析的输出可用作荧光蒂夫图像上的面罩，以获得细胞强度水平并消除荧光域（如细胞光晕）中的人工制品。开发的软件灵感来自类似的作品7，25，26，27，28，29，30，并提供了一个优雅的解决方案，为实验室量身定做。
- 首先，在 main_code.m中定义以下参数。
- 定义获取图像的文件夹。
- 定义图像时间段 - 明亮的字段通道时间步入分钟数。
- 定义 GFP 频率 - 获取 GFP 图像的速率。
- 定义显微镜分辨率（即等于 1 μm 的像素数）。
- 定义直方图箱范围 - 细胞区域范围。
注：根据细胞区域对数据进行分类的过程与流细胞测量数据分析中的门控原理相似。门被放置在具有共同特征的细胞群周围，通常向前分散和侧面分散，以隔离和量化这些感兴趣的群体。显微镜允许门，调查和量化几个细胞组。 - 定义卷积内核 （3，3） - 此参数通过全球阈值（count_cells.m）检测细胞边界。
注意：仅在更换实验室或显微镜时才需要此设置。软件要求输入明亮的字段通道标记为索引 c1，荧光通道标记为 c2。
- 运行main_code.m，自动运行所有其他脚本（count_cells.m，cell_growth_rate.m）。
- 程序自动分割明亮的字段图像（参见 补充图 2-4）。
- 将分割图像与荧光图像 （GFP） 相结合，以提取每个细胞的强度水平。
- 按时间计算细胞数量图，并根据指数增长进行拟合。
- 计算每个细胞区域范围的平均值和标准偏差 （STD）。
- 计算每个细胞区域范围的信号与噪声比 （SNR）。
- 按强度绘制并适合细胞数量的分布。
- 计算方差 （CV） 的系数，并比较流量分析仪数据。
注：软件将作为输出提供用于调整新文件夹"您的折叠器/分段"中的conv_kernel的最终细分图像。软件将按输出在一个新的文件夹"你的折叠器/图形。
- 为了比较实验，使用compare_experiments.m。
- 为保存的图形定义目录和 "比较结果目录"的地址。
- 运行文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该软件分析白色和黑色的明亮字段域图像。 大肠杆菌 在白色背景上看起来像黑色长方形，动态亮度范围应在其中心显示尖峰（图 1）。在荧光图像中，细胞可能有一个小光环，但具有长方形的单个细胞仍然可以得到解决。应在 30 分钟后首先检测到线粒体病事件。显微镜聚焦应随着时间的推移保持稳定，尽管细胞在这 30 分钟内移动缓慢，但不太可能离开视野。这样的实验将被认为是好的，可以在 图2中查看。在低倍率的明亮领域，细胞可能难以检测。我们建议使用高拷贝数 （HCN） 质粒建立平均对焦距离，因为在低放大倍率下很容易注意到。设置平均距离，同时提前测量高放大度下的低拷贝数 （LCN） 质粒。这种对焦距离主要取决于板、显微镜系统和油，而不是凝胶或 大肠杆菌 菌株的厚度。
当将此协议调整到其他实验室时，可能会出现以下问题 （1） 以不正确的稀释比率制备的大肠杆菌板（样本）可以显示不变的细胞数量（图 3和图 4） （2）未密封板的样本可能会显示过度收缩。当细胞漂移（图3）或导致焦点丧失时，可以观察到这一点（图5）（3）有些样本可能在游泳细胞（白色）的背景上显示缓慢移动的"固定"细胞（黑色）。这可能是由于一个潮湿的样本，它通常稳定，因为多余的水被凝胶吸收 （补充视频 1） （4） 在热身几分钟后没有显示细胞的样本可能准备不当，可能是由于：（ （I） 凝胶被浇注，而仍然太热，（II） 保护帽被遗忘，（III） 最小的介质缺乏成分，（IV） 不正确的细胞密度，和 （V） 凝胶密封太紧。重要的是打孔，使气体交换牺牲凝胶收缩（图5）和（六）细胞也可以缩进凝胶寻找营养物质，堆叠在另一个之上，损害细胞单层有效地防止细胞的检测和测量可靠的荧光信号（补充图5）。
我们在这项工作中测量了三个电路。首先，调节图6中显示的调节GFP的构成促销器。其次，调节图 7中显示的超折 GFP31 （sfGFP） 的构成促销器。sf GFP 中添加了 ssrA降解标记 （AAV），使其半寿命缩短到5分钟。第三个电路基于正反馈电路1，由乙基-同氨酸-拉酮（AHL）诱导。PluxR促进器调节sfGFP 和 LuxR，这是与 AHL 绑定的转录因子，可激活图 8中的 PluxR 。图9显示细胞生长的动态（细胞数量与时间），图10显示测量信号的动态（平均荧光与时间），图11显示评估总噪声（标准偏差（STD）与时间的动态。
SNR（或CV）广泛应用于模拟电子电路的设计，以表达电路32的精度和可靠性。简历涉及单个细胞之间的信号分布，并允许在显微镜和流量分析仪等不同方法和设备之间进行比较。从显微镜图像中计算 SNR 使我们能够比较跨时间的电路，在测量分段单元单元的同时，可测量噪声与信号相比的特定分辨率，或特定时间和诱导器浓度的噪声间隔。这可能表示探测器细胞是否能够解决对诱导器浓度的准确信号响应。在这项工作中，CV的计算方法是考虑所有分段的文物，这些文物是细胞，无论细胞在分裂周期中的进展如何。SNR 是根据特定细胞区域范围计算的，然后平均进行三次重复实验。既不是获得的信号，也不是性传播疾病是可靠的单独，因为它们是特定于实验和使用的设备。信号以任意单位进行测量，这些单元取决于设备获得预设、照片探测器和曝光时间。图 10中提供的数据表明，分裂周期中的细胞阶段不影响噪声水平，因为不同区域范围（分区周期中的点）显示相同的趋势。这一观察可能支持这样一种说法，即测量噪音可以避免跟踪确切的母女关系，这可以改进所呈现方法的SNR。如图12所示，GFP与sfGFP之间未发现SNR发生重大变化。我们计算 SNR （SNR® 均值/STD），并将其呈现在图 12和图 13 中。
然后，我们根据以下方程31计算了方差和 CV
1.1
1.2
其中λ是蛋白质折叠时间，T是细胞分裂时间，θ和μ是分体前后的质粒数量，质粒拷贝数为31。使用上述方程（1.1 和 1.2），我们可以将来自流量分析器信号的数据用于伽马分布。
然后，我们比较了CV，这是由流量分析仪（图14）和协议（图15）测量和计算。
图1：亮场曝光图像（a）在亮场（b）分段图像中稳定采集，只有彩色细胞进入计算（c）像素亮度图的采集，尖峰是背景噪声。门槛由它段只有埃舍里希亚大肠杆菌。请单击此处查看此图的更大版本。
图2：这个实验显示了良好的健康细胞在120分钟后分裂和反应。图像以20分钟的时间连续获得。 殖民地是焦点，凝胶是稳定的采样之间。殖民地分裂并产生强烈的信号。 请单击此处查看此图的更大版本。
图3：不正确的稀释比和凝胶收缩对荧光图像的影响。图像以20分钟的时间间隔获得（a） 以红色圆圈的个体大肠杆菌（b）相同的细胞漂移到视场的右边（c）细胞进一步漂移。细胞也不会分裂或改变位置，可能是由于稀释率低和凝胶收缩。请单击此处查看此图的更大版本。
图4：在这个实验中，没有检测到任何活动，几乎没有细胞存在。 可能的原因可能是凝胶太热，样品干燥太具有攻击性或没有保护帽（a）荧光图像拍摄于 40 分钟（b）荧光图像拍摄在 60 分钟。 请单击此处查看此图的更大版本。
图 5： 焦点丢失和照片漂白。使用自动对焦系统，以 15 分钟的时间间隔获取了（a） 到（d）的连续图像。请参阅 补充视频 2。 请单击此处查看此图的更大版本。
图6：调节GFP的P泰托的质粒图。没有泰特R抑制器，PtetO发起人充当构成促进者。该电路在低拷贝编号质粒上克隆。此质粒作为任何修改电路的 SNR 测量基础。请单击此处查看此图的更大版本。
图 7：调节sfGfp的 Ptto 的质粒图。sfGFP 与 AAV 退化标记融合在一起。该电路在低拷贝编号质粒上克隆。sfGFP-AAV 是 GFP 的一个更坚固的变种，而 AAV 标签使其易于通过家政大肠杆菌的蛋白酶而退化。请单击此处查看此图的更大版本。
图 8： 正反馈电路的质粒图。 该电路由 AHL 诱导器诱导，该诱导器结合了 LuxR 转录因子。PluxR 发起器由 AHL-LuxR 复合体管理，可激活 LuxR 和 sfGFP-AAV 的生产。该电路在低拷贝编号质粒上克隆。 请单击此处查看此图的更大版本。
图9：微量介质中大肠杆菌MG1655应变生长的动态包括（a）PtetO-GFP，指数增长约35分钟。这个实验的图像显示在图2（b）PtetO-sfGFP中，指数增长约35分钟。请单击此处查看此图的更大版本。
图10：荧光强度水平，每像素正常化，以20分钟为间隔获得。
细胞是按区域装箱的，以便最大限度地减少文物。细胞按其面积分成一个微米平方（a）Ptto-GFP 电路，在 210 分钟内首次重复强度为 0.004 a.u（b）PtetO-sfGF P 电路在 210 分钟内首次重复强度为 0.022 a.u（c）测量 Ptteto-GFP电路（d）测量 PtetO-sfGFP 电路的信号。所有实验数据均代表三个实验的平均值。该软件可以将单元格区域排序到不同的组（a）和（b）显示代表分裂周期的四个单元区域范围的图形。14微米的第一个区域表示分裂后的细胞，因为分裂后的细胞可能是最小的。21 μm 的第二个区域表示分裂前的细胞。第三和第四个区域表示分裂中的细胞，因为总面积乘以两个（29 和 36 μm），以便考虑分裂时间较长的细胞。这些区域是通过手动评估显微镜图像上的数据来选择的。 请单击此处查看此图的更大版本。
图11：单细胞荧光强化的标准偏差（STD）为：（a）PtetO-GFP电路在210分钟内首次重复性病为0.001865 a.u（b） P t 210分钟为性病的SfGFP 电路首次重复是 Ptteto- GFP 电路的 0.01477 a.u（c）性病-PtetO-sfGFP 电路的性病。请单击此处查看此图的更大版本。
图12：单细胞荧光强化的SNR。 我们计算 SNR=平均值/STD（a） PtetO- GFP 电路在 210 分钟内首次重复 SNR 是 1.309 a.u（b） PtetO-sfGFP 电路在 210 分钟内首次重复 SNR 是 1.29 a.u（c）GFP 测量（d）三次重复 sfGFP 测量。 请单击此处查看此图的更大版本。
图13：单细胞荧光电量的SNR （a）PluxR-sfGFP电路SNR，用于对AHL（b） PluxR-sfGFP电路SNR的饱和响应，对AHL进行半场响应。正反馈 AHL 调节电路的 SNR 高于构成sfGFP 电路的 SNR。请单击此处查看此图的更大版本。
图14：基于流量分析仪的基因电路的直方图：实验数据（蓝色）和随机模型数据（红色）。x轴表示来自流细胞测量的任意荧光单位，y轴表示产生相应荧光水平的细胞的频率。数据在三小时后使用流量分析仪进行测量。GFP 荧光通过波长为 484 nm 的激发和 510 nm 的波长排放来量化。PE-得克萨斯红滤波器用于高吞吐量采样器，以测量 GFP 表达水平。使用软件调整流分析器电压，以便用相同的电压设置测量最大和最小表达水平。因此，在整个实验中都使用了一致的电压。相同的电压用于随后重复同一实验。安装是由使用伽马分布31。这种方法假定信号主要取决于平板的随机分布（a） 在低拷贝数质粒上测量 Ptto-GFP克隆。实验性CV=0.46，型号CV=0.32（b）在低拷贝数质粒上克隆的P-sfGFP-AAV的测量。实验简历=0.86，型号简历=0.44。请单击此处查看此图的更大版本。
图15：基于显微镜的基因电路的直方图：实验数据（点缀线）和随机模型数据（实心线）。x轴表示来自倒显微镜的任意荧光单位，y轴表示产生相应荧光水平的细胞的频率。安装使用 MATLAB 伽马分布31，32 （a） 测量 PtetO- GFP 克隆在低拷贝编号质粒（b）测量 PtetO-sfGFP-AAV 克隆在低拷贝编号.比较表明，我们的协议获得与流量分析仪实验类似的简历值。请单击此处查看此图的更大版本。
补充 图1：MG1655菌株的四个稀释比，在1：500至1：20之间。 该图显示，如果初始密度高，LB 营养物质丰富，导致细胞分裂速度更快。对于 1：500 稀释，细胞密度保持不变。对于 1：100 稀释，细胞密度缓慢增加。对于 1：50 稀释，在 250 RPM 孵化中，细胞密度以中等分裂速度增加，没有明显延迟。在1：20稀释时，细胞密度迅速达到饱和度。我们选择了1：30的稀释比，允许短期孵化达到指数增长和实质性的分割范围，以适度的分割率实现高饱和度。请单击此处下载此图
补充 图2：处理明亮的字段图像。 （a） 来自显微镜系统明亮场通道的原始数据强度图像。（b） 图像的对比增强操作，以改善单元格对象与背景的分离。（c） 基于卷积过滤器33 的细胞边界识别和基于二进制的全球阈值34。（d） 形态学35 操作关闭和填充，以确定细胞群落边界。请单击此处下载此图
补充图3：细胞群落背景\前景分割。为了尽量减少噪音的影响，我们尝试识别细胞群落边界，并从凝胶噪声中提取它们。（a） 基于自适应阈值的对比度增强图像二进制操作，以检测单元格对象36。（b） 在 S2d 和 S3a 中呈现的矩阵矩阵的矩阵倍增成功地过滤掉了大多数噪音，并区分了细胞中的凝胶噪声。有些界限没有完全解决。（c） 使用基于距离转换 38 的分水岭算法37识别单元边界。（d） 在S3b和S3c中呈现的矩阵矩阵的矩阵倍增成功地解决了单个细胞。请单击此处下载此图
补充 图4：单细胞分割。 （a） 亮场图像的细分产品。进一步清洁是根据细胞区域门控和形状预先形成的，丢弃圆形气泡。（b） 从显微镜获得的荧光信号图像。（c） 在S4a和S4b中呈现的矩阵矩阵的矩阵倍增成功提取单细胞信号。请单击此处下载此图
补充 图5：单层损失。 （a） Pteto 840 分钟 （14 小时） 的细胞层的明亮场图像， 调节文章图 2 中显示的 GFP 电路， 作为一个很好的实验。可检测到显微镜右侧单层图像丢失。（b） 软件分割图像。由于单层细胞的丢失是零碎的，并将在区域门控上进行清洁。（c） 荧光图像显示，在图像的右侧，由于单层丢失，无法解决任何单元格和图像左侧细胞的低信号。（d） 细分图像与荧光图像相结合。请单击此处下载此图
补充视频 1.请点击这里下载此视频
补充视频2.请点击这里下载此视频
补充视频 3.请点击这里下载此视频
cell_growth_rate_fit.m 请单击此处下载此文件
compare_experiments.m. 请单击此处下载此文件
Count_Cells.m. 请单击此处下载此文件
main_code.m. 请单击此处下载此文件
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这项工作中，我们开发了一个协议，使计算机跟踪 大肠杆菌 活细胞，在几个小时内跟随分裂和荧光水平。该协议使我们能够通过实时测量简历和SNR来量化 大肠杆菌 遗传电路的随机动力学。在此协议中，我们比较了 图 10中显示的两个不同电路的随机行为。研究表明，拷贝数低的质粒更容易产生痉挛效应，受细胞分裂的影响较小。第一个电路构成表示GFP（图10a），第二个电路构成表达 sfGFP融合到ssrA退化标签（图10b）。为了量化荧光蛋白的随机行为，我们还记录了明亮的场图像。结果表明，GFP的表达，特别是在其成熟39，是占主导地位的噪声源。图 10a 中观察到的周期性锯齿行为模式可以通过细胞分裂的随机过程和GFP成熟（+50分钟）的长期尺度来解释。相比之下，第二个电路 的sfGFP信号在测量过程中稳定下来，因为 sfGFP的成熟时间很短（~6分钟）。我们开发了一个简单的公式，描述两个电路中的GFP水平，当我们只考虑细胞分裂和GFP成熟时间的过程。在给定的时间 ，t，我们假设有 x 拷贝数的蛋白质， 并μ 复制数的质粒。蛋白质拷贝编号可通过：
1.3
1.4
仅考虑分区事件时： 
蛋白质成熟后，所以对于特定的质粒，我们得到：
对于 GFP 
（）： 1.5
对于 sfGfp 
（）：1.6
然后，开发 系列sfGFP：
1.7
在这种情况下， 
我们获得 
。此结果可解释如下。当 x 较小时 ，sfGFP 水平会小幅增加。当 x 较大时 ，sfGFP 会退化到稳定状态。同样，对于GFP的电路，每个细胞包含大约10个单位的GFP，但由于GFP的成熟时间比线粒体长，观察到荧光强化的有辱人格的锯齿模式。在模型中，我们假设质粒的复制速度足够快，质粒分布在分裂前后保持不变。ssrA降解标签通常将蛋白质的半生时间从小时减少到不到1小时5， 并导致快速稳定状态。我们表明，该方法还提供类似于用高人口流量分析仪测量的分布，并且此分布的 CV 等于或小于流分析仪 CV。
虽然为活细胞成像开发了几种方法3、7、18，但这里介绍的方法是专门为大肠杆菌量身定做的。这种细菌需要特殊的介质和略有不同的方法。该协议具有以下重要特征：（1） 在指数增长开始时而不是在中间阶段（不摇晃的指数增长）（2）大肠杆菌在 37 °C 的最佳分界值时确定稀释比，但在 37 °C 时，最小介质凝胶会迅速失去水，导致收缩和不稳定。这里的协议克服了这一挑战 （3） 我们首先应用细菌样本，然后用液体凝胶密封它。由于样品夹在玻璃底和凝胶之间，我们需要一种凝胶（I）允许气体交换以避免切割气囊，（II） 在低温下保持液体，因为大肠杆菌对热量敏感，（III） 确保样品不会混合在液体凝胶中。凝胶保持液体在37°C，但是，我们建议使用保护帽在样品顶部，以避免过热和样品混合在凝胶（4）这种方法需要简单， 通用设备 （5） 样品可直接测量而不预热，因此不会丢失除法事件 （6） 该协议包括湿实验室步骤和定制自动化软件，可用于研究遗传电路的随机行为，如量化电路信号的 SNR 和 CV。我们比较了显微镜方法来流动分析结果，以验证小细胞群的使用，并根据CV（7）建立比较基线 该软件使我们能够在没有人工干预的情况下检测单层细胞并分析总噪音。像 ImageJ18或 Schnitzcells 这样的软件工具需要手动识别单元格，并且对调整具有挑战性。
当连续成像活细胞群落时，设计实验时会考虑几个复杂的物理参数，如细胞应激和毒性、资源消耗率、坏死和诱导剂和化学物质的降解时间。该协议允许可靠测量长达五个小时。我们的实验表明， 大肠杆菌 在微单层菌落中分裂时是同步的（补充视频3）。我们认为凝胶在资源和韧性方面是均匀的，细胞有类似的行为，从视野来看，照明领域稍大一些。因此，每个单元格应产生相同的信号和统计数据，这些信号和统计数据可以通过比较通过这种方式获得的简历与流量分析仪进行测量来收集。为了在较长时间内在恒定的初始条件下测量噪音，我们将考虑将来使用微流体芯片。这种装置的进一步好处是保持细胞的固定位置和稳定的对焦10。尽管如此，微流体芯片的设计、制造和实验准备需要培训、特定设备（有时定制）和时间。因此，使用本协议中显示的时间推移显微镜来获得对电路的一般理解是有益的。
拟议的协议和开发的软件允许可重复的测量，从这些测量中获取图表非常简单。它还允许测试和比较总噪声，并可用于测量内在噪声和外在噪声。该方法基于通用或易于订购材料、公开共享、易于使用的软件，无需特定培训。我们已经表明，通过显微镜测量的人口足以通过比较CV的方法与通过流量分析仪获得的方法CV来获得有意义的数据。因此，我们可以使用此协议成功建立 SNR 基线，并将其与更复杂的基因电路进行比较。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢吉尔·盖尔伯特先生（电气工程学院，技术学院）协助MATLAB代码。我们感谢李锡铭博士（生物医学工程学院，技术）协助校对本文。这项研究得到了Neubauer家庭基金会和以色列科学部的部分支持，授予2027345。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al.
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V.
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E.
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
