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Bioengineering

समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए एस्चेरिचिया कोलाई में जैविक शोर का निरंतर माप

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/61290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

यह काम एक माइक्रोस्कोपी विधि प्रस्तुत करता है जो सिंथेटिक जीन सर्किट के स्टोचस्टिक व्यवहार के विश्लेषण और मात्राकरण के लिए एस्चेरिचिया कोलाई की एक कोशिका की लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है।

Abstract

यहां विकसित प्रोटोकॉल कई घंटों में एस्चेरिचिया कोलाई डिवीजन और फ्लोरोसेंट स्तर के कंप्यूटर ट्रैकिंग को सक्षम करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यह प्रक्रिया उन कॉलोनियों के लिए स्क्रीनिंग से शुरू होती है जो न्यूनतम मीडिया पर जीवित रहते हैं, यह मानते हुए कि केवल एस्चेरिचिया कोलाई सही प्लाज्मिड को शरण देने वाले विशिष्ट परिस्थितियों में कामयाब हो सकेंगे। चूंकि बड़े आनुवंशिक सर्किट के निर्माण की प्रक्रिया, कई डीएनए भागों की असेंबली की आवश्यकता होती है, चुनौतीपूर्ण है, सर्किट घटकों को अक्सर कई एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग की आवश्यकता होती है विभिन्न कॉपी नंबरों पर कई प्लाज्मिड के बीच वितरित किए जाते हैं। प्लाज्मिड में उत्परिवर्तन एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के प्रतिलेखन को नष्ट कर सकते हैं और परिगलन के लिए अग्रणी कोशिका में संसाधन प्रबंधन के साथ interject । चयनित कॉलोनी एक ग्लास-बॉटम पेट्री डिश पर सेट की गई है और कुछ फोकस विमानों को उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट दोनों डोमेन में माइक्रोस्कोपी ट्रैकिंग के लिए चुना जाता है। प्रोटोकॉल प्रारंभिक परिस्थितियों के तहत 12 घंटे से अधिक के लिए छवि ध्यान रखता है जिसे विनियमित नहीं किया जा सकता है, जिससे कुछ कठिनाइयां पैदा होती हैं। उदाहरण के लिए, मृत कोशिकाएं इमेजिंग के कुछ घंटों के बाद लेंस के फोकस के क्षेत्र में जमा होने लगती हैं, जो विषाक्त पदार्थों को बिल्डअप और संकेत को धुंधला और क्षय करने का कारण बनती हैं। पोषक तत्वों की कमी नई मेटाबोलिक प्रक्रियाओं का परिचय देती है और सर्किट की वांछित प्रतिक्रिया में बाधा डालती है। प्रयोग का तापमान प्रेरकों और एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावता को कम करता है, जो संकेत की विश्वसनीयता को और नुकसान पहुंचा सकता है । न्यूनतम मीडिया जेल सिकुड़ता है और सूख जाता है, और परिणामस्वरूप ऑप्टिकल फोकस समय के साथ बदलता है। हमने एस्चेरिचिया कोलाईमें इन चुनौतियों से उबरने के लिए इस विधि को विकसित किया, जो अन्य सूक्ष्म जीवों के लिए अनुरूप तरीकों को विकसित करने वाले पिछले कार्यों के समान है। इसके अलावा, यह विधि अनछुए और परिवर्तित कोशिकाओं में कुल स्टोचस्टिक शोर को निर्धारित करने के लिए एक एल्गोरिदम प्रदान करती है, यह पाते हुए कि परिणाम प्रवाह विश्लेषक भविष्यवाणियों के अनुरूप हैं जैसा कि भिन्नता (सीवी) के समान गुणांक द्वारा दिखाया गया है।

Introduction

सिंथेटिक जीव विज्ञान एक बहुआयामी क्षेत्र है जो पिछले एक दशक में उभरा है और इसका उद्देश्य इंजीनियरिंग डिजाइन सिद्धांतों को तर्कसंगत जैविक डिजाइन 1 , 2,3में अनुवाद करना है , जो बुनियादी विज्ञान4,5, नैदानिक, चिकित्सीय और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगोंकोसमझने के लिए जीवित कोशिकाओं में बहु-संकेत एकीकरण और प्रसंस्करण प्राप्त करने के प्रयास में6,7, 8,9,10। सिंथेटिक जीन सर्किट के इनपुट-आउटपुट प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करने की हमारी क्षमता को एकल-कोशिका प्रौद्योगिकी में हाल की प्रगति से क्रांति आई है, जिसमें स्वचालित समय-चूक माइक्रोस्कोपी11का उपयोग करके प्रवाह विश्लेषक और लाइव सेल इमेजिंग शामिल हैं। एक फ्लो एनालाइजर का उपयोग अक्सर स्थिर अवस्था 1,12पर इन सर्किटों की प्रतिक्रिया को मापने के लिए कियाजाताहै और उल्टे माइक्रोस्कोपी का उपयोग एकल कोशिका 3 के स्तर पर सिंथेटिक जीन सर्किट की गतिशील प्रतिक्रिया को मापने के लिए कियाजाताहै । उदाहरण के लिए, सिंथेटिक जीव विज्ञान में शुरुआती कार्यों में से एक में देरी3के साथ नकारात्मक प्रतिक्रिया छोरों का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में आनुवंशिक आलसिलेटर नेटवर्क का निर्माण शामिल था। बाद में, जीवित कोशिकाओं के गतिशील वातावरण में मेटाबोलिक नियंत्रण को समझने के लिए आनुवंशिक आलसिलेटर सर्किट लागू किए गएथे 4। स्वचालित समय-चूक माइक्रोस्कोपी ऐसे सर्किट की विशेषता के लिए एक विधि है। हम परिकल्पना करते हैं कि मेजबान कोशिकाएं, एस्चेरिचिया कोलाई,सूक्ष्म उपनिवेश बनाते समय सिंक्रोनाइज करती हैं, सटीक मां-बेटी संबंधों को ट्रैक किए बिना सिग्नल और शोर की गणना की माप की अनुमति देती हैं।

शोर जैविक प्रणालियों का एक मौलिक, अंतर्निहित पहलू है जो अक्सर कई स्रोतों से उत्पन्न होता है। उदाहरण के लिए, जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं पर विचार करें जो संकेतों से उत्पन्न होते हैं जो प्रोटीन13के प्रसार जैसे असतत यादृच्छिक वाहकों के परिवहन से उत्पन्न होते हैं। ये संकेत14यादृच्छिक उतार - चढ़ाव के साथ प्रचारित करते हैं । अन्य शोर स्रोत संसाधन उपलब्धता, सेल डिवीजन और तापमान, आर्द्रता और दबाव जैसी पर्यावरणीय स्थितियों में भिन्नताएं हैं। सिंथेटिक जीन सर्किट में प्रचारित होने वाले जैविक संकेतों में अक्सर शोर अनुपात (एसएनआर) के लिए बहुत कम सिग्नल होता है, जो इस तरह के सर्किट के प्रदर्शन को परेशान करता है। इसलिए, जेनेटिक सर्किट डिजाइन जेनेटिक इंजीनियरिंग15के सबसे चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक बना हुआ है। उदाहरण के लिए, अधिकांश दृष्टिकोणों के विपरीत जो केवल मतलब जीन अभिव्यक्ति (पूरी कोशिका आबादी पर मापा जाता है) की गणना करते हैं, सिंथेटिक जीन नेटवर्क12के माध्यम से उम्मीद के मुताबिक व्यवहार को इंजीनियर करने के लिए मापा संकेत के विचरण पर विचार किया जाता है। इस प्रकार, प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता या शोर का स्तर एनालॉग और डिजिटल जीन सर्किट1, 16,17के डिजाइन और प्रदर्शन में एक प्रमुख भूमिकानिभाताहै।

एस्चेरिचिया कोलाई3,7,18सहित सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। इन तरीकों का उपयोग अक्सर जीन सक्रियण और मेटाबोलिक रास्तों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, हालांकि स्टोचस्टिक शोर गतिशीलता के अध्ययन पर कम ध्यान केंद्रित करने के साथ, जैसे विशिष्ट शोर स्रोतों को मापने और अलग करना, विशेष रूप से जीवित कोशिकाओं में आनुवंशिक सर्किट के लिए जहां यह एक मौलिक चुनौती है19,20,21। कई कारक, दोनों सर्किट को विरासत में मिले (आंतरिक) और मेजबान कोशिकाओं (बाह्य) से प्राप्त, आनुवंशिक सर्किट के निरंतर प्रदर्शन को परेशान कर सकते हैं। इस पेपर में, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसका उद्देश्य एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं में कुल शोर को निर्धारित करना है, जिसमें आंतरिक और बाह्य शोर स्रोत6,22शामिल हैं। कुल शोर की मात्रा निर्धारित करके और फिर एसएनआर23का मूल्यांकन करके, जीन सर्किट के डिजाइन में सुधार किया जा सकता है। इस विधि को स्वतंत्र शोर स्रोतों को अलग से मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है, कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन6,20की निगरानी करके। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए, हम पर्यावरणीय स्थितियों को अच्छी तरह से नियंत्रित रखते हैं और बाहरी कारकों के प्रभाव के बिना कोशिकाओं की गतिविधि को लगातार मापते हैं। हम समय के साथ एकल कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन से संकेत को मापते हैं और साथ ही उन्हें एक एगरेग्रेट सब्सट्रेट के तहत छवि देते हैं। परिणामस्वरूप छवियों प्रयोगशाला के कस्टम MATLAB का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं।

आदर्श रूप से, कोशिका के अंदर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की वास्तविक समय गतिविधि का निरंतर मापन कोशिकाओं के विकास और विभाजन के माध्यम से सटीक डेटा का उत्पादन करेगा। हालांकि, इस तरह के आंकड़े हासिल करना चुनौतीपूर्ण है। यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन के क्षरण के कारण होता है, जिसे फोटो-ब्लीचिंग 7 के नाम से जानाजाताहै, जब वे उत्तेजन प्रक्रिया में विकिरण के संपर्क में आते हैं। इसके अलावा, एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाएं भी उत्तेजन के लिए संवेदनशील हैं, जिससे फोटोटोक्सीसिटी7हो सकती है। दोनों मुद्दे फोटो फ्रेम की मात्रा को सीमित करते हैं जिन्हें अधिग्रहीत किया जा सकता है और अधिग्रहण के बीच का समय। इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट और मध्यम प्रकार (जैसे, lysogeny शोरबा) की भी महत्वपूर्ण भूमिका होती है। हम दृढ़ता से न्यूनतम माध्यम का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जो गैर-फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को कम करता है और सेल डिवीजन समय बढ़ाता है।

इसके अलावा, नमूना निम्नलिखित आवश्यकताओं को ध्यान में रखते हुए तैयार करने की जरूरत है (1) कम सेल डिवीजन दर डिवीजन चक्र को बारीकी से इमेजिंग करने और फोटोटॉक्सिसिटी और फोटोब्लैचिंग की संभावना को कम करने के लिए कम लगातार एक्सपोजर की अनुमति देता है। हम प्रयोग की शुरुआत में भविष्यवाणी की माइटोसिस समय (2) कम सेल घनत्व के बारे में आधे के लिए अधिग्रहण समय निर्धारित बेहतर एकरूपता और विभाजन की ट्रैकेबिलिटी के लिए अनुमति देता है । सेल घनत्व एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं के कमजोर पड़ने के अनुपात से प्रभावित होता है, जो इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है और हर प्रयोगशाला के लिए निर्धारित करने की जरूरत है। अनुपात स्थापित करने के लिए, प्रत्येक नए एस्चेरिचिया कोलाई तनाव या मीडिया का उपयोग विकास दर ग्राफ(अनुपूरक चित्रा 1)के साथ लगाया जाना चाहिए । एक उपयुक्त अनुपात प्राप्त किया गया है अगर कोशिकाओं के बारे में OD600nm = 0.1 के एक प्रारंभिक घनत्व से एक छोटी इनक्यूबेशन के बाद अतिरिक्त मिलाते हुए बिना विकसित कर सकते हैं। इस चरण में कोशिकाएं केवल पर्यावरण के तापमान (3) कोशिका आंदोलन के प्रतिबंध के अनुसार विभाजित होंगी: सेल आंदोलन दृढ़ता से सब्सट्रेट (एगर उठे पैड) दृढ़ता पर निर्भर करता है। सब्सट्रेट दृढ़ता कुल एगर उठे और जेल ठोस समय की मात्रा पर निर्भर करती है। जेल को कमरे के तापमान पर रात भर जमना नहीं छोड़ा जा सकता है, क्योंकि एस्चेरिचिया कोलाई को माइटोसिस से गुजरना होगा। सब्सट्रेट स्थिरता को प्रभावित करने वाले अन्य कारकों में नमूने और आर्द्रता में पानी की मात्रा शामिल है। प्रतिनिधि परिणामोंमें अतिरिक्त मुद्दों पर विस्तार से चर्चा की जाती है । यह प्रोटोकॉल कई विवरण प्रदान करता है और धीरे-धीरे एक कदम से दूसरे में जाता है। प्रोटोकॉल इमेजिंग प्रयोगों के लिए लंबी स्थिरता प्रदान करता है और एक बुनियादी छवि प्रसंस्करण उपकरण प्रदान करता है।

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Protocol

1. मीडिया और संस्कृति की तैयारी

  1. 1,000x कार्बेनेसिलिन (50 मिलीग्राम/एमएल) या प्रासंगिक एंटीबायोटिक का स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. . कार्बेनिकिन का वजन 0.5 ग्राम करें। बाँझ एच 2 O के 10 एमएल जोड़ें पूरीतरहसे भंग।
    2. 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से कार्बेनेसिलिन स्टॉक को स्टरलाइज करें। एंटीबायोटिक समाधान को अलीकोट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. लिसोजेनिक शोरबा (एलबी) प्लेटें तैयार करने के लिए, 5 ग्राम ट्राइप्टोन, एनएसीएल के 5 ग्राम, खमीर निकालने के 2.5 ग्राम और बाँझ एच 2 ओ के 0.5 एल के साथ बैक्टो एगर के 7.5 ग्राम मिश्रण20मिनट के लिए 121 सी पर समाधान।
    1. आंशिक रूप से पिघला हुआ जेल-मिश्रण को 50 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जलमग्न करें। कार्बेनिकिन (50 मिलीग्राम/एमएल) के 1,000 माइक्रोन जोड़ें।
    2. बाँझ वातावरण में पेट्री व्यंजन तैयार करें। प्लेटों को फ्रिज में संग्रहीत करने से पहले सेट करने के लिए छोड़ दें।
  3. M9 न्यूनतम मीडिया के लिए, निम्नलिखित के अलग स्टॉक समाधान तैयार करें: 5x M9 लवण (56.4 ग्राम/एल), 2 एम ग्लूकोज और 2% बायोटिन-मुक्त कैमामिनो एसिड। 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर समाधान ऑटोक्लेव।
  4. 5 पेट्री प्लेट्स तैयार करने के लिए, न्यूनतम मीडिया (1x M9) के 89.2 मिलीलन के साथ 1125 मिलीग्राम कम पिघलने वाले एगर और 400 मिलीग्राम एगर मिलाएं। 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 2% कैसमिनो एसिड (2% [vol/vol]) का 10 एमएल जोड़ें।
    नोट: फ्लास्क के भीतरी होठों पर मीडिया डालना सुनिश्चित करें।
  5. माइक्रोवेव 3 से 4 सेकंड के छोटे फटने में समाधान। समाधान स्पष्ट होने तक दोहराएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि उबलते बिंदु तक न पहुंचें।
  6. प्रसार द्वारा आगे मिश्रण करने के लिए गर्म पानी के स्नान (60 डिग्री सेल्सियस) में 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क रखें, और इसे ठंडा करने के लिए छोड़ दें जब तक कि इसका तापमान लगभग 45-50 डिग्री सेल्सियस तक न गिर जाए।
  7. थाली डालने वाली बेंच पर लौ को हल्का करें ।
  8. निम्नलिखित क्रम में सभी समाधान जल्दी से जोड़ें:
    50% ग्लाइसरोल के 800 माइक्रोन (0.4% [vol/vol])
    100 μL के थियामिन (B1)
    ग्लूकोज के 1100 माइक्रोन (2M)
    कार्बेनिकिन (50 मिलीग्राम/एमएल) के 100 माइक्रोनल।
  9. आगर में सभी अवयवों का वितरण सुनिश्चित करने के लिए एर्लेनमेयर फ्लास्क को भंवर करें।
  10. लौ के बगल में एक समय में एक प्लेट खोलें और डालने का कार्य शुरू करें।
    1. प्लेटों को प्रारंभिक ठोसता तक कुछ मिनटों के लिए बेंच पर छोड़ दें।
    2. जेल पर टपकने से पानी संघनन को रोकने के लिए प्लेटों को उल्टा करें।
    3. प्लेटों के बारे में 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर जमना छोड़ दें ।
    4. एक बार प्लेटें जम कर सूख जाती हैं, तो उन्हें लगभग 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. बैक्टीरियल उपभेदों और प्लाज्मिड निर्माण

नोट: आनुवंशिक सर्किट में एक हिस्सा होता है; पीटेटो प्रमोटर द्वारा संचालित ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) जिसके परिणामस्वरूप संविलियन अभिव्यक्ति होती है। इस काम में सभी प्लाज्मिड बुनियादी आणविक क्लोनिंग तकनीकों का उपयोग करके बनाए गए थे और एक मानक हीट शॉक प्रोटोकॉल24का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई 10 में बदल गए थे। अंतिम निर्माण परीक्षण के लिए एस्चेरिचिया कोलाई MG1655 जंगली प्रकार तनाव में तब्दील हो गया था।

  1. मानक हीट शॉक प्रोटोकॉल24के साथ वांछित प्लाज्मिड को एस्चेरिचिया कोलाई एमजी1655 कोशिकाओं में बदल दें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक पौंड आगर प्लेट पर बदल कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    नोट: माइक्रोस्कोपी उपयोग के लिए पेट्री व्यंजन को चरण 2.2 से 3 दिनों तक रखना संभव है।
  3. एक ग्लास ट्यूब में प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक पौंड शोरबा के 5 एमएल में एक ही कॉलोनी टीका।
  4. 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में गति मिलाते हुए 250 आरपीएम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ाएं जब तक कि तरल बादल न हो जाए।
  5. कमजोर पड़ने के समाधान के 1 एमएल को इस प्रकार तैयार करें:
    न्यूनतम मीडिया के 892 माइक्रोन (1x M9)
    8 μL के 50% ग्लाइसेरोल (0.4% [vol/vol])
    2% Casamino एसिड के 100 μL (0.2% [wt/vol])
    1 μL के थियामिन (B1)
    ग्लूकोज के 11 माइक्रोन (2 M)
    प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं के 1 माइक्रोन
    1. मिक्स और नीचे स्पिन।
  6. सेल कल्चर (1:30) को स्टेप 2.4 से 2 एमएल ट्यूब में कमजोर पड़ने वाले घोल (स्टेप 2.5) के 1000 माइक्रोन में एस्चेरिचिया कोलाई ग्रोथ के 30 माइक्रोन जोड़कर पतला करें।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए (250 आरपीएम) के साथ 1 घंटे के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  8. 40 माइक्रोन - चरण 1.10 में तैयार M9 प्लेटों पर 60 μL हो जाना। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली को इनक्यूबेट करें।
    नोट: चढ़ाना के लिए ऑप्टिकल घनत्व (OD600nm)0.1 के आसपास होना चाहिए।
  9. बेंच पर तीन 35 एमएम ग्लास बॉटम प्लेट्स तक रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्लेट के ग्लास में माइक्रोस्कोप लेंस का उपयोग करने के लिए सही मोटाई है।
  10. जेल प्लेटों पर सीडिंग के लिए संस्कृति तैयार करें, चरण 2.9 माइक्रोस्कोप माप पर तैयार प्लेट से कालोनियों के लिए चरण 2.3 से 2.6 दोहराएं।
  11. तीन माइक्रोस्कोप प्लेट बनाने के लिए निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
    1. पानी स्नान को 60 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
    2. न्यूनतम मीडिया (1x M9) के 8.92 मिलील के साथ 112.5 मिलीग्राम कम पिघलने वाला और 40 मिलीग्राम एगर मिलाएं और 25 एमएल एर्लेनमीयर फ्लास्क में 2% कैसमिनो एसिड (0.2% [vol/vol]) का 1 मिलियन जोड़ें।
      नोट: फ्लास्क के भीतरी होठों पर मीडिया डालना सुनिश्चित करें।
  12. माइक्रोवेव 2 से 3 सेकंड के छोटे फटने में समाधान। समाधान स्पष्ट होने तक दोहराएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि उबलते बिंदु तक न पहुंचें।
  13. 25 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क को गर्म पानी के स्नान (60 डिग्री सेल्सियस) में प्रसार द्वारा आगे मिश्रण करने के लिए रखें, और इसे बेंच पर ठंडा करने के लिए छोड़ दें जब तक कि इसका तापमान लगभग 45-50 डिग्री सेल्सियस तक न गिर जाए।

3. एगरेग्डेड पैड की तैयारी

  1. 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ बेंच। साफ बेंच पर स्ट्रेच टेप। सुनिश्चित करें कि टेप चिकनी और समतल है।
  2. दो कवर्लिप्स तैयार करें: एक टेप पर और एक दूसरा पास में। एक कवरलिड तैयार करें।
  3. पानी के स्नान से फ्लास्क (चरण 2.14 पर तैयार) निकालें, फ्लास्क के बाहर को साफ करें और इसे ठंडा करने के लिए छोड़ दें जब तक कि इसका तापमान लगभग 45-50 डिग्री सेल्सियस तक न गिर जाए।
  4. जेल समाधान बनाने के लिए, निम्नलिखित क्रम में सभी समाधानों को जल्दी से मिलाएं:
    80 माइक्रोन ऑफ 50% ग्लाइसेरोल (0.4% [vol/vol])
    2% कैसमिनो एसिड का 1 एमसीएल (0.2% [wt/vol])
    10 μl के थियामिन (B1)
    ग्लूकोज के 110 माइक्रोन (2 M)
    प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं के 10 μL।
  5. कवरस्लिप पर जेल के 1.5 एमएल डालें और इसे "सैंडविच" बनाने वाले दूसरे टुकड़े के साथ कवर करें।
  6. गर्म पानी के स्नान के लिए एर्लेनमेयर वापस करें। सैंडविच को ढक्कन से ढक कर 20 मिनट के लिए टाइमर सेट करें।
  7. साथ ही, ट्यूब को 1 घंटे के लिए चरण 2.11 से 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए (250 आरपीएम) के साथ इनक्यूबेट करें
  8. 20 मिनट के बाद सैंडविच (चरण 3.5) को फ्लिप करें, इसे कवर करें और 1 घंटे के लिए आराम करने के लिए छोड़ दें।
    नोट: बेहतर परिणामों के लिए चरण 3.8 की अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आराम करने के लिए "सैंडविच" छोड़ दें।
  9. 35 मिमी डिश पर नमूना पिपिंग करके चरण 3.7 से बीज एस्चेरिचिया कोलाई संस्कृति।
    नोट: अलग छोटी बूंदों के रूप में कोशिकाओं के 6 माइक्रोन पाइपिंग सबसे अच्छा परिणाम देता है ।
  10. बूंदों को कम से कम 15 मिनट और 30 मिनट तक सूखने दें।
  11. कवरस्लिप को दूर फिसलने से कदम 3.8 से सैंडविच के जम जेल का पर्दाफाश करें।
  12. बायोप्सी पंच या टिप के साथ छोटे व्यक्तिगत पैड में सैंडविच काटें।
  13. इसे धीरे से नमूने (चरण 3.9) पर दुबला करें। डिश को बेंच पर 20 मिनट के लिए छोड़ दें।

4. माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करना

  1. 3.6 चरण से पानी स्नान से फ्लास्क निकालें। फ्लास्क के बाहर को साफ करें और कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) को ठंडा होने दें।
    नोट: टाइमर समाप्त होने से लगभग 3 मिनट पहले 4.1 चरण पर फ्लास्क निकालें।
  2. एक गोलाकार गति में प्लेट परिधि में लगातार जेल के 3 एमएल डालें। कुछ मिनट के लिए जमना छोड़ दें।
  3. टेप के साथ सील प्लेटें और 25 जी सुई के साथ कई छेद छेद। जेल पर टपकता पानी संघनन को रोकने के लिए सभी व्यंजनों को फ्लिप करें।
  4. सेल माइटोसिस को रोकने के दौरान पूर्ण ठोसकरण की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी व्यंजनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: लगातार माप के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने छोड़ दें, एक दिन से अधिक नहीं।
  5. निर्माता निर्देशों के अनुसार माइक्रोस्कोप शुरू करें।
  6. सबसे कम प्रवर्धन लेंस का उपयोग कर प्रारंभिक ध्यान खोजें और स्वचालित फोकस सिस्टम (एएफएस) संलग्न करें।
  7. यदि आवश्यक हो तो तेल का उपयोग करें, लेंस को तेल के साथ डुबो दें और प्लेट को एक प्लेटफ़ॉर्म नियंत्रक (मैन्युअल रूप से नहीं) के साथ ले जाकर सावधानी से फैलाएं और एएफएस को फिर से लगाया जा सकता है।
  8. Z चरण क्रॉस-सेक्शन के लिए डिफ़ॉल्ट सुझाव के बाद, जेड दिशा में सापेक्ष क्रॉस-सेक्शन का उपयोग करें।
    नोट: हम हर 5 मिनट और फ्लोरोसेंट छवियों हर 20 मिनट उज्ज्वल क्षेत्र छवियों लिया । कभी-कभी पहले 30 मिनट के दौरान ध्यान को समायोजित करने की आवश्यकता होती है। माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर बॉक्स और तेल को प्रीहीटिंग करना, जबकि नमूने को ठंडा करने से ध्यान के प्रारंभिक नुकसान को कम करने में मदद मिलती है।

5. डेटा विश्लेषण

नोट: माइक्रोस्कोपी डेटा को संसाधित करने के लिए, हमने मैटलैब में कंप्यूटर आधारित सॉफ्टवेयर तैयार किया है। यह सॉफ्टवेयर क्षेत्र द्वारा उज्ज्वल क्षेत्र झगड़ा छवियों और खंडों और प्रकार कोशिकाओं से सेल सीमाओं की पहचान की सुविधा प्रदान करता है। इस छवि विश्लेषण के आउटपुट का उपयोग कोशिका तीव्रता के स्तर को प्राप्त करने और माइक्रोस्कोप रिज़ॉल्यूशन सीमा के कारण सेल हेलो जैसे फ्लोरोसेंट डोमेन में कलाकृतियों को रद्द करने के लिए फ्लोरोसेंट टिफ छवियों पर एक मुखौटा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। विकसित सॉफ्टवेयर इसी तरह के कार्यों से प्रेरित था7,25,26,27, 28,29,30 और प्रयोगशाला के लिए एक सुरुचिपूर्ण समाधान प्रदान करता है।

  1. सबसे पहले, main_code.mमें निम्नलिखित मापदंडों को परिभाषित करें।
    1. अधिग्रहण छवियों के फ़ोल्डर को परिभाषित करें।
    2. छवि समय अवधि को परिभाषित करें - मिनटों में उज्ज्वल फ़ील्ड चैनल समय चरण।
    3. जीएफपी आवृत्ति को परिभाषित करें - जीएफपी छवियों के अधिग्रहण की दर।
    4. माइक्रोस्कोप रेजोल्यूशन को परिभाषित करें (यानी, कितने पिक्सल 1 माइक्रोन के बराबर होते हैं)।
    5. हिस्टोग्राम बिन रेंज को परिभाषित करें - सेल क्षेत्र रेंज।
      नोट: सेल क्षेत्र के अनुसार डेटा को वर्गीकृत करने की प्रक्रिया प्रवाह साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण में गेटिंग के सिद्धांतों के समान है। गेट्स आम विशेषताओं के साथ कोशिकाओं की आबादी के आसपास रखा जाता है, आमतौर पर आगे बिखरे हुए और पक्ष बिखरे हुए, अलग और ब्याज की इन आबादी की मात्रा निर्धारित करने के लिए । माइक्रोस्कोपी गेट, जांच और कई सेल समूहों की मात्रा की अनुमति देता है।
    6. कन्वोोल्यूशन गिरी (3,3) को परिभाषित करें - यह पैरामीटर वैश्विक थ्रेसिंग(count_cells.m)द्वारा सेल सीमाओं का पता लगाता है।
      नोट: इस सेटअप की जरूरत लैब या माइक्रोस्कोप बदलने पर ही होती है। सॉफ्टवेयर इनपुट उज्ज्वल क्षेत्र चैनल के लिए सूचकांक c1, फ्लोरेसेंस चैनल c2 के रूप में लेबल के साथ लेबल की आवश्यकता है ।
  2. main_code.mचलाएं, जो अन्य सभी स्क्रिप्ट अपने आप(count_cells.m, cell_growth_rate.m)चलाएंगे ।
    1. प्रोग्राम स्वचालित रूप से उज्ज्वल फ़ील्ड छवियों को सेगमेंट करता है (पूरक चित्रा 2-4देखें)।
    2. प्रति सेल तीव्रता स्तर निकालने के लिए फ्लोरोसेंट छवि (जीएफपी) के साथ विभाजन छवि को मिलाएं।
    3. समय से कोशिकाओं की मात्रा के ग्राफ की गणना करें और घातीय वृद्धि के अनुसार फिट करें।
    4. प्रत्येक सेल क्षेत्र रेंज के लिए मतलब और मानक विचलन (एसटीडी) की गणना करें।
    5. प्रत्येक सेल क्षेत्र रेंज के लिए सिग्नल टू शोर अनुपात (एसएनआर) की गणना करें।
    6. साजिश और तीव्रता से कोशिकाओं की मात्रा के वितरण फिट।
    7. विचरण (सीवी) के गुणांक की गणना करें और विश्लेषक डेटा प्रवाह की तुलना करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर एक नए फ़ोल्डर "yourfolder/सेगमेंटेड" में conv_kernel को समायोजित करने के लिए अंतिम विभाजन छवियों को आउटपुट के रूप में देगा। सॉफ्टवेयर एक नए फ़ोल्डर में ग्राफ आउटपुट के रूप में देगा "yourfolder/
  3. प्रयोगों के बीच तुलना करने के लिए, compare_experiments.mका उपयोग करें।
    1. सहेजे गए रेखांकन के लिए निर्देशिका और तुलनासल्ट निर्देशिका के लिए पता परिभाषित करें।
    2. फाइल चलाएं।

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Representative Results

सॉफ्टवेयर उज्ज्वल क्षेत्र डोमेन छवियों का विश्लेषण करता है जो ऑफ-व्हाइट और ब्लैक हैं। एस्चेरिचिया कोलाई एक ऑफ-व्हाइट पृष्ठभूमि पर काले आयताकार आकार की तरह दिखेगा और चमक की गतिशील रेंज को अपने केंद्र(चित्रा 1)में एक स्पाइक दिखाना चाहिए। फ्लोरोसेंट छवियों में कोशिकाओं में एक छोटा सा प्रभामंडल हो सकता है लेकिन आयताकार आकार वाली व्यक्तिगत कोशिकाओं को अभी भी हल किया जा सकता है। एक माइटोसिस घटना का पता सबसे पहले 30 मिनट के बाद लगाया जाना चाहिए। माइक्रोस्कोप ध्यान समय के साथ स्थिर रहना चाहिए और हालांकि कोशिकाओं को उन 30 मिनट के दौरान धीरे से कदम हो सकता है, वे देखने के क्षेत्र छोड़ने की संभावना नहीं है । इस तरह का प्रयोग अच्छा माना जाएगा और इसे चित्र 2पर देखा जा सकता है . कोशिकाओं को कम आवर्धन पर उज्ज्वल क्षेत्र डोमेन में पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है । हम एक उच्च कॉपी संख्या (एचसीएन) प्लाज्मिड के साथ औसत फोकस दूरी स्थापित करने की सलाह देते हैं, क्योंकि कम आवर्धन पर ध्यान देना आसान है। पहले से उच्च आवर्धन पर कम कॉपी नंबर (एलसीएन) प्लाज्मिड को मापते समय औसत दूरी निर्धारित करें। यह फोकस दूरी मुख्य रूप से प्लेटों, माइक्रोस्कोपी सिस्टम और तेल में निर्भर करती है, न कि जेल या एस्चेरिचिया कोलाई तनाव की मोटाई।

इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रयोगशालाओं में अनुकूल बनाते समय, निम्नलिखित मुद्दे उत्पन्न हो सकते हैं (1) एस्चेरिचिया कोलाई प्लेटें (नमूने) जो गलत कमजोर पड़ने के अनुपात में तैयार किए गए हैं, वे प्लेट को सील किए बिना तैयार कोशिकाओं की अपरिवर्तित संख्या(चित्रा 3 और चित्रा 4) (2)नमूने अत्यधिक सिकुड़न दिखा सकते हैं। यह कोशिकाओं बहाव(चित्रा 3)के रूप में देखा जा सकता है या ध्यान की हानि का कारण(चित्रा 5)(3) कुछ नमूनों तैराकी कोशिकाओं की पृष्ठभूमि पर धीमी गति से स्थानांतरण ' तय ' कोशिकाओं (काले रंग में) प्रदर्शन कर सकते है (सफेद में) । यह एक गीले नमूने के कारण होने की संभावना है और यह आमतौर पर स्थिर हो जाता है क्योंकि अतिरिक्त पानी जेल द्वारा अवशोषित हो जाता है(अनुपूरक वीडियो 1)(4) नमूने जो वार्मिंग के कुछ मिनटों के बाद कोई कोशिकाओं को प्रदर्शित नहीं करते हैं, गलत तरीके से तैयार किया गया हो सकता है, संभावना के कारण: (I) जेल डाला गया था, जबकि अभी भी बहुत गर्म है, (द्वितीय) सुरक्षात्मक टोपी भूल गया था, (III) ंयूनतम मीडिया एक घटक का अभाव है, (चतुर्थ) गलत सेल घनत्व, और (V) जेल भी कसकर बंद कर दिया गया था । जेल सिकुड़न(चित्रा 5)और (छठी) कोशिकाओं की कीमत पर गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए छेद पंच करना महत्वपूर्ण है, कोशिकाओं के शीर्ष पर एक स्टैकिंग, सेल मोनोलेयर से प्रभावी ढंग से कोशिकाओं का पता लगाने और विश्वसनीय फ्लोरोसेंट सिग्नल(अनुपूरक चित्रा 5)को मापने से समझौता कर सकते हैं।

हमने इस काम में तीन सर्किट मापा है। सबसे पहले, एक संविलियन प्रमोटर जो चित्र 6में दिखाए गए जीएफपी को नियंत्रित करता है । दूसरा, एक संविलियन प्रमोटर जो चित्र 7 में दिखाए गए सुपर-फोल्ड जीएफपी31 (एसएफजीएफपी) को नियंत्रितकरता है। एक ssrA क्षरण टैग (AAV) एस एफGFP के लिए जोड़ा गया था इसके हाफ जीवन को कम करने के लिए मिनट5। तीसरा सर्किट एक सकारात्मक प्रतिक्रिया सर्किट1पर आधारित है, और एसील-होमोसेरीन-लैक्टोन (एएचएल) द्वारा प्रेरित है। पीलक्सआर प्रमोटर एस एफ जीएफपी और लक्सर को नियंत्रित करता है,जो एएचएल के साथ बाध्यकारी एक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर है जो पीलक्सआर को सक्रिय करने के लिए बाध्यकारी है जैसा कि चित्र 8में दिखाया गया है । चित्रा 9 सेल विकास की गतिशीलता प्रस्तुत करता है (सेल संख्या बनाम समय), चित्रा 10 मापा संकेत की गतिशीलता से पता चलता है (समय का मतलब फ्लोरेसेंस), और चित्रा 11 मूल्यांकन कुल शोर (मानक विचलन (एसटीडी) बनाम समय की गतिशीलता से पता चलता है) ।

एसएनआर (या सीवी) का व्यापक रूप से सर्किट32की सटीकता और विश्वसनीयता को व्यक्त करने के लिए एनालॉग इलेक्ट्रॉनिक सर्किट डिजाइन करने में उपयोग किया जाता है। सीवी एकल कोशिकाओं के बीच संकेत के वितरण से संबंधित है और तरीकों और माइक्रोस्कोप और प्रवाह विश्लेषकों जैसे विभिन्न उपकरणों में तुलना की अनुमति देता है। माइक्रोस्कोप छवियों से एसएनआर की गणना हमें समय भर में सर्किट की तुलना करने की अनुमति देती है, खंडित कोशिकाओं को संकेत की तुलना में शोर के विशिष्ट समाधान के लिए एक उपाय प्रदान करने के रूप में एक ही समय में मापा जाता है, या एक विशिष्ट समय और प्रेरक एकाग्रता के लिए शोर अंतराल। यह संकेत दे सकता है कि डिटेक्टर कोशिकाएं प्रेरक एकाग्रता के सटीक सिग्नल प्रतिक्रिया को हल करने में सक्षम होंगी या नहीं। इस काम में, सीवी की गणना उन सभी खंडित कलाकृतियों पर विचार करके की गई थी जो कोशिकाएं हैं, चाहे विभाजन चक्र में कोशिका प्रगति की परवाह किए बिना। एसएनआर की गणना समय के साथ विशिष्ट सेल क्षेत्र सीमा के लिए की गई थी, और फिर इसे तीन बार किए गए प्रयोगों के लिए औसत दिया गया था। न तो अधिग्रहीत संकेत और न ही एसटीडी अकेले विश्वसनीय हैं, क्योंकि वे प्रयोग और इस्तेमाल किए गए उपकरणों के लिए विशिष्ट हैं। सिग्नल को मनमाने ढंग से इकाइयों के साथ मापा जाता है जो उपकरण लाभ पूर्व निर्धारित, फोटो डिटेक्टर और एक्सपोजर समय पर निर्भर करता है। चित्रा 10 में प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि विभाजन चक्र में कोशिकाओं के चरण शोर के स्तर को प्रभावित नहीं करता है, के रूप में क्षेत्र की विभिन्न श्रेणियों (विभाजन चक्र में अंक) एक ही प्रवृत्ति दिखाते हैं । यह अवलोकन इस दावे का समर्थन कर सकता है कि सटीक मां-बेटी संबंधों को शोर को मापने के लिए टाला जा सकता है और यह प्रस्तुत विधि के लिए SNR में सुधार कर सकता है । जीएफपी से एसएफजीएफपी के बीच एसएनआर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया जैसा कि चित्र 12में दर्शाया गया है । हम एसएनआर (एसएनआर= मतलब/एसटीडी) की गणना करते हैं और इसे चित्र 12 और चित्रा 13 में पेश करते हैं।

हम तो निम्नलिखित समीकरणों के आधार पर विचरण और सीवी की गणना31

1.1Equation 2

1.2Equation 3

जहां λ प्रोटीन तह समय है, टी सेल डिवीजन समय है, θ और μ विभाजन से पहले और बाद में प्लाज्मिड की संख्या है, प्लाज्मिड कॉपी संख्या31। उपरोक्त समीकरणों (1.1, और 1.2) का उपयोग करके हम गामा वितरण के लिए फ्लो एनालाइजर सिग्नल से डेटा फिट कर सकते हैं।

फिर हमने सीवी के बीच तुलना की, जिसे फ्लो एनालाइजर(चित्रा 14)द्वारा मापा और गणना की जाती है, और प्रोटोकॉल(चित्र 15)द्वारा।

Figure 1
चित्रा 1:ब्राइट फील्ड एक्सपोजर इमेज (क) ब्राइट फील्ड में स्थिर अधिग्रहण (ख)सेगमेंटेशन इमेज, केवल रंगीन कोशिकाएं ही गणना(सी)पिक्सल ब्राइटनेस मैप ऑफ एक्विजिशन में प्रवेश करती हैं, स्पाइक बैकग्राउंड शोर है । इसके द्वारा थ्रेसहोल्ड केवल एस्चेरिचिया कोलाईको खंडित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:यह प्रयोग अच्छी स्वस्थ कोशिकाओं को विभाजित करने और 120 मिनट के बाद प्रतिक्रिया दिखाता है। छवियों को 20 मिनट के अंतराल पर क्रमिक रूप से प्राप्त किया गया । उपनिवेशों पर ध्यान केंद्रित किया जाता है, जेल नमूने के बीच स्थिर है। उपनिवेशों को विभाजित और मजबूत संकेतों का उत्पादन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:फ्लोरोसेंट छवि पर गलत कमजोर पड़ने के अनुपात और जेल सिकुड़न के प्रभाव। चित्र 20 मिनट के अंतराल पर प्राप्त किए गए थे(क)व्यक्तिगत एस्चेरिचिया कोलाई लाल रंग में परिक्रमा की(ख)एक ही कोशिका देखने के क्षेत्र के दाईं ओर बहती है(ग)सेल आगे बहाव । कोशिकाएं भी पदों को विभाजित या नहीं बदलती हैं, शायद कम कमजोर पड़ने वाले अनुपात और जेल सिकुड़न के कारण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:इस प्रयोग में किसी गतिविधि का पता नहीं चला और लगभग कोई कोशिकाएं मौजूद नहीं थीं। संभावित कारण जेल बहुत गर्म किया जा रहा है, नमूना के सुखाने बहुत आक्रामक जा रहा है या कोई सुरक्षात्मक टोपी(एक)फ्लोरोसेंट छवियों ४० मिनट पर लिया(ख)फ्लोरोसेंट छवियों ६० मिनट पर लिया जा रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:ध्यान हानि और फोटोब्लैचिंग। ऑटो फोकससिस्टम का उपयोग करके 15 मिनट के समय अंतराल पर (ए) के माध्यम से(डी)की उत्तरोत्तर छवियां प्राप्त की गई थीं। देखें अनुपूरक वीडियो 2। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:पीटेटो का प्लाज्मिड नक्शा जो जीएफपी को नियंत्रित करता है। टेटआर दमन के बिना, पीटेटो प्रमोटर एक संविलियन प्रमोटर के रूप में कार्य करता है। सर्किट कम कॉपी नंबर प्लाज्मिड पर क्लोन किया जाता है। यह प्लाज्मिड किसी भी संशोधित सर्किट के लिए एसएनआर माप के आधार के रूप में कार्य करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 7
चित्रा 7:पीटेटो का प्लाज्मिड नक्शाजो एस एफजीएफपी को नियंत्रित करता है। एस एफजीएफपी एक एएवी क्षरण टैग के लिए जुड़ा हुआ है। सर्किट कम कॉपी नंबर प्लाज्मिड पर क्लोन किया जाता है। एसएफजीएफपी-एएवी जीएफपी का एक अधिक मजबूत संस्करण है, जबकि एएवी टैग इसे एस्चेरिचिया कोलाईके हाउसकीपिंग प्रोटेसेस द्वारा गिरावट के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 8
चित्रा 8:सकारात्मक प्रतिक्रिया सर्किट का प्लाज्मिड नक्शा। सर्किट एक एएचएल प्रेरक द्वारा प्रेरित है, जो लक्सआर ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर को बांधता है। पीलक्सआर प्रमोटर, जिसे एएचएल-लक्सआर कॉम्प्लेक्स द्वारा विनियमित किया जाता है, लक्सर और एसएफजीएफपी-एएवी के उत्पादन को सक्रिय करता है। सर्किट कम कॉपी नंबर प्लाज्मिड पर क्लोन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 9
चित्रा 9: एस्चेरिचिया कोलाई MG1655कीगतिशीलता न्यूनतम मीडिया में तनाव वृद्धि में शामिल है (ए) पीटेटो-जीएफपी,लगभग 35 मिनट की घातीय वृद्धि। इस प्रयोग की छवियों को चित्र 2(ख)पीटेटो-एसएफजीएफपीमें दिखाया गया है, जो लगभग 35 मिनट की घातीय वृद्धि है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 10
चित्रा 10:फ्लोरोसेंट तीव्रता का स्तर, प्रति पिक्सेल सामान्यीकृत और 20 मिनट के अंतराल पर अधिग्रहीत किया गया। 
कलाकृतियों को कम करने के लिए कोशिकाओं को क्षेत्र के अनुसार binned किया जाता है। कोशिकाओं को उनके क्षेत्र द्वारा माइक्रोमीटर स्क्वायर में विभाजित किया जाता है(ए)पीटेटो-जीएफपीसर्किट210 मिनट पर तीव्रता के लिए पहली पुनरावृत्ति 0.004 a.u(b)PtetO-sfG एफपी सर्किट 210 मिनट पर तीव्रता के लिए पहली पुनरावृत्ति 0.022 एयू(सी)पीटेटो-जीएफपी सर्किट(डी)पीटेटोके मापा संकेत का मापा संकेत है -एस एफजीएफपी सर्किट। सभी प्रायोगिक डेटा तीन प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। सॉफ्टवेयर सेल क्षेत्र को विभिन्न समूहों(ए)और(बी)डिवीजन चक्र का प्रतिनिधित्व करने वाले चार सेल क्षेत्र श्रेणियों के लिए रेखांकन दिखा सकता है। 14 माइक्रोमीटर का पहला क्षेत्र विभाजन के बाद कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि सबसे अधिक संभावना है कि विभाजन के बाद कोशिकाएं सबसे छोटी होंगी । 21 माइक्रोन का दूसरा क्षेत्र विभाजन से पहले कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। तीसरे और चौथे क्षेत्र विभाजन पर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि कुल क्षेत्र को विभाजित करने में अधिक समय लेने वाली कोशिकाओं पर विचार करने के लिए दो (29 और 36 माइक्रोन) से गुणा किया जाता है। क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से माइक्रोस्कोपी छवियों पर देख डेटा का आकलन करके चुना गया था ।   कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11:एकल कोशिका फ्लोरेसेंस तीव्रता के मानक विचलन (एसटीडी) के लिए: (क)पीटेटो-जीएफपीसर्किट 210 मिनट पर एसटीडी के लिए पहली पुनरावृत्ति 0.001865 एयू(बी)पीटेटओ-एसएफजीएफपी सर्किट 210 मिनट पर एसटीडी के लिए पहली पुनरावृत्ति 0.01477 एयू(सी)पीटेटो-जीएफपी सर्किट(डी)एसटीडी पीटेटो-एसएफजीएफपी सर्किट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्रा 12:एकल कोशिका फ्लोरेसेंस तीव्रता का एसएनआर। हम एसएनआर = मीन/एसटीडी(ए)पीटेटो-जीएफपीसर्किट की गणना करते हैं 210 मिनट पर एसएनआर के लिए पहली पुनरावृत्ति 1.309 प्रति वर्ष(बी)पीटेटो-एसएफजीएफपी सर्किट 210मिनट पर एसएनआर के लिए पहली पुनरावृत्ति 1.29 ए यू(सी)जीएफपी मापन कीतीन पुनरावृत्ति है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 13
चित्रा 13:एएचएल को हाफ टाइम रिस्पांस के लिए एएचएल(बी)पीलक्सआर -एसएफजीएफपी सर्किट एसएनआर के लिए सिंगलसेल फ्लोरेसेंस तीव्रता (ए)पी लक्सआर -एसएफजीएफपी सर्किट एसएनआर के लिए एक - पीलक्सआरसर्किट एसएनआर का एसएनआर। सकारात्मक प्रतिक्रिया एएचएल विनियमित सर्किट का एसएनआर संविलियन एस एफजीएफपी सर्किट के लिए एसएनआर की तुलना में अधिक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 14
चित्रा 14: प्रवाह विश्लेषक के आधार पर जीन सर्किट के हिस्टोग्राम: प्रयोगात्मक डेटा (नीला) और स्टोचस्टिक मॉडल डेटा (लाल)। एक्स एक्सिस प्रवाह साइटोमेट्री से मनमाने ढंग से फ्लोरेसेंस इकाइयों का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई एक्सिस संबंधित फ्लोरेसेंस स्तर का उत्पादन करने वाली कोशिकाओं की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है। तीन घंटे के बाद फ्लो एनालाइजर का इस्तेमाल करते हुए डाटा मापा गया। जीएफपी फ्लोरेसेंस को 484 एनएम की तरंगदैर्ध्य और 510 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जन द्वारा उत्तेजित करके निर्धारित किया गया था। पीई-टेक्सासरेड फिल्टर वोल्टेज का उपयोग जीएफपी अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के लिए एक उच्च थ्रूपुट पारखी पर किया जाता था। फ्लो एनालाइजर वोल्टेज को सॉफ्टवेयर का उपयोग करके समायोजित किया गया था ताकि अधिकतम और न्यूनतम अभिव्यक्ति के स्तर को एक ही वोल्टेज सेटिंग्स के साथ मापा जा सके। इस प्रकार, प्रत्येक पूरे प्रयोग में लगातार वोल्टेज का उपयोग किया गया था। एक ही वोल्टेज एक ही प्रयोग के बाद पुनरावृत्ति के लिए इस्तेमाल किया गया। फिटिंग गामा वितरण31के उपयोग से किया गया था । इस विधि का मानना है कि संकेत ज्यादातर प्लाज्मिड के यादृच्छिक वितरण पर निर्भर करता है(क)कम कॉपी संख्या प्लाज्मिड पर पीटेटो-जीएफपी क्लोन का माप। प्रयोगात्मक सीवी = 0.46, मॉडल सीवी = 0.32(ख)पीटेटोका माप -एसएफजीएफपी-एएवी कम कॉपी नंबर प्लाज्मिड पर क्लोन किया गया। प्रायोगिक सीवी = 0.86, मॉडल सीवी = 0.44। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 15
चित्रा 15: माइक्रोस्कोप के आधार पर जीन सर्किट के हिस्टोग्राम: प्रायोगिक डेटा (बिंदीदार रेखाएं) और स्टोचस्टिक मॉडल डेटा (ठोस रेखाएं)। एक्स एक्सिस उल्टे माइक्रोस्कोप से मनमाने ढंग से फ्लोरेसेंस इकाइयों का प्रतिनिधित्व करता है और वाई एक्सिस इसी फ्लोरेसेंस स्तर का उत्पादन करने वाली कोशिकाओं की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है। कम कॉपी नंबर प्लाज्मिड(बी)पीटेटोका माप -एसएफजीएफपी-एएवी कम कॉपी नंबर पर क्लोन किए गए मैटलैब गामा डिस्ट्रीब्यूशन31,32 (ए) मापन का उपयोग करके फिटिंग की गई थी। तुलना से पता चलता है कि हमारा प्रोटोकॉल प्रवाह विश्लेषक प्रयोग के समान सीवी मूल्य प्राप्त करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1:एमजी1655 तनाव के लिए 1:500 और 1:20 के बीच चार कमजोर पड़ने का अनुपात। ग्राफ से पता चलता है कि यदि प्रारंभिक घनत्व अधिक है, तो पौंड पोषक तत्व प्रचुर मात्रा में हैं जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाएं तेजी से विभाजित होती हैं । 1:500 कमजोर पड़ने के लिए, सेल घनत्व स्थिर रहा। 1:100 कमजोर पड़ने के लिए, सेल घनत्व धीरे-धीरे बढ़ गया। 1:50 कमजोर पड़ने के लिए, 250 आरपीएम इनक्यूबेशन में महत्वपूर्ण देरी के बिना मध्यम विभाजन दर पर सेल घनत्व में वृद्धि हुई। 1:20 कमजोर पड़ने के लिए, सेल घनत्व संतृप्ति तेजी से पहुंच गया। हमने 1:30 के कमजोर पड़ने के अनुपात को चुना, जिससे मध्यम विभाजन दर पर उच्च संतृप्ति प्राप्त करने के लिए घातीय विकास और पर्याप्त विभाजन सीमा तक पहुंचने के लिए कम इनक्यूबेशन की अनुमति मिली । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक चित्रा 2:उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को संसाधित करना। (क)माइक्रोस्कोप सिस्टम से ब्राइट फील्ड चैनल से रॉ डेटा तीव्रता वाली इमेज। (ख)पृष्ठभूमि से कोशिका वस्तुओं के पृथक्करण में सुधार करने के लिए छवि में कंट्रास्ट वृद्धि हेरफेर। (ग)शंखनाद फिल्टर33 और बाइनरीज आधारित वैश्विक सीमा34पर आधारित सेल सीमा मान्यता । (घ)आकृति विज्ञान सेल कॉलोनी सीमाओं की पहचान करने के लिए बंद करने और भरने के३५ आपरेशन । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक चित्र 3:सेल कॉलोनी पृष्ठभूमि \ अग्रभूमि विभाजन। शोर के प्रभाव को कम करने के लिए हम सेल कॉलोनी की सीमाओं की पहचान करने और उन्हें जेल शोर से निकालने की कोशिश करते हैं। (क) कोशिका वस्तुओं का पता लगाने के लिए अनुकूली थ्रेसिंग के आधार पर कंट्रास्ट एन्हांसमेंट पर इमेज बाइनरी ऑपरेशन36 (ख)S2d और S3a में प्रस्तुत मैट्रिक्स के मैट्रिक्स मल्टीप्लेशन सफलतापूर्वक सबसे शोर बाहर छानने और कोशिकाओं से जेल शोर अंतर । कुछ सीमा पूरी तरह से हल नहीं कर रहे हैं । (ग)डिस्टेंस ट्रांसफॉर्म 38 के आधारपर वाटरशेड एल्गोरिदम37 का उपयोग करके सेल सीमाओं की पहचान . (घ)एस3बी और एस3सी में प्रस्तुत मैट्रिक्स का मैट्रिक्स मल्टीप्लेशन एकल कोशिकाओं को सफलतापूर्वक हल करता है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक चित्र 4:एकल कोशिका विभाजन। (ए) ब्राइट फील्ड इमेज का सेगमेंटेड प्रोडक्ट। इसके अलावा सफाई सेल क्षेत्र गेटिंग और आकार के आधार पर पूर्वतनाब है, गोल बुलबुले को त्यागने। (ख)फ्लोरेसेंस सिग्नल इमेज माइक्रोस्कोप से प्राप्त। (ग)एस4ए और एस4बी में प्रस्तुत मैट्रिक्स के मैट्रिक्स मल्टीप्लेशन ने एकल कोशिकाओं के संकेत को सफलतापूर्वक निकालने का काम किया । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक चित्र 5-मोनोलेयर का नुकसान। (क)पीटेटो के 840 मिनट (14 घंटे) पर एक सेल परत की उज्ज्वल क्षेत्र छवि जो एक अच्छे प्रयोग के रूप में लेख में चित्र 2 में दिखाए गए जीएफपी सर्किट को नियंत्रित करती है। मोनोलेयर के माइक्रोस्कोपी छवि हानि के दाईं ओर पता लगाया जा सकता है। (ख) सॉफ्टवेयर विभाजन छवि। मोनोलेयर कोशिकाओं के नुकसान के कारण खंडित हैं और क्षेत्र गेटिंग पर आधार साफ किया जाएगा। (ग)फ्लोरेसेंस छवि यह दिखाती है कि छवि के दाईं ओर किसी कोशिकाओं का समाधान नहीं किया जा सकता है और मोनोलेयर के नुकसान के कारण छवि के बाईं ओर कोशिकाओं का कम संकेत । (घ)विभाजन छवि फ्लोरेसेंस छवि के साथ संयुक्त । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक वीडियो 1. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक वीडियो 2। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक वीडियो 3. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

cell_growth_rate_fit.m। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें  

compare_experiments.m। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें  

Count_Cells.m। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें  

main_code.m। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें  

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Discussion

इस काम में, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो एस्चेरिचिया कोलाई लाइव कोशिकाओं के कंप्यूटर ट्रेसिंग को सक्षम बनाता है, जो घंटों की अवधि में विभाजन और फ्लोरोसेंट स्तर के बाद होता है। यह प्रोटोकॉल हमें वास्तविक समय में सीवी और एसएनआर को मापकर एस्चेरिचिया कोलाई में आनुवंशिक सर्किट की स्टोचस्टिक गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने चित्रा 10में दिखाए गए दो अलग-अलग सर्किटों के स्टोचस्टिक व्यवहार की तुलना की। यह दिखाया गया है कि कम कॉपी नंबर वाले प्लाज्मिड्स में स्टोचस्टिक प्रभाव और सेल डिवीजन से कम प्रभावित होने का खतरा अधिक होता है । पहला सर्किट संविलियन ने जीएफपी(चित्रा 10a)व्यक्त किया, और दूसरा सर्किट संविलियन व्यक्त किया गया एस एफजीएफपी एक ssrA क्षरण टैग(चित्रा 10b)से जुड़ा हुआ है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के स्टोचस्टिक व्यवहार की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को भी रिकॉर्ड किया। परिणाम बताते हैं कि जीएफपी की अभिव्यक्ति, विशेष रूप से इसकी परिपक्वता39पर, प्रमुख शोर स्रोत है। चित्रा 10ए में मनाए गए आवधिक देखा दांत व्यवहार पैटर्न सेल डिवीजन की यादृच्छिक प्रक्रिया और जीएफपी परिपक्वता (~ 50 मिनट) के लंबे समय के पैमाने से समझाया जा सकता है। इसके विपरीत, दूसरे सर्किट के एस एफजीएफपी संकेत माप के दौरान स्थिर हो गया था, क्योंकि एस एफजीएफपी (~ 6 मिनट) का बहुत कम परिपक्वता समय था। हमने एक सरल फार्मूला विकसित किया है जो दोनों सर्किटों में जीएफपी के स्तर का वर्णन करता है जब हम केवल सेल डिवीजन और जीएफपी परिपक्वता समय की प्रक्रिया पर विचार करते हैं। एक समय में, टी,हम मानते हैं कि प्रोटीन की एक्स कॉपी संख्या हैं, और प्लाज्मिड के μ कॉपी नंबर हैं। प्रोटीन कॉपी नंबर द्वारा वर्णित किया जा सकता है:

1.3Equation 4

1.4Equation 5

केवल विभाजन की घटनाओं पर विचार करते समय; Equation 6प्रोटीन परिपक्वता के बाद और इसलिए विशिष्ट प्लाज्मिड्स के लिए हमें मिलता है:

जीएफपी के लिए Equation 8 (): 1.5Equation 9

एस एफ जीएफपी केलिए Equation 10 (): 1.6Equation 11

फिर, एस एफजीएफपी की विकसित श्रृंखला:

1.7Equation 12

मामले में Equation 13 , हम प्राप्त Equation 14 करते हैं । इस परिणाम को इस प्रकार समझाया जा सकता है। जब एक्स छोटा होता है, तो एस एफजीएफपी का स्तर थोड़ी मात्रा में बढ़ जाता है। जब एक्स बड़ा होता है, तो एस एफजीएफपी को स्थिर स्थिति में अपमानित किया जाता है। इसी तरह, जीएफपी के सर्किट के लिए, प्रत्येक कोशिका में जीएफपी की लगभग 10 इकाइयां होती हैं, लेकिन चूंकि जीएफपी के लिए परिपक्वता का समय माइटोसिस से अधिक लंबा होता है, इसलिए फ्लोरेसेंस तीव्रता के दांतों के पैटर्न को अपमानजनक देखा जाता है। मॉडल में, हमने माना कि प्लाज्मिड की प्रतिकृति काफी तेज है कि प्लाज्मिड वितरण विभाजन से पहले और बाद में स्थिर रहता है। एसएसआरए क्षारता टैग अक्सर प्रोटीन आधे जीवन के समय को घंटों से कम समय 5 तक कम कर देता है और तेजी से स्थिर स्थिति की ओरजाता है। हमने दिखाया है कि विधि भी एक उच्च जनसंख्या प्रवाह विश्लेषक के साथ मापा है कि इसी तरह एक वितरण प्रदान करता है और इस वितरण के सीवी के बराबर या प्रवाह विश्लेषक सीवी से छोटे है ।

जबकि लाइव सेल इमेजिंग के लिए कई विधियां3,7,18 विकसित की गई थीं, यहां प्रस्तुत विधि विशेष रूप से एस्चेरिचिया कोलाईके अनुरूप है। इस जीवाणु के लिए एक विशेष मीडिया और थोड़ा अलग दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल में निम्नलिखित महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं: (1) मध्य चरण (हिलाए बिना घातीय विकास) (2) एस्चेरिचिया कोलाई सबसे अच्छा विभाजन के बजाय घातीय विकास की शुरुआत में बैक्टीरिया और तनाव के लिए विशिष्ट एक कमजोर पड़ने अनुपात की स्थापना 37 डिग्री सेल्सियस पर, लेकिन 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम मीडिया जेल पानी तेजी से खो देता है जो सिकुड़न और अस्थिरता की ओर जाता है। यहां प्रोटोकॉल इस चुनौती पर काबू पा जाता है (3) हम पहले बैक्टीरिया के नमूने को लागू करते हैं और फिर इसे तरल जेल से सील करते हैं। चूंकि नमूना ग्लास बॉटम और जेल के बीच फंस जाता है, इसलिए हमें एक जेल की आवश्यकता होती है जो (I) गैस एक्सचेंज को हवा की जेब काटने से बचने की अनुमति देता है, (II) कम तापमान पर तरल रहता है क्योंकि एस्चेरिचिया कोलाई गर्मी के प्रति संवेदनशील होते हैं और (III) सुनिश्चित करता है कि नमूना तरल जेल के अंदर नहीं मिलाया जाएगा। जेल 37 डिग्री सेल्सियस पर तरल रहता है, हालांकि, हम नमूने के शीर्ष पर एक सुरक्षात्मक टोपी के उपयोग की सलाह देते हैं ताकि जेल के अंदर अत्यधिक गर्मी और नमूना मिश्रण से बचा जा सके (4) इस दृष्टिकोण के लिए सरल, जेनेरिक उपकरण (5) नमूनों को बिना प्रीहीटिंग के सीधे मापा जा सकता है, इसलिए डिवीजन की घटनाओं (6) प्रोटोकॉल का कोई नुकसान नहीं है, जिसमें गीले-प्रयोगशाला कदम और अनुकूलित स्वचालित सॉफ्टवेयर शामिल हैं, का उपयोग आनुवंशिक सर्किट के स्टोचस्टिक व्यवहार जैसे कि एसएनआरआर और सीवी सिग्नल के बारे में किया जा सकता है। हमने कोशिकाओं की छोटी आबादी के उपयोग को मान्य करने और सीवी (7) के अनुसार तुलना के लिए एक आधार रेखा स्थापित करने के लिए एनालाइजर परिणामों को प्रवाहित करने के लिए माइक्रोस्कोपी विधि की तुलना की है सॉफ्टवेयर हमें मानव हस्तक्षेप के बिना मोनोलेयर पर कोशिकाओं का पता लगाने और कुल शोर का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। इमेजजे18 या श्निट्जसेल जैसे सॉफ्टवेयर टूल्स को कोशिकाओं की मैन्युअल पहचान की आवश्यकता होती है और समायोजन के लिए चुनौतीपूर्ण हैं।

जब लगातार जीवित कोशिका कालोनियों इमेजिंग, प्रयोग डिजाइन, इस तरह के सेलुलर तनाव और विषाक्तता, संसाधनों की कमी की दर, परिगलन और प्रेरकों और रसायनों के क्षरण समय के रूप में कई जटिल भौतिक मापदंडों पर विचार । प्रोटोकॉल पांच घंटे तक के विश्वसनीय माप की अनुमति देता है। हमारे प्रयोगों से पता चलता है कि सूक्ष्म, मोनोलेयर कॉलोनियों(अनुपूरक वीडियो 3)में विभाजित होने पर एस्चेरिचिया कोलाई सिंक्रोनाइज़ करते हैं। हम मानते हैं कि जेल संसाधनों और क्रूरता के मामले में एक समान है, कोशिकाओं में समान व्यवहार होता है, और रोशनी का क्षेत्र देखने के क्षेत्र से थोड़ा बड़ा होता है। इस प्रकार, प्रत्येक कोशिका को एक ही संकेत और सांख्यिकीय डेटा का उत्पादन करना चाहिए, जिसे हमने प्रवाह विश्लेषक के साथ माप करने के लिए इस तरह से प्राप्त सीवी की तुलना करके दिखाया है। आदेश में समय की लंबी अवधि के लिए लगातार प्रारंभिक परिस्थितियों में शोर को मापने के लिए, हम भविष्य में microfluidic चिप्स का उपयोग करने पर विचार करेंगे । इस तरह के उपकरण के आगे लाभ कोशिकाओं की निश्चित स्थिति और स्थिर फोकस10को बनाए रख रहे हैं । फिर भी, डिजाइन, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के निर्माण और प्रयोगों के लिए भड़काना प्रशिक्षण, विशिष्ट उपकरण (समय पर बनाया कस्टम) और समय की आवश्यकता है । इस कारण से, सर्किट की सामान्य समझ प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना फायदेमंद है।

प्रस्तावित प्रोटोकॉल और विकसित सॉफ्टवेयर प्रजनन योग्य माप की अनुमति देते हैं, जिसमें से रेखांकन प्राप्त करना सरल है। यह कुल शोर के परीक्षण और तुलना की भी अनुमति देता है और आंतरिक और बाह्य शोर को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है। विधि सामग्री को ऑर्डर करने के लिए सामान्य या आसान पर आधारित है, खुलेआम साझा किया गया है, सॉफ्टवेयर का उपयोग करने में आसान है और विशिष्ट प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है। हमने दिखाया है कि माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जनसंख्या काफी बड़ा है कि एक प्रवाह विश्लेषक के साथ प्राप्त करने के लिए विधि सीवी की तुलना करके सार्थक डेटा प्राप्त करने के लिए है । इसलिए, हम सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक एसएनआर बेसलाइन स्थापित कर सकते हैं और इसकी तुलना अधिक जटिल जीन सर्किट से कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मैटलैब कोड के साथ सहायता करने के लिए श्री गिल गेल्बर्ट (फैकल्टी ऑफ इलेक्ट्रिक इंजीनियरिंग, टेक्नोनियन) को धन्यवाद देते हैं। हम इस लेख को प्रूफ करने में सहायता करने के लिए डॉ Ximing ली (बायो मेडिकल इंजीनियरिंग, टेक्नोनियन के संकाय) को धन्यवाद देते हैं । इस शोध को आंशिक रूप से न्यूबॉयर फैमिली फाउंडेशन और इज़राइल मिनिस्ट्री ऑफ साइंस, ग्रांट 2027345 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm glass dish mattek P35G-0.170-14-C thickness corresponding with microscope lense.
Agarose  Lonza 5004 LB preperation
AHL  Sigma-Aldrich K3007 inducer
Bacto tryptone  BD - Becton, Dickinson and Company  211705 LB preperation
Carb Invitrogen 10177-012 antibiotic
Carb Formedium CAR0025 antibiotic
Casamino acids  BD - Becton, Dickinson and Company  223050 minimal media solution
eclipse Ti nikon inverted microscope
Glucose Sigma-Aldrich G5767 minimal media solution
Glyserol Bio-Lab 000712050100 minimal media substrate
Immersol 518F zeiss 4449600000000 immersion oil
M9 salt solution  Sigma-Aldrich M6030 minimal media solution
NaCl Bio-Lab 214010 LB preperation
Noble agar Sigma-Aldrich A5431 minimal media substrate
parafilm tape Bemis PM-996 refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose Lonza 50111 minimal media substrate
thaymine B1 Sigma-Aldrich T0376  minimal media solution
Yeast Extract BD - Becton, Dickinson and Company  212750 LB preperation

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 170 समय चूक माइक्रोस्कोपी सिग्नल टू शोर एस्चेरिचिया कोलाई,जैविक शोर न्यूनतम मीडिया कमजोर पड़ने का अनुपात कंप्यूटर एडेड सेल आइडेंटिफिकेशन।
समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग <em>करते हुए एस्चेरिचिया कोलाई</em> में जैविक शोर का निरंतर माप
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Chaimovitz, E. A., Reznik, E., Habib, M., Korin, N., Daniel, R. Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (170), e61290, doi:10.3791/61290 (2021).

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