Summary
Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la toma de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y cuantificación del comportamiento estocástico de los circuitos genéticos sintéticos.
Abstract
El protocolo desarrollado aquí ofrece una herramienta para permitir el seguimiento por computadora de la división Escherichia coli y los niveles fluorescentes durante varias horas. El proceso comienza por la detección de colonias que sobreviven en medios mínimos, suponiendo que sólo Escherichia coli que alberga el plásmido correcto será capaz de prosperar en las condiciones específicas. Dado que el proceso de construcción de grandes circuitos genéticos, que requieren el montaje de muchas partes del ADN, es un desafío, los componentes del circuito a menudo se distribuyen entre plásmidos múltiples en diferentes números de copia que requieren el uso de varios antibióticos. Las mutaciones en el plásmido pueden destruir la transcripción de los genes de resistencia a los antibióticos e interpelar con el manejo de los recursos en la célula que conduce a la necrosis. La colonia seleccionada está situada en una placa Petri con fondo de cristal y algunos planos de enfoque se seleccionan para el seguimiento de microscopía tanto en campos brillantes como en dominios fluorescentes. El protocolo mantiene el enfoque de imagen durante más de 12 horas en condiciones iniciales que no se pueden regular, creando algunas dificultades. Por ejemplo, las células muertas comienzan a acumularse en el campo de enfoque de las lentes después de unas horas de imágenes, lo que hace que las toxinas se acumulen y la señal se desenfoque y decaiga. El agotamiento de nutrientes introduce nuevos procesos metabólicos y dificulta la respuesta deseada del circuito. La temperatura del experimento reduce la efectividad de los inductores y los antibióticos, lo que puede dañar aún más la fiabilidad de la señal. El gel de medios mínimo se encoge y se seca, y como resultado el enfoque óptico cambia con el tiempo. Desarrollamos este método para superar estos desafíos en Escherichia coli,similar a trabajos anteriores que desarrollan métodos análogos para otros microorganismos. Además, este método ofrece un algoritmo para cuantificar el ruido estocástico total en celdas sin modificar y alteradas, encontrando que los resultados son consistentes con las predicciones del analizador de flujo como se muestra en un coeficiente similar de variación (CV).
Introduction
La biología sintética es un campo multidisciplinar que ha surgido en la última década y tiene como objetivo traducir los principios de diseño de ingeniería en diseño biológico racional1,2,3,en un esfuerzo por lograr la integración y procesamiento multi-señal en células vivas para entender la ciencia básica4,5,aplicaciones diagnósticas, terapéuticas y biotecnológicas6,7,8,9,10. Nuestra capacidad para cuantificar la respuesta de entrada y salida de los circuitos genéticos sintéticos se ha visto revolucionada por los recientes avances en la tecnología unicelular, incluido el analizador de flujo y las imágenes de células vivas mediante microscopía automatizada de lapso de tiempo11. A menudo se utiliza un analizador de flujo para medir la respuesta de estos circuitos en el estado estacionaria1,12,y la microscopía invertida se utiliza para medir la respuesta dinámica de los circuitos genéticos sintéticos a nivel de una sola célula3. Por ejemplo, uno de los primeros trabajos en biología sintética implicó la construcción de redes de osciladores genéticos en células vivas utilizando bucles de retroalimentación negativos con un retrasode 3. Más tarde, los circuitos osciladores genéticos se aplicaron para entender el control metabólico en el entorno dinámico de las células vivas4. La microscopía automatizada de lapso de tiempo es un método para caracterizar estos circuitos. Suponemos que las células huésped, Escherichia coli,se sincronizan al formar micro colonias, permitiendo la medición de la señal y el cálculo del ruido sin rastrear las relaciones exactas madre-hija.
El ruido es un aspecto fundamental e inherente de los sistemas biológicos que a menudo surgen de múltiples fuentes. Consideremos, por ejemplo, las reacciones bioquímicas que implican señales que se originan en el transporte de portadores aleatorios discretos, como la difusión de proteínas13. Estas señales se propagan con fluctuaciones aleatorias14. Otras fuentes de ruido son la disponibilidad de recursos, la división celular y las variaciones en condiciones ambientales como la temperatura, la humedad y la presión. Las señales biológicas que se propagan en circuitos genéticos sintéticos a menudo tienen una relación señal-ruido (SNR) muy baja, lo que perturba el rendimiento de dichos circuitos. Por lo tanto, el diseño de circuitos genéticos sigue siendo uno de los aspectos más desafiantes de la ingeniería genética15. Por ejemplo, a diferencia de la mayoría de los enfoques que calculan sólo la expresión génica media (medida sobre toda la población celular), la varianza de la señal medida se considera con el fin de diseñar un comportamiento predecible a través de redes genéticas sintéticas12. Como tal, los niveles de variabilidad o ruido en la expresión proteica desempeñan un papel dominante en el diseño y el rendimiento de los circuitos genéticos analógicos y digitales1,16,17.
Se han desarrollado muchos enfoques para cuantificar la variabilidad de célula a célula, incluso en Escherichia coli3,7,18. Estos métodos se utilizan a menudo para estudiar la activación genética y las vías metabólicas, sin embargo, con menos enfoque en el estudio de la dinámica del ruido estocástico, como medir y desenredar fuentes de ruido específicas, especialmente para los circuitos genéticos en las células vivas donde este es un desafío fundamental19,20,21. Varios factores, tanto heredados al propio circuito (intrínsecos) como derivados de las células huésped (extrínsecos), pueden perturbar el rendimiento continuo de los circuitos genéticos. En este documento, desarrollamos un protocolo que tiene como objetivo cuantificar el ruido total en las células de Escherichia coli, incluidas las fuentes de ruido intrínsecas y extrínsecas6,22. Al cuantificar el ruido total y luego evaluar el SNR23,se puede mejorar el diseño de los circuitos genéticos. Este método se puede modificar para medir fuentes de ruido independientes por separado, mediante la monitorización de varias proteínas fluorescentes6,20. Para el protocolo descrito aquí, mantenemos las condiciones ambientales bien controladas y medimos continuamente la actividad de las células sin la influencia de factores externos. Medimos la señal de las proteínas fluorescentes en células individuales con el tiempo y las imagen simultáneamente bajo un sustrato de agarose. Las imágenes resultantes se analizan utilizando el MATLAB personalizado del laboratorio.
Idealmente, la medición continua de la actividad en tiempo real de las proteínas fluorescentes dentro de una célula producirá datos precisos a través del crecimiento y la división de las células. Sin embargo, es difícil adquirir esos datos. Esto se debe a la degradación de las proteínas fluorescentes, conocidas como foto-blanqueamiento7,cuando están expuestas a la radiación en el proceso de excitación. Además, las células de Escherichia coli también son sensibles para la excitación, lo que podría conducir a la fototoxicidad7. Ambas emisiones limitan la cantidad de marcos de fotos que se pueden adquirir y el tiempo entre adquisiciones. El sustrato y los tipos medios (por ejemplo, caldo de lisógena) que se utiliza para cultivar las células durante la toma de imágenes también tienen un papel crítico. Recomendamos encarecidamente el uso de un medio mínimo, que minimice el fondo no fluorescente y amplíe el tiempo de división celular.
Además, la muestra debe prepararse teniendo en cuenta los siguientes requisitos (1) La baja tasa de división celular permite exposiciones menos frecuentes para realizar imágenes cercanas del ciclo de división y reducir la probabilidad de fototoxicidad y fotobleaching. Establecemos el tiempo de adquisición en aproximadamente la mitad del tiempo de mitosis pronosticado (2) La baja densidad celular al comienzo del experimento permite una mejor uniformidad y seguimiento de la división. La densidad celular se ve afectada por la relación de dilución de las células de Escherichia coli, que es un parámetro significativo para el éxito de este protocolo y debe determinarse para cada laboratorio. Para establecer la relación, cada nueva cepa o medio de Escherichia coli utilizado debe estar equipado con gráficos de tasa de crecimiento(Figura Suplementaria 1). Se ha logrado una relación adecuada si las células pueden crecer sin agitación adicional después de una breve incubación de una densidad inicial de aproximadamente600nm OD = 0.1. Las células en esta fase se dividirán de acuerdo con la temperatura ambiente solamente (3) Restricción del movimiento celular: el movimiento celular depende fuertemente de la firmeza del sustrato (almohadilla de agarose). La firmeza del sustrato depende de la cantidad de agarose total y el tiempo de solidificación del gel. Los geles no se pueden dejar solidificar durante la noche a temperatura ambiente, ya que la Escherichia coli se someterá a mitosis. Otros factores que afectan la estabilidad del sustrato incluyen la cantidad de agua en la muestra y la humedad. Las cuestiones adicionales se examinan en detalle en los Resultados del Representante. Este protocolo proporciona muchos detalles y se mueve gradualmente de un paso a otro. El protocolo ofrece una larga estabilidad para experimentos de imágenes y proporciona una herramienta básica de procesamiento de imágenes.
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Protocol
1. Preparación de los medios de comunicación y la cultura
- Preparar solución de stock de 1.000x carbenicilina (50 mg/ml) o antibiótico relevante.
- . Pesar 0,5 g de carbenicilina. Añadir 10 ml de estéril H2O. Disolver por completo.
- Esterilizar el stock de carbenicilina a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Aliquot la solución antibiótica y almacenar a -20 °C.
- Para preparar placas de caldo de lisógena (LB), mezcle 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extracto de levadura y 7,5 g de agar Bacto con 0,5 L de estéril H2O. Autoclave la solución a 121 °C durante 20 minutos.
- Sumerja parcialmente la mezcla de gel fundido en un baño de agua de 50 °C. Añadir 1.000 μL de carbenicilina (50 mg/ml).
- Prepare platos de Petri en un ambiente estéril. Deje los platos para ajustar antes de guardarlos en la nevera.
- Para medios mínimos M9, prepare soluciones de stock separadas de lo siguiente: sales de 5x M9 (56,4 g/L), glucosa de 2 M y 2% de homeminoácidos libres de biotinas. Autoclave las soluciones a 121 °C durante 20 min.
- Para preparar 5 placas De Petri, mezclar 1125 mg de agar de baja fusión y 400 mg de agar con 89,2 ml de medios mínimos (1x M9). Añadir 10 ml de 2% de homeminoácidos (2% [vol/vol]) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
NOTA: Asegúrese de verter los medios en los labios internos del matraz. - Microondas la solución en ráfagas cortas de 3 a 4 segundos. Repita la repetición hasta que la solución esté clara.
NOTA: Asegúrese de no llegar al punto de ebullición. - Coloque el matraz Erlenmeyer de 250 ml en un baño de agua caliente (60 °C) para mezclarlo aún más por difusión, y déjelo enfriar hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.
- Enciende la llama en el banco que vierte la placa.
- Añada rápidamente todas las soluciones en el siguiente orden:
800 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
100 μL de tiamina (B1)
1100 μL de glucosa (2M)
100 μL de carbenicilina (50 mg/ml). - Arremolina el matraz Erlenmeyer para asegurar una distribución uniforme de todos los ingredientes en todo el agar.
- Abra una placa a la vez junto a la llama y comience a verter.
- Deje las placas en el banco durante unos minutos hasta la solidificación inicial.
- Ponga las placas boca abajo para evitar que la condensación de agua gotee sobre el gel.
- Deje que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 h.
- Una vez que las placas se han solidificado y secado, se pueden almacenar a 4 °C durante aproximadamente 3 meses.
2. Construcción de cepas bacterianas y plásmidos
NOTA: El circuito genético contiene una parte; una proteína fluorescente verde (GFP) impulsada por un promotor deP tetO que resulta en expresión constitutiva. Todos los plásmidos de este trabajo fueron construidos utilizando técnicas básicas de clonación molecular y se transformaron en Escherichia coli 10β, utilizando un protocolo estándar de choque térmico24. La construcción final se transformó en cepa de tipo salvaje Escherichia coli MG1655 para pruebas.
- Transforme el plásmido deseado en células Escherichia coli MG1655 con el protocolo de choque térmico estándar24.
- Cultiva las células transformadas en una placa de agar LB durante la noche a 37°C.
NOTA: Es posible mantener las placas Petri desde el paso 2.2 hasta 3 días para uso de microscopía. - Inocular una sola colonia en 5 ml de caldo LB complementado con los antibióticos relevantes en un tubo de vidrio.
- Cultivar células a 37 °C con 250 rpm de velocidad de agitación en incubadora durante 2 h hasta que el líquido esté nublado.
- Prepare 1 ml de solución de dilución de la siguiente manera:
892 μL de medios mínimos (1x M9)
8 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
100 μL de 2% de ácidos Casamino (0,2% [wt/vol])
1 μL de tiamina (B1)
11 μL de glucosa (2 M)
1 μL de antibióticos relevantes- Mezcle y gire hacia abajo.
- Diluir el cultivo celular (1:30) del paso 2.4 en un tubo de 2 ml añadiendo 30 μL de crecimiento de Escherichia coli a 1000 μL de solución de dilución (paso 2.5).
- Incubar el tubo durante 1 h con agitación (250 rpm) a 37 °C.
- Crecer 40 μL - 60 μL en placas M9 preparadas en el paso 1.10. Incubar la placa a 37 °C durante la noche.
NOTA: La densidad óptica (OD600nm)para el chapado debe ser de alrededor de 0,1. - Coloque hasta tres placas inferiores de vidrio de 35 mm en el banco.
NOTA: Asegúrese de que el vidrio de la placa tenga el grosor correcto para las lentes del microscopio utilizadas. - Preparar el cultivo para la siembra en placas de gel, repita los pasos 2.3 a 2.6 para las colonias de la placa preparada en las mediciones del microscopio del paso 2.9.
- Prepare la siguiente solución para hacer tres placas de microscopio.
- Precalentar el baño de agua a 60 °C.
- Mezclar 112,5 mg de agar de baja fusión y 40 mg de agar con 8,92 ml de medios mínimos (1x M9) y añadir 1 ml de 2% de homeminoácidos (0,2% [vol/vol]) en un matraz Erlenmeyer de 25 ml.
NOTA: Asegúrese de verter los medios en los labios internos del matraz.
- Microondas la solución en ráfagas cortas de 2 a 3 segundos. Repita la repetición hasta que la solución esté clara.
NOTA:Asegúrese de no llegar al punto de ebullición. - Coloque el matraz Erlenmeyer de 25 ml en un baño de agua caliente (60 °C) para mezclarlo aún más por difusión, y déjelo enfriar en el banco hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.
3. Preparación de almohadillas de agarose
- Banco limpio con 70% etanol. Estirar la cinta en el banco limpiado. Asegúrese de que la cinta esté lisa y nivelada.
- Prepare dos coverslips: uno en la cinta y otro cerca. Prepara un párpado.
- Retire el matraz (preparado en el paso 2.14) del baño de agua, limpie el exterior del matraz y déjelo enfriar hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.
- Para hacer la solución de gel, mezcle rápidamente todas las soluciones en el siguiente orden:
80 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
1 ml de 2% de homeminoácidos (0,2% [wt/vol])
10 μL de tiamina (B1)
110 μL de glucosa (2 M)
10 μL de antibióticos relevantes. - Vierta 1,5 ml del gel en el coverlip y cúbralo con la segunda pieza haciendo un "sándwich".
- Devuélvele el Erlenmeyer al baño de agua caliente. Cubra el sándwich con la tapa y ajuste el temporizador durante 20 minutos.
- Al mismo tiempo, incubar el tubo desde el paso 2.11 para 1 h a 37 °C con agitación (250 rpm)
- Después de 20 minutos voltea el sándwich (paso 3.5), cúbrelo y deja reposar durante 1 h.
NOTA: Para obtener mejores resultados, deje que el "sándwich" descanse a 4 °C durante el paso 3.8. - Cultivo de semillas escherichia coli desde el paso 3.7 pipeteando la muestra en el plato de 35 mm.
NOTA: Pipetear 6 μL de células como pequeñas gotas separadas da los mejores resultados. - Deje que las gotas se sequen durante al menos 15 minutos y hasta 30 minutos.
- Exponga el gel solidificado del sándwich desde el paso 3.8 deslizando el deslizamiento de las cubiertas.
- Corte el sándwich en pequeñas almohadillas individuales con ponche o punta de biopsia.
- Inclínate suavemente sobre la muestra (paso 3.9). Deje el plato durante 20 minutos en el banco.
4. Preparación de la muestra para imágenes de microscopía
- Retire el matraz del baño de agua del paso 3.6. Limpie el exterior del matraz y deje enfriar a temperatura ambiente (25 °C).
NOTA: Retire el matraz en el paso 4.1 unos 3 minutos antes de que termine el temporizador. - Vierta 3 ml del gel constantemente al perímetro de la placa en un movimiento circular. Dejar solidificar durante unos minutos.
- Sellar placas con cinta adhesiva y perforar varios agujeros con aguja de 25 G. Voltea todos los platos para evitar que la condensación de agua gotee sobre el gel.
- Incubar todos los platos a 4 °C durante 30 min para permitir la solidificación completa mientras se previene la mitosis celular.
NOTA: Deje las muestras a 4 °C para mediciones sucesivas, no más de un día. - Inicie el microscopio según las instrucciones del fabricante.
- Encuentre el enfoque inicial utilizando la lente de amplificación más baja y enganche el sistema de enfoque automático (AFS).
- Utilice aceite si es necesario, ahogue la lente con aceite y esparce cuidadosamente moviendo la placa con un controlador de plataforma (no manualmente) y AFS se puede volver a enganchar.
- Utilice la sección transversal relativa en dirección Z, siguiendo la sugerencia predeterminada para las secciones transversales del paso Z.
NOTA: Tomamos imágenes de campo brillantes cada 5 minutos e imágenes fluorescentes cada 20 minutos. A veces, el enfoque debe ajustarse durante los primeros 30 minutos. El precalentamiento de la caja de incubadora de microscopios y el aceite, mientras que la refrigeración de la muestra tiende a ayudar a reducir la pérdida inicial de enfoque.
5. Análisis de datos
NOTA: Con el fin de procesar datos de microscopía, diseñamos un software basado en computadora en MATLAB. Este software facilita la identificación de los límites celulares de las imágenes y segmentos de tiff de campo brillante y clasifica las celdas por área. La salida de este análisis de imagen se puede utilizar como una máscara en imágenes fluorescentes tiff para derivar niveles de intensidad celular y cancelar artefactos en el dominio fluorescente como halo celular debido a los límites de resolución del microscopio. El software desarrollado se inspiró en obras similares7,25,26,27,28,29,30 y proporciona una solución elegante adaptada para el laboratorio.
- En primer lugar, defina los siguientes parámetros en main_code.m.
- Defina la carpeta de las imágenes de adquisición.
- Defina el período de tiempo de imagen - paso de tiempo de canal de campo brillante en minutos.
- Defina la frecuencia GFP - tasa de adquisición de imágenes GFP.
- Defina la resolución del microscopio (es decir, cuántos píxeles son iguales a 1 μm).
- Definir rango de ubicación de histograma - rango de área celular.
NOTA: El proceso de clasificación de los datos según el área de la célula es similar a los principios de gating en el análisis de datos de citometría de flujo. Las compuertas se colocan alrededor de poblaciones de células con características comunes, generalmente dispersas hacia adelante y dispersas lateralmente, para aislar y cuantificar estas poblaciones de interés. La microscopía permite gatear, investigar y cuantificar varios grupos celulares. - Definir kernel de convolución (3,3): este parámetro detecta los límites de las celdas mediante umbrales globales(count_cells.m).
NOTA: Esta configuración solo es necesaria al cambiar el laboratorio o el microscopio. El software requiere que el canal de campo brillante de entrada se etiquete con el índice c1, canal de fluorescencia etiquetado como c2.
- Ejecute main_code.m, que ejecutará todos los demás scripts automáticamente (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Programa segmenta automáticamente imágenes de campo brillantes (ver Figura suplementaria 2-4).
- Combine la imagen de segmentación con la imagen fluorescente (GFP) para extraer el nivel de intensidad por célula.
- Calcule el gráfico de la cantidad de células por tiempo y ajuste según el crecimiento exponencial.
- Calcule la desviación media y estándar (ETS) para cada rango de área celular.
- Calcule la relación señal-ruido (SNR) para cada rango de área celular.
- Trace y ajuste la distribución de la cantidad de células por intensidad.
- Calcule el coeficiente de Varianza (CV) y compárese con los datos del analizador de flujo.
NOTA: El software dará como salida las imágenes de segmentación final para ajustar conv_kernel en una nueva carpeta "yourfolder/Segmented". El software dará como salida los gráficos en una nueva carpeta "yourfolder/Graphs.
- Para comparar entre experimentos, utilice compare_experiments.m.
- Defina directorios para los gráficos guardados y la dirección del directorio \CompareResult.
- Ejecute el archivo.
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Representative Results
El software analiza imágenes de dominio de campo brillante que son fuera de blanco y negro. La Escherichia coli se verá como formas oblongas negras sobre un fondo blanquecino y el rango dinámico de luminancia debe mostrar un pico en su centro(Figura 1). En las imágenes fluorescentes las células pueden tener un halo pequeño, pero las células individuales con formas oblongas todavía se pueden resolver. Primero se debe detectar un evento de mitosis después de 30 minutos. El enfoque del microscopio debe permanecer estable con el tiempo y aunque las células pueden moverse lentamente durante esos 30 minutos, es poco probable que abandonen el campo de visión. Tal experimento se considerará bueno y se puede ver en la Figura 2. Las celdas pueden ser difíciles de detectar en el dominio de campo brillante con baja ampliación. Recomendamos establecer la distancia media de enfoque con un plásmido de alto número de copia (HCN), ya que es fácil de notar con baja ampliación. Establezca la distancia media mientras mide un plásmido de número de copia bajo (LCN) con la alta ampliación de antemano. Esta distancia de enfoque depende principalmente de las placas, el sistema de microscopía y el aceite, y no del grosor de la cepa de gel o Escherichia coli.
Al adaptar este protocolo a otros laboratorios, pueden surgir los siguientes problemas (1) Las placas de Escherichia coli (muestras) preparadas con una relación de dilución incorrecta pueden mostrar un número inmutable de células(Figura 3 y Figura 4) (2)Las muestras preparadas sin sellar la placa pueden mostrar una contracción excesiva. Esto se puede observar como células deriva (Figura 3) o causar una pérdida de enfoque (Figura 5) (3) Algunas muestras pueden exhibir células 'fijas' de cambio lento (en negro) sobre un fondo de células de natación (en blanco). Esto es probable debido a una muestra húmeda y por lo general se estabiliza como el exceso de agua es absorbida por el gel (Video Suplementario 1) (4) Muestras que no exhiben células después de unos minutos de calentamiento podrían haber sido preparados incorrectamente, probablemente debido a: (I) Gel se vertió mientras todavía demasiado caliente, (II) tapa protectora se olvidó, (III) medios mínimos carecen de un ingrediente, (IV) densidad celular incorrecta, y (V) gel fue sellado demasiado apretado. Es importante perforar agujeros para permitir el intercambio de gas a expensas de la contracción del gel(Figura 5)y (VI) las células también pueden indentar el gel en busca de nutrientes, apilando uno encima del otro, comprometiendo la monocapa celular evitando eficazmente la detección de células y midiendo de señal fluorescente confiable(Figura Suplementaria 5).
Hemos medido tres circuitos en este trabajo. En primer lugar, un promotor constitutivo que regula la GFP que figura en la Figura 6. En segundo lugar, un promotor constitutivo que regula el GFP31 (SFGFP) que se muestra en la Figura 7. Se añadió una etiqueta de degradación ssrA (AAV) a sfGFP para reducir su vida útil a minutos5. El tercer circuito se basa en un circuito de retroalimentación positiva1,y es inducido por acyl-homoserina-lactona (AHL). El promotor PluxR regula sfGFP y LuxR, un enlace de factor de transcripción con AHL para activar PluxR como se muestra en la Figura 8. La Figura 9 presenta la dinámica del crecimiento celular (números de celda versus tiempo), la Figura 10 muestra la dinámica de la señal medida (fluorescencia media versus tiempo), y la Figura 11 muestra dinámica de ruido total evaluado (desviación estándar (STD) versus tiempo).
El SNR (o CV) es ampliamente utilizado en el diseño de circuitos electrónicos analógicos para expresar la precisión y fiabilidad del circuito32. Cv se relaciona con la distribución de la señal entre células individuales y permite la comparación entre métodos y diferentes equipos como microscopios y analizadores de flujo. Calcular SNR a partir de imágenes de microscopio nos permite comparar circuitos a través del tiempo, las células segmentadas se miden al mismo tiempo que proporcionan una medida para la resolución específica del ruido en comparación con la señal, o un intervalo de ruido para un tiempo específico y la concentración del inductor. Esto puede indicar si las células detectoras serán capaces de resolver la respuesta exacta de la señal a la concentración del inductor. En este trabajo, el CV se calculó considerando todos los artefactos segmentados que son celdas, independientemente de la progresión celular en el ciclo de división. SNR se calculó para un rango de área celular específico con el tiempo, y luego se promedió para tres experimentos repetidos. Ni la señal adquirida ni la ETS son fiables por sí solas, ya que son específicas del experimento y del equipo utilizado. La señal se mide con unidades arbitrarias que depende de la ganancia preestablecida del equipo, el detector fotográfico y el tiempo de exposición. Los datos presentados en la Figura 10 sugieren que la etapa de las células en el ciclo de división no afecta al nivel de ruido, ya que diferentes rangos de área (puntos en el ciclo de división) muestran la misma tendencia. Esta observación podría apoyar la afirmación de que el seguimiento de las relaciones exactas madre - hija se puede evitar para medir el ruido y esto podría mejorar el SNR para el método presentado. No se observó ningún cambio sustancial en el SNR entre GFP y sfGFP como se muestra en la Figura 12. Calculamos el SNR (SNR= mean/STD) y lo presentamos en la Figura 12 y la Figura 13.
A continuación, calculamos la varianza y el CV en función de las siguientes ecuaciones31
1.1
1.2
Cuando λ es tiempo de plegado de proteínas, T es el tiempo de división celular, ḥ y μ son el número de plásmidos antes y después de la división, la copia plásmida número31. Usando las ecuaciones anteriores (1.1 y 1.2) podemos ajustar los datos de la señal del analizador de flujo para la distribución gamma.
Luego comparamos entre el CV, que se mide y calcula por el analizador de flujo (Figura 14), y por el protocolo (Figura 15).
Figura 1: Imagen de exposición de campo brillante (a) Adquisición estabilizada en la imagen de segmentación de campo brillante (b), sólo las celdas de color entran en los cálculos (c) Mapa de brillo del píxel de la adquisición, pico es el ruido de fondo. Umbral por segmentos sólo Escherichia coli. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Este experimento muestra buenas células sanas que se dividen y reaccionan después de 120 minutos. Las imágenes se adquirieron sucesivamente a intervalos de 20 minutos. Las colonias están enfocadas, el gel es estable entre los muestreos. Las colonias dividen y producen señales fuertes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos de la relación de dilución incorrecta y contracción del gel en la imagen fluorescente. Las imágenes fueron adquiridas a intervalos de 20 minutos (a) Escherichia coli individual rodeada de rojo (b) Las mismas derivas celulares a la derecha del campo de visión (c) La célula se desvía aún más. Las células tampoco dividen ni cambian de posición, probablemente debido a una baja relación de dilución y contracción del gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: En este experimento no se detectó ninguna actividad y casi ninguna celda estaba presente. Las posibles razones son que el gel está demasiado caliente, el secado de la muestra es demasiado agresivo o no tiene tapa protectora(a)Imágenes fluorescentes tomadas a los 40 minutos(b)Imágenes fluorescentes tomadas a los 60 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Pérdida de enfoque y fotobleaching. Las imágenes sucesivas de(a ) a (d) se adquirieron a intervalos de tiempo de 15 minutos utilizando el sistema de enfoque automático. Véase Vídeo complementario 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Mapaplásmido de Pteto que regula la GFP. Sin el represor TetR, el promotor de PtetO actúa como promotor constitutivo. El circuito está clonado en plásmidos de bajo número de copia. Este plásmido actúa como base para la medición SNR para cualquier circuito modificado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7:Mapa plásmido de Pteto que regula sfGFP. El SfGFP se fusiona con una etiqueta de degradación de AAV. El circuito está clonado en plásmidos de bajo número de copia. El sfGFP-AAV es una variante más robusta de GFP, mientras que la etiqueta AAV lo hace susceptible a la degradación por las proteasas de limpieza de la Escherichia coli. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Mapa plásmido del circuito de retroalimentación positiva. El circuito es inducido por un inductor AHL, que une el factor de transcripción LuxR. El promotor PluxR, que está regulado por el complejo AHL-LuxR, activa la producción de LuxR y sfGFP-AAV. El circuito está clonado en plásmidos de bajo número de copia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9:La dinámica del crecimientode la cepa De Escherichia coli MG1655 en medios mínimos incluye (a)PtetO-GFP, crecimiento exponencial de aproximadamente 35 minutos. Las imágenes de este experimento se muestran en la Figura 2 (b) PtetO-sfGFP,crecimiento exponencial de unos 35 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Nivel de intensidad fluorescente, normalizado por píxel y adquirido a intervalos de 20 minutos.
Las celdas se binned según el área, con el fin de minimizar los artefactos. Las células se dividen por su área en un cuadrado de micrómetro (a) Pteto-GFP circuitoprimera repetición para la intensidad a 210 minutos es 0.004 a.u (b) PtetO- circuitoSfGFP primera repetición para la intensidad a 210 minutos es 0.022 a.u (c) Señal medida de Pteto-GFP circuito (d) Señal medida de PtetO-sfGFP circuito. Todos los datos experimentales representan el promedio de tres experimentos. El software puede ordenar el área de la célula a diferentes grupos (a) yb) mostrar gráficos para cuatro rangos de área celular que representan el ciclo de división. La primera área de 14 micrómetros representa las células después de la división como lo más probable es que las células después de la división serán las más pequeñas. La segunda área de 21 μm representa las células antes de la división. Tercera y cuarta área representa las células en división, ya que el área total se multiplica por dos (29 y 36 μm) con el fin de considerar las células que tardaron más en dividirse. Las áreas fueron elegidas mediante la evaluación manual de los datos que se examinan en las imágenes de microscopía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: La desviación estándar (STD) de intensidades de fluorescencia de una sola célula para: (a) PtetO-GFP circuito primera repetición para ETS a 210 minutos es 0.001865 a.u (b) PtetO-sfGFP circuit first repeat for STD at 210 minutes is 0.01477 a.u (c) STD de Pteto-GFP circuit (d) STD of PtetO-sfGFP circuit. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12:SNR de intensidades de fluorescencia unicelular. Calculamos la primera repetición del circuito SNR=Mean/STD (a) PtetO-GFP primera repetición para SNR a 210 minutos es 1.309 a.u (b) PtetO-circuito SfGFP primera repetición para SNR a 210 minutos es 1.29 a.u (c) Tres repeticiones de medición GFP (d) Tres repeticiones de medición sfGFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13: SNR de intensidades de fluorescencia de una sola célula ( a )PluxR-sfGFP circuit SNR para respuesta de saturación a AHL (b) PluxR-sfGFP circuit SNR para la respuesta de medio tiempo a AHL. El SNR de la retroalimentación positiva circuito regulado AHL es mayor que SNR para el circuito SfGFP constitutivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 14: Histogramas de los circuitos genéticos basados en el analizador de flujo: datos experimentales (azul) y datos del modelo estocástico (rojo). El eje x representa unidades de fluorescencia arbitrarias de la citometría de flujo, y el eje y representa la frecuencia de las células que producen el nivel de fluorescencia correspondiente. Los datos se midieron utilizando un analizador de flujo después de tres horas. La fluorescencia GFP se cuantificó por excitación a una longitud de onda de 484 nm y emisión a una longitud de onda de 510 nm. Los voltajes de filtro PE-TexasRed se utilizaron en un muestreador de alto rendimiento para medir los niveles de expresión GFP. Los voltajes del analizador de flujo se ajustaron utilizando software para que los niveles máximos y mínimos de expresión pudieran medirse con los mismos ajustes de voltaje. Por lo tanto, se utilizaron voltajes consistentes a lo largo de todo el experimento. Los mismos voltajes se utilizaron para las repeticiones posteriores del mismo experimento. El montaje se realizó mediante el uso de la distribución gamma31. Este método asume que la señal depende principalmente de la distribución aleatoria de plásmidos (a) Medición del clon Pteto-GFP en plásmido de número de copia baja. CV experimental=0.46, Modelo CV=0.32 (b) Medición de Pteto-sfGFP-AAV clonado en plásmido de número de copia bajo. CV experimental=0.86, Modelo CV=0.44. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 15: Histogramas de los circuitos genéticos basados en microscopio: datos experimentales (líneas punteadas) y datos de modelos estocásticos (líneas sólidas). El eje x representa unidades de fluorescencia arbitrarias a partir de microscopio invertido y el eje y representa la frecuencia de las células que producen el nivel de fluorescencia correspondiente. El empalme se realizó utilizando la distribución gamma MATLAB31,32 (a) Medición de PtetO-GFP clon en número de copia baja plásmido (b) Medición de PtetO-sfGFP-AAV clonado en número de copia bajo. La comparación muestra que nuestro protocolo obtiene valores de CV similares a los del experimento del analizador de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Cuatro relaciones de dilución, entre 1:500 y 1:20, para la cepa MG1655. El gráfico muestra que si la densidad inicial es alta, los nutrientes LB son abundantes, lo que resulta en células que se dividen más rápido. Durante una dilución de 1:500, la densidad celular se mantuvo constante. Para una dilución de 1:100, la densidad celular aumentó lentamente. Para una dilución de 1:50, la densidad celular aumentó a una velocidad de división moderada sin demora significativa en la incubación de 250 RPM. Para una dilución de 1:20, la densidad celular alcanzó la saturación rápidamente. Elegimos una relación de dilución de 1:30, permitiendo una incubación corta para alcanzar un crecimiento exponencial y un rango de división sustancial para lograr una alta saturación a una tasa de división moderada. Haga clic aquí para descargar esta figura
Figura complementaria 2: Procesamiento de imágenes de campo brillante. (a) Imágenes de intensidad de datos sin procesar del canal de campo brillante del sistema de microscopio. (b) Manipulación de mejora de contraste de la imagen para mejorar la separación de objetos de celda del fondo. (c) Reconocimiento de límites de celda basado en el filtro de convolución33 y el umbral global basado en binarización34. (d)35 operaciones morfológicas de cierre y llenado para identificar los límites de las colonias celulares. Haga clic aquí para descargar esta figura
Figura complementaria 3: Origen de colonia celular\segmentación en primer plano. Para minimizar el impacto del ruido tratamos de identificar los límites de las colonias celulares y extraerlos del ruido del gel. (a) Operación de binarización de imágenes en la mejora del contraste basada en umbrales adaptables para detectar objetos de celda36. b) Multiplación matricial de matrices presentadas en S2d y S3a filtrando con éxito la mayoría de los ruidos y diferenciando el ruido del gel de las células. Algunos límites no están completamente resueltos. (c) Identificación de los límites celulares utilizando un algoritmo de cuencahidrográfica 37 basado en la transformación de distancia38. (d) Multiplación matricial de matrices presentadas en S3b y S3c resolviendo con éxito células individuales. Haga clic aquí para descargar esta figura
Figura suplementaria 4: Segmentación de una sola célula. (a) Producto segmentado de imagen de campo brillante. La limpieza adicional se preforma en función de la gating y la forma del área celular, descartando burbujas redondas. b) Imágenes de señal de fluorescencia adquiridas a partir de microscopio. (c) Multiplación matricial de matrices presentadas en S4a y S4b extrayendo con éxito la señal de células individuales. Haga clic aquí para descargar esta figura
Figura complementaria 5: Pérdida de monocapa. (a) Imagen de campo brillante de una capa celular a 840 minutos (14 horas) de Pteto que regula el circuito GFP que se muestra en la figura 2 del artículo como un buen experimento. En el lado derecho de la microscopía se puede detectar la pérdida de imagen de monocapa. (b) Imagen de segmentación de software. Debido a la pérdida de células monocapas se fragmentan y se limpiarán la base en la gating de área. (c) Imagen de fluorescencia que muestra que en el lado derecho de la imagen no se pueden resolver células y una señal baja de las células en el lado izquierdo de la imagen debido a la pérdida de monocapa. (d) Imagen de segmentación combinada con imagen de fluorescencia. Haga clic aquí para descargar esta figura
Vídeo complementario 1. Por favor, haga clic aquí para descargar este video
Vídeo complementario 2. Por favor, haga clic aquí para descargar este video
Vídeo complementario 3. Por favor, haga clic aquí para descargar este video
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Discussion
En este trabajo, desarrollamos un protocolo que permite el rastreo por ordenador de células vivas de Escherichia coli, siguiendo niveles de división y fluorescentes durante un período de horas. Este protocolo nos permite cuantificar la dinámica estocástica de los circuitos genéticos en Escherichia coli midiendo el CV y el SNR en tiempo real. En este protocolo, comparamos los comportamientos estocásticos de dos circuitos diferentes como se muestra en la Figura 10. Se ha demostrado que los plásmidos con números de copia bajos son más propensos a los efectos estocásticos y menos afectados por la división celular. El primer circuito expresado constitutivamente GFP(Figura 10a),y el segundo circuito expresado constitutivamente sfGFP fusionado a una etiqueta de degradación ssrA (Figura 10b). Con el fin de cuantificar el comportamiento estocástico de las proteínas fluorescentes, también grabamos las imágenes de campo brillante. Los resultados muestran que la expresión de GFP, específicamente en su maduración39,es la fuente de ruido dominante. El patrón periódico de comportamiento dental de sierra observado en la Figura 10a puede explicarse por el proceso aleatorio de división celular y la escala de largo plazo de maduración de GFP (~50 minutos). Por el contrario, la señal SFGFP del segundo circuito se estabilizó durante la medición, porque el tiempo de maduración muy corto de la SfGFP (~6 minutos). Desarrollamos una fórmula simple que describe el nivel de GFP en ambos circuitos cuando consideramos sólo el proceso de división celular y tiempo de maduración GFP. En un momento dado, t, suponemos que hay números de copia x de proteínas, y μ copiar números de plásmidos. El número de copia de proteínas se puede describir mediante:
1.3
1.4
Al considerar sólo eventos de división; 
después de la maduración de proteínas y así para los plásmidos específicos que obtenemos:
Para GFP ( 
): 1.5
Para sfGFP ( 
):1.6
A continuación, la serie desarrollada de sfGFP:
1.7
En el caso de que 
, obtenemos 
. Este resultado se puede explicar de la siguiente manera. Cuando x es pequeño, los niveles de GFP sfaumentan en una pequeña cantidad. Cuando x es grande, sfGFP se degrada a un estado estacionaria. Del mismo modo, para el circuito de GFP, cada célula contiene alrededor de 10 unidades de GFP, pero dado que el tiempo de maduración para la GFP es más largo que la mitosis, se observan patrones degradantes de dientes de veda de intensidades de fluorescencia. En el modelo, asumimos que la replicación del plásmido es lo suficientemente rápida como para que la distribución de plásmidos se mantenga constante antes y después de la división. La etiqueta de degradación ssrA a menudo reduce el tiempo de vida media de la proteína de horas a menos de una hora5 y conduce a un estado estable rápido. Demostramos que el método también proporciona una distribución similar a la medida con un analizador de flujo de población alto y que el CV de esta distribución es igual o menor que el CV del analizador de flujo.
Mientras que varios métodos3,7,18 fueron desarrollados para la toma de imágenes de células vivas, el método presentado aquí se adapta específicamente a Escherichia coli. Esta bacteria requiere un medio especial y un enfoque ligeramente diferente. El protocolo tiene las siguientes características importantes: (1) Establecer una relación de dilución específica para las bacterias y la cepa al comienzo del crecimiento exponencial en lugar de en la etapa media (Crecimiento exponencial sin agitar) (2) Escherichia coli mejor dividir a 37 °C, pero a 37 °C el gel de medios mínimo pierde agua rápidamente lo que conduce a la contracción y la inestabilidad. El protocolo aquí supera este desafío (3) Primero aplicamos la muestra de bacterias y luego la sellamos con gel líquido. Dado que la muestra está atrapada entre el fondo de vidrio y el gel, requerimos un gel que (I) permita el intercambio de gas para evitar cortar bolsas de aire, (II) permanece líquido a bajas temperaturas ya que Escherichia coli es sensible al calor y (III) se asegura de que la muestra no se mezcle dentro del gel líquido. El gel permanece líquido a 37 °C, sin embargo, recomendamos el uso de una tapa protectora en la parte superior de la muestra para evitar el calor excesivo y la mezcla de muestras dentro del gel (4) Este enfoque requiere equipos simples y genéricos (5) Las muestras se pueden medir directamente sin precalentamiento, por lo que no hay pérdida de eventos de división (6) El protocolo, que incluye los pasos de laboratorio húmedo y el software automatizado personalizado, se puede utilizar para estudiar el comportamiento estocástico de los circuitos genéticos como la cuantificación del SNR y el CV de las señales de circuito. Comparamos el método de microscopía con los resultados del analizador de flujo con el fin de validar el uso de pequeñas poblaciones de células y establecer una línea de base para la comparación según CV (7) El software nos permite detectar células en la monocapa sin intervención humana y analizar el ruido total. Las herramientas de software como ImageJ18 o Schnitzcells requieren la identificación manual de las células y son difíciles de realizar para los ajustes.
Cuando imágenes continuas colonias de células vivas, diseñar el experimento mientras se consideran varios parámetros físicos complejos, tales como estrés celular y toxicidad, tasa de agotamiento de los recursos, necrosis y tiempo de degradación de inductores y productos químicos. El protocolo permite una medición fiable de hasta cinco horas. Nuestros experimentos sugieren que Escherichia coli se sincroniza al dividirse en micro colonias monocapas(Video Complementario 3). Asumimos que el gel es uniforme en términos de recursos y dureza, las células tienen un comportamiento similar, y el campo de iluminación es ligeramente más grande desde el campo de visión. Por lo tanto, cada célula debe producir la misma señal y datos estadísticos, que se pueden recopilar como hemos demostrado comparando el CV obtenido de esta manera con la medición con un analizador de flujo. Con el fin de medir el ruido en condiciones iniciales constantes durante períodos de tiempo más largos, consideraremos el uso de chips microfluídicos en el futuro. Otros beneficios de este dispositivo son mantener posiciones fijas de las células y un enfoque estable10. Aún así, el diseño, la fabricación de chips microfluídicos y el cebado para experimentos requieren entrenamiento, equipos específicos (hechos a medida a veces) y tiempo. Por esta razón, es beneficioso utilizar microscopía de lapso de tiempo como se muestra en este protocolo para adquirir una comprensión general del circuito.
El protocolo propuesto y el software desarrollado permiten mediciones reproducibles, de las que es fácil derivar gráficos. También permite pruebas y comparación del ruido total y se puede modificar para medir el ruido intrínsico y extrínsico. El método se basa en materiales genéricos o fáciles de pedir, abiertamente compartidos, software fácil de usar y no requiere formación específica. Hemos demostrado que la población medida por microscopía es lo suficientemente grande como para obtener datos significativos comparando el método CV con el obtenido con un analizador de flujo. Por lo tanto, podemos establecer con éxito una línea base SNR usando este protocolo y compararlo con circuitos genéticos más complejos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Gil Gelbert (Facultad de Ingeniería Eléctrica, Technion) por ayudar con el código MATLAB. Agradecemos al Dr. Ximing Li (Facultad de Ingeniería Bio-médica, Technion) por ayudar con la prueba de este artículo. Esta investigación fue parcialmente apoyada por la Fundación de la Familia Neubauer y el Ministerio de Ciencia de Israel, subvención 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al.
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V.
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E.
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
