Summary
Dette arbeidet presenterer en mikroskopimetode som tillater levende avbildning av en enkelt celle av Escherichia coli for analyse og kvantifisering av stokastisk oppførsel av syntetiske genkretser.
Abstract
Protokollen utviklet her tilbyr et verktøy for å muliggjøre datasporing av Escherichia coli divisjon og fluorescerende nivåer over flere timer. Prosessen starter med å screene for kolonier som overlever på minimale medier, forutsatt at bare Escherichia coli som skjuler riktig plasmid, vil kunne trives under de spesifikke forholdene. Siden prosessen med å bygge store genetiske kretser, som krever montering av mange DNA-deler, er utfordrende, fordeles kretskomponenter ofte mellom flere plasmider ved forskjellige kopinumre som krever bruk av flere antibiotika. Mutasjoner i plasmidet kan ødelegge transkripsjon av antibiotikaresistensgenene og gripe inn med ressurshåndtering i cellen som fører til nekrose. Den valgte kolonien er satt på en glassbunn Petri-tallerken, og noen få fokusplan er valgt for mikroskopisporing i både lyse felt og fluorescerende domener. Protokollen opprettholder bildefokuset i mer enn 12 timer under innledende forhold som ikke kan reguleres, noe som skaper noen få vanskeligheter. For eksempel begynner døde celler å samle seg i linsenes fokusfelt etter noen timer med avbildning, noe som fører til at giftstoffer bygger seg opp og signalet blir uskarpt og forfaller. Uttømming av næringsstoffer introduserer nye metabolske prosesser og hindrer ønsket respons av kretsen. Eksperimentets temperatur senker effekten av indusere og antibiotika, noe som ytterligere kan skade signalets pålitelighet. Den minimale mediegelen krymper og tørker, og som et resultat endres det optiske fokuset over tid. Vi utviklet denne metoden for å overvinne disse utfordringene i Escherichia coli, ligner på tidligere arbeider som utvikler analoge metoder for andre mikroorganismer. I tillegg tilbyr denne metoden en algoritme for å kvantifisere den totale stokastiske støyen i uendrete og endrede celler, og finner at resultatene er i samsvar med strømningsanalysatorprediksjoner som vist av en lignende variasjonskoeffisient (CV).
Introduction
Syntetisk biologi er et tverrfaglig felt som har dukket opp det siste tiåret og tar sikte på å oversette ingeniørdesignprinsipper til rasjonell biologisk design1,2,3, i et forsøk på å oppnå multisignalintegrasjon og behandling i levende celler for å forstå grunnleggende vitenskap4,5, diagnostiske, terapeutiske og bioteknologiske applikasjoner6,7,8,9,10. Vår evne til å kvantifisere inngangseffekten av syntetiske genkretser har blitt revolusjonert av nylige fremskritt innen encelleteknologi, inkludert strømningsanalysatoren og levende celleavbildning ved hjelp av automatisert tidsforløpmikroskopi11. En strømningsanalysator brukes ofte til å måle responsen til disse kretsene ved steady state1,12, og invertert mikroskopi brukes til å måle den dynamiske responsen til syntetiske genkretser på nivået av en enkelt celle3. For eksempel involverte et av de tidlige verkene i syntetisk biologi bygging av genetiske oscillatornettverk i levende celler ved hjelp av negative tilbakemeldingssløyfer med en forsinkelse3. Senere ble de genetiske oscillatorkretsene brukt til å forstå metabolsk kontroll i det dynamiske miljøet til levende celler4. Automatisert tidsforløpmikroskopi er en metode for å karakterisere slike kretser. Vi hypoteser at vertscellene, Escherichia coli, synkroniserer når de danner mikrokolonier, slik at måling av signal og beregning av støy uten å spore eksakte mor-datter relasjoner.
Støy er et grunnleggende, iboende aspekt av biologiske systemer som ofte oppstår fra flere kilder. Vurder for eksempel biokjemiske reaksjoner som involverer signaler som stammer fra transport av diskrete tilfeldige bærere som diffusjon av proteiner13. Disse signalene forplanter seg med tilfeldigesvingninger 14. Andre støykilder er ressurstilgjengelighet, celledeling og variasjoner i miljøforhold som temperatur, fuktighet og trykk. Biologiske signaler som forplanter seg i syntetiske genkretser har ofte et svært lavt signal-til-støy-forhold (SNR), noe som forstyrrer ytelsen til slike kretser. Derfor er genetisk kretsdesign fortsatt en av de mest utfordrende aspektene ved genteknologi15. For eksempel, i motsetning til de fleste tilnærminger som bare beregner gjennomsnittlig genuttrykk (målt over hele cellepopulasjonen), vurderes variansen til det målte signalet for å konstruere forutsigbar oppførsel gjennom syntetiske gennettverk12. Som sådan spiller nivåene av variasjon eller støy i proteinuttrykket en dominerende rolle i design og ytelse av analoge og digitale genkretser1,16,17.
Mange tilnærminger er utviklet for å kvantifisere celle-til-celle variasjon, inkludert i Escherichia coli3,7,18. Disse metodene brukes ofte til å studere genaktivering og metabolske veier, men med mindre fokus på studiet av stokastisk støydynamikk, som måling og disentangling spesifikke støykilder, spesielt for genetiske kretser i levende celler der dette er en grunnleggende utfordring19,20,21. Flere faktorer, både arvet til selve kretsen (iboende) og avledet fra vertscellene (ekstrinsisk), kan forstyrre den kontinuerlige ytelsen til genetiske kretser. I dette dokumentet utviklet vi en protokoll som tar sikte på å kvantifisere den totale støyen i Escherichia coli-celler, inkludert de iboende og ekstrinsiske støykildene6,22. Ved å kvantifisere den totale støyen og deretter evaluere SNR23, kan utformingen av genkretser forbedres. Denne metoden kan modifiseres for å måle uavhengige støykilder separat, ved å overvåke flere fluorescerende proteiner6,20. For protokollen som er beskrevet her, holder vi miljøforholdene godt kontrollert og måler kontinuerlig aktiviteten til celler uten påvirkning av eksterne faktorer. Vi måler signalet fra fluorescerende proteiner i enkeltceller over tid og avbilder dem samtidig under et agarose substrat. De resulterende bildene analyseres ved hjelp av laboratoriets tilpassede MATLAB.
Ideelt sett vil kontinuerlig måling av sanntidsaktiviteten til fluorescerende proteiner inne i en celle produsere nøyaktige data gjennom veksten og delingen av cellene. Det er imidlertid utfordrende å innhente slike data. Dette skyldes nedbrytning av fluorescerende proteiner, kjent som fotobleking7, når de blir utsatt for stråling i eksitasjonsprosessen. Videre er Escherichia coli-celler også følsomme for eksitasjonen, noe som kan føre til fototoksisitet7. Begge problemene begrenser mengden fotorammer som kan anskaffes og tiden mellom oppkjøp. Substratet og mediumtypene (f.eks. lysogenybuljong) som brukes til å dyrke cellene under avbildning, har også en kritisk rolle. Vi anbefaler på det sterkeste å bruke minimalt medium, noe som minimerer ikke-fluorescerende bakgrunn og utvider celledelingstiden.
Videre må prøven utarbeides med tanke på følgende krav (1) Lav celledelingshastighet gir mindre hyppige eksponeringer for nøye avbildning av divisjonssyklusen og redusere sannsynligheten for fototoksisitet og fotobleaching. Vi setter oppkjøpstiden til omtrent halvparten av den anslåtte mitosetiden (2) Lav celletetthet i begynnelsen av eksperimentet gir bedre ensartethet og sporbarhet av divisjon. Celletetthet påvirkes av fortynningsforholdet til Escherichia coli-cellene, som er en betydelig parameter for suksessen til denne protokollen og må bestemmes for hvert laboratorium. For å etablere forholdet, bør hver nye Escherichia coli-stamme eller medier som brukes, utstyres med vekstrategrafer (Supplerende figur 1). Et passende forhold er oppnådd hvis celler kan vokse uten ekstra risting etter en kort inkubasjon fra en innledende tetthet på ca OD600nm = 0,1. Celler i denne fasen vil bare dividere i henhold til miljøtemperaturen (3) Begrensning av cellebevegelse: cellebevegelser avhenger sterkt av substrat (agarose pad) fasthet. Substratets fasthet avhenger av mengden total agarose og gel størkningstiden. Geler kan ikke overlates til å størkne over natten ved romtemperatur, da Escherichia coli vil gjennomgå mitose. Andre faktorer som påvirker substratstabiliteten inkluderer mengden vann i prøven og fuktigheten. Ytterligere problemer drøfter i detalj i representative resultater. Denne protokollen gir mange detaljer og beveger seg gradvis fra ett trinn til et annet. Protokollen gir lang stabilitet for bildebehandlingseksperimenter og gir et grunnleggende bildebehandlingsverktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medie- og kulturforberedelse
- Forbered lagerløsning på 1000x Carbenicillin (50 mg / ml) eller relevant antibiotika.
- . Vei 0,5 g carbenicillin. Tilsett 10 ml steril H2O. Oppløs helt.
- Steriliser carbenicillin lager gjennom et 0,22 μm sprøytefilter. Aliquot antibiotikaoppløsningen og lagre ved -20 °C.
- For å forberede lysogenibuljongplater (LB), bland 5 g trypton, 5 g NaCl, 2,5 g gjærekstrakt og 7,5 g Bacto agar med 0,5 L steril H2O. Autoklaver oppløsningen ved 121 °C i 20 minutter.
- Senk den smeltede gelblandingen delvis ned i et 50 °C vannbad. Tilsett 1000 μL carbenicillin (50 mg/ml).
- Forbered Petri retter i et sterilt miljø. La platene stå før du setter dem i kjøleskapet.
- For M9 minimale medier, lag separate lagerløsninger av følgende: 5x M9 salter (56,4 g / l), 2 M glukose og 2% biotinfrie casaminosyrer. Autoklaver løsningene ved 121 °C i 20 minutter.
- For å tilberede 5 Petri-plater, bland 1125 mg lav smeltende agar og 400 mg agar med 89,2 ml minimalt medium (1x M9). Tilsett 10 ml 2 % casaminosyrer (2 % [vol/vol]) i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe.
MERK: Sørg for å helle mediet på de indre leppene på kolben. - Mikrobølgeovn løsningen i korte utbrudd på 3 til 4 sekunder. Gjenta til løsningen er klar.
MERK: Pass på at du ikke når kokepunktet. - Plasser den 250 ml Erlenmeyer-kolben i et varmtvannsbad (60 °C) for ytterligere blanding ved diffusjon, og la den avkjøles til temperaturen faller til ca. 45-50 °C.
- Tenn flammen på platestøtbenken.
- Legg raskt til alle løsningene i følgende rekkefølge:
800 μL 50 % glyserol (0,4 % [vol/vol])
100 μL tiamin (B1)
1100 μL glukose (2M)
100 μL Carbenicillin (50 mg/ml). - Virvle Erlenmeyer-kolben for å sikre jevn distribusjon av alle ingrediensene i hele agaren.
- Åpne en tallerken om gangen ved siden av flammen og begynn å helle.
- La platene stå på benken i noen minutter til første størkning.
- Snu platene opp ned for å hindre at vannkondensasjon drypper på gelen.
- La platene størkne ved romtemperatur i ca. 2 timer.
- Når platene har størknet og tørket, kan de lagres ved 4 °C i ca. 3 måneder.
2. Bakteriestammer og plasmider konstruksjon
MERK: Den genetiske kretsen inneholder en del; et grønt fluorescerende protein (GFP) drevet av en PtetO-promotor som resulterer i konstituerende uttrykk. Alle plasmidene i dette arbeidet ble konstruert ved hjelp av grunnleggende molekylære kloningsteknikker og ble forvandlet til Escherichia coli 10β, ved hjelp av en standard varmesjokkprotokoll24. Den endelige konstruksjonen ble forvandlet til Escherichia coli MG1655 wild type belastning for testing.
- Forvandle ønsket plasmid til Escherichia coli MG1655 celler med standard varmesjokkprotokoll24.
- Dyrk de transformerte cellene på en LB agarplate over natten ved 37 °C.
MERK: Det er mulig å holde Petri-rettene fra trinn 2.2 til 3 dager for mikroskopibruk. - Inokuler en enkelt koloni i 5 ml LB kjøttkraft supplert med relevante antibiotika i et glassrør.
- Vokse celler ved 37 °C med 250 rpm ristingshastighet i inkubator i 2 timer til væsken er overskyet.
- Forbered 1 ml fortynningsløsning som følger:
892 μL minimalt medium (1x M9)
8 μL 50 % glyserol (0,4 % [vol/vol])
100 μL 2 % Casamino-syrer (0,2 % [wt/vol])
1 μL tiamin (B1)
11 μL glukose (2 M)
1 μL relevant antibiotika- Bland og spinn ned.
- Fortynn cellekulturen (1:30) fra trinn 2,4 til et 2 ml rør ved å tilsette 30 μL Escherichia coli-vekst til 1000 μL fortynningsløsning (trinn 2,5).
- Inkuber røret i 1 time med risting (250 o/min) ved 37 °C.
- Vokse 40 μL - 60 μL på M9-plater tilberedt i trinn 1.10. Inkuber platen ved 37 °C over natten.
MERK: Den optiske tettheten (OD600nm) for plating bør være rundt 0,1. - Plasser opptil tre 35 mm glassbunnplater på benken.
MERK: Kontroller at platens glass har riktig tykkelse for mikroskoplinsene som brukes. - Forbered kulturen for såing på gelplater, gjenta trinn 2,3 til 2,6 for kolonier fra plate fremstilt i trinn 2.9 mikroskopmålinger.
- Forbered følgende løsning for å lage tre mikroskopplater.
- Forvarm vannbadet til 60 °C.
- Bland 112,5 mg lav smeltende agar og 40 mg agar med 8,92 ml minimalt medium (1x M9) og tilsett 1 ml 2% casaminosyrer (0,2% [vol/vol]) i en 25 ml Erlenmeyer kolbe.
MERK: Sørg for å helle mediet på de indre leppene på kolben.
- Mikrobølgeovn løsningen i korte utbrudd på 2 til 3 sekunder. Gjenta til løsningen er klar.
MERK:Pass på at du ikke når kokepunktet. - Plasser 25 ml Erlenmeyer-kolben i et varmtvannsbad (60 °C) for ytterligere blanding ved diffusjon, og la den avkjøles på benken til temperaturen faller til ca. 45-50 °C.
3. Tilberedning av agarose pads
- Rengjør benken med 70% etanol. Strekk tape på den rensede benken. Kontroller at båndet er glatt og utjevnet.
- Forbered to coverlips: en på båndet og en annen i nærheten. Forbered en coverlid.
- Fjern kolben (tilberedt i trinn 2.14) fra vannbadet, tørk utsiden av kolben ren og la den avkjøles til temperaturen faller til ca. 45-50 °C.
- For å lage gelløsningen, bland raskt alle løsningene i følgende rekkefølge:
80 μL 50 % glyserol (0,4 % [vol/vol])
1 ml 2 % casaminosyrer (0,2 % [wt/vol])
10 μL tiamin (B1)
110 μL glukose (2 M)
10 μL relevant antibiotika. - Hell 1,5 ml gel på dekslene og dekk den med det andre stykket som lager et "smørbrød".
- Returner Erlenmeyer til varmtvannsbadet. Dekk smørbrødet med lokket og still timeren i 20 minutter.
- Samtidig inkuberer du røret fra trinn 2.11 i 1 time ved 37 °C med risting (250 o/min)
- Etter 20 minutter snur du smørbrødet (trinn 3.5), dekker det og lar det hvile i 1 time.
MERK: For bedre resultater, la "sandwich" hvile ved 4 °C så lenge trinn 3.8 varer. - Frø Escherichia coli kultur fra trinn 3.7 ved å pipettere prøven på 35 mm parabolen.
MERK: Pipettering 6 μL celler som separate små dråper gir de beste resultatene. - La dråpene tørke i minst 15 minutter og opptil 30 minutter.
- Utsett den størknede gelen på smørbrødet fra trinn 3.8 ved å skyve dekslene bort.
- Skjær smørbrødet i små individuelle pads med biopsistans eller spiss.
- Len den forsiktig på prøven (trinn 3.9). La retten stå i 20 minutter på benken.
4. Klargjøring av prøven for mikroskopiavbildning
- Fjern kolben fra vannbadet fra trinn 3.6. Tørk av utsiden av kolben og la den avkjøles til romtemperatur (25 °C).
MERK: Fjern kolben i trinn 4.1 ca. 3 minutter før timeren avsluttes. - Hell 3 ml gel hele tiden til plateområdet i en sirkulær bevegelse. La det være å størkne i noen minutter.
- Tetningsplater med tape og pierce flere hull med 25 G nål. Vend alle rettene for å unngå at vannkondensasjon drypper på gelen.
- Inkuber alle rettene ved 4 °C i 30 minutter for å tillate full størkning samtidig som cellemittose forhindres.
MERK: La prøvene stå på 4 °C for påfølgende målinger, ikke mer enn én dag. - Start mikroskopet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Finn det første fokuset ved hjelp av laveste forsterkningslinse og sett inn automatisk fokussystem (AFS).
- Bruk olje om nødvendig, drukne linsen med olje og spre den forsiktig ved å flytte platen med en plattformregulator (ikke manuelt) og AFS kan aktiveres igjen.
- Bruk relativt tverrsnitt i Z-retning, etter standardforslag for Z-trinns tverrsnitt.
MERK: Vi tok lysfeltbilder hvert 5. Noen ganger må fokuset justeres i løpet av de første 30 minuttene. Forvarming av mikroskopinkubatorboksen og olje, mens kjøling av prøven har en tendens til å bidra til å redusere det første tapet av fokus.
5. Dataanalyse
MERK: For å behandle mikroskopidata designet vi en databasert programvare i MATLAB. Denne programvaren letter identifisering av cellegrenser fra lyse felt tiff bilder og segmenter og sorterer celler etter område. Utgangen av denne bildeanalysen kan brukes som en maske på fluorescerende tiff-bilder for å utlede celleintensitetsnivåer og avbryte artefakter i det fluorescerende domenet som cellehalo på grunn av mikroskopoppløsningsgrenser. Programvaren utviklet ble inspirert av lignende verk7,25,26,27,28,29,30 og gir en elegant løsning skreddersydd for laboratoriet.
- Først definerer du følgende parametere i main_code.m.
- Definer mappen for anskaffelsesbildene.
- Definer bildetidsperioden – lysfeltkanaltidstrinn i minutter.
- Definer GFP-frekvensen - anskaffelseshastigheten for GFP-bilder.
- Definer mikroskopoppløsningen (dvs. hvor mange piksler som er lik 1 μm).
- Definer histogram bin område - celleområdeområde.
MERK: Prosessen med å klassifisere dataene i henhold til celleområdet ligner prinsippene for gating i strømningscytometridataanalyse. Gates er plassert rundt populasjoner av celler med felles egenskaper, vanligvis fremover spredt og side spredt, for å isolere og kvantifisere disse populasjonene av interesse. Mikroskopi gjør det mulig å portere, undersøke og kvantifisere flere cellegrupper. - Definer konvolusjonskjerne (3,3) - denne parameteren oppdager cellegrenser ved global terskelverdi (count_cells.m).
MERK: Dette oppsettet er bare nødvendig når du endrer laboratoriet eller mikroskopet. Programvare krever at den lyse feltkanalen for inngang merkes med indeks c1, fluorescenskanal merket som c2.
- Kjør main_code.m, som kjører alle andre skript automatisk (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Programmet segmenterer automatisk bilder med lyse felt (se Tilleggsfigur 2-4).
- Kombiner segmenteringsbildet med fluorescerende bilde (GFP) for å trekke ut intensitetsnivå per celle.
- Beregn diagrammet over mengder celler etter tid og tilpass i henhold til eksponentiell vekst.
- Beregn gjennomsnittet og standardavviket (STD) for hvert celleområdeområde.
- Beregn signal-til-støy-forholdet (SNR) for hvert celleområdeområde.
- Tegn inn og tilpass fordelingen av cellemengde etter intensitet.
- Beregn varianskoeffisienten (CV) og sammenlign med flytanalysedata.
MERK: Programvaren vil gi som utgang de endelige segmenteringsbildene for justering conv_kernel i en ny mappe "yourfolder / Segmented". Programvare vil gi som utgang grafene i en ny mappe "yourfolder / Graphs.
- Hvis du vil sammenligne mellom eksperimenter, bruker du compare_experiments.m.
- Definer mapper for de lagrede grafene og adressen for mappen \CompareResult.
- Kjør filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Programvaren analyserer lyse feltdomenebilder som er off-white og svart. Escherichia coli vil se ut som svarte avlange former på en off-white bakgrunn og dynamisk lystetthetsområde bør vise en spike i midten (Figur 1). I fluorescerende bilder kan celler ha en liten glorie, men individuelle celler med avlange former kan fortsatt løses. En mitosehendelse bør først oppdages etter 30 minutter. Mikroskopfokus bør forbli stabilt over tid, og selv om cellene kan bevege seg sakte i løpet av de 30 minuttene, er det lite sannsynlig at de forlater synsfeltet. Et slikt eksperiment vil bli ansett som godt og kan ses på figur 2. Celler kan være vanskelige å oppdage i det lyse feltdomenet ved lav forstørrelse. Vi anbefaler å etablere gjennomsnittlig fokusavstand med et høyt kopinummer (HCN) plasmid, da det er lett å legge merke til ved lav forstørrelse. Angi gjennomsnittlig avstand mens du måler et lavt kopieringsnummer (LCN) plasmid ved høy forstørrelse på forhånd. Denne fokusavstanden avhenger hovedsakelig i platene, mikroskopisystemet og oljen, og ikke tykkelsen på gel eller Escherichia coli-stamme.
Når du tilpasser denne protokollen til andre laboratorier, kan følgende problemer oppstå (1) Escherichia coli-plater (prøver) fremstilt ved feil fortynningsforhold kan vise uendret antall celler (Figur 3 og Figur 4) (2) Prøver fremstilt uten forsegling av platen kan vise overdreven krymping. Dette kan observeres som celler drift (Figur 3) eller føre til tap av fokus (Figur 5) (3) Noen prøver kan vise langsomme skiftende 'faste' celler (i svart) på bakgrunn av svømmeceller (i hvitt). Dette skyldes sannsynligvis en våt prøve, og det stabiliserer seg vanligvis ettersom overflødig vann absorberes av gelen (Supplementary Video 1) (4) Prøver som ikke viser noen celler etter noen minutter med oppvarming, kan ha blitt tilberedt feil, sannsynligvis på grunn av: (I) Gel ble hellet mens den fortsatt var for varm, (II) beskyttelseshetten ble glemt, (III) minimale medier mangler en ingrediens, (IV) feil celletetthet, og (V) gel ble forseglet. Det er viktig å stanse hull for å tillate gassutveksling på bekostning av gelkrymping (Figur 5) og (VI) celler kan også rykke gelen på jakt etter næringsstoffer, stable den ene oppå den andre, kompromittere cellemonolayeren effektivt forhindre deteksjon av celler og måling av pålitelig fluorescerende signal (Supplerende figur 5).
Vi har målt tre kretser i dette arbeidet. Først en konstituerende promotor som regulerer GFP vist i figur 6. For det andre en konstituerende promotor som regulerer superfoldet GFP31 (sfGFP) vist i figur 7. En ssrA-degraderingskode (AAV) ble lagt til sfGFP for å redusere levetiden til minutter5. Den tredje kretsen er basert på en positiv tilbakemeldingskrets1, og induseres av acyl-homoserin-laktone (AHL). PluxR-promotoren regulerer sfGFP og LuxR, en transkripsjonsfaktorbinding med AHL for å aktivere PluxR som vist i figur 8. Figur 9 presenterer dynamikken i cellevekst (celletall kontra tid), figur 10 viser dynamikken i det målte signalet (gjennomsnittlig fluorescens versus tid), og figur 11 viser dynamikken i evaluert total støy (standardavvik (STD) kontra tid).
SNR (eller CV) er mye brukt til å designe analoge elektroniske kretser for å uttrykke presisjonen og påliteligheten til kretsen32. CV relaterer seg til fordeling av signal mellom enkeltceller og tillater sammenligning på tvers av metoder og annet utstyr som mikroskoper og strømningsanalysatorer. Beregning av SNR fra mikroskopbilder gjør at vi kan sammenligne kretser over tid, segmenterte celler måles samtidig som de gir et mål for den spesifikke oppløsningen av støyen sammenlignet med signalet, eller et støyintervall for en bestemt tid og induserkonsentrasjon. Dette kan indikere om detektorceller vil kunne løse den nøyaktige signalresponsen til induserkonsentrasjonen. I dette arbeidet ble CVen beregnet ved å vurdere alle segmenterte artefakter som er celler, uavhengig av celleprogresjonen i divisjonssyklusen. SNR ble beregnet for et bestemt celleområde over tid, og deretter ble det gjennomsnittet for tre gjentatte eksperimenter. Verken det oppkjøpte signalet eller kjønnssykdommer er pålitelige alene, da de er spesifikke for eksperimentet og utstyret som brukes. Signalet måles med vilkårlige enheter som avhenger av utstyrsforsterkning, fotodetektor og eksponeringstid. Dataene som presenteres i figur 10 tyder på at celletrinnet i divisjonssyklusen ikke påvirker støynivået, da ulike arealområder (punkter i divisjonssyklusen) viser samme trend. Denne observasjonen kan støtte påstanden om at sporing av nøyaktig mor - datterrelasjoner kan unngås for å måle støy, og dette kan forbedre SNR for den presenterte metoden. Det ble ikke observert noen vesentlig endring i SNR mellom GFP og sfGFP, som vist i figur 12. Vi beregner SNR (SNR = middelverdi / STD) og presenterer det i figur 12 og figur 13.
Deretter beregnet vi variansen og CV-en basert på følgendeligninger 31
1.1
1.2
Der λ er proteinfoldingstid, er T celledelingstid, θ og μ er antall plasmider før og etter divisjon, plasmidkopinummeret31. Ved hjelp av ligningene ovenfor (1.1 og 1.2) kan vi passe dataene fra strømningsanalysatorsignalet for gammafordeling.
Deretter sammenligner vi mellom CVen, som måles og beregnes av strømningsanalysatoren (figur 14), og av protokollen (figur 15).
Figur 1: Lys felteksponeringsbilde (a) Stabilisert anskaffelse i lyst felt (b) Segmenteringsbilde, bare fargede celler skriver inn beregningene (c) Piksellysstyrkekart over oppkjøpet, spike er bakgrunnsstøyen. Terskler av det segmenterer bare Escherichia coli. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dette eksperimentet viser gode friske celler som deler seg og reagerer etter 120 minutter. Bilder ble anskaffet suksessivt med 20 minutters intervaller. Kolonier er i fokus, gel er stabil mellom prøvetakinger. Kolonier deler og produserer sterke signaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekter av feil fortynningsforhold og gelkrymping på fluorescerende bilde. Bilder ble anskaffet med 20 minutters intervaller (a) Individuell Escherichia coli sirklet inn i rødt (b) Den samme cellen driver til høyre for synsfeltet (c) Cellen driver videre. Cellene deler eller endrer heller ikke posisjoner, sannsynligvis på grunn av lavt fortynningsforhold og gelkrymping. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: I dette eksperimentet ble det ikke oppdaget noen aktivitet, og nesten ingen celler var til stede. Mulige årsaker er at gelen er for varm, tørkingen av prøven er for aggressiv eller ikke har noen beskyttende hette (a) Fluorescerende bilder tatt på 40 minutter (b) Fluorescerende bilder tatt på 60 minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fokustap og fotobleaching. Etterfølgende bilder av (a) til og med (d) ble anskaffet med 15 minutters tidsintervaller ved hjelp av autofokussystem. Se Tilleggsvideo 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6:Plasmidkart over Pteto som regulerer GFP. Uten TetR-repressoren fungerer PtetO-promotoren som en konstituerende promotor. Kretsen er klonet på lavt kopinummer plasmider. Denne plasmiden fungerer som grunnlag for SNR-måling for enhver modifisert krets. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7:Plasmidkart over Pteto som regulerer sfGFP. SfGFP er smeltet sammen til en AAV-forringelseskode. Kretsen er klonet på lavt kopinummer plasmider. SfGFP-AAV er en mer robust variant av GFP, mens AAV-taggen gjør den utsatt for nedbrytning av rengjøringsproteaser av Escherichia coli. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Plasmidkart over positiv tilbakemeldingskrets. Kretsen er indusert av en AHL-induser, som binder LuxR transkripsjonsfaktor. PluxR-promotoren, som er regulert av AHL-LuxR-komplekset, aktivgjør produksjonen av LuxR og sfGFP-AAV. Kretsen er klonet på lavt kopinummer plasmider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9:Dynamikken i Escherichia coli MG1655-belastningsveksten i minimale medier inkluderer (a) PtetO-GFP, eksponentiell vekst på ca. 35 minutter. Bildene av dette eksperimentet vises i figur 2 (b) PtetO-sfGFP, eksponentiell vekst på ca. 35 minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Fluorescerende intensitetsnivå, normalisert per piksel og anskaffet med 20 minutters intervaller.
Celler er binned i henhold til området, for å minimere artefakter. Celler er delt av deres område i en mikrometer firkant (a) Pteto-GFP kretsførste repetisjon for intensitet på 210 minutter er 0.004 a.u (b) PtetO-sfGFP krets første repetisjon for intensitet på 210 minutter er 0.022 a.u (c) Målt signal av Pteto-GFP krets (d) Målt signal av PtetO-sfGFP krets. Alle eksperimentelle data representerer gjennomsnittet av tre eksperimenter. Programvaren kan sortere celleområdet til forskjellige grupper (a) og (b) vise grafer for fire celleområdeområder som representerer divisjonssyklusen. Det første området på 14 mikrometer representerer celler etter deling som mest sannsynlig at celler etter divisjon vil være de minste. Det andre området på 21 μm representerer celler før divisjon. Tredje og fjerde område representerer celler ved divisjon ettersom det totale arealet multipliseres med to (29 og 36 μm) for å vurdere celler som tok lengre tid å dele. Områdene ble valgt ved å manuelt vurdere dataene som ser på mikroskopibilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Standardavvik (STD) for enkeltcellede fluorescensintensiteter for: (a) PtetO-GFP-kretsens første repetisjon for STD ved 210 minutter er 0,001865 a.u (b) PtetO-sfGFP krets første repetisjon for STD på 210 minutter er 0.01477 a.u (c) STD av Pteto-GFP krets (d) STD av PtetO-sfGFP krets. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12:SNR for fluorescensintensiteter i enkeltceller. Vi beregner SNR = Mean / STD (a) PtetO-GFP krets første repetisjon for SNR på 210 minutter er 1.309 a.u (b) PtetO-sfGFP krets første repetisjon for SNR på 210 minutter er 1.29 a.u (c) Tre repetisjoner av GFP måling (d) Tre repetisjoner av sfGFP måling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 13:SNR av enkeltcellede fluorescensintensiteter (a)PluxR-sfGFP krets SNR for metningsrespons på AHL (b) PluxR-sfGFP krets SNR for pauserespons på AHL. SNR for positiv tilbakemelding AHL regulert krets er høyere enn SNR for konstituerende sfGFP krets. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 14: Histogrammer av genkretsene basert på strømningsanalysatoren: eksperimentelle data (blå) og stokastiske modelldata (rød). X-aksen representerer vilkårlige fluorescensenheter fra strømningscytometri, og y-aksen representerer frekvensen av celler som produserer det tilsvarende fluorescensnivået. Dataene ble målt ved hjelp av en strømningsanalysator etter tre timer. GFP fluorescens ble kvantifisert ved eksitasjon ved en bølgelengde på 484 nm og utslipp ved en bølgelengde på 510 nm. PE-TexasRed filterspenninger ble brukt på en prøvetaker med høy gjennomstrømning for å måle GFP-uttrykksnivåer. Strømningsanalysatorspenningene ble justert ved hjelp av programvare slik at maksimums- og minimumsuttrykksnivåene kunne måles med samme spenningsinnstillinger. Dermed ble konsistente spenninger brukt på tvers av hvert hele eksperiment. De samme spenningene ble brukt til etterfølgende repetisjoner av samme eksperiment. Montering ble gjort ved bruk av gammafordeling31. Denne metoden forutsetter at signalet hovedsakelig avhenger av tilfeldig fordeling av plasmider (a) Måling av P teto-GFP-klone på lavt kopinummer plasmid. Eksperimentell CV = 0,46, Modell CV = 0,32 (b) Måling av Pteto-sfGFP-AAV klonet på lavt kopinummer plasmid. Eksperimentell CV=0,86, modell CV=0,44. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 15: Histogrammer av genkretsene basert på mikroskop: eksperimentelle data (stiplede linjer) og stokastiske modelldata (faste linjer). X-aksen representerer vilkårlige fluorescensenheter fra invertert mikroskop, og y-aksen representerer frekvensen av celler som produserer det tilsvarende fluorescensnivået. Montering ble gjort ved hjelp av MATLAB gammafordeling31,32 (a) Måling av PtetO-GFP klone på lavt kopinummer plasmid (b) Måling av PtetO-sfGFP-AAV klonet på lavt kopinummer. Sammenligning viser at vår protokoll oppnår lignende CV-verdier som i flow analyzer eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Fire fortynningsforhold, mellom 1:500 og 1:20, for MG1655-stammen. Grafen viser at hvis den første tettheten er høy, er LB-næringsstoffer rikelig, noe som resulterer i at cellene deler seg raskere. For en 1:500 fortynning forble celletettheten konstant. For en 1:100 fortynning økte celletettheten sakte. For en 1:50 fortynning økte celletettheten med moderat divisjonshastighet uten betydelig forsinkelse i 250 RPM inkubasjon. For en 1:20 fortynning nådde celletettheten metning raskt. Vi valgte et fortynningsforhold på 1:30, slik at kort inkubasjon for å nå eksponentiell vekst og betydelig divisjonsområde for å oppnå høy metning ved moderat divisjonsrate. Klikk her for å laste ned denne figuren
Tilleggsfigur 2: Behandler bilder med lyse felt. (a) Rå dataintensitetsbilder fra den lyse feltkanalen fra mikroskopsystemet. (b) Kontrastforbedringsmanipulering av bildet for å forbedre separasjonen av celleobjekter fra bakgrunnen. (c) Cellegrensegjenkjenning basert på konvolusjonsfilter33 og binariseringsbasert globalterskel 34. (d) Morfologiske35 operasjoner for lukking og fylling for å identifisere cellekolonigrenser. Klikk her for å laste ned denne figuren
Supplerende figur 3: Cellekolonibakgrunn\forgrunnssegmentering. For å minimere virkningen av støyen prøver vi å identifisere cellekolonigrenser og trekke dem ut fra gelstøyen. (a) Bildebinariseringsoperasjon på kontrastforbedring basert på adaptiv terskelverdi for å oppdage celleobjekter36. (b) Matrix multiplation av matriser presentert på S2d og S3a vellykket filtrere ut de fleste lyder og differensiere gel støy fra celler. Noen grenseverk er ikke fullstendig løst. (c) Identifisering av cellegrenser ved hjelp av en vannskillealgoritme37 basert på avstandstransformasjon38. (d) Matrise multiplation av matriser presentert på S3b og S3c vellykket løse enkeltceller. Klikk her for å laste ned denne figuren
Supplerende figur 4: Segmentering av enkeltceller. (a) Segmentert produkt av lysfeltbilde. Videre rengjøring er forhåndsformet basert på celleområde gating og form, kaste runde bobler. (b) Fluorescenssignalbilder hentet fra mikroskop. (c) Matrix multiplation av matriser presentert på S4a og S4b vellykket trekke ut signalet av enkeltceller. Klikk her for å laste ned denne figuren
Supplerende figur 5: Tap av monolayer. (a) Lys feltbilde av et cellelag på 840 minutter (14 timer) Pteto som regulerer GFP-kretsen vist i figur 2 i artikkelen som et godt eksperiment. På høyre side av mikroskopi kan bildetap av monolayer oppdages. (b) Bilde av segmentering av programvare. På grunn av tap av monolayerceller er fragmentert og vil bli rengjort base på område gating. (c) Fluorescensbilde som viser at ingen celler på høyre side av bildet kan løses og et lavt signal av celler på venstre side av bildet på grunn av tap av monolag. (d) Segmenteringsbilde kombinert med fluorescensbilde. Klikk her for å laste ned denne figuren
Supplerende video 1. Klikk her for å laste ned denne videoen
Supplerende video 2. Klikk her for å laste ned denne videoen
Supplerende video 3. Klikk her for å laste ned denne videoen
cell_growth_rate_fit.m. Klikk her for å laste ned denne filen
compare_experiments.m. Klikk her for å laste ned denne filen
Count_Cells.m. Klikk her for å laste ned denne filen
main_code.m. Klikk her for å laste ned denne filen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet utviklet vi en protokoll som muliggjør datasporing av Escherichia coli levende celler, etter divisjon og fluorescerende nivåer over en periode på timer. Denne protokollen lar oss kvantifisere den stokastiske dynamikken i genetiske kretser i Escherichia coli ved å måle CV og SNR i sanntid. I denne protokollen sammenlignet vi den stokastiske oppførselen til to forskjellige kretser som vist i figur 10. Det har vist seg at plasmider med lave kopitall er mer utsatt for stokastiske effekter og mindre påvirket av celledeling. Den første kretsen uttrykte konstituert GFP (figur 10a), og den andre kretsen uttrykte konstituert sfGFP smeltet sammen til en ssrA-nedbrytningsmerke (Figur 10b). For å kvantifisere den stokastiske oppførselen til de fluorescerende proteinene, registrerte vi også de lyse feltbildene. Resultatene viser at uttrykket av GFP, spesielt ved modningen39, er den dominerende støykilden. Det periodiske tannadferdsmønsteret som observeres i figur 10a, kan forklares med den tilfeldige prosessen med celledeling og den lange skalaen av GFP-modning (~ 50 minutter). Til sammenligning ble sfGFP-signalet til den andre kretsen stabilisert under målingen, fordi den svært korte modningstiden til sfGFP (~ 6 minutter). Vi utviklet en enkel formel som beskriver nivået av GFP i begge kretser når vi bare vurderer prosessen med celledeling og GFP modningstid. På et gitt tidspunkt, t, antar vi at det er x kopi antall proteiner, og μ kopiere antall plasmider. Proteinkopinummeret kan beskrives ved å:
1.3
1.4
Når du bare vurderer divisjonshendelser; 
etter proteinmodning og så for de spesifikke plasmidene får vi:
For GFP ( 
): 1.5
For sfGFP ( 
):1.6
Deretter den utviklede serien av sfGFP:
1.7
I tilfelle at 
, vi får 
. Dette resultatet kan forklares som følger. Når x er liten, øker SFGFP-nivåene med en liten mengde. Når x er stor, forringes sfGFP til en stabil tilstand. På samme måte, for kretsen av GFP, inneholder hver celle ca 10 enheter av GFP, men siden modningstid for GFP er lengre enn mitose, observeres nedverdigende sagentannmønstre av fluorescensintensiteter. I modellen antok vi at replikering av plasmidet er raskt nok til at plasmidfordelingen forblir konstant før og etter divisjon. SsrA-nedbrytningskoden reduserer ofte proteinets halveringstid fra timer til mindre enn en time5 og fører til en rask steady state. Vi viste at metoden også gir en fordeling som ligner den som måles med en høy populasjonsstrømningsanalysator, og at CVen til denne fordelingen er lik eller mindre enn strømningsanalysatoren CV.
Mens flere metoder3,7,18 ble utviklet for levende celleavbildning, er metoden som presenteres her skreddersydd spesielt for Escherichia coli. Denne bakterien krever et spesielt medium og en litt annen tilnærming. Protokollen har følgende viktige egenskaper: (1) Etablering av et fortynningsforhold som er spesifikt for bakteriene og stammen i begynnelsen av eksponentiell vekst i stedet for i midten (Eksponentiell vekst uten risting) (2) Escherichia coli skiller seg best ved 37 °C, men ved 37 °C mister den minimale mediegelen vann raskt, noe som fører til krymping og ustabilitet. Protokollen her overvinner denne utfordringen (3) Vi bruker først bakterieprøven og forsegler den deretter med flytende gel. Siden prøven er fanget mellom glassbunnen og gelen, trenger vi en gel som (I) tillater gassutveksling for å unngå å kutte luftlommer, (II) forblir flytende ved lave temperaturer da Escherichia coli er følsom for varme og (III) sørger for at prøven ikke blandes inne i væskegelen. Gelen forblir flytende ved 37 °C, Vi anbefaler imidlertid bruk av en beskyttelseshette på toppen av prøven for å unngå overdreven varme og prøveblanding inne i gelen (4) Denne tilnærmingen krever enkelt, generisk utstyr (5) Prøver kan måles direkte uten forvarming, så det er ikke noe tap av divisjonshendelser (6) Protokollen, som inkluderer våtlaboratoriet og den tilpassede automatiserte programvaren, kan brukes til å studere den stokastiske oppførselen til genetiske kretser som kvantifisering av SNR og CV-signaler. Vi sammenlignet mikroskopimetoden med strømningsanalysatorresultater for å validere bruken av små populasjoner av celler og etablere en basislinje for sammenligning i henhold til CV (7) Programvaren lar oss oppdage celler på monolayer uten menneskelig inngrep og analysere total støy. Programvareverktøy som ImageJ18 eller Schnitzcells krever manuell identifisering av celler og er utfordrende for justeringer.
Når du kontinuerlig forestiller levende cellekolonier, design eksperimentet mens du vurderer flere komplekse fysiske parametere, for eksempel cellulær stress og toksisitet, grad av ressursuttømming, nekrose og nedbrytningstid for indusere og kjemikalier. Protokollen tillater pålitelig måling på opptil fem timer. Våre eksperimenter tyder på at Escherichia coli synkroniseres når de deles i mikro, monolayerkolonier (Supplementary Video 3). Vi antar at gelen er jevn når det gjelder ressurser og seighet, cellene har lignende oppførsel, og belysningsfeltet er litt større fra synsfeltet. Dermed bør hver celle produsere samme signal og statistiske data, som kan samles inn som vi har vist ved å sammenligne CV oppnådd på denne måten med måling med en strømningsanalysator. For å måle støy ved konstante innledende forhold i lengre perioder, vil vi vurdere å bruke mikrofluidiske sjetonger i fremtiden. Ytterligere fordeler med en slik enhet opprettholder faste posisjoner av celler og stabil fokus10. Likevel krever design, fabrikasjon av mikrofluidiske sjetonger og grunning for eksperimenter trening, spesifikt utstyr (skreddersydd til tider) og tid. Av denne grunn er det gunstig å bruke tidsforløpmikroskopi som vist i denne protokollen for å skaffe seg en generell forståelse av kretsen.
Den foreslåtte protokollen og den utviklede programvaren tillater reproduserbare målinger, hvorfra det er enkelt å utlede grafer. Det tillater også testing og sammenligning av total støy og kan endres for måling av iboende og ekstrinsisk støy. Metoden er basert på generiske eller enkle å bestille materialer, åpent delt, brukervennlig programvare og krever ikke spesifikk opplæring. Vi har vist at populasjonen målt ved mikroskopi er stor nok til å innhente meningsfulle data ved å sammenligne metoden CV med den som oppnås med en strømningsanalysator. Derfor kan vi med hell etablere en SNR-basislinje ved hjelp av denne protokollen og sammenligne den med mer komplekse genkretser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Mr. Gil Gelbert (Fakultet for elektroteknikk, Technion) for å bistå med MATLAB-koden. Vi takker Dr. Ximing Li (Fakultet for biomedisinsk ingeniørfag, Technion) for å bistå med å bevise denne artikkelen. Denne forskningen ble delvis støttet av Neubauer Family Foundation og Israel Ministry of Science, grant 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al.
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V.
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E.
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
