Summary
ここでは、原発性新生児マウス精巣細胞から精巣オルガノイドを生成する4つの方法、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリーの2Dおよび3D培養環境について説明する。これらの技術は、複数の研究アプリケーションを持っており、体外で精巣の発達と生理学を研究するために特に有用である。
Abstract
精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および内分泌学を体外で研究するためのツールを提供します。精巣オルガノイドを作るためにいくつかの方法が開発された。これらの方法の多くは、de novo組織アセンブリを促進するために細胞外マトリックス(ECM)に依存しますが、バイオミメティック形態と組織の機能の点で方法の違いがあります。さらに、公開されたメソッドの直接比較はほとんどありません。ここでは、オルガノイド生成プロトコルの違いを研究することによって直接比較が行われ、結果が得られる。4つの原型生成方法:(1)2D ECMフリー、(2)2D ECM、(3)3D ECMフリー、および(4)3D ECM培養法が記載されている。精巣オルガノイド発生を評価するために3つの主要なベンチマークが使用された。これらは、細胞自己集合体、主要な細胞タイプ(セルトリ、レイディグ、胚芽、および骨膜細胞)を含み、適切に区分された組織アーキテクチャである。試験された4つの環境のうち、2D ECMおよび3D ECMフリー培養は、尿管細胞型と間質細胞型のデノボ区画化、管状構造の開発、確立された長期内分泌機能など、天然精巣に最も類似した内部形態を有するオルガノイドを生成した。研究されたすべての方法は、未ソートの一次マウス精巣細胞懸濁液を利用し、一般的にアクセス可能な培養リソースを使用した。これらの精巣オルガノイド生成技術は、精巣の器官形成および生理学の研究イニシアチブのための非常にアクセス可能で再現性の高いツールキットを提供する。
Introduction
精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および生理学をvitro11、2、3、42,3,4で研究するための先駆的な技術である。オルガノイド生成のためにいくつかの方法が検討されている。これらには、2次元(2D)および3次元(3D)の向きの両方で、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリー培養系が含まれる。異なる生成方法は、明確なセルラーアセンブリ戦略を促進することができます;これにより、公開されたオルガノイドモデル間の形態学的および機能的変動の高いレベルが生じる。この記事の目的は、精巣の器官化実験を設計する際に、体外精巣モデルの現状を議論し、将来の研究者のためのテンプレートとして機能することです。本研究では、4つの異なる培養系のアーキタイプが、実験過程および生物学的結果において定義され、特徴付けられる。これらには、2D ECM フリー、2D ECM、3D ECM フリー、および 3D ECM カルチャメソッドが含まれます。本書に示す戦略は、異なる研究所と研究グループ間で、シンプルでアクセスしやすく、再現性の高い戦略です。
歴史的に精巣のために、「in vitro」という指定は、精巣組織および細胞のいくつかの異なる培養方法のために使用されてきた。これらには、組織/臓器培養方法(すなわち、外植培養)5、単離された半細管培養6、精巣細胞培養7、およびデノボ組織形態形成(すなわち、生物学的構造およびオルガノイド)の方法が含まれる。体外精子形成の最初の調査は約100年前に行われ、ウサギの精巣の培養は19208年に、そして1937年にはマウスの外植体9で外植した。これらの最初の実験の中で、精子は培養の最初の週に大部分が退化することが観察されたが、いくつかのmeiottって分化する細胞が同定された。これらの歴史的な報告を連想させる、精巣培養は2011年に復活し、精巣10を研究するための実現可能な技術になるために最適化された。2011年以来、外植培養は、複数のレポート11、12、13,12で不妊治療の有能な精子を13産生している。しかし、外植培養が既存の在来精巣細管に依存しているため、これらの最近の進歩は、生物の体内からの除去時に維持または再開された組織機能である「ex vivo」精巣機能および精子形成の例としてより正確に記述されている。文献におけるその有病率にもかかわらず、精巣外植物内の長期生殖細胞維持および分化は、特に体外精子形成で完全に観察するのに十分な長さの時間枠にわたって14、15、16、17、18,15,16,17,18を複製することは困難である(ヒトでは19および74のマウスでは35日)。100年前に経験した同じ課題の多くが、今日でもex vivo精子形成の中で経験されていることを理解することは興味深いです。
ex vivoアプローチとは異なり、精巣オルガノイドは、細胞源(すなわち、一次精巣細胞)から完全にインビトロで生成されたデノボ組み立てられたマイクロ組織である。精巣オルガノイドは、既存のネイティブ組織に対するフィールドの歴史的依存を回避し、精巣生物学を完全にインビトロで再現するための創造的な戦略を提供します。ほとんどのオルガノイド組織モデルで共有される複数の要件があります。これらは、(1)生体擬態組織形態またはアーキテクチャにおいて、(2)代表組織の複数の主要な細胞型、(3)その生成における自己集合または自己組織化、および(4)表される組織の機能および生理学21、22、23、2422の一21定レベルをシミュレートする能力を含む。,23,24精巣の場合、これは4つの主要な特徴で捉えることができます:(1)主要な精巣細胞タイプを含む、 胚芽、セルトリ、ライディグ、骨膜、および他の間質細胞、(2)細胞指向組織アセンブリ、(3)適切に区分された細胞型を別々の管状コンパートメント(胚芽およびセルトリ)および間質領域(他のすべての細胞型)、および(4)ある程度の組織機能(例えば、生殖ホルモン分泌または生殖組織応答)および異なる細胞の応答を含む。生殖細胞分化ex vivoおよびin vitroを維持する際の歴史的課題を考慮すると、精巣生理学のシミュレーション(例えば、内分泌)機能を生成することを示唆する追加マーカーを用いた生体内模倣精巣精巣アーキテクチャ(すなわち、半細管に似た構造)の再現は、1日の精子で生殖機能を持続する臓器組織の生成に向けた優先的なマイルストーンである。
公示された精巣オルガノイド法の大部分は、市販のECM(例えば、コラーゲンまたは独自のECM製剤)25、26、27,26,27またはカスタム供給ECM(すなわち、脱細胞化精巣ECM由来ヒドロゲル)28、29、30,29,30を利用する。外因性ECMは、組織生成のための組み立て支持足場を提供することにより、デノボ組織形成を促進する。ECMの方法は、いくつかの生殖細胞の存在と組織模倣形態25、28を含む組織形成の印象的なレベルを28与えている。しかし、彼らが利用するECMは、常に普遍的に入手可能であるとは限らず(すなわち、脱細胞化されたECM由来ヒドロゲル)、そしていくつかの方法は洗練されたゲルおよび細胞の播種の向き(例えば、ECMおよび3D印刷の3層の勾配)25、31、3231,32を必要とする。25足場を含まない方法(例えば、ハンギングドロップおよび非接着培養プレート)33、34、35はまた、ECMゲルまたは足場を必要とせずに堅牢で再現性の高いオルガノイドを生成した。33,34,35しかし、これらの足場を含まないオルガノイドの組織形態は、生体内精巣と異なることが多く、これらの報告のほとんどは、組織形成を促進するために生化学的ECM添加剤を組み込み、33、34、36、34,36または代わりに、強制細胞凝集および圧縮34のための遠心分離に依存し、細胞指向移動および自己組織化を研究するのに理想的ではない。33
本稿で紹介する4つのオルガノイド生成法には、ECM依存性と独立した戦略の両方が含まれ、それぞれが細胞駆動型オルガノイド自己集合の観察を可能にする単純な細胞播種を用いる。4 つの手法はすべて、同じセルの中断から実行することも、カスタムおよびセル型の濃縮された集団を利用することもできます。これらの方法の強みは、オルガノイドをリアルタイムで自己集合的に観察し、精巣構造が異なる培養マイクロ環境間でどのように自己集合するかを直接比較する能力である。これら4つの培養方法の間の語体的な違いは、研究者の研究課題または主題に与える影響について考慮されるべきである。各方法は、24時間以下の生物学的構築物またはオルガノイドを生成する。結論として、ここで提示される方法は、精巣オルガノイドアセンブリ、組織の発達、および精巣生理学を試験的に研究するためのオルガノイド組立技術のツールキットを提供する。
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Protocol
すべてのマウス実験はノースウェスタン大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認され、すべての手順はIACUC承認プロトコルの下で行われました。
1. 酵素組織解離液の調製
- 2種類の酵素溶液(溶液1および溶液2)を用いて、いずれも基底培養培地溶液(BM)を用いて作製した。
- BMを調製するには、血清およびペニシリンストレプトマイシンを最小必須培地から最終濃度10%および1%にそれぞれ加えます(特定の試薬の材料表を参照)。次いで、0.22 μmフィルターを介してBMを無菌でフィルタします。細胞と共に使用する前に、培養皿に分注し、加湿した5%CO2インキュベーターを最低1時間37°Cで入2れることによって、無菌BMを中性pHに事前平衡化する。
注:BMは、新鮮なBMを作る必要があり、その後、1週間まで4°Cで保存することができます。 - コラゲレーターIストック液を調製するために、まず100mgのコラゲレーターIを1mLの無菌胚グレードH2O(最終濃度10%m/v)に溶解し、反転または旋回して溶解し、後で使用するために-20°Cで20μLのアリコートを保存する。アリコートは一度だけ解凍する必要があります。
- デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)ストック溶液を調製するには、DNase Iの20mgを無菌胚グレードH2O(最終濃度2%m/v)の1mLに加え、反転または旋回して溶解し(渦を起こさない)、後で使用するために-20°Cで20μLのアリコートを保存する。アリコートは一度だけ解凍する必要があります。
- ヒアルロニダーゼストック溶液の場合、1mLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、Ca++/Mg++を含むPBS中の最終濃度3%m/vヒアルロニダーゼ++)に30mgを加え、反転または渦巻いて溶解し、100μLアリコートを-20°Cで保存して後で使用します。アリコートは、酵素活性を失うことなく、数回解凍して再凍結することができます。
- 解離 液1を調製するには、10μLコラゲナーゼIと10μL DNase Iを1mLの無菌、事前平衡化されたBM(最終濃度:1mg/mLコラゲナーゼIおよび5 μg/mL DNase I)に加えます。ピペットで軽くトリチュレートして溶液を混合し、組織と共に使用する前に37°Cに予熱します。
注:溶液2は、溶液1の1mLあたり33μLのヒアルロニダーゼ(37°Cに予熱)を加えて調製される(最終濃度1mg/mL)。これは、以下のステップ2.5で精巣組織の酵素解離を経て途中で起こる。
2. 精巣組織解離
注:すべてのマウスはポリプロピレンケージ内に収容され、食品と水のアドリビタムを提供しました。動物は植物エストロゲンを含まない照射チャウを与えられた。若年性CD-1マウスは、産後5日間(dpp)、全ての実験に使用され、安楽死および組織採取前に、イソフルラン気化器に付着した麻酔室内(O2中2.5 L/分)内で麻酔を行った。マウスは、つま先刺しに対する応答がない場合に完全麻酔を確認し、その後マウスを切断によって安楽死させた。
- イオブルランチャンバーでマウスを麻酔し、つま先刺しで麻酔を行い、鋭利なはさみを使ってマウスの首を切ります。解剖マットの上に安楽死させたマウスの上に置き、70%エタノールで腹部を殺菌する。下腹部の皮膚を鉗子でテントにし、腹部をはさみで開きます。
- 腹部の左下および右のりすがり領域に精巣を見つける。精管とアンカー結合組織への接続を切断し、動物から精巣全体(精巣上体がまだ取り付けられている状態)を持ち上げます。事前に平衡したBMのペトリ皿に精巣を置く。
- 解剖顕微鏡の下で、無菌の分野内で、小さなマイクロディションはさみのいずれかで、または2つの細かい鉗子を使用して穏やかに引き裂くことによって、各精巣の一端にチュニカアルブギネアで小さな切開を行います。
- 次に、切開の反対側の端から精巣を保持しながら、細かい鉗子で精巣を軽く絞り、チュニカの穴に向かって穏やかな掃引運動を押し込みます。これは精巣組織を1つのまとまりのある部分として放出する。
- 精巣を小さく切り(≤2mm3)、あらかじめ温めた(37°C)解離液1mLに入れる。
- 37°Cで10分間インキュベートします。
- 10以上の試験の場合、解離液の総体積を1mL増やし、10回の精巣につき最低1mLの解離溶液を確保します(例えば、20回の精巣に対して2mL、30回の精巣等で3mL)。
- P1000ピペットを用いて溶液1中に精巣片を50回(50倍)軽く三分化する。この時点で、尿細管が互いに分離し、間質組織から分離していることを確認します。塊が残っている場合は、さらに5分間インキュベートし、もう一度(50倍)トリチュレートします。
- 溶液1解1解離液混合物(部分的に解離した精巣組織および細管を含む)あたり33μLのヒアルロニダーゼストック溶液(ステップ1.5から事前に加温)を加える。ヒアルロン化症を添加した後、これを溶液2と呼ばれる。
- P1000を用いてトリチュレート(50倍)を37°Cで5分間インキュベートする。
- P200ピペットを使用してトリチュレート(50倍)
- この時点で、可視の細管または細胞の塊が存在しないようにしてください。塊が持続する場合は、P200ピペット(50x)を使用してさらにトリウテーションを使用して、さらに5分までインキュベートします。
- ウシ胎児血清(FBS)を溶液2の全容量の10%に加えて解離酵素をクエンチする。P200ピペットを使用して数回トリチュレートして塊が残らないようにし、40 μmのセルストレーナーを通してフィルターを通して単一細胞懸濁液を生成します。
- 遠心分離細胞を 100xg で7分間、上清を捨て、新鮮なBMで細胞を再懸濁する。
- ヘモサイトメーター上のトリパンブルー排除を使用して、総および生存細胞濃度をカウントします。1:1希釈、細胞懸濁液の10 μLを加える:トリパンブルー溶液、ヘモサイトメーターセル計数チャンバー( 材料表を参照)
- 100 x g で 7 分間再遠心分離し、新鮮な BM で再懸濁します。
注:セルの濃度と数を計算するために生存可能なセルのみを使用してください。オルガノイドを発生させる≥80%の生存率の細胞懸濁液のみを使用する。 - セクション3で下記のプロトコル固有のステップで使用されるボリュームを与えられた280,000細胞をアリツーコートするために説明したように、単一細胞懸濁液を細胞濃度に準備する:2D ECM-Free – 0.56 x 106セル/mL、 2D ECM – 0.56 x 106セル/mL、 3D ECM フリー –6 4.66 x 10 6 セル/mL, 3D ECM – 2.8 x 10 6 細胞/mL.
注:ここで紹介するすべての培養実験は、培養1回あたり280,000個の細胞を播種していきます。これらの数値は、図 1 、 図 2、 図 3、 図 4の代表的なデータと一致しています。
- 100 x g で 7 分間再遠心分離し、新鮮な BM で再懸濁します。
3. オルガノイド培養皿の作製と細胞の播種
注:均質なECMを確実にするために、実験の前にECMの凍結されたアリコートを一晩解凍する。ECMアリコートは、温度のゆっくりとした緩やかな上昇を保証するために、4°C冷蔵庫または冷蔵室内の氷のバケツ内に沈む必要があります。すべてのECMは、培養のためにBMの1:1最終希釈で使用されます。解凍したECMと1:1希釈ECMを使用する直前まで氷上に保管し、それ以外の場合はECMが早期に重合する可能性があります。
- 2D ECMフリー培養では、特別な調製は必要なく、プレート単一細胞懸濁液(BMで0.56 x 106 細胞/mLの500 μL)を直接4-ウェルチャンバースライド上に配置し、培養用35°Cインキュベーターに入れます。
注: 細胞は培養の最初の 24 時間以内に培養皿の底に付着し、この同時に小さな 3D 細胞クラスターを示す可能性があります。 - 2D ECM培養の場合、冷たい1:1希釈された細胞外基底マトリックス媒体の100 μLを4ウェルチャンバースライドに分配し、ゲルが皿底全体を覆っていることを確認します。
- チャンバースライドを35°Cインキュベーターに30分以上入れ、ECMをゲルに重合させます。
- 重合した後、2Dゲルの上に直接細胞懸濁液(0.56 x 106 細胞/mLの500 μL)を加えます。
注: セルは、培養の最初の 24 時間内に小さな 3D クラスターを形成するために、一緒にクラスター化する必要があります。
- 3D ECMフリー培養の場合、細胞培養を開始する前にアガロース3Dペトリ皿の挿入物を準備します。
- まず、オートクレーブ1.5gアガロースパウダーを100 mLビーカーに入れ、75 mLの滅菌、蒸留水、マイクロ波を加えて、3Dペトリ皿鋳造用の2%アガロースを溶融して生成します。
- 無菌ワークスペース内で、メニスカスが金型の側面と同じレベルになるまで、溶融アガロースを3Dペトリ皿型に分配します。
- アガロースを冷却し、固める。固体の場合は、金型を逆さまにし、アガロース3Dペトリ皿が金型から自由になるまで穏やかに繰り返し屈曲します。
注:この時点で、多くのアガロース3Dペトリ料理を準備し、1ヶ月以上4°Cで滅菌H2OまたはDPBSでそれらを保存することができます。 - 培養する前に、アガロース3Dペトリ料理を24のウェルカルチャーディッシュに入れ、1mLのBMで覆います。3Dペトリ料理は、37°C培養器内で少なくとも30分間BMで平衡させます。BMを廃棄し、1 mLの新鮮なBMでもう一度平衡を繰り返します。BMで3Dペトリ料理を平衡化した後、それらはBM(すなわち、ピンク)と同じ色で現れます。
- 細胞の播種の準備のために、ウェルからすべてのBMを取り出し、3Dペトリ皿の中心凹部の内側ではなく、周りに新鮮なBMの200 μLを分配します。また、マイクロウェルインサートの中央細胞播種凹部の内側から残りのBMを収集する。
- アガロース3Dペトリ皿の中央凹部に単一細胞懸濁液(BMの60 μLで4.66細胞/mL)を分配します。上下に軽く三分酸して細胞を混合し、培養開始時に単一の細胞懸濁液を保証します。
- 培養用に加湿した35°Cインキュベーターに入れる。翌日、マイクロウェルインサートの周りからBMの200 μLを取り出し、1 mLのフレッシュBMに交換します。これにより、液体レベルが挿入物の平面の上に、培養物全体を水没させます。
- アガロース3Dペトリ皿の外側からゆっくりと慎重にメディアを取り出します。オルガノイドは一晩で圧縮され、底部で休むことを可能にし、オルガノイドを邪魔されないままにするメディアの変更を可能にするべきである。
- 3D ECM培養の場合、BM中の細胞懸濁液を冷たく解凍前ECM(最終濃度=2.8 x 106 細胞/mL)と組み合わせて単一細胞懸濁液を調製する。
- すぐにセル-ECM混合物を4ウェルチャンバースライドに分配し、混合物がプレートの底全体を覆っていることを確認します。
- チャンバースライドをインキュベーターに35°Cに入れ、内容物を重合します。これには少なくとも30分かかります。重合後、培養の上部に500μLのBMを加えます。
注: セルは、培養の最初の 24 時間内に小さな 3D 集計を形成するために、一緒にクラスター化する必要があります。
4. オルガノイドメンテナンス
- 35°Cで全オルガノイドモデルタイプを培養する。 すべての文化タイプのために2日ごとに新鮮なBMとメディアの半分を交換します。オルガノイドがメディアを交換している間に誤って収集されないようにするために、常にチャンバースライド皿の隅から、そしてアガロース3Dペトリ皿の外の外の点からゆっくりとメディアを収集します。すべての培地は、後で免疫アッセイまたは他の分析(すなわち分泌された生殖ホルモンまたはサイトカインの定量化)で使用するために-20°Cで保存することができる。
- 培養で7日後、卵胞刺激ホルモン(最終濃度20 mIU/mL)およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(最終濃度4.5 IU/mL)を含むBMを使用する。これは、すべてのオルガノイド培養タイプに適用されます。
- オルガノイドの形成を特徴付け、時間の経過とともに自己集合、発達、成長の指標を定量化するために、すべてのオルガノイド培養物(すなわち、タイムラプスイメージング)を日常的に画像化する。
5. オルガノイドコレクション
注:すべてのオルガノイドは、下流の免疫標識および組織学的分析のためにPBSで4%パラホルムアルデヒドで固定することができます。回転で室温で2時間、または4°Cで一晩固定します。
- 2D ECM フリーの培養物の場合は、まず新鮮な PBS でサンプルをリンスし、次に付着したコンストラクトの上に直接固定液を追加します。
- ECM(2Dおよび3D)培養方法の場合、PBSで一度リンスし、ECMオルガノイドサンプルの上部に直接固定剤を追加するか(ECMゲルとオルガノイドを一緒に固定する)、またはオルガノイドを上下に穏やかにピペットして周囲のECMから解放し、別のチューブに移して固定する。
- 3D ECMフリー培養の場合、アガロース3Dペトリ皿の中央凹部内でオルガノイドを上下にピペットします。これはピペットで彼らの容易なコレクションを促進するオルガノイドを洗い流す。その後、オルガノイドを別のチューブに移して固定します。
- パラフィンに加工する前に、組織処理ゲルの小さな体積(〜30μL)内に多くのオルガノイド(≥20)を埋め込みます。これにより、オルガノイドをパラフィンブロック内の小さな領域に配向して濃縮し、パラフィンセクション内での断面化時の観察が容易になり、視覚的な識別が容易になります。
注:オルガノイドは、パラフィンの埋め込みとミクロトームの切除後の識別に困難な場合があります。
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Representative Results
精巣細胞が培養72時間以内に自己集合しなかった場合、オルガノイド生成は失敗と考えられていたが、ここで提示されるすべての方法は、若年性(5dpp)マウス細胞を使用する場合には24時間以内に組み立てられる。培養後も自由に懸濁した細胞( 図1の0hカラム)の継続として提示される生物学的構築物生成の失敗(72時間)。。組織自己集合性がない場合、任意の見かけの細胞クラスターは、穏やかな操作(すなわち、ピペット化)でさえも個々の細胞に容易に分散する。正常に生成された組織は、最初は3D細胞の「クラスター」として観察された( 図1の6hカラムの黄色い矢印)。ECMフリー環境(2Dおよび3D)内では、これらの構造は、特に3Dアガロースペトリ皿(図1A,C)で、文化の最初の24時間にわたって「コンパクト」に見えました(ECM 環境 (2D および 3D) のセル クラスターでは、クラスタとその周辺環境との間に明確なマージンがあります (図 1B,D)。また、細胞クラスターは、ECMを横断し、より大きなクラスターを形成して融合することも観察された( 図1Bの赤い矢印)。独立した自己集合構造を理解するのに必要な時間を測定し、2Dと3D ECMフリー条件と2D ECMの両方の間に必要な時間に有意な差はなかったが、3D ECM培養は他のすべての培養方法よりもデノボ構造を組み立てるのにかなり多くの時間を要した(図1E)。2D ECM フリーおよび 3D ECM 培養は、2D ECM および 3D ECM フリー培養方法よりもサイズが大幅に小さいセル クラスターを生成します。3D ECMフリー培養は、3Dアガロースペトリ皿の各井戸内に単一の大きくてコンパクトなクラスターを持つ最大のクラスターを生産しました(図1C,F)。要約すると、これらのデータは、4つの原型培養環境における若年マウス一次細胞から精巣生物学的構造を産生し、これらの異なる培養環境内で異なる細胞指向性アセンブリフェノタイプを強調する容易さを示している。
すべてのオルガノイドモデルの目標は、ネイティブ組織の内側の形態模倣体を再現することです。この結果を評価するために、各培養条件内で組み立てられた生物学的構築物を72時間培養し、次いで細胞特異的マーカーについて探り出し、免疫蛍光で可視化した(図2)。組織形態の変動は異なる培養方法の間で観察された。セルトリ細胞(SOX9およびβカテニン)のクラスターとして提示された2D ECMフリーオルガノイドは、セルトリ、骨膜(αSMA)、レイディグ細胞(3βHSD)を含む多くの体細胞を含む2D基底コンフルエント層の上に付着した細胞A-D(DDX4、汎生殖細胞マーカー)図2B-Dは、2D ECMフリーサンプル全体の蛍光画像であり、5μmのセクションではありません。これにより、基底体体細胞層とセルトリ細胞および生殖細胞の優れた指向凝集体の両方の可視化が可能になります。対照的に、2D ECM培養物は、明確な境界を有する明確な生物学的構造が基底ECMゲルの上に容易に識別されたように、ほとんど異なる表現型を呈した(図2E)。これらの構造は、精巣の間質細胞型と対尿細管のデノボ区画化を有する複雑な内部形態を有し、成功したオルガノイドとみなされた。管状領域には、セルトリ、骨下、および生殖細胞、および間質領域が含まれ、レイディグ、管内細胞および非標識細胞が含まれていた(図2F-H)。同様に、3D ECMフリーオルガノイドも区画化された内部形態を有し、オルガノイドが成功したと考えられた。特に、3D ECMフリーオルガノイドは、セルトリおよび生殖細胞のグループを忠実に中心とする垂管周囲細胞を含む管状領域によって区別された(図2I-L)。3D ECM組み立てられた構造は洗練された形態を有せず、その代わりにセルトリ細胞のクラスターであり、時折胚芽およびライディッヒ細胞であることが観察された。これらのサンプルでは、多くのセルトリ細胞および非標識細胞は、「間質状」の配向でオルガノイド間に浮遊したままであった(図2M-P)。これらのデータは、異なるオルガノイド生成方法が生成する形態学的形質の変動を強調し、精巣区画化の非常に模倣的な内側の形態を有する精巣オルガノイドの生成のために、2D ECMおよび3D ECMフリーの2つの特定のオルガノイド集合環境の使用をサポートする。
精巣オルガノイド機能をさらに評価するために、より深い長期分析のために3D ECMフリーの集付されたオルガノイドを選択した。本研究では、これらのオルガノイドを14日間培養し、細胞および構造特異的マーカーについて調査した。14日の免疫蛍光分析の際、3D ECMフリーオルガノイドは、尿細管様構造(TLS)と生体内精巣と非常によく似た組織アーキテクチャを含む観察された(図3A-D)。間質細胞は、TLSとは別の領域に適宜配置した。次いで、汎生殖細胞マーカー、DDX4、精子幹細胞マーカー、SALL4、およびMeiosisマーカーについて組織切片をプローブした、SCP3(図3E-G)。希少DDX4陽性およびSALL4陽性細胞は認められなかったが、SCP3シグナルは同定されなかった。TLSのより深い特徴付けの上に、それらは、分極セルトリ細胞と周管細胞の外的単層に囲まれた内腔現れる空間を含んでいるのを観察した(図3I-L)。セルトリ細胞はまた、透過型電子顕微鏡法で視覚化され、血液検査用バリアの接合タンパク質および成分であるZO-1に対する標識を用いて、互いに緊密な接合を示した(図3H,L)。次に、3D ECMフリーオルガノイドを、12週間の、長期培養における性腺刺激を用いた内分泌機能について検討した(図4)。テストステロンおよびインヒビンBは、それぞれライディグおよびセルトリ細胞からの生殖ホルモンを、オルガノイド調整培地から同定および定量した(図4A)。12 週間の培養, 両方のホルモンが有意に性腺刺激ホルモン FSH と hCGの補充に応答するために測定されました (赤い矢印は、補充の開始を示します, 週 2 – 12 の間).完了時に、内分泌応答性が維持されているかどうかを判断するための試験を行った。ゴナドトロピンは48時間除去され、その間にテストステロンとインヒビンB濃度の両方が濃度が有意に低下した。48時間後、ゴナドトロピンは培養に戻され、両方のホルモン濃度が最終的な24時間にわたって再び有意に増加し、適切な内分泌応答性を示した(図4B)。全体として、これらの組織学的および内分泌アッセイの結果は、精巣オルガノイドが精巣の発達(すなわち、脱ノボ区画化および尿管形成)および体細胞精巣機能(例えば、タイトな接合形成および内分泌機能)を研究するのに有用なモデルであることを示している。
図1:オルガノイドは、2Dおよび3D、ECMおよびECMフリー培養条件で自己集合する。
5 dppマウス精巣細胞は、2D ECMフリー(行A)、2D AECM(行B)、3D ECMフリー(行C)、3DECM(行BD)の4つの異なる条件で培養した。カルチャ メソッドを表すグラフィックスは、左側の列に表示されます。代表的な画像モンタージュは、ライブ文化の間に撮影されたタイムラプス画像から組み立てられました。各画像の時間ポイントは、上余白にラベルが付けられます。時間0hは、オルガノイド集合体が発生する前、時間3時間は、進行中の細胞駆動オルガノイドアセンブリの間であり、時間6hおよび9時間は、代表的な、正常に形成されたオルガノイドを示す。黄色の矢印はセルクラスタを示し、赤い矢印は、別々のセルクラスタが移行され、マージされた場所を示します。全てのスケールバー=1mm(E)別々の細胞クラスターが目に見えて理解できる前に必要な時間は、各条件について記録された。2DF = 2D ECM フリー;2DE = 2D ECM;3DF = 3D ECM フリー;3DE = 3D ECM。(F)各培養条件についてクラスタ当たりの面積を測定した。画像は、n= 3 ~ 5 の個別の実験から選択されました。Tukeyの多重比較検定を用いた一方の分散分析は、1Eと1Fの有意性を判断するために使用されました。グラフは、n=4の別々の実験の手段から組み立てられた。この図は、エドモンズとウッドラフ37から変更されています。IOP の発行©。許可を得て再現。すべての権利が予約されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2D ECMおよび3D ECMフリー培養オルガノイドは、管状および間質細胞タイプの区画化を示す。
72時間培養後の自己組織化オルガノイドの代表的な明視野および免疫蛍光画像。2D ECMフリーサンプルは、全体のマウントを画像化し、他のすべてのサンプルは5μmの組織セクションで画像化した。(A – D) 2D ECM フリーカルチャ。(E – H) 2D ECM カルチャ。(I – L) 3D ECM フリーカルチャ。(M – P) 3D ECM カルチャ。セルトリ細胞核(SOX9)および細胞体(βカテニン)、生殖細胞(DDX4、汎生殖細胞マーカー)、ライディグ細胞(3βHSD)、および骨膜細胞(αSMA)の細胞特異的マーカーが、上マージンに標識されています。全ての蛍光サンプルをDAPIとDNAについて共染色した。黄色の矢印は、左から 2 番目の列の DDX4 マークされた生殖細胞を指し、赤い矢印は、右の 2 つの列のセルトリ細胞クラスターを指します。明るいフィールドスケールバー= 400 μm、蛍光スケールバー = 100 μm。この図は、エドモンズとウッドラフ37から変更されています。IOP の発行©。許可を得て再現。すべての権利が予約されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:オルガノイドは、希少な生殖細胞によって移入された細管状の構造を発達させる。
3D-ECMフリーの組み立てられたオルガノイドを14日間培養した。(A –D)管状構造(TLS)の周りの細胞タイプと組織特徴を詳述した代表的なH&Eおよび免疫蛍光画像;同じオルガノイドは、横並びに形態学的特徴の比較を可能にする隣接組織切片で描かれています:レイディグ細胞(3βHSD)、骨内細胞(αSMA)、セルトリ細胞体(βカテニン)、コラーゲン膜(COL IV)、セルトリ細胞核(SOX9)。スケールバー= 100 μm(E – G)免疫蛍光標識は、生殖細胞マーカー(DDX4)、精子幹細胞マーカー(SALL4)および精液活性精子細胞(SCP3)を含む生殖細胞に対して行った。高度に拡大されたインセットは、3Eと3Fの黄色のパネルで概説されています。緑の三角形は、DDX4 ラベル付きセルを指します。赤い矢印は、SALL4 ラベルのセルを指します。(H)オルガノイド内のセルトリ細胞間の緊密な接合の代表的な透過電子顕微鏡写真(TEM)TEM スケール バー = 100 nm。(I – L)密接(ZO1)およびラミニンを含む半日本星上皮の主要な特徴のために標識されたTLSの高倍率の代表的なイメージ。同じ TLS は、パネル I – L の隣接する組織セクションで示されます。全ての蛍光サンプルをDAPIとDNAについて共染色した。画像はn=7の別々の生物学的実験から選択された。この図は、エドモンズとウッドラフ37から変更されています。IOP の発行©。許可を得て再現。すべての権利が予約されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: オルガノイドは、ゴナドトロピン FSH と hCG に応答して培養の 12 週間にわたってテストステロンとインヒビン B を分泌します。.
3D-ECMフリーオルガノイドから収集されたコンディションされた培地を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を介してテストステロンおよびインヒビンBについて測定した。(A)オルガノイドは、週2 - 12の間にFSHとhCG補充(補充の開始は、X軸上の赤い矢印でマークされています)、12週間培養しました。すべての値は、統計的検定の文化の7日目と比較されました。(B)12週間後に内分泌応答性が維持されたかどうかを判断する「再刺激試験」の拡大グラフ。Bテストの期間は4Aの灰色のボックスで概説されています。培養で12週間の完了時に、ゴナドトロピンを48時間除去し、その後、培養の最後の24時間のために再補充した。ホルモンは、ゴナドトロピン再刺激後0、2、6、12、および24時間で測定された。赤いシェーディング領域は、FSH と hCG を使用して、非シェーディング領域は FSH と hCG のない期間を指定する、カルチャの間の期間を指定します。注意したp値は、再刺激後2時間に対して相対的である。Tukeyの多重比較の検定を用いた双方向のANOVAは、すべての内分泌データ、n=5の別々の生物学的実験の有意性を決定するために使用された。この図は、エドモンズとウッドラフ37から変更されています。IOP の発行©。許可を得て再現。すべての権利が予約されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このオルガノイド生成プロトコルの完成により、ユーザーはECMまたはECMフリー環境で精巣構造およびオルガノイドを組み立てるために利用可能な4つの異なる培養技術を有する。重要なことに、4つの方法はすべて、研究者がタイムラプスイメージングまたはビデオ記録を通じて時間の経過とともにオルガノイド自己集合を非侵襲的に観察し、培養中に組織を乱すことなく、分泌されたホルモンおよびサイトカインの分析のために非侵襲的に条件付き培地を収集することを可能にする。すべての方法において、24時間の間に、実験者は細胞数が許す限り数百個のオルガノイド/精巣構造を生成することができる。これらの方法は、組織の自己集合を異なるサイズと形態を持つ構造に促進します。オルガノイドサイズは、培養で使用される細胞数および濃度に依存し、他のオルガノイド報告書34に見られるようになる。オルガノイドの大きさや直径を小さくすることは、時にはより大きなオルガノイドに現れる壊死の内側領域の発達を減らすのに役立つかもしれない。2D ECMおよび3D ECMフリープロトコル法の特定の強みは、形態学的模倣精巣オルガノイドを生成する能力であり、管状細胞型と間質細胞型のデノボコンパートメント化を含む。さらに、3D ECMフリーの集結オルガノイドは、セニファーTLSのデノボ管形成のためのモデルを提供し、適切に区画化され、配向したセルトリおよび垂門細胞を有する。これは精巣オルガノイドを研究するための重要な表現型であり、まだ異なる精巣オルガノイドレポートの中で可変的な結果である。他の複数のレポートは、管状対インタースティジウム区画化を欠き、いくつかも「裏管状」表現型32、33、34、38,34,38を開発する。32,本稿で提示されたオルガノイド生成方法はいずれも、培養の延長日にわたって大きな生殖細胞集団を維持することを特徴とするものではないが、生殖細胞は早くも72時間観察されることはまれであったが、2D ECMおよび3D ECMフリーの方法は、体管切垂体および精子ニッチ環境の体細胞成分を研究するのに有用なツールを提供するかもしれない。この目標を念頭に置いて、精巣オルガノイドは、体外生殖細胞の維持、meioticの進行、および分化を改善するために、将来のプロトコルを最適化するための潜在的なプラットフォームを提供します。
これらのプロトコルのもう一つの利点は、オルガノイド生成をカスタマイズし、スケールする能力です。カスタマイズされた、薬物処理された、または操作された細胞集団は、一次マウス精巣細胞37に加えて、置換または使用することができる。細胞懸濁液が低生存率(<80%)である場合、細胞懸濁液の細胞生存率を向上させる方法を取る必要があります。これには、解離メディアに費やす時間を短縮し、組織消化中の三分の一を最小限に抑える(ステップ2.4.1- 2.5.2)、解離後のワッシュの数を増やす、または細胞選別または死細胞標識キットとの解離後の死細胞の除去が含まれます。ただし、このレポートで共有される代表的なデータを生成するために、これらの手順は必要ありませんでした。2D および 3D ECM 培養法では、これらのプロトコルは、ここで紹介する研究に使用されるものに加えて、他の構造タンパク質ベースの生体材料マトリックスと共に使用できます。これらの他の生体材料は、コラーゲン、ゼラチン、市販のECM抽出物、およびカスタム製の非細胞化ECM由来ヒドロゲル25、26、2826,を含む。25ECMゲルの塗布と高品質のアガロース3Dペトリ皿の挿入物を作成するトラブル撮影のためのいくつかのポインタがあります。ECMゲルをチャンバープレートに投げる場合は、培養皿に分配する前に、チューブまたはピペットチップ内でECMの早期重合を防ぐために、迅速に動作し、冷たいピペットチップを使用してください。溶融アガロースを3Dペトリ皿型(3D ECMフリー培養用)に鋳造する場合は、高温で暖かくしないアガロースのみを使用して、最小限のバリエーションでインサートの高品質な鋳造を確保し、アガロースが室温まで完全に冷却され、固化したことを確認してから金型から取り出そうとします。アガロース3Dペトリ料理は、細かい鉗子で優しく扱うのが一番です。固定のためにオルガノイドを収集する場合は、解剖顕微鏡の下で作業し、すべてのオルガノイドのコレクションを視覚化してください。オルガノイドは、培養料理のプラスチック側とピペットの先端の内側に固執することができます。ガラスピペットはプラスチックよりもオルガノイド付着性が低い。ECMの内部または上にカプセル化されたままオルガノイドを固定することは、固定前にECMからそれらを取り除くよりも、より困難で繊細なプロセスです。組織処理ゲルは、培養チャンバから除去する前にECM-オルガノイド構築物の上にキャストして、固定39の前にゲルを補強するのを助けることができる。4°Cに下げると非重合する可能性が高いため、室温で固定を行い、ECMヒドロゲルを回収する必要があります。 さらに、0.1% - 1.0 % グルタルアルデヒドを 4 % PFA 溶液に追加して、ECM をさらにクロスリンクすることができます。しかし、この方法は、サンプルのバックグラウンド自己蛍光を増加させます。
上記のオルガノイド生成法によって達成された結果には、生殖細胞特有の限界がかなりあり、これは将来のイノベーションの優先分野を表しています。生殖細胞は、拡張培養で十分に支持されておらず、培養の最初の数日間しか容易に観察されず、培養の最初の週の終わりと後の時点ではほとんど観察されない。未分化精子はインビトロ細胞培養中に維持できるが、イン,ビボ管状40に移植した際に精子形成を回復させる能力を維持しながら、尿細管体性微小環境(すなわち、 直接セルトリ細胞相互作用)は、,マイトロ1、5、40、415におけるmeiosisおよび精子形成を介して、前のマイオティック生殖細胞を分化するための前提条件であると仮定される。14041構造的に模倣されたTLS内の早期時点で精子を含む精巣オルガノイドは、この分野が体細胞性体細胞および体細胞相互作用を完全にインビトロで非侵襲的に研究することを可能にするかもしれない。培養前の培地添加剤および細胞調製物の最適化(例えば、体外精子幹細胞培養に使用される薬剤の組み込み)42,43,43は、将来の研究において、特に数日間よりも長い培養期間にわたって生殖細胞の収量を増加させる可能性がある。逆に、マイクロインジェクションを通じてTLSが形成された後に精子を再導入する方法は、オルガノイド内の生殖細胞を復元する興味深い機会をもたらし、生殖細胞を維持するためのインビトロ組織体環境の能力をテストする。他の生物学的要因は、年齢/成熟45および遺伝的背景の違いを含む、ex vivo外植培養に影響を与える観察されている。これらの同じ変数は精巣オルガノイド生物学の分野で直接調査されていません。しかし、異なるアセンブリ、形態、および機能的な型は、オルガノイドが異なる老化動物(すなわち、新生児、少年、成体)または様々な遺伝的背景(例えば、異なるマウス株)の動物から分離された細胞から生成される場合に生じる可能性があることはもっともらしい。
要約すると、この原稿で共有される技術は、細胞駆動精巣構築自己集合、2つの別々の構造的模倣精巣オルガノイドモデルの生成、およびインビトロにおけるTLS開発およびホルモン応答性内分泌機能の重要な成果を研究するための4つの有用なモデルを提供する。これらのモデルは、複雑で完全に定義された培養媒体を持つECM環境とECM環境における2Dおよび3D空間的指向を包含します。各方法は非常に再現性が高く、一般的に利用可能なカルチャ リソースのみを使用します。これらの方法は、体外で精巣形態形成を研究し、体外精子形成のための将来の培養条件を最適化するために有利である可能性があります。さらに、2D ECMおよび3D ECMフリー法は、精巣、体外管形成、体細胞細胞および体細胞細胞相互作用に特有のデノボ組織区画化のプロセスを研究するための新しいツールを提供する。精巣オルガノイドは、体細胞精巣生理学的特徴の発達と調節を調査する柔軟でスケーラブルな機会を提供します。血液検査の障壁と内分泌の生産と応答を含む;また、次世代の翻訳研究組織モデルの開発にも役立つツールです。これらには、生殖ホルモンをより大きなシステムレベルのモデルに組み込むことが含まれます, 例えば、組織オンチップとマイクロ生理学プラットフォーム45,,46.精巣オルガノイドがいつか適用される可能性のある他の翻訳目標には、生殖毒物学と免疫学的バリア検査、男性避妊発達、生殖技術の革新支援が含まれます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所、国立衛生人間開発研究所(NICHD)F31 HD089693、国立環境衛生研究所/国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(NIEHS/NCATS)UH3TR001207および4UH3ES029073-03、トーマス・J・ワトキンの記念教授によって資金提供されました。
著者らは、エリック・W・ロスが透過電子顕微鏡の支援をしてくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、ソフトおよびハイブリッドナノテクノロジー実験(SHyNE)リソース(NSF ECCS-1542205)からの支援を受けているノースウェスタン大学のNU ANCE センターのBioCryo施設を利用しました。材料研究センターのMRSECプログラム(NSF DMR-1720139)国際ナノテクノロジー研究所(IIN)そしてイリノイ州、IINを通じて。また、MRIプログラム(NSF DMR-1229693)からサポートを受けているCryoCluster機器を利用しました。図 1 のグラフィックスは、BioRender.comを使用して設計されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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