Summary
هنا، هناك أربع طرق لتوليد الخصية العضوية من خلايا الخصية الخصية الخصية حديثي الولادة الأولية هي وصفها، أي المصفوفة خارج الخلية (ECM) وبيئات الثقافة 2D و 3D الخالية من ECM. هذه التقنيات لها تطبيقات بحثية متعددة ومفيدة بشكل خاص لدراسة تطوير الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.
Abstract
توفر الخصية أداة لدراسة تطور الخصية، ونشوء الحيوانات المنوية، والغدد الصماء في المختبر. وقد تم تطوير عدة طرق من أجل خلق الأعضاء الخصية. يعتمد العديد من هذه الطرق على المصفوفة خارج الخلية (ECM) لتعزيز تجميع الأنسجة من جديد ، ومع ذلك ، هناك اختلافات بين الأساليب من حيث مورفولوجيا الأنسجة والوظائف الحيوية. وعلاوة على ذلك، هناك عدد قليل من المقارنات المباشرة بين الأساليب المنشورة. هنا، يتم إجراء مقارنة مباشرة من خلال دراسة الاختلافات في بروتوكولات توليد الأعضاء، مع النتائج المقدمة. أربعة أساليب الجيل الأركيولوجي: (1) 2D ECM خالية، (2) 2D ECM، (3) 3D ECM خالية، و (4) 3D ECM الثقافة هي الموصوفة. واستخدمت ثلاثة معايير أولية لتقييم توليد الخصية العضوية. هذه هي التجميع الذاتي الخلوي ، وإدراج أنواع الخلايا الرئيسية (Sertoli ، Leydig ، والجرثومة ، والخلايا المحيطية) ، والهندسة المعمارية الأنسجة المجزأة بشكل مناسب. من البيئات الأربع التي تم اختبارها، ولدت 2D ECM و 3D ECM-الثقافات organoids مع المورفولوجيا الداخلية الأكثر شبها الخصيتين الأصلية، بما في ذلك تقسيم دي نوفو من أنواع الخلايا الأنبوبية مقابل الخلالي، وتطوير هياكل تشبه الأنابيب، ودالة الغدد الصماء على المدى الطويل المنشأة. استخدمت جميع الأساليب التي تمت دراستها تعليق خلايا الخصية الأولية غير المُنَتَجة واستخدمت موارد الثقافة التي يمكن الوصول إليها بشكل شائع. وتوفر تقنيات توليد الخصية هذه مجموعة أدوات يسهل الوصول إليها ويمكن استنساخها للمبادرات البحثية في تكوين الأعضاء الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.
Introduction
الخصية هي تقنية رائدة لدراسة تطوير الخصية ، والحيوانات المنوية ، وعلم وظائف الأعضاء في المختبر1،2،3،4. وقد تم استكشاف عدة طرق لتوليد organoid; وتشمل هذه مجموعة متنوعة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وECM- أنظمة الثقافة الخالية، في كل من ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) التوجهات. يمكن أن تعزز أساليب التوليد المختلفة استراتيجيات تجميع خلوية متميزة؛ وهذا يؤدي إلى مستوى عال من التباين المورفولوجي والوظيفي بين النماذج العضوية المنشورة. الغرض من هذه المقالة هو مناقشة الحالة الراهنة للنماذج الخصية في المختبر، ولخدمة كنموذج للمحققين في المستقبل، عند تصميم التجارب الخصية. وفي إطار هذه الدراسة، تم تحديد أربعة نماذج مختلفة من نماذج النظم الثقافية وتتميز في العملية التجريبية والنتائج البيولوجية. وتشمل هذه: 2D ECM-Free، 2D ECM، 3D ECM-Free، و 3D ECM الأساليب ثقافة. تهدف الاستراتيجيات المعروضة هنا إلى أن تكون بسيطة وسهلة الاستخدام وقابلة للاستنساخ بشكل كبير بين مختلف المختبرات ومجموعات البحث.
تاريخيا للخصية، وقد استخدمت التسمية "في المختبر"، لعدة طرق مختلفة لثقافة الأنسجة والخلايا الخصية. وتشمل هذه الأنسجة العضوية / أساليب زراعة الجهاز (أي ثقافة explant)5، معزولة ثقافة أنبوب شبهيرول6، ثقافة الخلية الخصية7، وطرق دي نوفو تكوين الأنسجة (أي، وانشاءات البيولوجية والأجهزة)1. وقد أجريت التحقيقات الأولى في الحيوانات المنوية في المختبر قبل ما يقرب من 100 سنة، مع ثقافة الخصية الأرانب explants في 19208، وفي وقت لاحق في عام 1937 مع explants الماوس9. ضمن هذه التجارب الأولية لوحظ spermatogonia إلى حد كبير منحطة عبر الأسبوع الأول من الثقافة، على الرغم من أن بعض الخلايا التفريق meioticly تم تحديدها. تذكرنا هذه التقارير التاريخية، تم إحياء ثقافة explant testis الأمثل في عام 2011 لتصبح تقنية مجدية لدراسة الخصية10. منذ عام 2011، أنتجت ثقافة explant الحيوانات المنوية المختصة الخصوبة في تقارير متعددة11,12,13. ومع ذلك ، بسبب اعتماد ثقافة explant على أنابيب الخصية الأصلية الموجودة مسبقًا ، فإن هذه التطورات الأخيرة توصف بدقة أكبر كأمثلة على وظيفة الخصية "ex vivo" وتولد الحيوانات المنوية ، وظيفة الأنسجة التي تم الحفاظ عليها أو استئنافها عند إزالتها من جسم الكائن الحي. على الرغم من انتشارها في الأدب، على المدى الطويل صيانة الخلايا الجرثومية والتمايز داخل explants الخصية هو التحدي لتكرار14،,15،,16،,17،,18، وخاصة على مدى الأطر الزمنية طويلة بما يكفي لمراقبة كاملة في المختبر الحيوانات المنوية (~ 35 يوما في الفئران19 و 74 في البشر20). ومن المثير للاهتمام أن نقدر أن العديد من التحديات نفسها التي واجهتها قبل 100 سنة، لا تزال من ذوي الخبرة داخل الحيوانات المنوية السابقين vivo اليوم.
مختلفة عن النهج الجسم الحي السابق، والعضوية الخصية هي دي نوفو تجميعها microtissues ولدت تماما في المختبر من مصادر خلوية (أي الخلايا الخصية الأولية). توفر الخصية العضية استراتيجية مبتكرة للتحايل على الاعتماد التاريخي للحقل على الأنسجة المحلية الموجودة من قبل ، واختخيص بيولوجيا الخصية تمامًا في المختبر. هناك متطلبات متعددة مشتركة بين معظم نماذج الأنسجة العضوية; وتشمل هذه (1) في مورفولوجيا الأنسجة vivo-mimetic أو الهندسة المعمارية، (2) أنواع الخلايا الرئيسية المتعددة من الأنسجة الممثلة، (3) التجميع الذاتي أو التنظيم الذاتي في جيلهم، و (4) القدرة على محاكاة مستوى ما من وظيفة الأنسجة الممثلة وعلم وظائف الأعضاء21،,22،,23،,24. بالنسبة للخصيتين ، يمكن التقاط هذا في أربع علامات رئيسية: (1) إدراج أنواع خلايا الخصية الرئيسية ، الجرثومة، Sertoli، Leydig، peritubular، وغيرها من الخلايا الخلالية، (2) خلية موجهة الجمعية الأنسجة، (3) أنواع الخلايا المجزأة بشكل مناسب في مقصورات أنبوبي منفصلة (الجرثومة وSertoli) والمناطق الخلالي (جميع أنواع الخلايا الأخرى)، و (4) درجة ما من وظيفة الأنسجة (على سبيل المثال، إفراز هرمون أو استجابات الأنسجة، والحفاظ على الخلايا الجرثومية والتمايز). وبالنظر إلى التحديات التاريخية في الحفاظ على تمايز الخلايا الجرثومية السابقين في الجسم الحي وفي المختبر، فإن تلخيص في الهياكل الخصية المحنية -المحاكاة (أي الهياكل التي تشبه الأنابيب شبه المنيفيرة) مع علامات إضافية توحي بمحاكاة فسيولوجيا الخصية (على سبيل المثال، وظيفة الغدد الصماء)، هي معالم ذات أولوية نحو توليد الغدد الصماء التي قد تستمر يوماً ما في الحفاظ على تكوين الحيوانات المنوية في المختبر.
غالبية الأساليب العضوية الخصية المنشورة الاستفادة من ECM المتاحة تجاريا (مثل الكولاجين أو تركيبات ECM الملكية)25،26،27 أو ECMs حسب المصدر (أي، الخصيص decellularized الهيدروجين المستمدة من ECM)28،29،30. ECM خارجية يعزز تكوين الأنسجة دي نوفو من خلال توفير سقالة الجمعية داعمة لتوليد الأنسجة. وقد أتاحت أساليب ECM مستوى مثير للإعجاب من تكوين الأنسجة، بما في ذلك بعض وجود الخلايا الجرثومية ومورفولوجيا الأنسجة المحاكاة25،28. ومع ذلك، فإن ECMs التي يستخدمونها ليست متاحة دائماً عالمياً (أي هيدروجيلات مشتقة من ECM غير الخلوية)، وتتطلب بعض الطرق التوجهات المتطورة من الجل والخلايا البذر (مثل تدرجات 3 طبقات من ECM والطباعة ثلاثية الأبعاد)25و31,,و32. سقال طرق خالية (على سبيل المثال، معلقة قطرة ولوحات الثقافة nonadherent)33،34،35 كما ولدت organoids قوية وقابلة للاستنساخ للغاية دون الحاجة إلى المواد الهلامية ECM أو السقالات. ومع ذلك، فإن مورفولوجيا الأنسجة لهذه العضوية الخالية من السقالات غالباً ما تختلف عن الخصيتين الجسمية، ومعظم هذه التقارير تتضمن إضافة كيماوية بيولوجية ECM لتعزيز تكوين الأنسجة33،34،36، أو بدلاً من ذلك ، تعتمد على الطرد المركزي لتجميع الخلايا القسري وضغط34، مما يجعلها أقل مثالية لدراسة الهجرة الموجهة نحو الخلايا والتنظيم الذاتي.
تتضمن أساليب التوليد العضوية الأربعة المعروضة في هذه المخطوطة استراتيجيات مستقلة تعتمد على ECM، كل منها يستخدم البذر الخلوي البسيط الذي يتيح مراقبة التجميع الذاتي العضوي القائم على الخلية. يمكن تنفيذ التقنيات الأربعة جميعها من نفس التعليقات الخلوية أو يمكن أن تستفيد من مجموعات مخصصة ومخصبة من نوع الخلية. قوة هذه الطرق هي القدرة على مراقبة تجميع الأعضاء الذاتية في الوقت الحقيقي ، ومقارنة مباشرة كيف تتجمع الهياكل الخصية ذاتيا بين البيئة المجهرية المختلفة. وينبغي النظر في الاختلافات الظاهرية بين هذه الأساليب الثقافية الأربعة لتأثيرها على السؤال البحثي أو موضوع المحقق. وتنتج كل طريقة التركيبات البيولوجية أو الأعضاء في غضون 24 ساعة أو أقل. في الختام، فإن الأساليب المعروضة هنا توفر مجموعة من تقنيات التجميع العضوي لدراسة تجميع الخصية العضوية، وتطوير الأنسجة، وعلم وظائف الأعضاء الخصية في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على جميع تجارب الماوس لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة نورث وسترن، وتم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب بروتوكولات وافقت عليها اللجنة.
1. إعداد محلول الإنزيمي للتفكك الأنسجة
- استخدم حلين انزيميين مختلفين (الحل 1 والحل 2)، وكلاهما تم باستخدام حل متوسط للثقافة القاعدية (BM).
- لإعداد BM، أضف المصل والبنسلين-الستربتوميسين إلى الحد الأدنى من التركيزات المتوسطة الأساسية إلى النهائية من 10٪ و 1٪ على التوالي (انظر جدول المواد للكاشائب محددة). ثم تصفية معقمة BM من خلال مرشح 0.22 μm. قبل استخدامها مع الخلايا، قبل الإكسالات BM العقيمة إلى درجة ح ح محايدة عن طريق الاستغناء في طبق الثقافة ووضع داخل ترطيب، 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
ملاحظة: يمكن تخزين BM عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع، وبعد ذلك يجب إجراء BM جديدة. - لإعداد الكولاجين I حلول الأسهم، أولاً حل 100 ملغ من الكولاجيناز الأول في 1 مل من الجنين معقمة الصف H2O (التركيز النهائي 10٪ م / الخامس)، عكس أو دوامة إلى حل، وتخزين 20 ميكروغرام في -20 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. يجب أن تذوب Aliquots مرة واحدة فقط.
- لإعداد deoxyribonuclease I (DNase I) حلول الأسهم، إضافة 20 ملغ من DNase I إلى 1 مل من الجنين العقيم الصف H2O (التركيز النهائي 2٪ م / الخامس)، عكس أو دوامة إلى حل (لا دوامة)، وتخزين 20 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. يجب أن تذوب Aliquots مرة واحدة فقط.
- لحلول الأسهم hyaluronidase، إضافة 30 ملغ إلى 1 مل من الفوسفات العقيمة المخزنة المالحة (PBS؛ التركيز النهائي 3٪ م / الخامس hyaluronidase في PBS التي تحتوي على كا++/ Mg++)، عكس أو دوامة إلى حل، وتخزين 100 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. يمكن إذابة Aliquots وإعادة تجميدها عدة مرات دون فقدان النشاط الأنزيمي.
- لإعداد حل الانفصام 1، أضف 10 ميكرولتر كولاجيناز I و 10 ميكرولتر DNase I إلى 1 مل من BM العقيمة ، قبل التوازن (التركيزات النهائية: 1 ملغم / مل collagenase I و 5 ميكروغرام / مل DNase I). اِثر بلطف مع ماصة لخلط المحلول، و سخينة إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها مع الأنسجة.
ملاحظة: يتم إعداد الحل 2 عن طريق إضافة 33 ميكرولتر من الهيالورونيداسي (مسبقة الارهاد إلى 37 درجة مئوية) لكل 1 مل من الحل 1 ، (إلى تركيز نهائي قدره 1 ملغ / مل). يحدث هذا في منتصف الطريق من خلال انفصال انزيمي من أنسجة الخصية في الخطوة 2.5 أدناه.
2. Testis تفكك الأنسجة
ملاحظة: تم إيواء جميع الفئران داخل أقفاص البولي بروبلين وزودت بالطعام والماء الإعلاني libitum. تم تغذية الحيوانات بـ chow المشعة التي لا تحتوي على فيتويستروغنز. تم استخدام فئران CD-1 الأحداث، 5 أيام بعد الولادة (dpp)، لجميع التجارب ومخدر قبل القتل الرحيم وجمع الأنسجة، داخل غرفة التخدير المرفقة بمرذاذ isoflurane (2.5 لتر/دقيقة في O2). تم تأكيد الفئران للتخدير الكامل عن طريق عدم وجود استجابة لوخزة شبع، وبعد ذلك تم قتل الفئران عن طريق قطع الرأس.
- تخدير الفئران في غرفة isoflurane ، وضمان التخدير عن طريق وخزة أصابع ، ومن ثم قطع رأس الماوس باستخدام مقص حاد. وضع الماوس القتل الرحيم سوبين على حصيرة تشريح وتعقيم البطن مع 70٪ الإيثانول. خيمة جلد أسفل البطن مع ملقط وفتح البطن مع مقص.
- حدد مكان الخصية في المناطق الأربية السفلية اليسرى والأنية من البطن. قطع اتصالاتهم إلى vas deferens وأي نسيج الضام الرسو، ثم رفع الخصية بأكملها (مع epididymis لا تزال تعلق) من الحيوان. ضع الخصية في طبق بيتري من BM قبل التوازن.
- تحت مجهر تشريح وداخل حقل معقمة، وجعل شق صغير في albuginea tunica على نهاية واحدة من كل الخصية مع مقص microdissection الصغيرة أو عن طريق تمزيق بلطف باستخدام اثنين من ملقط غرامة.
- ثم, في حين عقد الخصية من الطرف الآخر من شق, ضغط بلطف الخصية مع ملقط غرامة ودفع في حركة كاسحة لطيف نحو ثقب في tunica; هذا سوف الافراج عن الأنسجة الخصية كما قطعة واحدة متماسكة.
- قطع الخصيات إلى قطع أصغر (≤ 2 مم3) ووضعها في 1 مل من قبل الدافئة (37 درجة مئوية) حل الانفصام 1.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- لأكثر من 10 الخصية، وزيادة إجمالي حجم حل تفكك بمقدار 1 مل، وضمان الحد الأدنى من 1 مل من حل تفكك لكل 10 الخصية (على سبيل المثال، 2 مل ل 20 الخصية، 3 مل ل30 الخصية، الخ).
- 310 بلطف القطع الخصية 50 مرة (50x) في الحل 1 باستخدام ماصة P1000. تأكد من أن الأنابيب منفصلة عن بعضها البعض وعن الأنسجة الخلالية في هذه المرحلة. إذا ظلت كتل، احتضان لمدة 5 دقائق إضافية وtriturate مرة أخرى (50x).
- إضافة 33 ميكرولتر من محلول الأسهم هيالورونيداز (قبل warmed عند 37 درجة مئوية، من الخطوة 1.5) لكل 1 مل من محلول 1 خليط الانفصام (الذي يحتوي على أنسجة الخصية و الأنابيب المنفصلة جزئيا). بعد إضافة هيالورونيداسي، وهذا ما يسمى الحل 2.
- Triturate (50x) باستخدام P1000 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- Triturate (50x) باستخدام ماصة P200.
- تأكد من أنه في هذه المرحلة لا توجد أنابيب مرئية أو كتل من الخلايا. إذا استمرت الكتل، حضن لمدة تصل إلى 5 دقائق أخرى، مع مزيد من التثابت باستخدام ماصة P200 (50x).
- إخماد الانزيمات تفكك بإضافة مصل الأبقار الجنين (FBS) إلى 10٪ من الحجم الإجمالي للحل 2. تُجرّد عدة مرات باستخدام ماصة P200 لضمان عدم بقاء الكتل، وتصفية مصفاة خلايا 40 ميكرومتر لإنتاج تعليق أحادي الخلية.
- خلايا الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 7 دقائق، والتخلص من افر، وإعادة تثبيت الخلايا في BM الطازجة.
- عد تركيزات الخلايا الكلية والقابلة للحياة باستخدام الاستبعاد الأزرق trypan على مقياس الدم. إضافة 10 μL من 1:1 المخفف، تعليق الخلية: trypan حل أزرق، في غرفة عد خلية قياس الهيموزية (انظر جدول المواد).
- خلايا إعادة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 7 دقائق وإعادة تعليق في BM الطازجة.
ملاحظة: استخدام الخلايا القابلة للتطبيق فقط لحساب تركيز الخلية ورقمها. فقط استخدام تعليق الخلايا من ≥ 80٪ قابلية البقاء لتوليد organoids. - إعداد تعليق الخلية واحدة في تركيزات الخلايا كما هو موضح من أجل aliquot 280،000 الخلايا نظرا للحجم المستخدمة في الخطوات المحددة بروتوكول أدناه في القسم 3: 2D ECM-Free – 0.56 x 106 الخلايا / مل، 2D ECM – 0.56 × 106 خلايا / مل, 3D ECM-Free – 4.66 x 106 خلايا/مل, 3D ECM – 2.8 x 106 خلايا/مل.
ملاحظة: تبدأ جميع التجارب الثقافية المعروضة هنا بـ 280,000 خلية مبذرة في الثقافة بشكل جيد. وتتطابق هذه الأرقام مع البيانات التمثيلية في الشكل 1والشكل 2 والشكل 3 والشكل 4.
- خلايا إعادة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 7 دقائق وإعادة تعليق في BM الطازجة.
3. إعداد أطباق الثقافة العضوية وبذر الخلايا
ملاحظة: لضمان ECM متجانسة، قبل ذوبان aliquots المجمدة من ECM بين عشية وضحاها قبل التجريب. يجب أن تكون مغمورة في شكل ثلج ECM داخل دلو من الثلج داخل ثلاجة 4 °C أو غرفة باردة لضمان زيادة بطيئة وتدرجية في درجة الحرارة. يتم استخدام جميع ECM في التخفيف النهائي 1:1 في BM للثقافة. الحفاظ على ذاب ECM و 1:1 ECM المخفف على الجليد حتى قبل الاستخدام مباشرة، وإلا قد ECM البلمرة قبل الأوان.
- بالنسبة لثقافة 2D ECM الخالية ، لا يلزم إعداد خاص ، تعليق خلية واحدة لوحة (500 ميكرولتر من 0.56 × 106 خلايا / مل في BM) مباشرة على 4 - شرائح الغرفة جيدا ، ووضع في حاضنة 35 درجة مئوية للثقافة.
ملاحظة: يجب أن تلتزم الخلايا إلى الجزء السفلي من طبق الثقافة داخل أول 24 h من الثقافة وقد يعرض بعض مجموعات الخلايا ثلاثية الأبعاد الصغيرة ضمن هذا الوقت نفسه. - لثقافة ECM 2D، الاستغناء 100 ميكرولتر من 1:1 الباردة المخففة مصفوفة الطابق السفلي خارج الخلية المتوسطة في شريحة غرفة 4 جيدا، وضمان هلام يغطي كامل من أسفل الطبق.
- ضع الشريحة في الغرفة في حاضنة 35 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة للسماح ECM بالتمرمر إلى هلام.
- إضافة تعليق الخلية (500 ميكرولتر من 0.56 × 106 الخلايا / مل في BM) مباشرة على الجزء العلوي من هلام 2D مرة واحدة وقد تمبل.
ملاحظة: يجب أن تتجمع الخلايا معاً لتشكل مجموعات صغيرة ثلاثية الأبعاد داخل أول 24 ساعة من الثقافة.
- لثقافة 3D ECM خالية، وإعداد أغاروز 3D طبق بيتري إدراج قبل البدء في ثقافة الخلية.
- أولاً، الأوتوكلاف 1.5 ز مسحوق أغاروز في 100 مل من الكأس، ثم إضافة 75 مل معقم، الماء المقطر والميكروويف لإنتاج أغاروز 2% المنصهر لطبق بيتري 3D الصب.
- داخل مساحة عمل معقمة، الاستغناء agarose المنصهر في قالب طبق بيتري 3D حتى الغضروف المفصلي هو مستوى مع الجانبين من القالب.
- السماح لأغاروز لتبرد وتتوطد. عندما الصلبة، بدوره القالب رأسا على عقب وثني بلطف مرارا وتكرارا حتى صحن agarose 3D بيتري يقع خالية من العفن.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن للمرء أن يعد العديد من أطباق agarose 3D بيتري وتخزينها في العقيمة H2O أو DPBS في 4 درجة مئوية لأكثر من شهر واحد. - قبل الاستزراع، ضع أطباق agarose 3D Petri في طبق ثقافة 24 جيدًا، واغطيها بـ 1 مل من BM. اسمحوا 3D بيتري أطباق موازين في BM لمدة 30 دقيقة على الأقل داخل 37 درجة مئوية حاضنة الثقافة. تجاهل BM، وكرر التوازن مرة أخرى مع BM 1 مل جديدة. بعد توازن أطباق 3D Petri في BM ، ستظهر بنفس لون BM (أي الوردي).
- للتحضير لبذر الخلايا، وإزالة جميع BM من البئر والاستغناء 200 ميكرولتر من BM الطازجة حولها، ولكن ليس داخل عطلة مركز طبق بيتري 3D. أيضا، جمع أي BM المتبقية من داخل مركز خلية البذر عطلة إدراج microwell.
- الاستغناء عن تعليق خلية واحدة (4.66 الخلايا / مل في 60 ميكرولتر من BM) في عطلة مركز من صحن agarose 3D بيتري. ثلاثية بلطف صعودا وهبوطا لخلط الخلايا وضمان تعليق خلية واحدة في بداية الثقافة.
- مكان في في حاضنة 35 درجة مئوية المرطبة للثقافة. في اليوم التالي، قم بإزالة 200 ميكرولتر من BM من حول إدراج الميكروويل، واستبدله بـ 1 مل من BM الطازجة. وهذا سيجلب مستوى السائل فوق مستوى إدراج، غمر الثقافة بأكملها.
- ببطء وبعناية إزالة / إضافة وسائل الإعلام من خارج صحن agarose 3D بيتري. كان ينبغي أن تكون الأجهزة مدمجة بين عشية وضحاها ، مما يسمح لهم بالراحة في القاع وتمكين التغييرات الإعلامية لترك organoids دون عائق.
- بالنسبة لثقافة ECM ثلاثية الأبعاد، قم بإعداد تعليق خلية واحد من خلال الجمع بين تعليق الخلية في أجزاء متساوية في BM مع ECM البارد المذاب مسبقًا (التركيز النهائي = 2.8 × 106 خلايا/مل).
- الاستغناء فورا الخلية ECM الخليط في 4 4 جيدا شريحة الغرفة، وضمان الخليط يغطي الجزء السفلي كله من لوحة.
- ضع شرائح الغرفة عند 35 درجة مئوية في حاضنة واسمح لمحتوياتها بالبليمرة. هذا يجب أن يستغرق 30 دقيقة على الأقل. بعد البلمرة، إضافة 500 ميكرولتر من BM على الجزء العلوي من الثقافة.
ملاحظة: يجب أن تتجمع الخلايا معًا لتشكيل مجاميع ثلاثية الأبعاد صغيرة داخل أول 24 ساعة من الثقافة.
4. صيانة الجهاز
- ثقافة جميع أنواع نموذج الجهاز في 35 درجة مئوية. لجميع أنواع الثقافة تبادل نصف وسائل الإعلام الخاصة بهم مع BM الطازجة كل 2 أيام. لضمان عدم جمع الأعضاء بطريق الخطأ أثناء تبادل الوسط ، وجمع الوسائط دائمًا ببطء من زاوية طبق شريحة الغرفة ، ومن نقطة خارجية خارج أطباق agarose 3D Petri. يمكن تخزين جميع الوسائط في -20 درجة مئوية للاستخدام مع المناعية أو غيرها من التحليلات في وقت لاحق (أي، الكم من الهرمونات التناسلية أو السيتوكينات السرية).
- بعد 7 أيام في الثقافة، واستخدام BM التي تحتوي على هرمون تحفيز بصيلات (التركيز النهائي 20 mIU/mL) وgonadotropin المشيمية الإنسان (التركيز النهائي 4.5 وحدة دولية / مل). وهذا ينطبق على جميع أنواع ثقافة الجهاز.
- صورة روتينية جميع الثقافات العضوية (أي، التصوير الفاصل الزمني) لتميز تشكيل organoid وتحديد مقاييس التجميع الذاتي، والتنمية، والنمو مع مرور الوقت.
5. جمع الجهاز العضوي
ملاحظة: يمكن إصلاح جميع الأعضاء مع 4٪ شبه شكلي في برنامج تلفزيوني للمناعة المصب والتحليلات النسيجية. قم بإصلاح 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الدوران، أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- بالنسبة للثقافات الخالية من ECM ثنائية الأبعاد ، قم أولاً بشطف العينة باستخدام برنامج تلفزيوني جديد ، ثم أضف التثبيت مباشرة فوق الثوابت الملتزم بها.
- ل ECM (2D و 3D) أساليب الثقافة، شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم إضافة إما مثبت مباشرة على الجزء العلوي من العينة ECM organoid (لإصلاح هلام ECM و organoids معا)، أو بدلا من ذلك، بلطف الماصات organoids صعودا وهبوطا لتحريرها من ECM المحيطة بها، ونقلها إلى أنبوب منفصل لتثبيت.
- لثقافة 3D ECM خالية، ماص بلطف organoids صعودا وهبوطا داخل عطلة مركز من صحن agarose 3D بيتري. هذا سوف طرد organoids من تسهيل جمعها سهلة مع ماصة. ثم نقل الأعضاء إلى أنبوب منفصل لتثبيت.
- قبل المعالجة في البارافين ، تضمين العديد من الأعضاء (≥ 20) داخل حجم صغير (~ 30 ميكرولتر) من هلام معالجة الأنسجة ؛ وهذا يساعد على توجيه وتركيز الأعضاء في منطقة صغيرة داخل كتل البارافين، مما يسهل المراقبة عند اقسام وأسهل البصرية في أقسام البارافين.
ملاحظة: يمكن أن يكون Organoids تحديا لتحديد بعد إدراج البارافين والقطع على microtome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واعتبر جيل العضوية غير ناجحة إذا لم الخلايا الخصية تجميع الذاتي داخل 72 ساعة من الثقافة، ومع ذلك، جميع الأساليب المعروضة هنا تجميع داخل 24 ساعة عند استخدام خلايا مورين الأحداث (5 ديسيبل). فشل بناء البيولوجية جيل قدم على أنه استمرار للخلايا علقت بحرية (0 عمود ح في الشكل 1)حتى بعد ثقافة ممتدة (72 ح). في غياب الأنسجة التجميع الذاتي، أي مجموعات الخلايا الظاهرة تفرق بسهولة في خلايا فردية حتى على التلاعب لطيف (أي، pipetting). وقد لوحظت في البداية الأنسجة التي تم إنشاؤها بنجاح كخلية ثلاثية الأبعاد "مجموعات" (الأسهم الصفراء في عمود 6 h من الشكل 1). ضمن بيئات ECM خالية (2D و 3D) ، ويبدو أن هذه الانشاءات واضحة "المدمجة" عبر أول 24 ساعة من الثقافة ، وخصوصا عندما في 3D agarose بيتري أطباق(الشكل 1ألف ، جيم). في بيئات ECM (2D و 3D) تمتلك مجموعات الخلايا هوامش واضحة بين الكتلة والبيئة المحيطة بها(الشكل 1B, D). ولوحظ أيضاً أن مجموعات الخلايا تنتقل عبر إدارة المحتوى في المؤسسة وأن تدمج معاً تشكيل مجموعات أكبر (الأسهم الحمراء في الشكل 1B). تم قياس الوقت اللازم لتقدير هياكل منفصلة ذاتية التجميع ، ولم يكن هناك فرق كبير في الوقت المطلوب بين كل من الشروط الخالية من 2D و 3D ECM و2D ECM ، ومع ذلك ، تتطلب ثقافة ECM 3D وقتًا أكبر لتجميع هياكل de novo من جميع طرق الثقافة الأخرى(الشكل 1E). ولدت ثقافة 2D ECM خالية و 3D ECM مجموعات الخلايا بأحجام أصغر بكثير من 2D ECM و 3D ECM- ثقافة الأساليب؛ أنتجت ثقافة 3D ECM خالية من أكبر المجموعات مع مجموعة واحدة كبيرة ومدمجة داخل كل بئر من 3D agarose بيتري طبق(الشكل 1C، F). وخلاصة القول، هذه البيانات توضح سهولة إنتاج الخصية التركيبات البيولوجية من الخلايا الأولية فأر الأحداث في أربع بيئات ثقافة الأركيولوجية وتسليط الضوء على مختلف الخلايا الموجهة التجميع الظاهرية داخل هذه البيئات ثقافة مختلفة.
هدف من كلّ نماذج عضويّة أن يُخّصّف داخليّة مورمورولوجيّة من نسيج أهليّ. لتقييم هذه النتيجة، كانت الانشاءات البيولوجية المجمعة داخل كل حالة من حالات الاستزراع مُزرعة لمدة 72 ساعة ثم تم فحصها لعلامات خاصة بالخلايا وتصورها مع الفلورا المناعية (الشكل 2). ولوحظ تقلب في مورفولوجيا الأنسجة بين أساليب مختلفة في مجال الثقافة. 2D ECM خالية organoids قدمت كتجمعات من خلايا Sertoli (SOX9 و βCatenin) مع بعض الخلايا الجرثومية (DDX4، علامة الخلية الجرثومية عموم) انضمت على رأس طبقة 2D القاعدية التي تحتوي على العديد من الخلايا الجسدية، بما في ذلك Sertoli، peritubular (αSMA)، وخلايا Leydig (3βHSD)(الشكل 2A-D). لاحظ أن الشكل 2B-D هي صور epifluorescent لكامل العينة 2D ECM خالية، وليس مقطع 5 ميكرومتر؛ وهذا يتيح التصور لكل من طبقة الخلية الجسدية القاعدية والمجاميع الموجهة متفوقة من Sertoli والخلايا الجرثومية. وعلى النقيض من ذلك، فإن ثقافة 2D ECM المقدمة مع نمط ظاهري مختلف إلى حد كبير، حيث أن الهياكل البيولوجية الواضحة ذات الحدود المتميزة كانت مُستشفاة بسهولة فوق جل ECM القاعدي(الشكل 2E). هذه الهياكل تمتلك مورفولوجيا داخلية معقدة مع تقسيم دي نوفو من الأنابيب مقابل أنواع الخلايا الخلالية من الخصية، وذلك اعتبرت organoids ناجحة. احتوت المناطق الأنبوبية على خلايا سيرتولي، والخلايا العضية والجرثومية، وكانت المناطق الخلالية تحتوي على Leydig والخلايا المحيطية والخلايا غير المسماة(الشكل 2F-H). وبالمثل ، 3D ECM خالية organoids تمتلك أيضا مورفولوجيا داخلية مجزأة ، وذلك اعتبرت organoids ناجحة. على وجه الخصوص، تم تمييز 3D ECM-organoids خالية من المناطق أنبوبي تحتوي على الخلايا المحيطة التي تتجه على وجه التحديد حول مجموعات من الخلايا الجرثومية والخلايا الجرثومية مع دقة عالية(الشكل 2I-L). لم تمتلك الهياكل المجمعة 3D ECM مورفولوجيا متطورة ، ولكن بدلا من ذلك لوحظ أن تكون مجموعات من خلايا سيرتولي ، مع الجرثومة في بعض الأحيان وخلايا Leydig. في هذه العينات، ظلت العديد من الخلايا Sertoli و un-labeled معلقة بين الأعضاء في اتجاه "ستروما مثل"(الشكل 2M-P). معا، وهذه البيانات تسليط الضوء على التباين في الأنماط الظاهرية المورفولوجية التي تنتج أساليب مختلفة توليد organoid وتدعم استخدام اثنين من بيئات محددة التجمع العضوي، 2D ECM و 3D ECM خالية، لتوليد organoids الخصية مع مورفولوجيا داخلية محاكاة عالية من تقسيم الخصية.
لمزيد من تقييم وظيفة الخصية العضوية، تم اختيار 3D ECM- الخالية من organoids العضوية لإجراء تحليل أعمق على المدى الطويل. لهذه الدراسة، كانت هذه organoids مثقف لمدة 14 يوما ومن ثم بحث عن علامات الخلية والهيكل محددة. عند تحليل الفلورسنت في 14 يوما، لوحظ 3D ECM خالية من الهياكل العضوية (TLS) وهندسة الأنسجة مشابهة بشكل ملحوظ في الخصيتين الجسمية(الشكل 3A-D). وكانت الخلايا الخلالية موجودة بشكل مناسب في مناطق منفصلة عن TLS. ثم تم فحص أقسام الأنسجة لعلامة الخلية الجرثومية عموم، DDX4، وعلامة الخلايا الجذعية المنوية، SALL4، وعلامة ميوسيس، SCP3 (الشكل 3E-G). لوحظت خلايا DDX4 إيجابية نادرة والخلايا الإيجابية SALL4، ومع ذلك، تم تحديد أي إشارة SCP3. بناء على توصيف أعمق من TLS، لوحظ أنها تحتوي على مساحة التجويف التي تظهر محاطة خلايا Sertoli المستقطبة و أحادية خارجية من الخلايا المحيطة(الشكل 3I-L). كما أظهرت خلايا سيرتولي تقاطعات ضيقة بين بعضها البعض، كما هو متصور مع المجهر الإلكترون انتقال ومع وضع العلامات ضد ZO-1، وهو بروتين تقاطعي ومكون من حاجز الخصية الدم(الشكل 3 H،L). بعد ذلك ، تمت دراسة 3D ECM - organoids وظيفة الغدد الصماء في 12 أسبوعا ، على المدى الطويل مع تحفيز gonadotropin(الشكل 4). التستوستيرون وinhibin B, الهرمونات الإنجابية من خلايا Leydig وSertoli على التوالي, تم تحديدها على حد سواء وكميا من المتوسطة مكيفة organoid(الشكل 4A). أكثر من 12 أسابيع من الثقافة, تم قياس كل من الهرمونات إلى الاستجابة بشكل كبير إلى مكملات من gonadotropins FSH وHCG (السهم الأحمر يدل على بداية مكملات, خلال الأسابيع 2 – 12). وعند الانتهاء، أُجري اختبار لتحديد ما إذا كان قد تم الحفاظ على استجابة الغدد الصماء. تمت إزالة Gonadotropins ل 48 ح, خلالها كل من التستوستيرون والتركيزات B inhibin انخفضت بشكل ملحوظ في التركيز. بعد 48 ح, عاد gonadotropins إلى الثقافة وكلا تركيزات هرمون زيادة كبيرة مرة أخرى على مدى 24 ح النهائي, مما يدل على السليم الغدد الصماء-الاستجابة (الشكل 4B). بشكل جماعي، هذه النتائج المقايسة الغدد الصماء والغدد الصماء تثبت أن الأعضاء الخصية هي نموذج مفيد لدراسة التنمية الخصية (أي، دي نوفو تقسيم وتولد الأنبوب) ووظيفة الخصية الخلوية الجسدية في المختبر (على سبيل المثال، تشكيل تقاطع ضيق ووظيفة الغدد الصماء).
الشكل 1: العضانية ذاتية التجمع في ظروف الثقافة 2D و 3D، ECM و ECM- خالية من الظروف.
تم استزراع خلايا الخصية 5 dpp في أربع حالات مختلفة: 2D ECM خالية (الصف A)،2D ECM (الصف B)،3D ECM خالية (الصف C)،و 3D ECM (الصف D). يتم توفير الرسومات التي تصور أسلوب الثقافة في العمود الأيسر. تم تجميع المونتاجات صورة تمثيلية من الصور الفاصلة بين الوقت التي تم التقاطها خلال الثقافة الحية. يتم تسمية نقاط الوقت لكل صورة في الهامش العلوي. الوقت 0 ح هو قبل أي الجمعية organoid قد حدث، والوقت 3 ح هو خلال الجمعية العضوية المستمرة التي تحركها الخلية، ومرات 6 ح و 9 ح إظهار تمثيلي، تشكيلها بنجاح organoids. الأسهم الصفراء علامة كتل الخلايا والأسهم الحمراء علامة المواقع حيث مجموعات الخلايا منفصلة ترحيل واندمجت معا. تم تسجيل جميع أشرطة المقياس = 1 مم (E) الوقت المطلوب قبل مجموعات الخلايا المنفصلة يمكن أن تكون موضع تقدير واضح لكل حالة. 2DF = 2D ECM خالية؛ 2DE = 2D ECM؛ 3DF = 3D ECM خالية؛ 3DE = 3D ECM. (F) تم قياس المساحة لكل مجموعة لكل حالة من شروط الثقافة. تم اختيار الصور من n = 3 - 5 تجارب منفصلة. ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار مقارنات Multi من Toey تم استخدامه لتحديد الأهمية في 1E و 1F. تم تجميع الرسوم البيانية من وسائل n = 4 تجارب منفصلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من ادموندز وودروف37. © نشر IOP. مستنسخة بإذن. جميع الحقوق محفوظة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: 2D ECM و 3D ECM- organoids مُزَلَّمة مُزْرِجة تَظهر تقسيم أنواع الخلايا الأنبوبية والخلوية.
ممثل brightfield وصور مناعية من organoids تجميعها ذاتيا بعد 72 ساعة من الثقافة. تم تصوير عينات 2D ECM خالية من جبل كامل، وصورت جميع العينات الأخرى في 5 μm أقسام الأنسجة. (A – D) ثقافة 2D ECM خالية. (E– H) ثقافة ECM 2D. (I– L) 3D ECM خالية من الثقافة. (M – P) ثقافة 3D ECM. علامات الخلية الخاصة المستخدمة للتحليل هي التي تحمل علامة على الهامش العلوي: نواة الخلية Sertoli (SOX9) و أجسام الخلايا (βCatenin)، والخلايا الجرثومية (DDX4، وعلامة الخلية الجرثومية عموم)، خلايا Leydig (3βHSD)، والخلايا اضموري (αSMA). وكانت جميع عينات الفلورسنت ملطخة بالحمض النووي مع DAPI. تشير الأسهم الصفراء إلى الخلايا الجرثومية التي تحمل علامة DDX4 في العمود الثاني من اليسار، وتشير الأسهم الحمراء إلى مجموعات خلايا Sertoli في العمودين الأيمنين. أشرطة مقياس المجال الساطع = 400 ميكرومتر، أشرطة مقياس الفلورسنت = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من ادموندز وودروف37. © نشر IOP. مستنسخة بإذن. جميع الحقوق محفوظة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يطور العضيات هياكل تشبه الأنابيب مأهولة بخلايا جرثومية نادرة.
3D-ECM- خالية من organoids المجمعة كانت مثقفة لمدة 14 يوما. (أ - د) النائب H & E والصور المناعية التي تفصل أنواع الخلايا وخصائص الأنسجة حول الهياكل الشبيهة بالانبوب (TLS); ويصور نفس الجهاز في أقسام الأنسجة المجاورة التي تمكن من المقارنة جنبا إلى جنب من الميزات المورفولوجية: خلايا Leydig (3βHSD), الخلايا المحيطة (αSMA), أجسام خلايا سيرتولي (βCatenin), الكولاجين الكولاجين (COL IV), ونيوية الخلايا Sertoli (SOX9); أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. (E – G) تم وضع العلامات المناعية ضد الخلايا الجرثومية، بما في ذلك علامة الخلية الجرثومية عموم (DDX4)، وعلامة الخلايا الجذعية المنوية (SALL4) والحيوانات المنوية النشطة meiotically (SCP3). يتم تحديد الألواح الداخلية المكبرة للغاية بواسطة الألواح الصفراء في 3E و 3F. تشير المثلثات الخضراء إلى خلايا مسمّاة DDX4؛ تشير الأسهم الحمراء إلى الخلايا المسماة بـ SALL4. (H) الإرسال التمثيلي للإلكترونات الدقيقة (TEM) من تقاطع ضيق بين خلايا سيرتولي داخل الجهاز؛ مقياس TEM شريط = 100 نانومتر. (I – L) ارتفاع تكبير الصور التمثيلية ل TLS المسمى للميزات الرئيسية للظهارة شبهiferous بما في ذلك تقاطعات ضيقة (ZO1) وlaminin. ويصور نفس TLS في أقسام الأنسجة المجاورة في لوحات I – L. وكانت جميع عينات الفلورسنت ملطخة بالحمض النووي مع DAPI. تم اختيار الصور من n = 7 تجارب بيولوجية منفصلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من ادموندز وودروف37. © نشر IOP. مستنسخة بإذن. جميع الحقوق محفوظة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: Organoids إفراز التستوستيرون وinhibin B أكثر من 12 أسبوعا من الثقافة ردا على gonadotropins FSH وHCG.
تم قياس الوسائط المكيفة التي تم جمعها من الأعضاء الخالية من 3D-ECM للتشرمون وتستوستيرون inhibin B عن طريق مقايسة المناعة المرتبطة بالانزيم (ELISA). (A)تم استزراع العضيات لمدة اثني عشر أسبوعاً، مع مكملات FSH وHCG خلال الأسابيع 2 – 12 (بداية المكملات معلمة بسهم أحمر على المحور x)؛ تمت مقارنة جميع القيم باليوم 7 من الثقافة للاختبارات الإحصائية. (ب) الرسم البياني المكبرة من "اختبار إعادة التحفيز" لتحديد ما إذا كان تم الحفاظ على استجابة الغدد الصماء بعد 12 أسبوعا. يتم تحديد فترة الاختبار بواسطة المربع الرمادي في 4A. عند الانتهاء من 12 أسابيع في الثقافة، تمت إزالة gonadotropins لمدة 48 ساعة ومن ثم إعادة تكملة ل24 ساعة النهائي من الثقافة. تم قياس الهرمونات في 0, 2, 6, 12, و 24 ح بعد gonadotropin إعادة التحفيز; المناطق ذات التظليل الأحمر تحدد فترات زمنية أثناء الثقافة مع FSH وhCG، و المناطق غير المظللة تحدد فترات زمنية بدون FSH وhCG؛ لاحظ ف القيم هي نسبة إلى 2 ساعة بعد إعادة التحفيز. تم استخدام ANOVA ذات الاتجاهين مع اختبار تووكي المتعدد للمقارنة لتحديد أهمية جميع بيانات الغدد الصماء ، n = 5 تجارب بيولوجية منفصلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من ادموندز وودروف37. © نشر IOP. مستنسخة بإذن. جميع الحقوق محفوظة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع الانتهاء من هذا البروتوكول الجيل العضوي، سيكون للمستخدم أربع تقنيات ثقافة مختلفة متاحة لهم لتجميع التشييد الخصية و organoids في أي ECM أو ECM-البيئات الخالية من. الأهم من ذلك، جميع الأساليب الأربع تسمح للباحث لمراقبة غير الغازية التجميع الذاتي organoid مع مرور الوقت من خلال التصوير الفاصل الزمني أو تسجيل الفيديو، وجمع وسائل الإعلام غير مشروط غير الباضعة لتحليل الهرمونات السرية والسيكوكاينات، دون إزعاج الأنسجة خلال الثقافة. في جميع الأساليب، على مدى 24 ح، يمكن للمجرب توليد ما يصل إلى عدة مئات من العضية / الخصية الانشاءات، كما تسمح أرقام الخلايا. هذه الأساليب تعزيز الأنسجة الذاتي التجمع في بنيات مع أحجام مختلفة ومورفولولوجي; يعتمد حجم الجهاز على عدد الخلايا والتركيز المستخدم في الثقافة ، كما هو الحال في تقارير organoid الأخرى34. قد يساعد تقليل حجم أو قطر الجهاز العضوي في تقليل تطور المناطق الداخلية من النخر والتي تكون في بعض الأحيان في الأعضاء الأكبر. وهناك قوة خاصة من 2D ECM و3D ECM وسائل بروتوكول خالية من قدرتها على توليد الخصية الخصية المحاكاة شكليا، التي تحتوي على دي نوفو تقسيم من أنواع الخلايا الأنبوبية مقابل الخلالي. وعلاوة على ذلك، 3D ECM خالية من الأجهزة المجمعة توفير نموذج لتي نوفو tubulogenesis من TLS شبهiferous، مع تقسيم مناسب وتوجه Sertoli والخلايا peritubular. هذا هو نوع ظاهري مهم لدراسة الخصية organoids, ولا يزال نتيجة متغيرة بين مختلف تقارير الخصية organoid; تقارير أخرى متعددة تفتقر الأنابيب مقابل تقسيم الخلالصال وبعض حتى تطوير "أنبوب من الداخل إلى الخارج" النمط الظاهري32,33,34,38. في حين أن أيا من أساليب توليد الأعضاء المعروضة في هذه المخطوطة كانت تتميز بالحفاظ على مجموعات كبيرة من الخلايا الجرثومية على مدى أيام طويلة من الثقافة، حيث نادراً ما لوحظت الخلايا الجرثومية في وقت مبكر من 72 ساعة، فإن كلاً من الأساليب الخالية من ECM 2D و 3D ECM قد توفر أداة مفيدة لدراسة تكوين الأنابيب في المختبر ومكون الخلايا الجسدية في بيئة متخصصة في الحيوانات المنوية. مع هذا الهدف في الاعتبار، والأجهزة الخصية توفير منصة محتملة لتحسين بروتوكولات المستقبل لتحسين في المختبر الجراثيم صيانة الخلايا الجذعية، والتقدم meiotic، والتمايز.
ميزة أخرى لهذه البروتوكولات هي القدرة على تخصيص ومقياس توليد الأعضاء. يمكن تخصيص، والمخدرات المعالجة، أو هندسة مجموعات الخلايا استبدال، أو يمكن استخدامها بالإضافة إلى، الخلايا الخصية الماوس الأولية37. إذا كان تعليق الخلايا من صلاحية منخفضة (<80 %)، ينبغي اتخاذ أساليب لتحسين صلاحية الخلية من التعليق الخلوي. ويمكن أن تشمل هذه تقليل الوقت الذي يقضيه في وسائل الإعلام الانفصام والتقليل من التثاقل أثناء هضم الأنسجة (الخطوات 2.4.1 - 2.5.2)، وزيادة عدد يغسل بعد تفكك، أو إزالة الخلايا الميتة بعد فصل مع خلية الفرز أو مجموعات وضع العلامات الخلية الميتة. ومع ذلك، لم تكن أي من هذه الخطوات ضرورية لإنتاج البيانات التمثيلية المشتركة في هذا التقرير. بالنسبة لأساليب ثقافة 2D و 3D ECM ، يمكن استخدام هذه البروتوكولات مع مصفوفات حيوية هيكلية أخرى تعتمد على البروتين بالإضافة إلى تلك المستخدمة للدراسات المعروضة هنا. وتشمل هذه المواد الحيوية الأخرى الكولاجين، الجيلاتين، مستخلصات ECM المتاحة تجاريا، والهيدروجيل المستمدة من ECM المصنوعة خصيصا25،26،28. هناك عدد قليل من المؤشرات لالمتاعب اطلاق النار ECM هلام الاستغناء وخلق عالية الجودة agarose 3D بتري إدراج طبق. عند صب المواد الهلامية ECM على لوحات الغرفة، تأكد من العمل بسرعة واستخدام نصائح ماصة باردة لمنع البلمرة السابقة لأوانها من ECM داخل أنبوب أو تلميح ماصة قبل الاستغناء في طبق الثقافة. عند صب agarose المنصهر في قوالب طبق بيتري 3D (لثقافة 3D ECM خالية)، استخدم فقط أجاروروز الساخنة وغير الدافئة لضمان الصب عالية الجودة من إدراج مع الحد الأدنى من الاختلاف، والتحقق من أن agarose قد بردت تماما إلى درجة حرارة الغرفة وتوطدت قبل محاولة إزالة من القالب. يتم التعامل مع أطباق Agarose 3D Petri بشكل أفضل بلطف مع ملقط غرامة. عند جمع الأعضاء لتثبيت، تأكد من العمل تحت مجهر تشريح لتصور جمع جميع organoids. Organoids يمكن التمسك الجانب البلاستيك من الأطباق والثقافة وداخل نصائح ماصة; الماصات الزجاج معرض أقل التزام organoid من البلاستيك. تحديد organoids في حين لا تزال مغلفة داخل أو على رأس ECM هو عملية أكثر تحديا وحساسة من إزالتها من ECM قبل التثبيت. يمكن أن يلقي هلام معالجة الأنسجة فوق بناء ECM organoid قبل إزالتها من غرفة الثقافة للمساعدة في تعزيز هلام قبل التثبيت39. وينبغي أن يتم التثبيت في درجة حرارة الغرفة لاسترداد هيدروجيلات ECM كما أنها من المرجح أن دي-بلمرة إذا خفضت إلى 4 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، 0.1 ٪ - 1.0 ٪ من الجلوتارالدهيد يمكن أن تضاف إلى 4 ٪ PFA الحل للمساعدة في مزيد من ربط عبر ECM؛ ومع ذلك، يزيد هذا الأسلوب autofluorescence الخلفية من العينة.
وهناك قيود كبيرة خاصة بالخلايا الجرثومية على النتائج التي حققتها أساليب التوليد العضوي المعروضة أعلاه، والتي تمثل مجالات ذات أولوية للابتكار في المستقبل. والخلايا الجرثومية لا تحظى بدعم جيد على امتداد الثقافات الممتدة، ولا يُلاحظ سوى بسهولة خلال الأيام القليلة الأولى من الثقافة، ونادراً ما تُلاحظ بنهاية الأسبوع الأول من الثقافة وفي وقت لاحق. في حين يمكن الحفاظ على الحيوانات المنوية غير المتمايزة داخل ثقافة الخلايا المختبرية مع الحفاظ على قدرتها على استعادة تكوين الحيوانات المنوية عند زرعها في الأنابيب الحية40، فإن البيئة الدقيقة الأنبوبية الجسدية (أي ، تفاعلات مباشرة الخلية Sertoli) هو افتراض أن يكون شرطا مسبقا للتمييز الخلايا الجرثومية قبل ال meiotic في و من خلال meiosis والحيوانات المنوية في المختبر1,5,40,41. قد تمكن الأعضاء الخصية التي تحتوي على الحيوانات المنوية في وقت مبكر من نقطة داخل TLS مُمَيّة من الناحية الهيكلية المجال من دراسة التفاعلات الخلوية الجسدية الجسدية والجرثومية وغير الجسدية تمامًا في المختبر. تحسين الإضافات وسائل الإعلام وإعداد الخلايا قبل الثقافة (على سبيل المثال، دمج العوامل المستخدمة في زرع الخلايا الجذعية المنوية في المختبر)42،43 قد تزيد من العائد من الخلايا الجرثومية في الدراسات المستقبلية، وخاصة على مدى فترات الثقافة أطول من عدة أيام. عكسيا، طرق إعادة إدخال spermatogonia بعد TLS قد شكلت، مثل عن طريق الحقن المجهري، تشكل فرصة مثيرة للاهتمام لاستعادة الخلايا الجرثومية داخل organoids، واختبار قدرة في المختبر البيئات الجسدية المنظمة للحفاظ على الخلايا الجرثومية. وقد لوحظت عوامل بيولوجية أخرى تؤثر على ثقافة explant الجسم الحي السابق ، بما في ذلك العمر / النضج45 والاختلافات في الخلفية الوراثية17. هذه المتغيرات نفسها لم يتم بعد التحقيق مباشرة داخل مجال البيولوجيا الخصية organoid. ومع ذلك، فمن المعقول أن يحدث اختلاف في التركيبة، والمورفولوجيا، والأنماط الظاهرية الوظيفية عندما تتولد الأجهزة من خلايا معزولة عن الحيوانات التي تشيخ بشكل مختلف (أي حديثي الولادة، أو الأحداث، أو البالغين)، أو ذات خلفية جينية مختلفة (مثل سلالات ماوس مختلفة).
باختصار، توفر التقنيات المشتركة في هذه المخطوطة أربعة نماذج مفيدة لدراسة بناء الخصية التي تحركها الخلية، وهي توليد نموذجين عضويين منفصلين من الخصية الميولوجية الهيكلية، والإنجاز الهام لتطوير TLS ووظيفة الغدد الصماء المستجيبة للهرمونات في المختبر. وتشمل هذه النماذج التوجهات المكانية 2D و 3D في ECM و ECM-البيئات مع الحد الأدنى معقدة، وسائل الإعلام الثقافة المعرفة تماما. كل أسلوب هو القابلة لإعادة إنتاج عالية ويستخدم فقط موارد الثقافة المتوفرة بشكل شائع. قد تكون هذه الأساليب مفيدة لدراسة تكوين الخصية في المختبر وتحسين ظروف الثقافة المستقبلية لنشأة الحيوانات المنوية في المختبر. أكثر من ذلك، 2D ECM و 3D ECM-الأساليب الخالية توفر أداة جديدة لدراسة عملية تقسيم الأنسجة دي نوفو فريدة من نوعها إلى الخصية، في tubulogenesis المختبر، وتفاعلات الخلايا الجسدية الجسدية والجرثومية الجرثومية. توفر الخصية العضوية فرصة مرنة وقابلة للتطوير للتحقيق في تطوير وتنظيم السمات الفسيولوجية للخصية الجسدية؛ بما في ذلك حاجز الخصية الدموية وإنتاج الغدد الصماء والاستجابة؛ وأيضا، أداة مفيدة لتطوير الجيل التالي نماذج الأنسجة البحثية الترجمية. وتشمل هذه دمج الهرمونات الإنجابية في نماذج أكبر على مستوى النظم، مثل الأنسجة على رقاقة ومنصات علم وظائف الأعضاء الدقيقة45،46. وتشمل الأهداف الأخرى التي يمكن أن تطبق نحوها الخصية العضوية في يوم من الأيام السمية الإنجابية واختبار الحواجز المناعية، وتطوير وسائل منع الحمل من الذكور، والمساعدة في ابتكار تكنولوجيا الإنجاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) F31 HD089693، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية / المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمية (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 و4UH3ES029073-03، وSessed.000.03 توماس ج. واتكين.
الكتاب يود أن أشكر اريك و. روث لمساعدتهم في المجهر الإلكترون انتقال. وقد استفاد هذا العمل من مرفق BioCryo التابع لمركز جامعة نورث وسترنللعلوم والتكنولوجيات النووية (NUANCE) التابع لجامعة نورث وسترن، الذي تلقى الدعم من الموارد التجريبية لتكنولوجيا النانو (SHyNE) (NSF ECCS-1542205)؛ برنامج MRSEC (NSF DMR-1720139) في مركز أبحاث المواد؛ المعهد الدولي لتكنولوجيا النانو (IIN)؛ وولاية إلينوي، من خلال IIN. كما استخدمت معدات CryoCluster، التي تلقت الدعم من برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي (NSF DMR-1229693). تم تصميم الرسومات في الشكل 1 باستخدام BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
