Summary
Aquí, se describen cuatro métodos para generar organoides testiculares a partir de células testiculares murinas neonatales primarias, es decir, matriz extracelular (ECM) y entornos de cultivo 2D y 3D libres de ECM. Estas técnicas tienen múltiples aplicaciones de investigación y son especialmente útiles para el estudio del desarrollo testicular y la fisiología in vitro.
Abstract
Los organoides testiculares proporcionan una herramienta para estudiar el desarrollo testicular, espermatogénesis, y la endocrinología in vitro. Se han desarrollado varios métodos para crear organoides testiculares. Muchos de estos métodos se basan en la matriz extracelular (ECM) para promover el ensamblaje de tejido de novo, sin embargo, hay diferencias entre los métodos en términos de morfología biomimética y función de los tejidos. Además, hay pocas comparaciones directas de métodos publicados. Aquí, se hace una comparación directa mediante el estudio de las diferencias en los protocolos de generación de organoides, con los resultados proporcionados. Se describen cuatro métodos de generación arquetípica: (1) 2D sin ECM, (2) ECM 2D, (3) sin ECM 3D y (4) se describe la referencia cultural 3D ECM. Se utilizaron tres puntos de referencia primarios para evaluar la generación de organoides testiculares. Se trata de autoensamble celular, inclusión de los principales tipos celulares (Sertoli, Leydig, germen y células peritubulares), y arquitectura de tejido compartimentada adecuadamente. De los cuatro entornos probados, los cultivos libres de ECM 2D y ECM 3D generaron organoides con morfologías internas más similares a los testículos nativos, incluyendo la compartimentación de novo de los tipos de células tubulares frente a intersticiales, el desarrollo de estructuras similares a los tubulos y una función endocrina establecida a largo plazo. Todos los métodos estudiados utilizaron suspensión de células testiculares murinas primarias no ordenadas y utilizaron recursos de cultivo comúnmente accesibles. Estas técnicas de generación de organoides testiculares proporcionan un conjunto de herramientas altamente accesible y reproducible para iniciativas de investigación en organogénesis testicular y fisiología in vitro.
Introduction
Los organoides testiculares son una técnica pionera para el estudio del desarrollo testicular, la espermatogénesis y la fisiología in vitro1,2,3,4. Se han explorado varios métodos para la generación de organoides; estos incluyen una variedad de sistemas de cultivo libre de ECM y matriz extracelular (ECM), tanto en orientaciones bidimensionales (2D) como tridimensionales (3D). Diferentes métodos de generación pueden promover estrategias de ensamblaje celular distintas; esto da como resultado un alto nivel de variabilidad morfológica y funcional entre los modelos organoides publicados. El propósito de este artículo es discutir el estado actual de los modelos testiculares in vitro, y servir como una plantilla para futuros investigadores, al diseñar experimentos organoides testiculares. Dentro del presente estudio, se definen y caracterizan cuatro arquetipos diferentes del sistema de cultivo en el proceso experimental y el resultado biológico. Estos incluyen: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, y 3D ECM métodos de referencia cultural. Las estrategias presentadas en el presente documento pretenden ser sencillas, accesibles y altamente reproducibles entre diferentes laboratorios y grupos de investigación.
Históricamente para los testículos, la designación "in vitro", se ha utilizado para varios métodos de cultivo diferentes de tejidos testiculares y células. Estos incluyen métodos de cultivo de tejidos/órganos organotípicos (es decir, cultivo de explantes)5, cultivo aislado de tubulos semíferos6,cultivo celular testicular7, y métodos de morfogénesis de tejido de novo (es decir, construcciones biológicas y organoides)1. Las primeras investigaciones sobre espermatogénesis in vitro se realizaron hace aproximadamente 100 años, con el cultivo de conejo testis explants en 19208,y más tarde en 1937 con explantes de ratón9. Dentro de estos experimentos iniciales se observó que la espermatogonia degeneraba en gran medida a lo largo de la primera semana de cultivo, aunque se identificaron algunas células meiotically diferenciadoras. Reminiscente de estos informes históricos, el cultivo de explant testis fue revivido y optimizado en 2011 para convertirse en una técnica factible para el estudio de los testis10. Desde 2011, el cultivo de explant ha producido espermatozoides competentes para la fertilidad en múltiples informes11,12,13. Sin embargo, debido a la dependencia del cultivo explantado de los túbulos nativos preexistentes, estos avances recientes se describen con mayor precisión como ejemplos de función testicular "ex vivo" y espermatogénesis, función tisular que se mantuvo o se reanudó al extraerse del cuerpo de un organismo. A pesar de su prevalencia en la literatura, el mantenimiento y la diferenciación de células germinales a largo plazo dentro de los explantes testiculares es difícil replicar14,15,16,17,18, especialmente en los períodos de tiempo suficiente para observar completamente la espermatogénesis in vitro (35 días en ratones19 y 74 en humanos20).18 Es intrigante apreciar que muchos de los mismos desafíos experimentados hace 100 años, todavía se experimentan dentro de la espermatogénesis ex vivo hoy en día.
Diferentes de los enfoques ex vivo, los organoides testiculares son microtiss ensambladas de novo generadas enteramente in vitro a partir de fuentes celulares (es decir, células testiculares primarias). Los organoides testiculares proporcionan una estrategia creativa para eludir la dependencia histórica del campo del tejido nativo preexistente, y para recapitular la biología testicular completamente in vitro. Hay múltiples requisitos compartidos por la mayoría de los modelos de tejido organoides; estos incluyen (1) morfología o arquitectura de tejido in vivo-mimético, (2) múltiples tipos celulares principales del tejido representado, (3) autoensamble o auto-organización en su generación, y (4) la capacidad de simular algún nivel de la función del tejido representado y la fisiología21,,22,,23,,24. Para los testículos, esto se puede capturar en cuatro señas de identidad principales: (1) la inclusión de los principales tipos de células testiculares, germen, Sertoli, Leydig, células peritubulares y otras células intersticiales, (2) conjunto de tejidos dirigidos por células, (3) tipos de células adecuadamente compartimentadas en compartimentos tubulares separados (germen y sertoli) y regiones intersticiales (todos los demás tipos de células), y (4) cierto grado de función tisular (por ejemplo, secreción de hormonas reproductivas o respuestas de tejidos, y mantenimiento y diferenciación de células germinales). Teniendo en cuenta los desafíos históricos en el mantenimiento de la diferenciación de células germinales ex vivo e in vitro, la recapitulación de arquitecturas testiculares in vivo-miméticas (es decir, estructuras que se asemejan a túbulos seminíferos) con marcadores adicionales que sugieren la simulación de la fisiología testicular (por ejemplo, función endocrina), son hitos prioritarios hacia la generación de organoides que algún día podrían sostener espermatogénesis in vitro.
La mayoría de los métodos organoides testiculares publicados aprovechan el ECM disponible comercialmente (por ejemplo, formulaciones de colágeno o ECM patentadas)25,26,27 o ECM de origen personalizado (es decir, testículos decelularizados hidrogeles derivados de ECM)28,,29,30. El ECM exógeno promueve la formación de tejido de novo proporcionando un andamio de apoyo al ensamblaje para la generación de tejidos. Los métodos de ECM han dado un nivel impresionante de formación de tejidos, incluyendo cierta presencia de células germinales y morfología de los tejidos miméticos25,,28. Sin embargo, los ECM que utilizan no siempre están disponibles universalmente (es decir, hidrogeles descelularizados derivados de ECM), y algunos métodos requieren sofisticadas orientaciones de siembra de gel y células (por ejemplo, gradientes de 3 capas de ECM e impresión 3D)25,,31,,32. Los métodos libres de andamios (por ejemplo, gota colgante y placas de cultivo no adherentes)33,34,35 también han generado organoides robustos y altamente reproducibles sin necesidad de geles ECM o andamios. Sin embargo, la morfología tisular de estos organoides libres de andamios es a menudo diferente a los testículos in vivo, y la mayoría de estos informes incorporan un aditivo ECM bioquímico para promover la formación de tejidos33,,34,36, o alternativamente, dependen de la centrifugación para la agregación de células forzadas y la compactación34,haciéndolos menos ideales para el estudio de la migración dirigida por células y la autoorganización.
Los cuatro métodos de generación de organoides presentados en este manuscrito incluyen estrategias tanto dependientes de ECM como estrategias independientes, cada una de las dos utilizando una simple siembra celular que permite la observación del autoensamble organoide impulsado por células. Las cuatro técnicas se pueden realizar desde las mismas suspensiones celulares o pueden hacer uso de poblaciones personalizadas y enriquecidas de tipo celular. Una fuerza de estos métodos es la capacidad de observar organoides autoensamblados en tiempo real, y comparar directamente cómo las estructuras testiculares se autoensamblan entre diferentes microambientes de cultivo. Las diferencias fenotípicas entre estos cuatro métodos de cultivo deben ser consideradas por su impacto en la cuestión de investigación o sujeto del investigador. Cada método produce construcciones biológicas u organoides dentro de 24 h o menos. En conclusión, los métodos presentados aquí proporcionan un conjunto de herramientas de técnicas de ensamblaje organoides para el estudio del ensamblaje organoide testicular, desarrollo de tejidos y fisiología testicular in vitro.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Northwestern, y todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por la CICIC.
1. Preparación de soluciones enzimáticas de disociación tisular
- Utilice dos soluciones enzimáticas diferentes (Solución 1 y Solución 2), ambas realizadas con una solución de medio de cultivo basal (BM).
- Para preparar BM, añada suero y penicilina-estreptomicina a concentraciones mínimas esenciales de medio a final del 10% y del 1% respectivamente (ver Tabla de materiales para reactivos específicos). A continuación, el filtro estéril del BM a través de un filtro de 0,22 m. Antes de su uso con células, preequilebra BM estéril a un pH neutro dispensando en un plato de cultivo y colocándolo dentro de una incubadora humidificada de 5% deCO2 a 37oC durante un mínimo de 1 h.
NOTA: BM se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana, después de lo cual se debe hacer BM fresco. - Para preparar la colagenasa I soluciones de stock, primero disolver 100 mg de colagenasa I en 1 ml de embrión estéril grado H2O (concentración final 10% m/v), invertir o remolino para disolver, y almacenar 20 l alícuotas a -20 oC para su uso posterior. Las alícuotas deben descongelarse una sola vez.
- Para preparar soluciones de stock de desoxirribonucleasa I (DNase I), añada 20 mg de DNase I en 1 ml de embrión estéril grado H2O (concentración final 2% m/v), invertir o girar para disolver (no vórtice), y almacenar 20 l alícuotas a -20 oC para su uso posterior. Las alícuotas deben descongelarse una sola vez.
- Para soluciones de hialuronidasa, añadir 30 mg en 1 ml de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS; concentración final 3% m/v hialuronidasa en PBS que contenga Ca++/Mg++), invertir o girar para disolver, y almacenar 100 alícuotas alícuotas a -20 oC para su uso posterior. Las alícuotas se pueden descongelar y volver a congelar varias veces sin pérdida de actividad enzimática.
- Para preparar la disociación Solución 1, añadir 10 l de colagenasa I y 10 l DNase I en 1 ml de BM estéril, preequilibrada (Concentraciones finales: 1 mg/ml de colagenasa I y 5 g/ml de DNase I). Triturar suavemente con una pipeta para mezclar la solución, y precalentó a 37 oC antes de su uso con el tejido.
NOTA: La solución 2 se prepara añadiendo 33 l de hialuronidasa (preadvertida a 37 oC) por 1 ml de la solución 1 (a una concentración final de 1 mg/ml). Esto ocurre a mitad de la vía a través de la disociación enzimática del tejido testículo en el paso 2.5 a continuación.
2. Disociación de tejido Testis
NOTA: Todos los ratones fueron alojados en jaulas de polipropileno y provistos de alimentos y agua ad libitum. Los animales fueron alimentados con comida irradiada que no contiene fitoestrógenos. Los ratones JUVENILEs CD-1, 5 días después del parto (dpp), se utilizaron para todos los experimentos y se anestesiaron antes de la eutanasia y la recolección de tejidos, dentro de una cámara de anestesia unida a un vaporizador de isoflurano (2,5 L/min en O2). Los ratones fueron confirmados para anestesia completa a través de la ausencia de una respuesta a la punción del dedo del pie, después de lo cual los ratones fueron eutanasiados por decapitación.
- Anesthetizar ratones en una cámara de isoflurano, asegurar la anestesia a través de un pinchazo del dedo del pie, y luego decapitar el ratón usando una tijera afilada. Coloque el ratón eutanizado supino en una estera de disección y esterilizar el abdomen con 70% de etanol. Tienda de la piel de la parte inferior del abdomen con fórceps y abrir el abdomen con tijeras.
- Localice los testículos en las regiones inguinales inferiores izquierda y derecha del abdomen. Cortar sus conexiones a los vasos deferentes y cualquier tejido conectivo de anclaje, a continuación, levantar todo el testículo (con epidídimo todavía unido) del animal. Coloque los testículos en un plato de Petri de BM preequilibrado.
- Bajo un microscopio de disección y dentro de un campo estéril, haga una pequeña incisión en la tunica albuginea en un extremo de cada testículo con una pequeña tijera de microdisección o rasgando suavemente usando dos fórceps finos.
- Luego, mientras sostiene los testículos desde el extremo opuesto de la incisión, apriete suavemente los testículos con fórceps finos y empuje en un suave movimiento de barrido hacia el agujero en la tunica; esto liberará el tejido testicular como una pieza cohesiva.
- Cortar los testículos en trozos más pequeños (≤ 2 mm3) y colocarlos en 1 ml de la solución de disociación precalentada (37 oC) 1.
- Incubar a 37oC durante 10 min.
- Para más de 10 testículos, aumente el volumen total de la solución de disociación en 1 ml, asegurando un mínimo de 1 ml de solución de disociación por cada 10 testículos (por ejemplo, 2 ml para 20 testículos, 3 ml para 30 testículos, etc.).
- Triturar suavemente las piezas de testis 50 veces (50x) en la solución 1 utilizando una pipeta P1000. Asegúrese de que los túbulos se separan entre sí y del tejido intersticial en este punto. Si quedan grumos, incubar durante 5 minutos adicionales y triturar una vez más (50x).
- Añadir 33 l de solución de hialuronidasa (precalentada a 37oC, a partir del paso 1.5) por 1 ml de mezcla de disociación de solución 1 (que contenga el tejido testicular parcialmente disociado y los túbulos). Después de añadir hialuronidasa, esto se llama solución 2.
- Triturar (50x) con un P1000 e incubar a 37oC durante 5 min.
- Triturar (50x) con una pipeta P200.
- Asegúrese de que en este punto no haya túbulos visibles ni grupos de células. Si los grumos persisten, incubar hasta 5 minutos más, con una trituración adicional con una pipeta P200 (50x).
- Aprieta las enzimas de disociación añadiendo suero bovino fetal (FBS) al 10% del volumen total de la solución 2. Triturar varias veces usando una pipeta P200 para asegurar que no queden grumos, y filtrar a través de un colador celular de 40 m para producir una suspensión de una sola célula.
- Centrifugar las células a 100 x g durante 7 min, desechar el sobrenadante y resuspender las células en BM fresco.
- Cuente las concentraciones celulares totales y viables utilizando la exclusión azul tripano en un hemocitoómetro. Añadir 10 l de 1:1 diluido, suspensión celular: solución azul tripano, en la cámara de conteo de celdas del hemocitómetro (ver Tabla de materiales).
- Re-centrifugar las células a 100 x g durante 7 min y resuspend en BM fresco.
NOTA: Utilice únicamente celdas viables para calcular la concentración y el número de células. Utilice únicamente suspensiones celulares de ≥ 80% de viabilidad para generar organoides. - Preparar la suspensión de una sola célula en las concentraciones celulares como se describe para aliquot 280,000 células dados los volúmenes utilizados en los pasos específicos del protocolo a continuación en la sección 3: 2D ECM-Free – 0.56 x 106 células/mL, 2D ECM – 0,56 x 106 células/ml, 3D sin ECM – 4,66 x 106 celdas/ml, 3D ECM – 2,8 x 106 celdas/ml.
NOTA: Todos los experimentos de cultivo presentados aquí comienzan con 280.000 células sembradas por cultivo. Estos números se comparan con los datos representativos de la Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 y la Figura 4.
- Re-centrifugar las células a 100 x g durante 7 min y resuspend en BM fresco.
3. Preparación de platos de cultivo organoides y siembra de células
NOTA: Para garantizar un ECM homogéneo, precongelar las alícuotas congeladas de ECM durante la noche antes de la experimentación. Las alícuotas de ECM deben sumergirse dentro de un cubo de hielo dentro de un refrigerador o sala fría de 4 oC para garantizar un aumento lento y gradual de la temperatura. Todo ECM se utiliza en una dilución final 1:1 en BM para cultivo. Mantener el ECM descongelado y el ECM diluido 1:1 sobre hielo hasta inmediatamente antes de su uso, de lo contrario el ECM podría polimerizarse prematuramente.
- Para el cultivo libre de ECM 2D, no es necesaria ninguna preparación especial, las suspensiones de una sola célula de placa (500 l de 0,56 x 106 células/ml en BM) directamente sobre los portaobjetos de cámara de 4 pocillos, y colocarlas en una incubadora de 35 oC para el cultivo.
NOTA: Las células deben adherirse a la parte inferior del plato de cultivo dentro de las primeras 24 horas de cultivo y pueden exhibir algunos pequeños grupos celulares 3D dentro de este mismo tiempo. - Para el cultivo de ECM 2D, dispensar 100 l de medio de matriz sótano extracelular diluido 1:1 en un portaobjetos de cámara de 4 pocilnos, asegurando que el gel cubra la totalidad de la parte inferior del plato.
- Colocar el portaobjetos de la cámara en una incubadora de 35 oC durante un mínimo de 30 minutos para permitir que el ECM se polimerice en un gel.
- Agregue la suspensión celular (500 l de 0,56 x 106 células/ml en BM) directamente en la parte superior del gel 2D una vez que se haya polimerizado.
NOTA: Las celdas deben agruparse para formar pequeños clústeres 3D dentro de las primeras 24 horas de cultivo.
- Para el cultivo libre de ECM 3D, prepare inserciones de platos de agarosa 3D Petri antes de comenzar el cultivo celular.
- En primer lugar, autoclave 1,5 g de polvo de agarosa en un vaso de precipitados de 100 ml, luego añadir 75 ml de agua estéril, destilada y microondas para producir agarosa fundida al 2% para la fundición de platos 3D Petri.
- Dentro de un espacio de trabajo estéril, dispensar agarrose fundida en el molde de la placa 3D Petri hasta que el menisco esté nivelado con los lados del molde.
- Deje que la agarosa se enfríe y solidifique. Cuando sea sólido, gire el molde al revés y flexione suavemente repetidamente hasta que el plato de Petri 3D de agarosa se libere del molde.
NOTA: En este punto, se pueden preparar muchos platos de agarosa 3D Petri y guardarlos en H2O estéril o DPBS a 4 oC durante más de un mes. - Antes de cultivar, coloque los platos de agarosa 3D Petri en un plato de cultivo de 24 pozos, y cúbralos con 1 ml de BM. Deje que los platos de Petri 3D se equilibren en BM durante al menos 30 minutos dentro de una incubadora de cultivo de 37oC. Deseche el BM y repita el equilibrio una vez más con 1 ml de BM fresco. Después del equilibrio de los platos 3D Petri en BM, aparecerán del mismo color que el BM (es decir, rosa).
- Para prepararse para la siembra celular, retire todo el BM del pozo y dispensar 200 l de BM fresco alrededor, pero no dentro del hueco central de la placa 3D Petri. Además, recoja cualquier BM restante del interior del hueco de la siembra de celdas centrales de la plaquita micropocillos.
- Dispensar la suspensión de una sola célula (4,66 células/ml en 60 ml de BM) en el hueco central de la placa de agarosa 3D Petri. Limpie suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células y garantizar una suspensión de una sola célula al comienzo del cultivo.
- Colocar en una incubadora humidificada de 35oC para el cultivo. Al día siguiente, retire los 200 l de BM de alrededor de la plaquita micropocillos y sustitúyalos por 1 ml de BM fresco. Esto llevará el nivel de líquido por encima del plano de la plaquita, sumergiendo todo el cultivo.
- Retire/agregue lentamente y cuidadosamente medios desde fuera de la placa de agarosa 3D Petri. Los organoides deben haberse compactado durante la noche, lo que les permite descansar en la parte inferior y permitir que los cambios en los medios dejen los organoides sin perturbaciones.
- Para el cultivo de ECM 3D, preparar una suspensión de una sola célula combinando, en partes iguales, la suspensión celular en BM con ECM frío y predescongelado (concentración final de 2,8 x 106 células/ml).
- Dispensar inmediatamente la mezcla celular-ECM en un portaobjetos de 4 pozos, asegurando que la mezcla cubra toda la parte inferior de la placa.
- Coloque los portaobjetos de la cámara a 35 oC en una incubadora y deje que su contenido se polimerice. Esto debe tomar al menos 30 min. Después de la polimerización, agregue 500 l de BM en la parte superior del cultivo.
NOTA: Las celdas deben haberse agrupado para formar pequeños agregados 3D dentro de las primeras 24 horas de referencia cultural.
4. Mantenimiento organoide
- Cultivo de todos los tipos de modelos organoides a 35 oC. Para todos los tipos de cultivo, intercambie la mitad de sus medios con BM fresco cada 2 días. Para asegurarse de que los organoides no se recogen accidentalmente durante el intercambio de medios, siempre recoja los medios lentamente desde una esquina de la placa deslizante de la cámara, y desde un punto externo fuera de los platos de Petri 3D agarosa. Todos los medios se pueden almacenar a -20 oC para su uso con inmunoensayos u otros análisis posteriores (es decir, cuantificación de hormonas reproductivas secretadas o citoquinas).
- Después de 7 días en cultivo, utilice BM que contiene la hormona estimulante del folículo (concentración final 20 mIU/ml) y gonadotropina coriónica humana (concentración final 4,5 UI/ml). Esto se aplica a todos los tipos de cultivo organoide.
- Imagen rutinaria de todos los cultivos organoides (es decir, imágenes de lapso de tiempo) para caracterizar la formación de organoides y cuantificar las métricas de autoensamble, desarrollo y crecimiento a lo largo del tiempo.
5. Colección organoide
NOTA: Todos los organoides se pueden fijar con un 4% de paraformaldehído en PBS para el inmunoetiquetado aguas abajo y los análisis histológicos. Fijar durante 2 h a temperatura ambiente con rotación, o durante la noche a 4 oC.
- Para cultivos libres de ECM 2D, primero enjuague la muestra con PBS fresco y, a continuación, agregue fijador directamente en la parte superior de las construcciones adheridas.
- Para los métodos de cultivo ECM (2D y 3D), enjuague una vez con PBS y, a continuación, agregue fijador directamente en la parte superior de la muestra ECM-organoid (para fijar el gel ECM y organoides juntos), o alternativamente, pipetee suavemente los organoides hacia arriba y hacia abajo para liberarlos del ECM circundante, y transfiera a un tubo separado para su fijación.
- Para el cultivo libre de ECM 3D, pipetee suavemente los organoides hacia arriba y hacia abajo dentro del recreo central de la placa de agarosa 3D Petri; esto eliminará los organoides facilitando su fácil recolección con una pipeta. A continuación, transfiera organoides a un tubo separado para su fijación.
- Antes de procesar en parafina, incorporar muchos organoides (≥ 20) dentro de un pequeño volumen (30 l) de gel de procesamiento de tejido; esto ayuda a orientar y concentrar organoides en un área pequeña dentro de bloques de parafina, facilitando la observación al seccionar y facilitar la identificación visual dentro de secciones de parafina.
NOTA: Los organoides pueden ser difíciles de identificar después de la incrustación y sección de parafina sobre un microtoma.
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Representative Results
La generación de organoides se consideró infructuosa si las células testiculares no se autoensamblaban dentro de 72 h de cultivo, sin embargo, todos los métodos presentados aquí se ensamblan dentro de las 24 h cuando se utilizan células murinas juveniles (5 dpp). Fallo de la generación de construcción biológica presentada como una continuación de células suspendidas libremente (columna de 0 h en la Figura 1) incluso después del cultivo extendido (72 h). En ausencia de autoensamble de tejido, cualquier grupo celular aparente se dispersa fácilmente en células individuales incluso sobre una manipulación suave (es decir, pipeteo). Los tejidos generados con éxito se observaron inicialmente como "clusters" de células 3D (flechas amarillas en la columna 6 h de la Figura 1). Dentro de entornos libres de ECM (2D y 3D), estas construcciones visiblemente parecían "compactar" a través de las primeras 24 horas de cultivo, especialmente cuando en 3D agarose Petri Dishes (Figura 1A,C). En entornos ECM (2D y 3D) los clústeres de celdas poseían márgenes claros entre el clúster y su entorno circundante (Figura 1B,D). También se observaron clústeres de celdas para migrar a través del ECM y fusionarse formando clústeres más grandes (flechas rojas en la Figura 1B). Se midió el tiempo necesario para apreciar estructuras autoensambladas separadas, y no se requirió una diferencia significativa en el tiempo entre las condiciones libres de ECM 2D y 3D y 2D ECM, sin embargo, la cultura ECM 3D requirió mucho más tiempo para ensamblar estructuras de novo que todos los demás métodos de cultivo (Figura 1E). El cultivo de cultivo ecM 2D libre de ECM y ECM 3D generó clústeres celulares con tamaños significativamente más pequeños que los métodos de cultivo libre de ECM 2D y ECM 3D; La cultura libre de ECM 3D produjo los clusters más grandes con un solo racimo grande y compacto dentro de cada pozo de la antena de agarosa Petri 3D(Figura 1C,F). En resumen, estos datos demuestran la facilidad con la que producir construcciones biológicas testiculares a partir de células primarias de ratón juvenil en cuatro entornos de cultivo arquetípicos y destacan diferentes fenotipos de ensamblaje dirigidos por células dentro de estos diferentes entornos de cultivo.
Un objetivo de todos los modelos organoides es recapitular una morfología mimética interna del tejido nativo. Para evaluar este resultado, las construcciones biológicas ensambladas dentro de cada condición de cultivo se cultivaron durante 72 h y luego se sondearon para marcadores específicos de la célula y se visualizaron con inmunofluorescencia (Figura 2). Se observó variabilidad en la morfología tisular entre diferentes métodos de cultivo. Los organoides libres de ECM 2D presentados como grupos de células sertoli (SOX9 y -catenin) con algunas células germinales (DDX4, un marcador de células germinales de la bandeja) se adhirieron en la parte superior de una capa confluente basal 2D que contiene muchas células somáticas, incluyendo Sertoli, peritubular (SMA) y células Leydig (3-HSD) (Figura 2A-D). Tenga en cuenta que la Figura 2B-D son imágenes epifluorescentes de toda la muestra 2D libre de ECM, no una sección de 5 m; esto permite la visualización tanto de la capa celular somática basal como de los agregados orientados superiormente de Sertoli y las células germinales. Por el contrario, el cultivo de ECM 2D se presentaba con un fenotipo en gran medida diferente, ya que las estructuras biológicas claras con bordes distintos se discernían fácilmente en la parte superior del gel ecM basal (Figura 2E). Estas estructuras poseían una morfología interna compleja con compartimentación de novo de los tipos de células intersticiales de los testículos, por lo que se consideraban organoides exitosos. Las regiones tubulares contenían células sertoli, peritubulares y germinales, y las regiones intersticiales contenían Leydig, células peritubulares y células no etiquetadas (Figura 2F-H). Del mismo modo, los organoides libres de ECM 3D también poseían una morfología interna compartimentada y por lo tanto se consideraban organoides exitosos. En particular, los organoides libres de ECM 3D se distinguieron por regiones tubulares que contienen células peritubulares que se orientaban específicamente en torno a grupos de sertoli y células germinales con alta fidelidad (Figura 2I-L). Las estructuras montadas de 3D ECM no poseían una morfología sofisticada, sino que se observó que eran grupos de células Sertoli, con germen ocasional y células de Leydig. En estas muestras, muchas células Sertoli y no etiquetadas permanecieron suspendidas entre organoides en una orientación "similar al estroma"(Figura 2M-P). Juntos, estos datos ponen de relieve la variabilidad en fenotipos morfológicos que los diferentes métodos de generación de organoides producen y apoyan el uso de dos entornos específicos de ensamblaje organoides, 2D ECM y 3D libre de ECM, para la generación de organoides testiculares con una morfología interna altamente mimética de compartimentación testicular.
Para evaluar aún más la función organoides testiculares, se seleccionaron organoides ensamblados sin ECM 3D para un análisis más profundo a largo plazo. Para este estudio, estos organoides fueron cultivados durante 14 días y luego sondeados para marcadores específicos de células y estructuras. Tras el análisis inmunofluorescente a los 14 días, se observó que los organoides libres de ECM 3D contenían estructuras similares a tubulas (TLS) y una arquitectura tisular notablemente similar a los testículos in vivo (Figura 3A-D). Las celdas intersticiales se ubicaron adecuadamente en regiones separadas de TLS. Las secciones de tejido fueron entonces sondeadas para el marcador de células germinales de la bandeja, DDX4, marcador de células madre espermatogoniales, SALL4, y marcador de meiosis, SCP3 (Figura 3E-G). Se observaron células raras DDX4-positivas y SALL4-positivas, sin embargo, no se identificó ninguna señal SCP3. Tras una caracterización más profunda de TLS, se observó que contenían un espacio lumen-appearing rodeado de células Sertoli polarizadas y una monocapa externa de células peritubulares (Figura 3I-L). Las células sertoli también presentaban uniones estrechas entre sí, visualizadas con microscopía electrónica de transmisión y con etiquetado contra ZO-1, una proteína de unión y un componente de la barrera blood-testis(Figura 3H,L). A continuación, se estudiaron organoides libres de ECM 3D para la función endocrina en cultivo a largo plazo de 12 semanas con estimulación de gonadotropina (Figura 4). Testosterona e inhibición B, hormonas reproductivas de las células de Leydig y Sertoli respectivamente, fueron identificadas y cuantificadas a partir de medio condicionado organoides (Figura 4A). Más de 12 semanas de cultivo, ambas hormonas se midieron para responder significativamente a la suplementación de gonadotropinas FSH y hCG (flecha roja denota el comienzo de la suplementación, durante las semanas 2 – 12). Al finalizar, se realizó una prueba para determinar si se conservó la capacidad de respuesta endocrina. Gonadotropinas se eliminaron durante 48 h, durante el cual las concentraciones de testosterona e inhibición B disminuyeron significativamente en la concentración. Después de 48 h, las gonadotropinas fueron devueltas al cultivo y ambas concentraciones hormonales aumentaron significativamente de nuevo durante un final de 24 h, demostrando una capacidad de respuesta endocrina adecuada (Figura 4B). En conjunto, estos resultados de ensayos histológicos y endocrinos demuestran que los organoides testiculares son un modelo útil para estudiar el desarrollo testicular (es decir, la compartimentación de novo y la tubulogénesis) y la función testicular de células somáticas in vitro (por ejemplo, la formación de uniones estrechas y la función endocrina).
Figura 1: Los organoides se autoensamblan en condiciones de cultivo 2D y 3D, ECM y libre de ECM.
5 células testiculares murinas de dpp se cultivaron en cuatro condiciones diferentes: 2D libre de ECM (fila A), ECM 2D (fila B),3D libre de ECM (fila C)y 3D ECM (fila D). Los gráficos que representan el método de referencia cultural se proporcionan en la columna de la izquierda. Los montajes de imágenes representativas se ensamblaron a partir de imágenes de lapso de tiempo capturadas durante la cultura en vivo. Los puntos de tiempo para cada imagen se etiquetan en el margen superior. El tiempo 0 h es antes de que se haya producido cualquier ensamblaje organoide, el tiempo 3 h es durante el montaje organoide impulsado por células en curso, y los tiempos 6 h y 9 h demuestran organoides representativos, formados con éxito. Las flechas amarillas marcan los clústeres de celdas y las flechas rojas marcan las ubicaciones donde los clústeres de celdas independientes se migraron y se fusionaron. Todas las barras de escala de 1 mm. (E) El tiempo requerido antes de que los racimos de celdas separados pudieran ser visiblemente apreciados se registró para cada condición. 2DF - 2D libre de ECM; 2DE a 2D ECM; 3DF - 3D libre de ECM; 3DE a 3D ECM. (F) Se midió el área por grupo para cada condición de cultivo. Las imágenes se seleccionaron entre los números 3 y 5 experimentos separados. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey se utilizó para determinar la importancia en 1E y 1F; gráficos se ensamblaron a partir de los medios de los experimentos separados n.o 4. Esta figura ha sido modificada de Edmonds y Woodruff37. © IOP Publishing. Reproducido con permiso. Todos los derechos reservados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los organoides cultivados libres de ECM 2D y ECM 3D exhiben compartimentación de tipos de células tubulares e intersticiales.
Imágenes representativas de campo brillante e inmunofluorescentes de organoides autoensamblados después de 72 h de cultivo. Las muestras 2D libres de ECM fueron imágenes de montaje entero, todas las demás muestras fueron semesadas en secciones de tejido de 5 m. (A – D) Cultura libre de ECM 2D. (E – H) Cultura ecM 2D. (I – L) Cultura libre de ECM 3D. (M – P) Cultura ECM 3D. Los marcadores específicos de las células utilizados para el análisis se etiquetan en el margen superior: núcleos de células sertoli (SOX9) y cuerpos celulares ( sCatenin), células germinales (DDX4, un marcador de células germinales de sartén), células de Leydig (3-HSD) y células peritubulares (SMA). Todas las muestras fluorescentes fueron co-manchadas para ADN con DAPI. Las flechas amarillas apuntan a celdas germinales marcadas con DDX4 en la segunda columna de la izquierda, las flechas rojas apuntan a los grupos de celdas Sertoli en las dos columnas de la derecha. Barras de escala de campo brillantes a 400 m, barras de escala fluorescente a 100 m. Esta figura ha sido modificada de Edmonds y Woodruff37. © IOP Publishing. Reproducido con permiso. Todos los derechos reservados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los organoides desarrollan estructuras similares a los de los tubulos pobladas por células germinales raras.
Los organoides ensamblados sin ECM libres de ECM se cultivaron durante 14 días. (A–D) Imágenes representativas de H&E e inmunofluorescentes que detallan tipos de células y características tisulares alrededor de estructuras similares a tubulos (TLS); el mismo organoide se representa en secciones de tejido adyacentes que permiten la comparación lado a lado de las características morfológicas: células de Leydig (3-HSD), células peritubulares (SMA), cuerpos celulares sertoli (-Catenin), membrana de colágeno (COL IV), y núcleos de células sertoli (SOX9); barras de escala a 100 m. (E – G) El etiquetado inmunofluorescente se realizó contra las células germinales, incluyendo un marcador de células germinales pan (DDX4), marcador de células madre espermatogoniales (SALL4) y espermatozoides meiotically activos (SCP3). Los insertos altamente magnificados están esbozados por paneles amarillos en 3E y 3F. Los triángulos verdes apuntan a celdas etiquetadas con DDX4; Las flechas rojas apuntan a celdas etiquetadas por SALL4. (H) Micrografía electrónica de transmisión representativa (TEM) de una unión estrecha entre las células de Sertoli dentro de un organoide; Barra de escala TEM a 100 nm. (I – L) Imágenes representativas de alto aumento de un TLS etiquetado para características clave del epitelio seminifero, incluyendo uniones estrechas (ZO1) y laminin. El mismo TLS se representa en secciones de tejido adyacentes en los paneles I – L. Todas las muestras fluorescentes fueron co-manchadas para ADN con DAPI. Las imágenes se seleccionaron de los experimentos biológicos separados n.o 7. Esta figura ha sido modificada de Edmonds y Woodruff37. © IOP Publishing. Reproducido con permiso. Todos los derechos reservados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Organoids secretan testosterona e inhibin B sobre 12 semanas de cultivo en respuesta a gonadotropinas FSH y hCG.
Los medios condicionados recogidos de organoides libres de ECM 3D se midieron para la testosterona y la inhibición B a través de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). (A) Los organoides se cultivaron durante doce semanas, con la suplementación de FSH y hCG durante las semanas 2 – 12 (comienzo de la suplementación se marca con una flecha roja en el eje X); todos los valores se compararon con el día 7 de la cultura para las pruebas estadísticas. (B) Gráfico magnificado de una "prueba de reestimulación" para determinar si la capacidad de respuesta endocrina se conservó después de 12 semanas. El período de la prueba es esbozado por la caja gris en 4A. Al finalizar 12 semanas en el cultivo, gonadotropinas fueron eliminados durante 48 h y luego re-complementado para una final 24 h de cultura. Las hormonas se midieron en 0, 2, 6, 12, y 24 h después de la reestimulación de gonadotropina; las áreas con sombra roja designan períodos de tiempo durante el cultivo con FSH y hCG, las áreas no sombreadas designan períodos de tiempo sin FSH y hCG; los valores p observados son relativos a 2 h después de la reestimulación. ANOVA bidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey se utilizó para determinar la importancia de todos los datos endocrinos, no 5 experimentos biológicos separados. Esta figura ha sido modificada de Edmonds y Woodruff37. © IOP Publishing. Reproducido con permiso. Todos los derechos reservados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Con la finalización de este protocolo de generación de organoides, el usuario tendrá cuatro técnicas de cultivo diferentes disponibles para ensamblar construcciones testiculares y organoides en entornos libres de ECM o ECM. Es importante destacar que los cuatro métodos permiten al investigador observar no invasivamente el autoensamble organoide a lo largo del tiempo a través de imágenes de lapso de tiempo o grabación de vídeo, y recopilar de forma no invasiva medios condicionados para el análisis de hormonas y citoquinas secretadas, sin alterar los tejidos durante el cultivo. En todos los métodos, en el transcurso de 24 h, un experimentador puede generar hasta varios cientos de organoides / construcciones testiculares, como los números de células permiten. Estos métodos promueven el autoensamble de tejidos en construcciones con diferentes tamaños y morfologías; el tamaño de organoides depende del número de células y la concentración utilizada en el cultivo, como se ve en otros informes organoides34. Reducir el tamaño o el diámetro organoides podría ayudar a reducir el desarrollo de regiones internas de necrosis que a veces se presentan en organoides más grandes. Una fuerza particular de los métodos de protocolo 2D ECM y 3D libre de ECM son su capacidad para generar organoides testiculares morfológicamente miméticos, que contienen de novo compartimentación de tipos de células tubulares frente a intersticiales. Además, los organoides ensamblados 3D sin ECM proporcionan un modelo para la de novo tubulogénesis de TLS seminiferous, con células sertoli y peritubulares adecuadamente compartimentadas y orientadas. Este es un fenotipo importante para el estudio de organoides testiculares, y sigue siendo un resultado variable entre diferentes informes organoides testiculares; múltiples otros informes carecen de tubulo versus interstitium compartimentación y algunos incluso desarrollan un fenotipo "tubo interior-exterior"32,33,34,38. Aunque ninguno de los métodos de generación organoides presentados en el presente manuscrito se caracterizó para mantener grandes poblaciones de células germinales durante días prolongados de cultivo, ya que las células germinales rara vez se observaron tan pronto como 72 h, tanto los métodos libres de ECM 2D como los ecM 3D podrían proporcionar una herramienta útil para estudiar la tubulogénesis y el componente celular somático de un entorno de nicho espermatogonial. Con este objetivo en mente, los organoides testiculares proporcionan una plataforma potencial para optimizar los protocolos futuros para mejorar el mantenimiento in vitro de células madre germinales, la progresión meítica y la diferenciación.
Otra ventaja de estos protocolos es la capacidad de personalizar y escalar la generación de organoides. Las poblaciones celulares personalizadas, tratadas con medicamentos o diseñadas pueden reemplazar, o ser utilizadas además de, células testiculares primarias deratón 37. Si las suspensiones celulares son de baja viabilidad (<80 %), se deben tomar métodos para mejorar la viabilidad celular de la suspensión celular. Estos pueden incluir reducir el tiempo dedicado a los medios de disociación y minimizar la trituración durante la digestión del tejido (pasos 2.4.1 – 2.5.2), aumentar el número de lavados después de la disociación, o eliminar las células muertas después de la disociación con kits de clasificación celular o de etiquetado de células muertas. Sin embargo, ninguna de estas medidas era necesaria para producir los datos representativos compartidos en este informe. Para los métodos de cultivo ECM 2D y 3D, estos protocolos se pueden utilizar con otras matrices de biomateriales a base de proteínas estructurales, además de las utilizadas para los estudios presentados aquí. Estos otros biomateriales incluyen colágeno, gelatina, extractos de ECM disponibles comercialmente e hidrogeles descelularizados hechos a medida derivados de ECM25,,26,,28. Hay algunos consejos para la dosificación de gel ECM de toma de problemas y la creación de inserciones de platos de agarosa 3D Petri de alta calidad. Al lanzar geles ECM en placas de cámara, asegúrese de trabajar rápidamente y utilice puntas de pipeta frías para evitar la polimerización prematura del ECM dentro de un tubo o punta de pipeta antes de dispensar en el plato de cultivo. Al fundar la agarosa fundida en los moldes de la placa 3D Petri (para cultivo libre de ECM 3D), utilice sólo agarosa caliente y no caliente para asegurar la fundición de alta calidad de las plaquitas con una variación mínima, y compruebe que la agarosa se ha enfriado completamente a temperatura ambiente y solidificada antes de intentar eliminar del molde. Los platos Agarose 3D Petri se manejan mejor suavemente con fórceps finos. Al recoger organoides para la fijación, asegúrese de trabajar bajo un microscopio de disección para visualizar la colección de todos los organoides. Los organoides pueden adherirse al lado plástico de los platos de cultivo y el interior de las puntas de pipeta; pipetas de vidrio exhiben menos adherencia organoides que el plástico. Fijar organoides mientras todavía están encapsulados dentro o encima de ECM es un proceso más desafiante y delicado que eliminarlos de ECM antes de la fijación. El gel de procesamiento de tejido se puede fundir por encima de la construcción ECM-organoid antes de la extracción de la cámara de cultivo para ayudar a reforzar el gel antes de la fijación39. La fijación se debe realizar a temperatura ambiente para recuperar los hidrogeles ECM, ya que es probable que se despolimericen si se reducen a 4 oC. Además, se puede añadir 0,1 % - 1,0 % de glutaraldehído a la solución de PFA al 4 % para ayudar a cruzar aún más el ECM; sin embargo, este método aumenta la autofluorescencia de fondo de la muestra.
Existen limitaciones considerables específicas de las células germinales a los resultados obtenidos por los métodos de generación de organoides presentados anteriormente, que representan áreas prioritarias para la innovación futura. Las células germinales están mal soportadas sobre el cultivo extendido, sólo se observan fácilmente durante los primeros días de cultivo y rara vez se observan al final de la primera semana de cultivo y en puntos posteriores. Mientras que la espermatogonia indiferenciada se puede mantener dentro del cultivo celular in vitro mientras mantienen su capacidad para restaurar la espermatogénesis tras el trasplante en túbulos in vivo40,el microambiente somático del túbulo (es decir, interacciones celulares directas de Sertoli) se presume que es un requisito previo para diferenciar las células germinales premeíticas en y a través de la meiosis y la esperquegénesis in vitro1,5,40,41. Los organoides testiculares que contienen espermatogonia en puntos de tiempo temprano dentro de un TLS estructuralmente mimético podrían permitir que el campo estudie de forma no invasiva interacciones de células somáticas-somáticas y somáticas-germen completamente in vitro. Optimización de aditivos multimedia y preparación celular antes del cultivo (por ejemplo, incorporación de agentes utilizados para el cultivo de células madre espermatogoniales in vitro)42,43 podría aumentar el rendimiento de las células germinales en estudios futuros, especialmente en períodos de cultivo más largos que varios días. Inversamente, los métodos para reinsernciar la espermatogonia después de que se hayan formado TLS, como a través de la microinyección, representan una oportunidad interesante para restaurar las células germinales dentro de los organoides, y probar la capacidad de entornos somáticos organizados in vitro para mantener las células germinales. Se ha observado que otros factores biológicos afectan al cultivo ex vivo de explant, incluyendo la edad/madurez45 y las diferencias genéticas de fondo17. Estas mismas variables aún no se han investigado directamente en el campo de la biología organoide testicular. Sin embargo, es plausible que diferentes conjuntos, morfología y fenotipos funcionales puedan resultar cuando se generan organoides a partir de células aisladas de animales de edad diferente (es decir, neonatales, juveniles, adultos) o animales de diferentes antecedentes genéticos (por ejemplo, diferentes cepas de ratón).
En resumen, las técnicas compartidas en este manuscrito proporcionan cuatro modelos útiles para el estudio de la autoensensensidad de la construcción testicular impulsada por células, la generación de dos modelos de organoides testiculares estructuralmente miméticos separados y el logro importante del desarrollo TLS y la función endocrina sensible a las hormonas in vitro. Estos modelos abarcan orientaciones espaciales 2D y 3D en entornos ECM y ECM con medios de referencia cultural mínimamente complejos y completamente definidos. Cada método es altamente reproducible y utiliza solo recursos de referencia cultural comúnmente disponibles. Estos métodos pueden resultar ventajosos para estudiar la morfogénesis testicular in vitro y optimizar las condiciones futuras de cultivo para la espermatogénesis in vitro. Más aún, los métodos libres de ECM 2D y ECM 3D proporcionan una herramienta novedosa para estudiar el proceso de compartimentación de tejido de novo exclusiva de los testículos, la tubulogénesis in vitro y las interacciones celulares somáticas-somáticas y somáticas-germen. Los organoides testiculares proporcionan una oportunidad flexible y escalable para investigar el desarrollo y la regulación de las señas de identidad fisiológicas testiculares tanmáticas; incluyendo la barrera de los análisis de sangre y la producción y respuesta endocrina; y, también, una herramienta útil para el desarrollo de modelos de tejidos de investigación traslacional de próxima generación. Estos incluyen la incorporación de hormonas reproductivas en modelos de nivel de sistemas más grandes, como las plataformas de tejido en un CHIP y microfisiológicas45,,46. Otros objetivos traslacionales hacia los que podrían aplicarse organoides testiculares algún día son la toxicología reproductiva y las pruebas de barreras inmunológicas, el desarrollo de anticonceptivos masculinos y la innovación en tecnología de reproducción asistida.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD) F31 HD089693, el Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental / Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 y 4UH3ES029073-03, y el Profesor Memorial de Thomas J. Watkin.
Los autores quieren agradecer a Eric W. Roth por su ayuda con la microscopía electrónica de transmisión. Este trabajo hizo uso de las instalaciones de BioCryo del Centro NUANCE de la Universidad Northwestern, que ha recibido el apoyo del Recurso Experimental de Nanotecnología Suave e Híbrida (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); el programa MRSEC (NSF DMR-1720139) en el Centro de Investigación de Materiales; el Instituto Internacional de Nanotecnología (IIN); y el estado de Illinois, a través del IIN. También hizo uso del equipo CryoCluster, que ha recibido apoyo del programa de RMN (NSF DMR-1229693). Los gráficos de la Figura 1 se diseñaron con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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