Summary
Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.
Abstract
Organoides testiculares fornecem uma ferramenta para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e endocrinologia in vitro. Vários métodos foram desenvolvidos para criar organoides testiculares. Muitos desses métodos dependem da matriz extracelular (ECM) para promover a montagem de novos tecidos, no entanto, há diferenças entre métodos em termos de morfologia biomimética e função dos tecidos. Além disso, há poucas comparações diretas de métodos publicados. Aqui, uma comparação direta é feita estudando diferenças nos protocolos de geração organoide, com resultados fornecidos. São descritos quatro métodos de geração arquetípica: (1) cultura ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) 3D ECM livre e (4) cultura ECM 3D. Foram utilizados três benchmarks primários para avaliar a geração organoide testicular. São células de automontagem celular, inclusão de grandes tipos celulares (sertoli, Leydig, germes e células peritubulares) e arquitetura de tecido compartimentalizada adequadamente. Dos quatro ambientes testados, culturas 2D ECM e 3D sem ECM geraram organoides com morfologias internas mais semelhantes aos testículos nativos, incluindo a compartimentação de novo dos tipos de células tubulares versus intersticiais, o desenvolvimento de estruturas semelhantes a túbulos e uma função endócrina estabelecida a longo prazo. Todos os métodos estudados utilizaram suspensões de células testiculares murinas não variadas e utilizaram recursos culturais comumente acessíveis. Essas técnicas de geração organoide testicular fornecem um kit de ferramentas altamente acessível e reprodutível para iniciativas de pesquisa sobre organogênese testicular e fisiologia in vitro.
Introduction
Organoides testiculares são uma técnica pioneira para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e fisiologia in vitro1,2,,3,4. Vários métodos têm sido explorados para a geração organoide; estes incluem uma variedade de sistemas de cultura extracelular (ECM) e sem ECM, tanto em orientações bidimensionais (2D) quanto tridimensionais (3D). Diferentes métodos de geração podem promover estratégias distintas de montagem celular; isso resulta em um alto nível de variabilidade morfológica e funcional entre modelos organoides publicados. O objetivo deste artigo é discutir o estado atual dos modelos testiculares in vitro, e servir de modelo para futuros pesquisadores, ao projetar experimentos organoides testiculares. No presente estudo, quatro arquétipos diferentes do sistema cultural são definidos e caracterizados em processo experimental e desfecho biológico. Estes incluem: métodos de cultura 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free e 3D ECM. As estratégias aqui apresentadas destinam-se a ser simples, acessível e altamente reprodutível entre diferentes laboratórios e grupos de pesquisa.
Historicamente para os testis, a designação "in vitro", tem sido usada para vários métodos culturais diferentes de tecidos e células testiculares. Estes incluem métodos organotípicos de tecido/cultura de órgãos (ou seja, cultura explant)5, cultura de túbulos seminiferosisolados 6,cultura celular testicular7, e métodos de morfogênese de novo tecido (ou seja, construções biológicas e organoides)1. As primeiras investigações sobre espermatogênese in vitro foram realizadas há aproximadamente 100 anos, com a cultura de explants de testígenos de coelho em 19208, e mais tarde em 1937 com explants de camundongos9. Dentro desses experimentos iniciais, a espermatogonia foi observada para se degenerar em grande parte durante a primeira semana de cultura, embora algumas células meioticamente diferenciadas tenham sido identificadas. Lembrando esses relatos históricos, a cultura explant testis foi revivida e otimizada em 2011 para se tornar uma técnica viável para o estudo do testis10. Desde 2011, a cultura explant produz esperma competente em múltiplos relatórios11,12,13. No entanto, devido à dependência da cultura explant em túbulos de testículos nativos pré-existentes, esses avanços recentes são descritos com mais precisão como exemplos de função testicular "ex vivo" e espermatogênese, função tecidual que foi mantida ou retomada após a remoção do corpo de um organismo. Apesar de sua prevalência na literatura, a manutenção de células germinativas de longo prazo e a diferenciação dentro de explants testiculares são desafiadoras para replicar14,15,16,17,18, especialmente em períodos longos o suficiente para observar totalmente a espermatogênese in vitro (~35 dias em camundongos19 e 74 em humanos20). É intrigante perceber que muitos dos mesmos desafios experimentados há 100 anos, ainda são experimentados dentro da espermatogênese ex vivo hoje.
Diferente das abordagens ex vivo, os organoides testiculares são microtissues montados de novo gerados inteiramente in vitro a partir de fontes celulares (ou seja, células testiculares primárias). Organoides testiculares fornecem uma estratégia criativa para contornar a dependência histórica do campo sobre o tecido nativo pré-existente, e para recapitular a biologia testicular completamente in vitro. Existem múltiplos requisitos compartilhados pela maioria dos modelos de tecido organoide; estes incluem (1) morfologia ou arquitetura de tecido simicoético vivo, (2) múltiplos tipos de células principais do tecido representado, (3) auto-montagem ou auto-organização em sua geração, e (4) a capacidade de simular algum nível da função e fisiologia do tecido representado21,,22,,23,,24. Para os testis, isso pode ser capturado em quatro grandes marcas: (1) a inclusão de grandes tipos de células testiculares, germe, Sertoli, Leydig, peritubular, e outras células intersticiais, (2) conjunto de tecidos direcionados por células, (3) tipos de células compartimentadas apropriadamente em compartimentos tubulares separados (germe e Sertoli) e regiões intersticiais (todos os outros tipos de células), e (4) algum grau de função tecidual (por exemplo, secreção hormonal reprodutiva ou respostas teciduais, germe e manutenção celular e diferenciação). Considerando os desafios históricos na manutenção da diferenciação de células germinativas ex vivo e in vitro, a recapitulação de arquiteturas testiculares intramicéticas (ou seja, estruturas semelhantes a túbulos seminiferos) com marcadores adicionais sugerindo simulação de fisiologia testicular (por exemplo, função endócrina), são marcos prioritários para a geração de organoides que podem um dia sustentar na espergenena.
A maioria dos métodos organoides testiculares publicados aproveitam as formulações de ECM disponíveis comercialmente (por exemplo, colágeno ou ecm proprietário)25,,26,27 ou ECMs de origem personalizada (ou seja, testis descelularizados)28,,29,,30. O ECM exógeno promove a formação de tecidos de novo através do fornecimento de um andaime de suporte à montagem para a geração de tecidos. Os métodos de ECM têm proporcionado um nível impressionante de formação tecidual, incluindo alguma presença de células germinativas e morfologia mímica tecidual25,,28. No entanto, os ECMs que utilizam nem sempre estão disponíveis universalmente (ou seja, hidrogéis derivados do ECM), e alguns métodos requerem orientações sofisticadas de gel e semeadura celular (por exemplo, gradientes de 3 camadas de ECM e impressão 3D)25,,31,,32. Métodos livres de andaimes (por exemplo, gota suspensa e placas de cultura não adesê),33,,34,35 também geraram organoides robustos e altamente reprodutíveis sem a necessidade de géis ECM ou andaimes. No entanto, a morfologia tecidual desses organoides livres de andaimes é muitas vezes diferente dos testículos in vivo, e a maioria desses relatórios incorpora um aditivo bioquímico de ECM para promover a formação de tecidos33,,34,,36ou, alternativamente, dependem de centrifugação para agregação celular forçada e compactação34, tornando-os menos ideais para estudar migração e auto-organização dirigidas por células.
Os quatro métodos de geração organoide apresentados neste manuscrito incluem estratégias dependentes do ECM e independentes, cada uma utilizando semeadura celular simples que permite a observação da automontagem organoide orientada por células. Todas as quatro técnicas podem ser realizadas a partir das mesmas suspensões celulares ou podem fazer uso de populações personalizadas e enriquecidas do tipo celular. Uma força desses métodos é a capacidade de observar organoides auto-montados em tempo real, e comparar diretamente como estruturas testiculares se auto-reúnem entre diferentes microambientes culturais. As diferenças fenotípicas entre esses quatro métodos culturais devem ser consideradas por seu impacto na questão da pesquisa ou assunto do pesquisador. Cada método produz construções biológicas ou organoides dentro de 24 h ou menos. Em conclusão, os métodos aqui apresentados fornecem um kit de ferramentas de técnicas de montagem organoide para o estudo do montagem organoide testicular, desenvolvimento de tecidos e fisiologia testicular in vitro.
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Protocol
Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade northwestern, e todos os procedimentos foram realizados sob protocolos aprovados pela IACUC.
1. Preparação de soluções enzimáticas de dissociação de tecidos
- Use duas soluções enzimáticas diferentes (Solução 1 e Solução 2), ambas feitas utilizando uma solução média de cultura basal (BM).
- Para preparar bm, adicione soro e penicilina-estreptomicina ao mínimo essencial de concentrações médias para finais de 10% e 1% respectivamente (ver Tabela de Materiais para reagentes específicos). Em seguida, estéril filtro o BM através de um filtro de 0,22 μm. Antes do uso com células, pré-equilibre bm estéril a um pH neutro, dispensando em um prato de cultura e colocando dentro de uma incubadora de CO2 umidificada de 5% a 37 °C para um mínimo de 1h.
NOTA: A BM pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana, após a qual deve ser feita bm fresca. - Para preparar as soluções de estoque de colagenase I, primeiro dissolva 100 mg de colagenase I em 1 mL de embrião estéril grau H2O (concentração final de 10% m/v), inverter ou girar para dissolver, e armazenar alíquotas de 20 μL a -20 °C para uso posterior. Alíquotas devem ser descongeladas apenas uma vez.
- Para preparar soluções de estoque desoxyribonuclease I (DNase I), adicione 20 mg de DNase I em 1 mL de embrião estéril grau H2O (concentração final 2% m/v), inverter ou girar para dissolver (não vórtice) e armazenar 20 alíquotas de μL a -20 °C para uso posterior. Alíquotas devem ser descongeladas apenas uma vez.
- Para soluções de estoque de hialuronidase, adicione 30 mgs em 1 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato estéril (PBS; concentração final de 3% m/v de hyaluronidase em PBS contendo Ca++/Mg++), inverter ou redemoinho para dissolver, e armazenar 100 alíquotas μL a -20 °C para uso posterior. As alíquotas podem ser descongeladas e re congeladas várias vezes sem perda de atividade enzimática.
- Para preparar a solução de dissociação 1,adicione 10 μL de colagenase I e 10 μL DNase I em 1 mL de BM estéril e pré-equilibrada (concentrações finais: 1 mg/mL colagenase I e 5 μg/mL DNase I). Triturar suavemente com uma pipeta para misturar a solução e pré-aquecer a 37 °C antes de usar com o tecido.
NOTA: A solução 2 é preparada adicionando 33 μL de hialuronidase (pré-37 °C) por 1 mL de Solução 1, (a uma concentração final de 1 mg/mL). Isso ocorre no meio do caminho através da dissociação enzimática do tecido testiá-s na etapa 2.5 abaixo.
2. Dissociação tecidual testis
NOTA: Todos os ratos foram alojados dentro de gaiolas de polipropileno e fornecidos com comida e água ad libitum. Os animais foram alimentados com comida irradiada que não contém fitoestrogênios. Camundongos cd-1 juvenis, 5 dias pós-parto (dpp), foram usados para todos os experimentos e anestesiados antes da eutanásia e coleta de tecidos, dentro de uma câmara de anestesia anexada a um vaporizador isoflurane (2,5 L/min em O2). Os camundongos foram confirmados para anestesia total através da ausência de uma resposta ao toe-prick, após o qual os ratos foram eutanizados via decapitação.
- Anestesiar ratos em uma câmara isoflurane, garantir anestesia através de um dedo do dedo do dedo do dedo do pedaço, e, em seguida, decapitar o rato usando uma tesoura afiada. Coloque o supino de camundongos eutanizado em um tapete de dissecção e esterilize o abdômen com 70% de etanol. Tenda a pele do abdômen inferior com fórceps e abra o abdômen com uma tesoura.
- Localize os testículos nas regiões inferior esquerda e direita do abdômen. Corte suas conexões com os adiamentos vas e qualquer tecido conjuntivo de ancoragem, em seguida, levante todo o testíase (com epidídis ainda ligado) do animal. Coloque testículos em uma placa de Petri de BM pré-equilibrada.
- Sob um microscópio de dissecção e dentro de um campo estéril, faça uma pequena incisão na tunica albuginea em uma extremidade de cada teste com uma pequena tesoura de microdisseção ou rasgando suavemente usando duas fórceps finas.
- Em seguida, enquanto segura o testío da extremidade oposta da incisão, aperte suavemente o testíps com fórceps finos e empurre em um movimento suave de varredura em direção ao buraco na tunica; isso vai liberar o tecido testicular como uma peça coesa.
- Corte os testículos em pedaços menores (≤ 2 mm3) e coloque-os em 1 mL de solução de dissociação pré-aquecida (37 °C).
- Incubar a 37 °C por 10 min.
- Para mais de 10 testículos, aumente o volume total da solução de dissociação em 1 mL, garantindo um mínimo de 1 mL de solução de dissociação por 10 testículos (por exemplo, 2 mL para 20 testículos, 3 mL para 30 testículos, etc.).
- Triturar suavemente as peças testis 50 vezes (50x) na solução 1 usando uma pipeta P1000. Certifique-se de que os túbulos se separem um do outro e do tecido intersticial neste momento. Se os aglomerados permanecerem, incubar por mais 5 minutos e triturar mais uma vez (50x).
- Adicione 33 μL de solução de estoque de hialuronidase (pré-aquecida a 37 °C, a partir da etapa 1,5) por 1 mL de mistura de dissociação da solução 1 (contendo o tecido testicular parcialmente dissociado e as tubulações). Depois de adicionar hyaluronidase, esta é chamada solução 2.
- Triturate (50x) utilizando um P1000 e incubar a 37 °C por 5 min.
- Triturata (50x) usando uma pipeta P200.
- Certifique-se de que, neste momento, não há túbulos visíveis ou aglomerados de células. Se as aglomerações persistirem, incubar por mais 5 minutos, com mais trituração usando uma pipeta P200 (50x).
- Sacie as enzimas de dissociação adicionando soro bovino fetal (FBS) a 10% do volume total da solução 2. Triturar várias vezes usando uma pipeta P200 para garantir que não restem aglomerados e filtrar através de um coador de células de 40 μm para produzir uma suspensão de célula única.
- Centrífugas a 100 x g por 7 min, descartam o supernascedor e resuspensam as células em BM fresco.
- Conte as concentrações celulares totais e viáveis usando a exclusão azul tripano em um hemócito. Adicionar 10 μL de 1:1 diluído, suspensão celular: solução azul trypan, na câmara de contagem de células hemótâmica (ver Tabela de Materiais).
- Re-centrífugas células a 100 x g por 7 min e resuspend em BM fresco.
NOTA: Use apenas células viáveis para calcular a concentração celular e o número. Basta usar suspensões celulares de ≥ viabilidade de 80% para geração de organoides. - Prepare a suspensão de célula única em concentrações celulares conforme descrito para alíquotar de 280.000 células, dado os volumes utilizados no protocolo de etapas específicas abaixo na seção 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 células/mL, 2D ECM – 0,56 x 106 células/mL , 3D ECM-Free – 4,66 x 106 células/mL, 3D ECM – 2,8 x 106 células/mL.
NOTA: Todos os experimentos culturais apresentados aqui começam com 280.000 células semeadas por cultura bem. Esses números são combinados com os dados representativos na Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4.
- Re-centrífugas células a 100 x g por 7 min e resuspend em BM fresco.
3. Preparação de pratos de cultura organoide e semeadura de células
NOTA: Para garantir um ECM homogêneo, pré-descongelar alíquotas congeladas de ECM durante a noite antes da experimentação. As alíquotas do ECM devem ser submersas dentro de um balde de gelo dentro de uma geladeira de 4 °C ou sala fria para garantir um aumento lento e gradual da temperatura. Todo ECM é usado em uma diluição final de 1:1 em BM para cultura. Mantenha o ECM descongelado e o ECM diluído 1:1 no gelo até imediatamente antes do uso, caso contrário, o ECM pode polimerizar prematuramente.
- Para a cultura livre de ECM 2D, não é necessária uma preparação especial, suspensões de célula única de placa (500 μL de 0,56 x 106 células/mL em BM) diretamente em slides de câmara de 4 poços, e coloque em uma incubadora de 35 °C para cultura.
NOTA: As células devem aderir ao fundo do prato de cultura dentro das primeiras 24 horas de cultura e podem exibir alguns pequenos aglomerados de células 3D dentro deste mesmo tempo. - Para a cultura 2D ECM, dispense 100 μL de frio 1:1 diluído extracelular matriz de porão médio em um slide de câmara de 4 poços, garantindo que o gel cubra a totalidade do fundo do prato.
- Coloque o deslizamento da câmara em uma incubadora de 35 °C por um mínimo de 30 minutos para permitir que o ECM polimerize em um gel.
- Adicione a suspensão celular (500 μL de 0,56 x 106 células/mL em BM) diretamente na parte superior do gel 2D uma vez que tenha polimerizado.
NOTA: As células devem agrupar-se para formar pequenos clusters 3D dentro das primeiras 24 horas de cultura.
- Para a cultura livre de ECM 3D, prepare as pastilhas 3D de placas de Petri antes de iniciar a cultura celular.
- Primeiro, autoclave 1,5 g pó de agarose em um béquer de 100 mL, em seguida, adicione 75 mL de água estéril, água destilada e micro-ondas para produzir 2% de agarose derretida para fundição de placa 3D Petri.
- Dentro de um espaço de trabalho estéril, dispense agarose derretida no molde da placa 3D Petri até que o menisco esteja nivelado com as laterais do molde.
- Deixe a agarose esfriar e solidificar. Quando sólido, vire o molde de cabeça para baixo e flexione suavemente repetidamente até que a placa 3D Petri cai livre do molde.
NOTA: Neste ponto, pode-se preparar muitas placas 3D Petri agarose e armazená-las em H2O ou DPBS estéreis a 4 °C por mais de um mês. - Antes de cultivar, coloque pratos 3D Petri em uma placa de cultura de 24 poços, e cubra-os com 1 mL de BM. Deixe que as placas 3D Petri se equilibrem em BM por pelo menos 30 min dentro de uma incubadora de cultura de 37 °C. Descarte o BM e repita o equilíbrio mais uma vez com 1 mL de BM fresco. Após o equilíbrio das placas 3D Petri em BM, elas aparecerão da mesma cor do BM (ou seja, rosa).
- Para se preparar para a semeadura celular, remova todo o BM do poço e dispense 200 μL de BM fresco ao redor, mas não dentro do recesso central da placa 3D Petri. Além disso, colete qualquer BM restante de dentro do recesso central de semeadura de células da inserção de microwell.
- Dispense a suspensão de célula única (4,66 células/mL em 60 μL de BM) no recesso central da placa de Petri 3D agarose. Triturar suavemente para cima e para baixo para misturar células e garantir uma única suspensão celular no início da cultura.
- Coloque em uma incubadora umidificada de 35 °C para cultura. No dia seguinte, remova os 200 μL de BM ao redor da pastilha de microwell, e substitua por 1 mL de BM fresco. Isso trará o nível líquido acima do plano da inserção, submergindo toda a cultura.
- Lentamente e cuidadosamente remova/adicione mídia de fora da placa 3D Petri agarose. Os organoides deveriam ter compactado durante a noite, permitindo que eles descansassem na parte inferior e permitindo que as mudanças na mídia deixassem os organoides imperturbáveis.
- Para a cultura 3D ECM, prepare uma suspensão única celular combinando, em partes iguais, a suspensão celular em BM com ECM frio e pré-descongelado (concentração final = 2,8 x 106 células/mL).
- Dispense imediatamente a mistura célula-ECM em um slide de câmara de 4 poços, garantindo que a mistura cubra toda a parte inferior da placa.
- Coloque os slides da câmara a 35 °C em uma incubadora e deixe seu conteúdo polimerizar. Isso deve levar pelo menos 30 min. Após a polimerização, adicione 500 μL de BM no topo da cultura.
NOTA: As células deveriam ter se agrupado para formar pequenos agregados 3D dentro das primeiras 24 horas de cultura.
4. Manutenção organoide
- Cultura todos os tipos de modelo organoide a 35 °C. Para todos os tipos de cultura trocam metade de suas mídias com BM fresco a cada 2 dias. Para garantir que os organoides não sejam coletados acidentalmente durante a troca de meio, colete sempre a mídia lentamente de um canto da placa de slides da câmara, e de um ponto externo fora das placas 3D Petri. Todas as mídias podem ser armazenadas a -20 °C para uso com imunoensaios ou outras análises posteriores (ou seja, quantificação de hormônios reprodutivos secretos ou citocinas).
- Após 7 dias na cultura, use BM contendo hormônio estimulante folículo (concentração final de 20 mIU/mL) e gonadotropina coriônica humana (concentração final 4,5 UI/mL). Isso se aplica a todos os tipos de cultura organoide.
- Imagem rotineira de todas as culturas organoides (ou seja, imagem de lapso de tempo) para caracterizar a formação organoide e quantificar métricas de auto-montagem, desenvolvimento e crescimento ao longo do tempo.
5. Coleta organoide
NOTA: Todos os organoides podem ser corrigidos com 4% de paraformaldeído em PBS para imunolabelação a jusante e análises histológicas. Fixar por 2h em temperatura ambiente com rotação, ou durante a noite a 4 °C.
- Para culturas livres de ECM 2D, primeiro enxágue a amostra com PBS fresco e, em seguida, adicione fixativo diretamente em cima dos construtos aderidos.
- Para métodos de cultura ECM (2D e 3D), enxágue uma vez com PBS e, em seguida, adicione fixativo diretamente na parte superior da amostra ECM-organóide (para fixar o gel ECM e organoides juntos), ou, alternativamente, pipetar suavemente os organoides para cima e para baixo para libertá-los do ECM circundante, e transferir para um tubo separado para fixação.
- Para a cultura 3D livre de ECM, pipeta suavemente os organoides para cima e para baixo dentro do recesso central da placa 3D Petri agarose; isso vai lavar os organoides facilitando sua fácil coleta com uma pipeta. Em seguida, transfira organoides para um tubo separado para fixação.
- Antes de transformar em parafina, incorpore muitos organoides (≥ 20) dentro de um pequeno volume (~ 30 μL) de gel de processamento de tecidos; isso ajuda a orientar e concentrar organoides em uma pequena área dentro de blocos de parafina, facilitando a observação ao se seccionamento e identificação visual mais fácil dentro de seções de parafina.
NOTA: Os organoides podem ser desafiadores para identificar após a incorporação da parafina e a secção em cima de um microtome.
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Representative Results
A geração organoide foi considerada sem sucesso se as células testiculares não se auto-montarem dentro de 72 h de cultura, no entanto, todos os métodos aqui apresentados se reúnem dentro de 24 horas quando se utiliza células murinas juvenis (5 dpp). Falha na geração de construções biológicas apresentada como continuação de células livremente suspensas (coluna 0 h na Figura 1) mesmo após cultura estendida (72 h). Na ausência de auto-montagem tecidual, quaisquer aglomerados celulares aparentes facilmente dispersados em células individuais após manipulação até suave (ou seja, pipetação). Os tecidos gerados com sucesso foram inicialmente observados como "clusters" de células 3D (setas amarelas na coluna 6h da Figura 1). Dentro de ambientes livres de ECM (2D e 3D), essas construções visivelmente pareciam "compactas" nas primeiras 24h de cultura, especialmente quando em pratos 3D agarose Petri(Figura 1A,C). Em ambientes ECM (2D e 3D) os aglomerados de células possuíam margens claras entre o cluster e seu ambiente circundante(Figura 1B,D). Também foram observados aglomerados celulares para migrar através do ECM e fundir-se formando aglomerados maiores (setas vermelhas na Figura 1B). O tempo necessário para apreciar estruturas auto-montadas separadas foi medido, e não houve diferença significativa no tempo necessário entre as condições livres de ECM 2D e 3D e o ECM 2D, no entanto, a cultura 3D ECM exigiu significativamente mais tempo para montar estruturas de novo do que todos os outros métodos culturais(Figura 1E). A cultura de ECM livre de ECM 2D e 3D gerou aglomerados celulares com tamanhos significativamente menores do que os métodos de cultura 2D ECM e 3D sem ECM; A cultura livre de ECM 3D produziu os maiores clusters com um único cluster grande e compacto dentro de cada poço da placa 3D agarose Petri(Figura 1C,F). Em resumo, esses dados demonstram a facilidade com que produzir construções biológicas testiculares a partir de células primárias de camundongos juvenis em quatro ambientes de cultura arquetípica e destacam diferentes fenótipos de montagem direcionados por células dentro desses diferentes ambientes culturais.
Um objetivo de todos os modelos organoides é recapitular uma mímica de morfologia interna do tecido nativo. Para avaliar esse desfecho, foram cultivadas construções biológicas montadas dentro de cada condição cultural por 72 h e, em seguida, sondadas para marcadores específicos de células e visualizadas com imunofluorescência(Figura 2). Observou-se variabilidade na morfologia tecidual entre diferentes métodos culturais. Organoides livres de ECM 2D apresentados como aglomerados de células sertoli (SOX9 e βCatenin) com algumas células germinativas (DDX4, um marcador de células germinativas pan) aderiram em cima de uma camada confluente basal 2D contendo muitas células somáticas, incluindo Sertoli, peritubular (αSMA) e Ley celldigs (3βHSD) (Figura 2A-D). Observe que a Figura 2B-D são imagens epifluorescentes de toda a amostra sem ECM 2D, não uma seção de 5 μm; isso permite a visualização tanto da camada celular somática basal quanto dos agregados orientais superiores das células sertoli e germinativas. Em contraste, a cultura 2D ECM apresentou um fenótipo em grande parte diferente, pois estruturas biológicas claras com bordas distintas eram facilmente discernidas em cima do gel basal ECM(Figura 2E). Essas estruturas possuíam uma morfologia interna complexa com de novo compartimentação de túbulos vs. tipos de células intersticiciais dos testis, e assim foram considerados organoides bem sucedidos. As regiões tubulares continham células sertoli, peritubulares e germinativas, e regiões intersticiais continham Leydig, células peritubulares e células não rotuladas(Figura 2F-H). Da mesma forma, organoides livres de ECM 3D também possuíam uma morfologia interna compartimentalizada e assim foram considerados organoides bem sucedidos. Em particular, os organoides livres de ECM 3D foram distinguidos por regiões tubulares contendo células peritubulares que especificamente orientavam em torno de grupos de células germinais e germinais com alta fidelidade(Figura 2I-L). As estruturas montadas em ECM 3D não possuíam uma morfologia sofisticada, mas, em vez disso, foram observadas agrupamentos de células sertoli, com células de germes ocasionais e leydig. Nessas amostras, muitas células sertoli e não rotuladas permaneceram suspensas entre organoides em uma orientação "semelhante a estroma"(Figura 2M-P). Juntos, esses dados destacam a variabilidade em fenótipos morfológicos que diferentes métodos de geração organoide produzem e suportam o uso de dois ambientes específicos de montagem organoide, 2D ECM e 3D ECM-free, para a geração de organoides testiculares com uma morfologia interna altamente mimética de compartimentação testicular.
Para avaliar melhor a função organoide testicular, foram selecionados organoides montados sem ECM 3D para uma análise mais profunda a longo prazo. Para este estudo, esses organoides foram cultivados por 14 dias e, em seguida, sondados para marcadores específicos de células e estrutura. Após análise imunofluorescente aos 14 dias, foram observados organoides livres de ECM em 3D contendo estruturas semelhantes a túbulos (TLS) e uma arquitetura de tecido notavelmente semelhante aos testículos in vivo(Figura 3A-D). As células intersticiciais foram adequadamente localizadas em regiões separadas da TLS. As seções teciduais foram então sondadas para o marcador de células germinativas pan, DDX4, marcador de células-tronco espermatogonial, SALL4, e marcador de meiose, SCP3 (Figura 3E-G). Foram observadas células raras DDX4 positivos e SALL4 positivos, no entanto, nenhum sinal SCP3 foi identificado. Após uma caracterização mais profunda do TLS, observou-se que eles continham um espaço aparecendo em lúmen cercado por células sertoli polarizadas e uma monocamada externa de células peritubulares(Figura 3I-L). As células sertoli também apresentaram junções apertadas entre si, visualizadas com microscopia eletrônica de transmissão e com rotulagem contra ZO-1, proteína juncional e componente da barreira de exames sanguíneos(Figura 3H,L). Em seguida, organoides livres de ECM 3D foram estudados para função endócrina em 12 semanas, cultura de longo prazo com estimulação de gonadotropina(Figura 4). Testosterona e inhibina B, hormônios reprodutivos das células Leydig e Sertoli, respectivamente, foram identificados e quantificados a partir do meio organoide(Figura 4A). Ao longo de 12 semanas de cultura, ambos os hormônios foram medidos para responder significativamente à suplementação de gonadotropinas FSH e hCG (seta vermelha denota o início da suplementação, durante as semanas 2 – 12). Ao término, foi realizado um teste para determinar se a responsividade endócrina foi preservada. As gonadotropinas foram removidas por 48 h, durante as quais as concentrações de testosterona e inhibin B diminuíram significativamente na concentração. Após 48 h, as gonadotropinas foram devolvidas à cultura e ambas as concentrações hormonais aumentaram significativamente novamente ao longo das 24 horas finais, demonstrando a adequada resposta endócrina(Figura 4B). Coletivamente, esses resultados de ensaios histológicos e endócrinos demonstram que os organoides testiculares são um modelo útil para estudar o desenvolvimento testicular (ou seja, de nova compartimentação e tubulogênese) e função testicular de células somáticas in vitro (por exemplo, formação de junção apertada e função endócrina).
Figura 1: Organoides se auto-montam em condições de cultura 2D e 3D, ECM e ECM.
As células testiculares murinas de 5 dpp foram cultivadas em quatro condições diferentes: 2D ECM-free (linha A),2D ECM (linha B),3D ECM-free (linha C)e ECM 3D (linha D). Gráficos que retratam o método de cultura são fornecidos na coluna à esquerda. Montagens de imagens representativas foram montadas a partir de imagens de lapso de tempo capturadas durante a cultura ao vivo. Os pontos de tempo para cada imagem são rotulados na margem superior. O tempo 0 h é antes de qualquer montagem organoide ter ocorrido, o tempo de 3h é durante o contínuo montagem organoide orientado por células, e vezes 6 h e 9h demonstram organoides representativos, formados com sucesso. Setas amarelas marcam aglomerados celulares e setas vermelhas marcam locais onde aglomerados celulares separados migraram e se fundiram. Todas as barras de escala = 1 mm. (E) O tempo necessário antes que os aglomerados celulares separados pudessem ser visivelmente apreciados foi registrado para cada condição. 2DF = 2D livre de ECM; 2DE = ECM 2D; 3DF = 3D ECM-free; 3DE = 3D ECM. (F) Área por cluster foi medida para cada condição de cultura. As imagens foram selecionadas a partir de n= 3 – 5 experimentos separados. Anova unidirecional com o teste de comparações múltiplas de Tukey foi usado para determinar a significância em 1E e 1F; gráficos foram montados a partir dos meios de experimentos separados n=4. Este número foi modificado de Edmonds e Woodruff37. © IOP Publishing. Reproduzido com permissão. Todos os direitos reservados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Organoides cultivados 2D ECM e 3D sem ECM apresentam compartimentação de tipos de células tubulares e intersticiciais.
Imagens representativas de brightfield e imunofluorescentes de organoides auto-montados após 72 h de cultura. Amostras sem ECM 2D foram imagens de montagem inteira, todas as outras amostras foram imagens em seções de tecido de 5 μm. (A – D) Cultura livre de ECM 2D. (E – H) Cultura 2D ECM. (I – L) Cultura livre de ECM 3D. (M – P) cultura 3D ECM. Os marcadores específicos de células utilizados para análise são rotulados na margem superior: núcleos celulares sertoli (SOX9) e corpos celulares (βCatenin), células germinativas (DDX4, um marcador de células germinativas pan), células leydig (3βHSD) e células peritubulares (αSMA). Todas as amostras fluorescentes foram co-manchadas para DNA com DAPI. Setas amarelas apontam para células germinativas marcadas por DDX4 na segunda coluna da esquerda, setas vermelhas apontam para aglomerados de células sertoli nas duas colunas direitas. Barras de escala de campo brilhante = 400 μm, barras de escala fluorescentes = 100 μm. Este número foi modificado de Edmonds e Woodruff37. © IOP Publishing. Reproduzido com permissão. Todos os direitos reservados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Organoides desenvolvem estruturas semelhantes a túbulos povoadas por células germinativas raras.
Organoides montados sem ECM sem 3D foram cultivados por 14 dias. (A-D) Imagens representativas de H&E e imunofluorescentes detalhando tipos de células e características teciduais em torno de estruturas semelhantes a túbulos (TLS); o mesmo organoide é retratado em seções de tecido adjacentes que permitem a comparação lado a lado das características morfológicas: células leydig (3βHSD), células peritubulares (αSMA), corpos celulares sertoli (βCatenin), membrana de colágeno (COL IV) e núcleos celulares Sertoli (SOX9); barras de escala = 100 μm. (E – G) A rotulagem imunofluorescente foi realizada contra células germinativas, incluindo um marcador de células germinativas pan (DDX4), marcador de células-tronco espermatogonial (SALL4) e espermatocitocitos meioticamente ativos (SCP3). Insets altamente ampliados são delineados por painéis amarelos em 3E e 3F. Triângulos verdes apontam para células rotuladas por DDX4; Setas vermelhas apontam para células rotuladas SALL4. (H) Micrografo eletrônico de transmissão representativo (TEM) de uma junção apertada entre células sertoli dentro de um organoide; Barra de escala TEM = 100 nm. (I – L) Imagens representativas de alta ampliação de um TLS rotulado para características-chave do epitélio seminifero, incluindo junções apertadas (ZO1) e laminina. O mesmo TLS é retratado em seções de tecido adjacentes em painéis I – L. Todas as amostras fluorescentes foram co-manchadas para DNA com DAPI. As imagens foram selecionadas a partir de experimentos biológicos separados n=7. Este número foi modificado de Edmonds e Woodruff37. © IOP Publishing. Reproduzido com permissão. Todos os direitos reservados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Organoides secretam testosterona e inhibinA B ao longo de 12 semanas de cultura em resposta às gonadotropinas FSH e hCG.
A mídia condicionada coletada de organoides livres de 3D-ECM foi medida para testosterona e inhibina B através de ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). (A) Os organoides foram cultivados durante doze semanas, com suplementação de FSH e hCG durante as semanas 2 – 12 (o início da suplementação é marcado com uma seta vermelha no eixo x); todos os valores foram comparados ao 7º dia de cultura para testes estatísticos. (B) Gráfico ampliado de um "teste de reestimulação" para determinar se a responsividade endócrina foi preservada após 12 semanas. O período do teste é delineado pela caixa cinza em 4A. Ao completar 12 semanas na cultura, as gonadotropinas foram removidas por 48 h e depois re-suplementadas para um final de 24 horas de cultura. Os hormônios foram medidos em 0, 2, 6, 12 e 24 h após a reetimulação da gonadotropina; áreas de sombreamento vermelho designam períodos de tempo durante a cultura com FSH e hCG, áreas não sombreadas designam períodos de tempo sem FSH e hCG; p-valores observados são relativos a 2 h após a reestimulação. A ANOVA bidirecional com o teste de comparação múltipla de Tukey foi usada para determinar a significância de todos os dados endócrinos, n=5 experimentos biológicos separados. Este número foi modificado de Edmonds e Woodruff37. © IOP Publishing. Reproduzido com permissão. Todos os direitos reservados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com a conclusão deste protocolo de geração organoide, o usuário terá quatro técnicas de cultura diferentes disponíveis para a montagem de construtos testiculares e organoides em ambientes livres de ECM ou ECM. É importante ressaltar que todos os quatro métodos permitem ao pesquisador observar não invasivamente a automontagem organoide ao longo do tempo através de imagens de lapso de tempo ou gravação de vídeo, e coletar mídias não invasivamente condicionadas para análise de hormônios e citocinas secretados, sem perturbar tecidos durante a cultura. Em todos os métodos, ao longo de 24 h, um experimentador pode gerar até centenas de organoides/construtos testiculares, como os números de células permitem. Esses métodos promovem a automontagem tecidual em construções com diferentes tamanhos e morfologias; o tamanho organoide depende do número celular e concentração utilizado na cultura, como visto em outros relatóriosorganoides 34. A redução do tamanho ou diâmetro organoide pode ajudar a reduzir o desenvolvimento de regiões internas de necrose que às vezes estão presentes em organoides maiores. Uma força particular dos métodos de protocolo 2D ECM e 3D sem ECM são sua capacidade de gerar organoides testiculares morfologicamente miméticos, contendo de novo compartimentação dos tipos de células tubulares versus intersticiciais. Além disso, organoides montados sem ECM 3D fornecem um modelo para de novo tubulogênese de TLS seminiferous, com células Sertoli e peritubulares adequadamente compartimentadas e orientadas. Este é um fenótipo importante para o estudo de organoides testiculares, e ainda é um desfecho variável entre diferentes relatos organoides testiculares; vários outros relatos carecem de compartimentação túbula versus interstitium e alguns até desenvolvem um fenótipo de "túcula de dentro para fora"32,33,,34,38. Embora nenhum dos métodos de geração organoide apresentado no presente manuscrito tenha sido caracterizado para manter grandes populações de células germinativas durante dias prolongados de cultura, uma vez que as células germinativas raramente foram observadas tão cedo quanto 72 h, tanto os métodos 2D ECM quanto 3D ECM-free podem fornecer uma ferramenta útil para estudar tubulogênese in vitro e o componente celular somático de um ambiente de nicho espermatogonial. Com esse objetivo em mente, os organoides testiculares fornecem uma plataforma potencial para otimizar protocolos futuros para melhorar a manutenção de células-tronco de germinais in vitro, a progressão meiotic e a diferenciação.
Outra vantagem desses protocolos é a capacidade de personalizar e escalar a geração organoide. Populações de células personalizadas, tratadas com drogas ou projetadas podem substituir ou ser usadas além das células testiculares primárias do rato37. Se as suspensões celulares forem de baixa viabilidade (<80 %), devem ser tomados métodos para melhorar a viabilidade celular da suspensão celular. Estes podem incluir a redução do tempo gasto em mídia de dissociação e a minimização da trituração durante a digestão tecidual (etapas 2.4.1 – 2.5.2), aumentar o número de lavagens após a dissociação, ou remover células mortas após dissociação com kits de classificação celular ou rotulagem de células mortas. No entanto, nenhuma dessas etapas foi necessária para produzir os dados representativos compartilhados neste relatório. Para métodos de cultura 2D e 3D ECM, esses protocolos podem ser utilizados com outras matrizes biomateriais estruturais baseadas em proteínas, além daquelas utilizadas para os estudos aqui apresentados. Esses outros biomateriais incluem colágeno, gelatina, extratos ECM disponíveis comercialmente e hidrogéis derivados de ECM feitos sob medida25,,26,,28. Existem algumas dicas para dispensar gel ECM de tiro de problemas e criar inserções de placa 3D Petri de alta qualidade. Ao lançar géis ECM em placas de câmara, certifique-se de trabalhar rapidamente e use pontas de pipeta fria para evitar a polimerização prematura do ECM dentro de um tubo ou ponta de pipeta antes de dispensar no prato de cultura. Ao fundar agarose fundida nos moldes da placa 3D Petri (para cultura livre de ECM 3D), use apenas agarose quente e não quente para garantir a fundição de alta qualidade das pastilhas com variação mínima, e verifique se a agarose esfriou totalmente à temperatura ambiente e solidificou antes de tentar remover do molde. As placas de Petri 3D agarose são melhor manuseadas suavemente com fórceps finos. Ao coletar organoides para fixação, certifique-se de trabalhar sob um microscópio de dissecção para visualizar a coleta de todos os organoides. Organoides podem ficar ao lado plástico dos pratos culturais e ao interior das pontas da pipeta; pipetas de vidro apresentam menos adesão organoide do que plástico. Fixar organoides enquanto ainda encapsulados dentro ou em cima do ECM é um processo mais desafiador e delicado do que removê-los do ECM antes da fixação. O gel de processamento de tecidos pode ser lançado acima da construção ECM-organóide antes da remoção da câmara de cultura para ajudar a reforçar o gel antes da fixação39. A fixação deve ser realizada à temperatura ambiente para recuperar hidrogéis ECM, pois eles provavelmente des polimerizar se reduzidos a 4 °C. Além disso, 0,1 % - 1,0 % glutaraldeído pode ser adicionado à solução PFA de 4 % para ajudar a cruzar ainda mais o ECM; no entanto, este método aumenta a autofluorescência de fundo da amostra.
Há limitações consideráveis específicas das células germinativas aos resultados alcançados pelos métodos de geração organoide apresentados acima, que representam áreas prioritárias para a inovação futura. As células germinativas são mal apoiadas sobre a cultura estendida, só são facilmente observadas durante os primeiros dias de cultura e raramente são observadas até o final da primeira semana de cultura e em momentos posteriores. Enquanto espermatogonia indiferenciada pode ser mantida dentro da cultura in vitro celular, mantendo sua capacidade de restaurar a espermatogênese após o transplante em túbulos in vivo40, o microambiente túbulo somático (ou seja, interações celulares sertoli diretas) é hipótese de ser um pré-requisito para diferenciar células germinativas pré-meiotic em e através de meiose e espermaiogênese in vitro1,,5,,40,,41. Organoides testiculares contendo espermatogonia em pontos de tempo precoces dentro de um TLS estruturalmente mimético podem permitir que o campo estude não invasivamente interações somáticas-somáticas e células germinativas somáticas inteiramente in vitro. Otimização de aditivos de mídia e preparação celular antes da cultura (por exemplo, incorporação de agentes usados para cultura de células-tronco in vitro)42,43 podem aumentar o rendimento das células germinativas em estudos futuros, especialmente em períodos de cultura maiores que vários dias. Inversamente, os métodos para reinserir a espermatogonia após a formação de TLS, como através da microinjeção, representam uma oportunidade interessante para restaurar células germinativas dentro de organoides, e testar a capacidade de ambientes somáticos organizados in vitro para manter células germinativas. Outros fatores biológicos têm sido observados para afetar a cultura ex vivo explant, incluindo idade/maturidade45 e diferenças genéticas de fundo17. Essas mesmas variáveis ainda não foram diretamente investigadas no campo da biologia organoide testicular. No entanto, é plausível que diferentes montagem, morfologia e fenótipos funcionais possam resultar quando organoides são gerados a partir de células isoladas de animais de idade diferente (ou seja, neonatais, juvenis, adultos) ou animais de diferentes origens genéticas (por exemplo, diferentes cepas de camundongos).
Em resumo, as técnicas compartilhadas neste manuscrito fornecem quatro modelos úteis para estudar a automontagem de construção testicular orientada por células, a geração de dois modelos organoides testiculares estruturalmente miméticos separados e a importante realização do desenvolvimento da TLS e da função endócrina responsável por hormônios in vitro. Esses modelos abrangem orientações espaciais 2D e 3D em ambientes ECM e ECM com mídias culturais minimamente complexas e completamente definidas. Cada método é altamente reprodutível e usa apenas recursos culturais comumente disponíveis. Esses métodos podem ser vantajosos para estudar morfogênese testicular in vitro e otimizar condições futuras de cultura para espermatogênese in vitro. Além disso, os métodos 2D ECM e 3D ECM-free fornecem uma nova ferramenta para estudar o processo de compartimentação de tecido de novo exclusiva do testis, tubulogênese in vitro e interações células somáticas e somáticas-germinativas. Organoides testiculares proporcionam uma oportunidade flexível e escalável para investigar o desenvolvimento e regulação de marcas fisiológicas testiculares somáticas; incluindo a barreira do exame de sangue e a produção e resposta endócrina; e, também, uma ferramenta útil para o desenvolvimento de modelos de tecido de pesquisa translacional de última geração. Estes incluem a incorporação de hormônios reprodutivos em modelos de nível de sistemas maiores, como tecido-em-um-CHIP e plataformas micro-fisiológicas45,,46. Outros objetivos translacionais para os quais os organoides testiculares podem um dia ser aplicados incluem toxicologia reprodutiva e testes de barreira imunológica, desenvolvimento de contraceptivos masculinos e inovação em tecnologia reprodutiva assistida.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD) F31 HD089693, instituto nacional de ciências da saúde ambiental / Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 e 4UH3ES029073-03, e o Professor Memorial Thomas J. Watkin.
Os autores gostariam de agradecer a Eric W. Roth por sua ajuda com a microscopia eletrônica de transmissão. Este trabalho fez uso da instalação BioCryo do NUANCE Center da Northwestern University, que recebeu apoio do Recurso Experimental de Nanotecnologia Macia e Híbrida (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); o programa MRSEC (NSF DMR-1720139) no Centro de Pesquisa de Materiais; o Instituto Internacional de Nanotecnologia (IIN); e o Estado de Illinois, através do IIN. Também fez uso do equipamento CryoCluster, que recebeu apoio do programa de ressonância magnética (NSF DMR-1229693). Os gráficos na Figura 1 foram projetados usando BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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