Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/61403
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Summary

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Abstract

Testiculaire organoïden bieden een hulpmiddel voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese, en endocrinologie in vitro. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om testiculaire organoïden te maken. Veel van deze methoden vertrouwen op extracellulaire matrix (ECM) ter bevordering van de novo weefselassemblage, maar er zijn verschillen tussen methoden in termen van biomimetische morfologie en functie van weefsels. Bovendien zijn er weinig directe vergelijkingen van gepubliceerde methoden. Hier wordt een directe vergelijking gemaakt door verschillen in organoïde generatieprotocollen te bestuderen, met verstrekte resultaten. Vier archetypische generatiemethoden: (1) 2D ECM-vrij, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-vrij en (4) 3D ECM-cultuur worden beschreven. Drie primaire benchmarks werden gebruikt om de testiculaire organoïde generatie te beoordelen. Dit zijn cellulaire zelfassemblage, opname van grote celtypen (Sertoli, Leydig, kiem, en peritubulaire cellen), en adequaat gecompartimenteerde weefselarchitectuur. Van de vier geteste omgevingen genereerden 2D ECM- en 3D ECM-vrije culturen organoïden met interne morfologieën die het meest lijken op inheemse teelballen, waaronder de de novo compartimentering van buisvormige versus interstitiële celtypen, de ontwikkeling van tubule-achtige structuren en een gevestigde langdurige endocriene functie. Alle bestudeerde methoden gebruikten ongesorteerde, primaire murine testiculaire celsuspensies en gebruikten algemeen toegankelijke kweekmiddelen. Deze testiculaire organoïde generatietechnieken bieden een zeer toegankelijke en reproduceerbare toolkit voor onderzoeksinitiatieven op het gebied van testiculaire organogenese en fysiologie in vitro.

Introduction

Testiculaire organoïden zijn een baanbrekende techniek voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese en fysiologie in vitro1,2,3,4. Verschillende methoden zijn onderzocht voor organoïde generatie; deze omvatten een verscheidenheid aan extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije kweeksystemen, zowel in tweedimensionale (2D) als in driedimensionale (3D) oriëntaties. Verschillende generatiemethoden kunnen verschillende cellulaire assemblagestrategieën bevorderen; dit resulteert in een hoge mate van morfologische en functionele variabiliteit tussen gepubliceerde organoïde modellen. Het doel van dit artikel is om de huidige toestand van in vitro testiculaire modellen te bespreken, en om te dienen als een sjabloon voor toekomstige onderzoekers, bij het ontwerpen van testiculaire organoïde experimenten. Binnen deze studie worden vier verschillende cultuursysteemarchetypen gedefinieerd en gekenmerkt in experimenteel proces en biologische uitkomst. Deze omvatten: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free en 3D ECM cultuurmethoden. De hierin gepresenteerde strategieën zijn bedoeld om eenvoudig, toegankelijk en zeer reproduceerbaar te zijn tussen verschillende laboratoria en onderzoeksgroepen.

Historisch voor de testis, de benaming "in vitro", is gebruikt voor verschillende cultuurmethoden van testiculaire weefsels en cellen. Deze omvatten organotypische weefsel/orgaankweekmethoden (d.w.z. explantcultuur)5, geïsoleerde halfnifereuze tubulicultuur6, testiculaire celkweek7, en methoden van de novo weefselmorfogenese (d.w.z., biologische constructies en organoïden)1. De eerste onderzoeken naar in vitro spermatogenese werden ongeveer 100 jaar geleden uitgevoerd, met de cultuur van konijn testis explants in 19208, en later in 1937 met muis explants9. Binnen deze eerste experimenten spermatogonia werden waargenomen om grotendeels te degenereren in de eerste week van de cultuur, hoewel sommige meiotically differentiërende cellen werden geïdentificeerd. Doet denken aan deze historische rapporten, testis explant cultuur werd nieuw leven ingeblazen en geoptimaliseerd in 2011 om een haalbare techniek voor het bestuderen van de testis10. Sinds 2011 produceert de explantcultuur vruchtbaarheidsge competent sperma in meerdere rapporten11,12,13. Toch, als gevolg van explant cultuur afhankelijkheid van reeds bestaande inheemse testis tubuli, deze recente vooruitgang worden nauwkeuriger beschreven als voorbeelden van "ex vivo" testiculaire functie en spermatogenese, weefsel functie die werd gehandhaafd of hervat bij verwijdering uit het lichaam van een organisme. Ondanks de prevalentie in de literatuur, lange termijn kiemcel onderhoud en differentiatie binnen testiculaire explants is een uitdaging om te repliceren14,15,16,17,18, vooral over termijnen lang genoeg om volledig te observeren in vitro spermatogenese (~ 35 dagen bij muizen19 en 74 bij de mens20). Het is intrigerend om te begrijpen dat veel van dezelfde uitdagingen ervaren 100 jaar geleden, zijn nog steeds ervaren binnen ex vivo spermatogenese vandaag.

Anders dan ex vivo benaderingen, testiculaire organoïden zijn de novo geassembleerde microtissues die volledig in vitro worden gegenereerd uit cellulaire bronnen (d.w.z. primaire testiculaire cellen). Testiculaire organoïden bieden een creatieve strategie om de historische afhankelijkheid van het veld van reeds bestaand inheems weefsel te omzeilen en testiculaire biologie volledig in vitro samen te vatten. Er zijn meerdere eisen gedeeld door de meeste organoïde weefselmodellen; deze omvatten (1) in vivo-mimetische weefselmorfologie of architectuur, (2) meerdere belangrijke celtypen van het vertegenwoordigde weefsel, (3) zelfassemblage of zelforganisatie in hun generatie, en (4) de mogelijkheid om een bepaald niveau van de functie en fysiologie van het vertegenwoordigde weefsel te simuleren21,22,23,24. Voor de testis kan dit worden vastgelegd in vier belangrijke kenmerken: (1) de opname van belangrijke soorten testiculaire cellen, kiem,Sertoli, Leydig, peritubulaire, en andere interstitiële cellen, (2) cel-gerichte weefsel assemblage, (3) adequaat gecompartimenteerde celtypen in afzonderlijke buisvormige compartimenten (kiem en Sertoli) en interstitiële gebieden (alle andere celtypes), en (4) een zekere mate van weefselfunctie (bijvoorbeeld, reproductieve hormoon secretie of weefselreacties, en kiemcel onderhoud en differentiatie). Gezien de historische uitdagingen bij het handhaven van kiemceldifferentiatie ex vivo en in vitro, zijn de recapitulatie van in vivo-mimetische testiculaire architecturen (d.w.z. structuren die lijken op seminiferous tubuli) met extra markers die simulatie van testiculaire fysiologie suggereren (bijvoorbeeld endocriene functie), prioritaire mijlpalen zijn ten aanzien van het genereren van organoïden die op een dag in vitro spermatogenese zouden kunnen ondersteunen.

De meeste gepubliceerde testiculaire organoïde methoden maken gebruik van commercieel beschikbare ECM (bv. collageen of gepatenteerde ECM-formuleringen)25,26,27 of op maat gemaakte ECU's (d.w.z. gedecelluleerde testis ECM-afgeleide hydrogels)28,29,30. Exogene ECM bevordert de novo weefselvorming door het verstrekken van een assemblage-ondersteunende steiger voor weefsel generatie. ECM-methoden hebben een indrukwekkend niveau van weefselvorming geboden, waaronder enige aanwezigheid van kiemcelcellen en weefselmimetische morfologie25,28. De ECM's die zij gebruiken zijn echter niet altijd universeel beschikbaar (d.w.z. gedecelluleerde ECM-afgeleide hydrogels) en sommige methoden vereisen geavanceerde gel- en celzaaioriëntaties (bijvoorbeeld 3-laaggradiënten van ECM en 3D-printen)25,31,32. Steigervrije methoden (bijvoorbeeld hangende val en niet-loodzhemende kweekplaten)33,34,35 hebben ook robuuste en zeer reproduceerbare organoïden gegenereerd zonder de noodzaak van ECM-gels of steigers. De weefselmorfologie van deze steigervrije organoïden is echter vaak ongelijk aan in vivo teelballen, en de meeste van deze rapporten bevatten een biochemisch ECM-additief ter bevordering van weefselvorming33,34,36, of als alternatief, vertrouwen op centrifugatie voor geforceerde celaggregatie en verdichting34, waardoor ze minder ideaal zijn voor het bestuderen van celgestuurde migratie en zelforganisatie.

De vier organoïde generatie methoden gepresenteerd in dit manuscript omvatten zowel ECM-afhankelijke en onafhankelijke strategieën, elk met behulp van eenvoudige cel zaaien die de observatie van cel-gedreven organoïde zelfassemblage mogelijk maakt. Alle vier de technieken kunnen worden uitgevoerd vanuit dezelfde cel suspensies of kan gebruik maken van aangepaste en cel-type verrijkte populaties. Een kracht van deze methoden is het vermogen om organoïden zelf te assembleren in real-time te observeren, en om direct te vergelijken hoe testiculaire structuren zelf assembleren tussen verschillende cultuurmicro-omgevingen. De fenotypische verschillen tussen deze vier cultuurmethoden moeten worden overwogen voor hun impact op de onderzoeksvraag of het onderwerp van de onderzoeker. Elke methode produceert biologische constructies of organoïden binnen 24 uur of minder. Tot slot, de hier gepresenteerde methoden bieden een toolkit van organoïde assemblagetechnieken voor het bestuderen van testiculaire organoïde assemblage, weefselontwikkeling en testiculaire fysiologie in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle muis experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Northwestern University, en alle procedures werden uitgevoerd onder IACUC-goedgekeurde protocollen.

1. Bereiding van enzymatische oplossingen voor weefselesociatie

  1. Gebruik twee verschillende enzymatische oplossingen (Solution 1 en Solution 2), beide gemaakt met behulp van een basale cultuur medium oplossing (BM).
  2. Voeg voor de voorbereiding van BM serum en penicilline-streptomycine toe aan minimale essentiële medium tot eindconcentraties van respectievelijk 10% en 1% (zie tabel met materialen voor specifieke reagentia). Vervolgens steriel filter de BM door een 0,22 μm filter. Voor gebruik met cellen, pre-equilibrate steriele BM naar een neutrale pH door uit te geven in een kweekschaal en het plaatsen in een bevochtigde, 5% CO2 incubator op 37 °C voor een minimum van 1 uur.
    LET OP: BM kan maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard, waarna verse BM moet worden gemaakt.
  3. Om collagenase I stock oplossingen voor te bereiden, los eerst 100 mg collagenase I op in 1 mL steriele embryo kwaliteit H2O (uiteindelijke concentratie 10% m/v), omkeren of wervelen om op te lossen, en sla 20 μL aliquots op bij -20 °C voor later gebruik. Aliquots mogen slechts één keer ontdooid worden.
  4. Om deoxyribonuclease I (DNase I) voorraadoplossingen voor te bereiden, voegt u 20 mg DNase I toe in 1 mL steriel embryoniveau H2O (eindconcentratie 2% m/v), omkeren of wervelen om op te lossen (niet vortex), en 20 μL aliquots op te slaan bij -20 °C voor later gebruik. Aliquots mogen slechts één keer ontdooid worden.
  5. Voeg voor hyaluronidase-voorraadoplossingen 30 mg toe in 1 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; eindconcentratie 3% m/v hyaluronidase in PBS met Ca++/Mg++), omkeren of wervelen om op te lossen, en bewaar 100 μL aliquoten bij -20 °C voor later gebruik. Aliquots kunnen meerdere keren ontdooid en opnieuw worden ingevroren zonder verlies van enzymatische activiteit.
  6. Voeg 10 Solution 1μL collagenase I en 10 μL DNase I toe in 1 mL steriele, vooraf geëquilibreerde BM (Definitieve concentraties: 1 mg/mL collagenase I en 5 μg/mL DNase I). Trituraat voorzichtig met een pipet om de oplossing te mengen, en voorverwarmen tot 37 °C voor gebruik met het weefsel.
    OPMERKING: Oplossing 2 wordt bereid door 33 μL hyaluronidase (voorverwarmd tot 37 °C) per 1 mL van oplossing 1 (toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL). Dit gebeurt halverwege door enzymatische dissociatie van testisweefsel bij stap 2.5 hieronder.

2. Testis weefseldissociatie

LET OP: Alle muizen waren gehuisvest in polypropyleen kooien en voorzien van voedsel en water ad libitum. Dieren werden gevoed chow die geen fyto-oestrogenen bevat gevoed. Jonge CD-1 muizen, 5 dagen post-partum (dpp), werden gebruikt voor alle experimenten en verdoofd voorafgaand aan euthanasie en weefselverzameling, binnen een anesthesiekamer die is bevestigd aan een isoflurane vaporizer (2.5 L/min in O2). Muizen werden bevestigd voor volledige anesthesie via het ontbreken van een reactie op teen-prik, waarna muizen werden geëuthanaseerd via onthoofding.

  1. Verdoof muizen in een isofluranekamer, zorg voor anesthesie via een teenprik en onthoofd de muis vervolgens met een scherpe schaar. Plaats de geëuthanaseerde muis supine op een dissectie mat en steriliseren de buik met 70% ethanol. Tent de huid van de onderbuik met tangen en open de buik met een schaar.
  2. Zoek de teelballen in de linker- en rechter inguinale gebieden van de buik. Snijd hun verbindingen met de vas deferens en eventuele verankering bindweefsel, dan til de hele testis (met epididymis nog steeds bevestigd) van het dier. Plaats teelballen in een petrischaaltje van vooraf geëquilibreerde BM.
  3. Onder een dissectiemicroscoop en binnen een steriel veld, maak een kleine incisie in de tunica albuginea aan de ene kant van elke testis met ofwel een kleine microdissectie schaar of door zachtjes scheuren met behulp van twee fijne tangen.
    1. Vervolgens knijpt u tijdens het vasthouden van de testis aan het andere uiteinde van de incisie voorzichtig met fijne tangen en duw in een zachte vegende beweging naar het gat in de tunica; dit zal het testiculaire weefsel als één samenhangend stuk vrijgeven.
  4. Snijd de teelballen in kleinere stukken (≤ 2 mm3)en leg ze in 1 mL voorverwarmde (37 °C) dissociatieoplossing 1.
    1. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten.
    2. Voor meer dan 10 teelballen verhoog u het totale volume van de dissociatieoplossing met 1 mL, waarbij een minimum van 1 mL dissociatieoplossing per 10 teelballen wordt gegarandeerd (bijvoorbeeld 2 mL voor 20 teelballen, 3 mL voor 30 teelballen, enz.).
    3. Triturate de testis stukken 50 keer (50x) in oplossing 1 met behulp van een P1000 pipet. Zorg ervoor dat de tubuli scheiden van elkaar en van interstitiële weefsel op dit punt. Als klonten blijven, incubeer voor een extra 5 min en trituraat nogmaals (50x).
  5. Voeg 33 μL hyaluronidase-voorraadoplossing (voorverwarmd bij 37 °C, vanaf stap 1,5) per 1 mL van oplossing 1 dissociatiemengsel (met het gedeeltelijk gescheiden testiculaire weefsel en de tubuli) toe. Na toevoeging van hyaluronidase wordt dit oplossing 2 genoemd.
    1. Trituraat (50x) met behulp van een P1000 en incubaal bij 37 °C gedurende 5 minuten.
    2. Trituraat (50x) met behulp van een P200 pipet.
    3. Zorg ervoor dat op dit punt geen zichtbare tubuli of klonten cellen aanwezig zijn. Als klonten aanhouden, incubeer voor maximaal 5 min, met verdere trituratie met behulp van een P200 pipet (50x).
  6. Blus de dissociatieenzymen door foetaal runderserum (FBS) toe te voegen aan 10% van het totale volume van oplossing 2. Trituraat meerdere malen met behulp van een P200 pipet om ervoor te zorgen geen klonten blijven, en filter door een 40 μm cel zeef om een eencellige suspensie te produceren.
  7. Centrifugecellen op 100 x g gedurende 7 minuten, gooi de supernatant weg en roep de cellen opnieuw op in verse BM.
  8. Tel de totale en levensvatbare celconcentraties met trypan blauwe uitsluiting op een hemocytometer. Voeg 10 μL van 1:1 verdund, celsuspensie: trypan blauwe oplossing, in de hemocytometerceltelkamer toe (zie Tabel van Materialen).
    1. Re-centrifuge cellen op 100 x g gedurende 7 min en resuspend in verse BM.
      OPMERKING: Gebruik alleen levensvatbare cellen voor het berekenen van celconcentratie en -getal. Gebruik alleen celsuspensies van ≥ 80% levensvatbaarheid voor het genereren van organoïden.
    2. Bereid de suspensie van één cel in celconcentraties zoals beschreven voor om 280.000 cellen te verwerken, gezien de volumes die worden gebruikt in de onderstaande protocolspecifieke stappen in punt 3: 2D ECM-Vrij – 0,56 x 106 cellen/mL, 2D ECM – 0,56 x 106 cellen/mL, 3D ECM-Vrij – 4,66 x 106 cellen/mL, 3D ECM – 2,8 x 106 cellen/mL.
      LET OP: Alle hier gepresenteerde cultuurexperimenten beginnen met 280.000 cellen die per cultuur goed zijn gezaaid. Deze nummers komen overeen met de representatieve gegevens in figuur 1, figuur 2, figuur 3 en figuur 4.

3. Bereiding van organoïde kweekgerechten en zaaien van cellen

OPMERKING: Om een homogene ECM te garanderen, vóór ontdooien bevroren aliquots van ECM 's nachts voor het experimenteren. ECM-aliquoten moeten worden ondergedompeld in een emmer ijs in een koelkast van 4 °C of een koude ruimte om een langzame, geleidelijke temperatuurstijging te garanderen. Alle ECM wordt gebruikt bij een 1:1 definitieve verdunning in BM voor cultuur. Houd ontdooide ECM en 1:1 verdunde ECM op ijs tot vlak voor gebruik, anders zou de ECM voortijdig kunnen polymeriseren.

  1. Voor 2D ECM-vrije cultuur is geen speciale voorbereiding nodig, plaat eencellige suspensies (500 μL van 0,56 x 106 cellen/mL in BM) direct op 4- goed kamerdia's, en plaats in een 35 °C incubator voor cultuur.
    OPMERKING: Cellen moeten zich aan de onderkant van het kweekgerecht houden binnen de eerste 24 uur van de cultuur en kunnen binnen deze zelfde tijd enkele kleine 3D-celclusters vertonen.
  2. Voor 2D ECM cultuur, afzien van 100 μL koude 1:1 verdunde extracellulaire kelder matrix medium in een 4 put kamer glijbaan, zodat de gel dekt het geheel van de schotel bodem.
    1. Plaats de schuifkamer in een couveuse van 35 °C gedurende minimaal 30 minuten, zodat de ECM in een gel kan polymeriseren.
    2. Voeg de celsuspensie (500 μL van 0,56 x 106 cellen/mL in BM) direct toe aan de bovenkant van de 2D-gel zodra deze is gepolymeriseerd.
      OPMERKING: Cellen moeten samen clusteren tot kleine 3D-clusters binnen de eerste 24 uur van de cultuur.
  3. Voor 3D ECM-vrije cultuur, bereiden agarose 3D Petri schotel inserts voordat u begint met de celcultuur.
    1. Ten eerste, autoclave 1,5 g agarose poeder in een 100 mL beker, voeg dan 75 mL steriel, gedestilleerd water en magnetron te produceren gesmolten 2% agarose voor 3D Petri schotel gieten.
    2. Binnen een steriele werkruimte, afzien gesmolten agarose in de 3D Petri schotel schimmel totdat de meniscus is niveau met de zijkanten van de mal.
    3. Laat de agarose afkoelen en stollen. Wanneer solide, draai de mal ondersteboven en voorzichtig voorzichtig buigen herhaaldelijk tot de agarose 3D Petri schotel valt vrij van de mal.
      OPMERKING: Op dit punt kan men veel agarose 3D Petri gerechten bereiden en ze opslaan in steriele H2O of DPBS op 4 °C gedurende meer dan een maand.
    4. Voorafgaand aan het kweken, plaats agarose 3D Petri gerechten in een 24 goed cultuur gerecht, en bedek ze met 1 mL van BM. Laat de 3D Petri gerechten minstens 30 minuten in BM equilibrate in een 37 °C kweekcubator. Gooi de BM weg en herhaal het evenwicht nogmaals met 1 mL verse BM. Na evenwicht van 3D Petri gerechten in BM, zullen ze verschijnen dezelfde kleur als de BM (dat wil zeggen, roze).
    5. Om voor te bereiden op celzaaien, verwijder alle BM uit de put en doe 200 μL verse BM rond, maar niet in het midden uitsparing van de 3D Petri schotel. Verzamel ook de resterende BM vanuit het midden celzaaien uitsparing van de microwell insert.
    6. Doe de suspensie van één cel (4,66 cellen/mL in 60 μL BM) in de middenuitsparing van de agarose 3D Petri schotel. Voorzichtig tritureren op en neer om cellen te mengen en een enkele cel suspensie te garanderen aan het begin van de cultuur.
    7. Plaats in een bevochtigde 35 °C incubator voor cultuur. De volgende dag verwijdert u de 200 μL BM uit de microwell wisselplaat en vervangt u deze door 1 mL verse BM. Dit brengt het vloeistofniveau boven het vlak van de insert, het onderdompelen van de hele cultuur.
    8. Langzaam en voorzichtig verwijderen / voeg media van buiten de agarose 3D Petri schotel. De organoïden moeten 's nachts verdicht zijn, zodat ze aan de onderkant kunnen rusten en mediawisselingen ongestoord kunnen laten.
  4. Bereid voor 3D ECM-cultuur een eencellige suspensie door in gelijke delen de celsuspensie in BM te combineren met koude, voorbedachte ECM (uiteindelijke concentratie = 2,8 x 106 cellen/mL).
    1. Breng het cel-ECM mengsel onmiddellijk in een 4 put kamer schuif, zodat het mengsel de gehele bodem van de plaat bedekt.
    2. Plaats de kamerglijbanen op 35 °C in een couveuse en laat de inhoud ervan polymeriseren. Dit duurt minstens 30 minuten. Voeg na de polymerisatie 500 μL BM toe aan de bovenkant van de cultuur.
      OPMERKING: Cellen moeten zijn geclusterd om kleine 3D-aggregaten te vormen binnen de eerste 24 uur van de cultuur.

4. Organoïde onderhoud

  1. Cultuur alle organoïde modeltypes bij 35 °C. Voor Alle cultuur types wisselen de helft van hun media met verse BM elke 2 dagen. Om ervoor te zorgen dat organoïden niet per ongeluk worden verzameld tijdens het uitwisselen van medium, altijd verzamelen media langzaam uit een hoek van de kamer dia schotel, en vanaf een extern punt buiten agarose 3D Petri gerechten. Alle media kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voor gebruik met immunoassays of andere analyses later (d.w.z. kwantificering van uitgescheiden voortplantingshormonen of cytokinen).
  2. Gebruik na 7 dagen in cultuur BM met follikelstimulerend hormoon (eindconcentratie 20 mIU/mL) en menselijke chorionic gonadotropine (laatste concentratie 4,5 IE/mL). Dit geldt voor alle organoïde cultuurtypes.
  3. Routinematig beeld alle organoïde culturen (dat wil zeggen, time-lapse imaging) voor het karakteriseren van organoïde vorming en het kwantificeren van statistieken van zelfassemblage, ontwikkeling en groei in de tijd.

5. Organoid Collection

OPMERKING: Alle organoïden kunnen met 4% paraformaldehyde in PBS worden bevestigd voor downstream immunolabeling en histologische analyses. Fix for 2 h at room temperature with rotation, or overnight at 4 °C.

  1. Voor 2D ECM-vrije culturen, eerst spoelen het monster met verse PBS, en voeg fixatief direct op de top van de aangehangen constructies.
  2. Voor ECM (2D en 3D) cultuurmethoden, spoel een keer met PBS, en voeg vervolgens fixatief direct op de top van de ECM-organoïde monster (om de ECM gel en organoïden samen vast te stellen), of als alternatief, zachtjes pipette de organoïden op en neer om ze te bevrijden uit de omliggende ECM, en over te dragen aan een aparte buis voor fixatie.
  3. Voor 3D ECM-vrije cultuur, voorzichtig pipette de organoïden op en neer binnen het centrum uitsparing van de agarose 3D Petri schotel; dit zal spoelen de organoïden uit het vergemakkelijken van hun gemakkelijke collectie met een pipet. Breng vervolgens organoïden over naar een aparte buis voor fixatie.
  4. Voordat u tot paraffine wordt verwerkt, sluit u veel organoïden (≥ 20) in een klein volume (~ 30 μL) van weefselverwerkingsgel; dit helpt bij het oriënteren en concentreren van organoïden in een klein gebied binnen paraffineblokken, waardoor gemakkelijker wordt geobserveerd bij het doorsneed en gemakkelijker visuele identificatie binnen paraffinesecties.
    OPMERKING: Organoïden kunnen een uitdaging zijn om te identificeren na paraffine inbedding en sectie op een microtome.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Organoïde generatie werd beschouwd als niet succesvol als testiculaire cellen niet zelf assembleren binnen 72 uur van de cultuur, echter, alle methoden hier gepresenteerd verzamelen binnen 24 uur bij het gebruik van jonge (5 dpp) murine cellen. Falen van biologische constructgeneratie gepresenteerd als een voortzetting van vrij zwevende cellen (0 h kolom in figuur 1) zelfs na uitgebreide cultuur (72 h). Bij afwezigheid van zelfassemblage van weefsel, alle schijnbare celclusters gemakkelijk verspreid in individuele cellen bij zelfs zachte manipulatie (dat wil zeggen, pipetting). Met succes gegenereerde weefsels werden aanvankelijk waargenomen als 3D-cel "clusters" (gele pijlen in 6 h kolom van figuur 1). Binnen ECM-vrije omgevingen (2D en 3D) bleken deze constructies zichtbaar "compact" over de eerste 24 uur van de cultuur, vooral wanneer in 3D agarose Petri gerechten (figuur 1A,C). In ECM-omgevingen (2D en 3D) beschikten celclusters duidelijke marges tussen het cluster en hun omgeving (figuur 1B, D). Celclusters werden ook waargenomen om over de ECM te migreren en samen te smelten en grotere clusters te vormen (rode pijlen in figuur 1B). De tijd die nodig was om afzonderlijke zelf geassembleerde structuren te waarderen werd gemeten en er was geen significant verschil in tijd nodig tussen zowel 2D- als 3D ECM-vrije omstandigheden en 2D ECM, maar de 3D ECM-cultuur vergde aanzienlijk meer tijd om de novo-structuren samen te stellen dan alle andere cultuurmethoden(figuur 1E). 2D ECM-vrije en 3D ECM-kweekgegenereerde celclusters met aanzienlijk kleinere afmetingen dan 2D ECM- en 3D ECM-vrije kweekmethoden; 3D ECM-vrije cultuur produceerde de grootste clusters met een enkele grote en compacte cluster binnen elke put van de 3D agarose Petri schotel (Figuur 1C,F). Samengevat tonen deze gegevens het gemak aan waarmee testiculaire biologische constructies van primaire cellen van jonge muizen in vier archetypische cultuuromgevingen kunnen worden geproduceerd en verschillende celgestuurde assemblage-fenotypes binnen deze verschillende cultuuromgevingen kunnen worden belicht.

Een doel van alle organoïde modellen is om een innerlijke morfologie mimetisch van inheems weefsel samen te vatten. Om dit resultaat te beoordelen, werden biologische constructies die binnen elke kweektoestand werden samengesteld, gedurende 72 uur gekweekt en vervolgens gesoneerd op celspecifieke markers en gevisualiseerd met immunofluorescentie (figuur 2). Variabiliteit in weefselmorfologie werd waargenomen tussen verschillende kweekmethoden. 2D ECM-vrije organoïden gepresenteerd als clusters van Sertoli cellen (SOX9 en βCatenin) met een aantal kiemcellen (DDX4, een pan kiemcelmarker) gehecht op de top van een 2D basale confluent laag met veel somatische cellen, waaronder Sertoli, peritubular (αSMA), en Leydig cellen (3βHSD)( 2A-D). Merk op dat figuur 2B-D epifluorescente beelden zijn van het gehele 2D ECM-vrije monster, niet een sectie van 5 μm; dit maakt visualisatie van zowel de basale somatische cellaag als de superieur georiënteerde aggregaten van Sertoli en kiemcellen mogelijk. Daarentegen werd de 2D ECM-cultuur gepresenteerd met een grotendeels ander fenotype, omdat duidelijke biologische structuren met verschillende randen gemakkelijk werden onderscheiden bovenop de basale ECM-gel(figuur 2E). Deze structuren bezaten een complexe innerlijke morfologie met de novo compartimentering van tubuli vs interstitiële celtypes van de testis, en dus werden beschouwd als succesvolle organoïden. Buisvormige gebieden bevatten Sertoli, peritubulaire, en kiemcellen, en interstitiële gebieden bevatte Leydig, peritubulaire cellen en niet-gelabelde cellen (Figuur 2F-H). Ook 3D ECM-vrije organoïden bezaten een gecompartimenteerde innerlijke morfologie en werden dus beschouwd als succesvolle organoïden. In het bijzonder werden 3D ECM-vrije organoïden onderscheiden door buisvormige gebieden die peritubulaire cellen bevatten die specifiek gericht waren op groepen Sertoli en kiemcellen met hoge getrouwheid(figuur 2I-L). 3D ECM geassembleerde structuren beschikten niet over een geavanceerde morfologie, maar werden in plaats daarvan waargenomen als clusters van Sertoli cellen, met af en toe kiem en Leydig cellen. In deze monsters bleven veel Sertoli en niet-gelabelde cellen tussen organoïden hangen in een "stroma-achtige" oriëntatie(figuur 2M-P). Samen wijzen deze gegevens op de variabiliteit in morfologische fenotypes die verschillende organoïde generatiemethoden produceren en ondersteunt het gebruik van twee specifieke organoïde assemblageomgevingen, 2D ECM en 3D ECM-vrij, voor de generatie van testiculaire organoïden met een innerlijke morfologie zeer mimetisch van testiculaire compartimentering.

Om de testiculaire organoïde functie verder te beoordelen, werden 3D ECM-vrije geassembleerde organoïden geselecteerd voor een diepere langetermijnanalyse. Voor deze studie werden deze organoïden 14 dagen gekweekt en vervolgens onderzocht op cel- en structuurspecifieke markers. Na immunofluorescente analyse na 14 dagen werden 3D ECM-vrije organoïden waargenomen om tubule-achtige structuren (TLS) en een weefselarchitectuur te bevatten die opmerkelijk lijkt op in vivo teelballen(figuur 3A-D). Interstitiële cellen bevonden zich op de juiste wijze in afzonderlijke regio's van TLS. Weefselsecties werden vervolgens onderzocht op de pankiemcelmarker, DDX4, spermatogonale stamcelmarker, SALL4 en meiosemarker, SCP3 (figuur 3E-G). Zeldzame DDX4-positieve en SALL4-positieve cellen werden waargenomen, maar er werd geen SCP3-signaal geïdentificeerd. Na diepere karakterisering van TLS, werden ze waargenomen om een lumen-verschijnende ruimte omgeven door gepolariseerde Sertoli cellen en een externe monolaag van peritubular cellen (Figuur 3I-L) bevatten. Sertoli cellen vertoonden ook strakke verbindingen tussen elkaar, zoals gevisualiseerd met transmissie elektronenmicroscopie en met etikettering tegen ZO-1, een junctional eiwit en component van de bloedtestis barrière (Figuur 3H,L). Vervolgens werden 3D ECM-vrije organoïden bestudeerd voor endocriene functie in 12 weken durende, lange termijn cultuur met gonadotropin stimulatie (Figuur 4). Testosteron en inhibine B, reproductieve hormonen uit respectievelijk Leydig- en Sertoli-cellen, werden zowel geïdentificeerd als gekwantificeerd uit organoïde geconditioneerd medium(figuur 4A). Meer dan 12 weken van cultuur, beide hormonen werden gemeten om aanzienlijk te reageren op de suppletie van gonadotropins FSH en hCG (rode pijl duidt op het begin van suppletie, tijdens week 2 – 12). Na afloop werd een test uitgevoerd om te bepalen of de responsiviteit van endocriene behouden bleef. Gonadotropinen werden verwijderd voor 48 uur, waarbij zowel testosteron en inhibine B concentraties aanzienlijk verminderd in concentratie. Na 48 uur werden gonadotropins teruggebracht naar de cultuur en beide hormoonconcentraties namen aanzienlijk weer toe over een laatste 24 uur, wat de juiste endocriene responsiviteit aantoont(figuur 4B). Gezamenlijk tonen deze histologische en endocriene testresultaten aan dat testiculaire organoïden een nuttig model zijn voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling (d.w.z. de novo compartimentering en tubulogenese) en somatische celtesticulaire functie in vitro (bijvoorbeeld, strakke verbindingsvorming en endocriene functie).

Figure 1
Figuur 1: Organoïden assembleren zelf in 2D- en 3D-, ECM- en ECM-vrije kweekomstandigheden.
5 dpp murine testiculaire cellen werden gekweekt in vier verschillende omstandigheden: 2D ECM-vrij (rij A), 2D ECM (rij B), 3D ECM-vrij (rij C) en 3D ECM (rij D). Afbeeldingen die de cultuurmethode weergeven, worden weergegeven in de linkerkolom. Representatieve beeldmontages werden samengesteld uit time-lapse beelden die tijdens de live cultuur werden vastgelegd. Tijdstippen voor elke afbeelding worden gelabeld bij de bovenste marge. Tijd 0 h is voordat een organoïde assemblage heeft plaatsgevonden, tijd 3 uur is tijdens de lopende cel-gedreven organoïde assemblage, en keer 6 h en 9 h tonen representatieve, met succes gevormde organoïden. Gele pijlen markeren celclusters en rode pijlen markeren locaties waar afzonderlijke celclusters zijn gemigreerd en samengevoegd. Alle schaalbalken = 1 mm. (E) Tijd die nodig is voordat afzonderlijke celclusters zichtbaar kunnen worden gewaardeerd, werd voor elke voorwaarde geregistreerd. 2DF = 2D ECM-vrij; 2DE = 2D ECM; 3DF = 3D ECM-vrij; 3DE = 3D ECM. (F) Voor elke cultuurconditie werd het gebied per cluster gemeten. Beelden werden geselecteerd uit n = 3 – 5 afzonderlijke experimenten. One-way ANOVA met Tukey's multiple comparisons test werd gebruikt om de betekenis in 1E en 1F te bepalen; grafieken werden samengesteld uit de middelen van n = 4 afzonderlijke experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Edmonds en Woodruff37. © IOP Publishing. Gereproduceerd met toestemming. Alle rechten voorbehouden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: 2D ECM en 3D ECM-vrije gekweekte organoïden vertonen compartimentering van buisvormige en interstitiële celtypen.
Representatieve brightfield en immunofluorescente beelden van zelf-geassembleerde organoïden na 72 h van cultuur. 2D ECM-vrije monsters werden afgebeeld hele mount, alle andere monsters werden afgebeeld in 5 μm weefsel secties. (A – D) 2D ECM-vrije cultuur. (E – H) 2D ECM cultuur. (I – L) 3D ECM-vrije cultuur. (M – P) 3D ECM cultuur. Celspecifieke markers die voor analyse worden gebruikt, worden gelabeld op de bovenste marge: Sertoli-celkernen (SOX9) en cellichamen (βCatenin), kiemcellen (DDX4, een pankiekiekiecelmarker), Leydig-cellen (3βHSD) en peritubulaire cellen (αSMA). Alle fluorescerende monsters werden mede-gekleurd voor DNA met DAPI. Gele pijlen wijzen naar DDX4-gemarkeerde kiemcellen in de tweede kolom van links, rode pijlen wijzen naar Sertoli-celclusters in de rechter twee kolommen. Heldere veldschaalbalken = 400 μm, tl-schaalbalken = 100 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Edmonds en Woodruff37. © IOP Publishing. Gereproduceerd met toestemming. Alle rechten voorbehouden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Organoïden ontwikkelen tubuleachtige structuren bevolkt door zeldzame kiemcellen.
3D-ECM-vrije geassembleerde organoïden werden 14 dagen gekweekt. (A-D) Representatieve H&E- en immunofluorescente beelden die celtypen en weefselkenmerken rond tubuleachtige structuren (TLS) beschrijven; dezelfde organoïde wordt afgebeeld in aangrenzende weefselsecties die een vergelijking mogelijk maken van morfologische kenmerken: Leydig-cellen (3βHSD), peritubulaire cellen (αSMA), Sertoli-cellichamen (βCatenin), collageenmembraan (COL IV) en Sertoli-celkernen (SOX9); schaalbalken = 100 μm. (E – G) Immunofluorescente etikettering werd uitgevoerd tegen kiemcellen, waaronder een pankiemcelmarker (DDX4), spermatogonale stamcelmarkering (SALL4) en meiotically actieve spermatocyten (SCP3). Sterk vergrote insets worden geschetst door gele panelen in 3E en 3F. Groene driehoeken wijzen naar DDX4-gelabelde cellen; Rode pijlen wijzen naar SALL4-gelabelde cellen. (H) Representatieve transmissieelektronmicrograaf (TEM) van een nauwe verbinding tussen Sertoli-cellen in een organoïde; TEM-schaalbalk = 100 nm. (I – L) Hoge vergroting representatieve beelden van een TLS gelabeld voor de belangrijkste kenmerken van de seminiferous epitheel met inbegrip van strakke knooppunten (ZO1) en laminine. Dezelfde TLS is afgebeeld in aangrenzende weefselsecties in panelen I – L. Alle fluorescerende monsters werden mede-gekleurd voor DNA met DAPI. Beelden werden geselecteerd uit n=7 afzonderlijke biologische experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Edmonds en Woodruff37. © IOP Publishing. Gereproduceerd met toestemming. Alle rechten voorbehouden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Organoïden scheiden testosteron en inhibine B uit over 12 weken cultuur in reactie op gonadotropins FSH en hCG.
Geconditioneerde media verzameld uit 3D-ECM-vrije organoïden werd gemeten voor testosteron en inhibine B via enzym-gebonden immunosorbent test (ELISA). (A) Organoïden werden gedurende twaalf weken gekweekt, met FSH en hCG suppletie tijdens de weken 2 – 12 (begin van suppletie is gemarkeerd met een rode pijl op de x-as); alle waarden werden vergeleken met dag 7 van de cultuur voor statistische tests. (B) Vergrootgrafiek van een "re-stimulatietest" om te bepalen of de responsiviteit van de endocriene na 12 weken is bewaard. De periode van de test wordt geschetst door het grijze vak in 4A. Na 12 weken cultuur werden gonadotropins 48 uur lang verwijderd en vervolgens opnieuw aangevuld voor een laatste 24 uur cultuur. Hormonen werden gemeten bij 0, 2, 6, 12 en 24 uur na gonadotropin re-stimulatie; roodschaduwgebieden wijzen perioden aan tijdens de cultuur met FSH en hCG, niet-schaduwrijke gebieden wijzen perioden aan zonder FSH en hCG; nota-waarden zijn relatief ten opzichte van 2 uur na herstimulatie. Tweerichtings ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey werd gebruikt om de betekenis voor alle endocriene gegevens te bepalen, n=5 afzonderlijke biologische experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Edmonds en Woodruff37. © IOP Publishing. Gereproduceerd met toestemming. Alle rechten voorbehouden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met de voltooiing van dit organoïde generatieprotocol heeft de gebruiker vier verschillende cultuurtechnieken tot hun beschikking voor het assembleren van testiculaire constructies en organoïden in ECM- of ECM-vrije omgevingen. Belangrijk is dat alle vier de methoden de onderzoeker in staat stellen om organoïde zelfassemblage in de loop van de tijd niet te observeren door middel van time-lapse beeldvorming of video-opname, en om niet-invasief geconditioneerde media te verzamelen voor analyse van uitgescheiden hormonen en cytokines, zonder weefsels tijdens de cultuur te storen. In alle methoden, in de loop van 24 uur, een experimentator kan genereren maar liefst enkele honderden organoïden / testiculaire constructies, zoals celnummers toestaan. Deze methoden bevorderen weefsel zelfassemblage in constructies met verschillende maten en morfologieën; organoïde grootte is afhankelijk van het celnummer en de concentratie die in de cultuur worden gebruikt, zoals te zien is in andere organoïde rapporten34. Het verminderen van de organoïde grootte of diameter kan helpen verminderen de ontwikkeling van binnenste gebieden van necrose die soms presenteert in grotere organoïden. Een bijzondere sterkte van 2D ECM en 3D ECM-vrije protocolmethoden zijn hun vermogen om morfologisch mimetische testiculaire organoïden te genereren, die de novo compartimentering van buisvormige versus interstitiële celtypen bevatten. Bovendien bieden 3D ECM-vrije geassembleerde organoïden een model voor de novo tubulogenese van halfniferous TLS, met de juiste gecompartimenteerde en georiënteerde Sertoli en peritubular cellen. Dit is een belangrijk fenotype voor het bestuderen van testiculaire organoïden, en is nog steeds een variabele uitkomst onder verschillende testiculaire organoïde rapporten; meerdere andere rapporten ontbreken tubule versus interstitium compartimentering en sommige zelfs de ontwikkeling van een "inside-out tubule" fenotype32,33,34,38. Hoewel geen van de organoïde generatiemethoden die in het onderhavige manuscript werden gepresenteerd, werden gekenmerkt om grote kiemcelpopulaties te behouden gedurende langere dagen van cultuur, omdat kiemcellen zelden werden waargenomen al vanaf 72 uur, kunnen zowel 2D ECM- als 3D ECM-vrije methoden een nuttig hulpmiddel zijn om in vitro tubulogenese en de somatische celcomponent van een spermatogonale nicheomgeving te bestuderen. Met dit doel voor ogen bieden testiculaire organoïden een potentieel platform voor het optimaliseren van toekomstige protocollen om het onderhoud van in vitro kiemlijnstamcellen, meiotische progressie en differentiatie te verbeteren.

Een ander voordeel van deze protocollen is de mogelijkheid om organoïde generatie aan te passen en te schalen. Aangepaste, met geneesmiddelen behandelde of gemanipuleerde celpopulaties kunnen naast primaire muistesticulaire cellen37vervangen of worden gebruikt. Als celsuspensies een lage levensvatbaarheid hebben (<80 %), moeten methoden worden genomen om de levensvatbaarheid van de cel van de cellulaire suspensie te verbeteren. Deze kunnen onder meer het verminderen van de tijd doorgebracht in dissociatie media en het minimaliseren van trituratie tijdens weefselvertering (stappen 2.4.1 – 2.5.2), het verhogen van het aantal wasbeurten na dissociatie, of het verwijderen van dode cellen na dissociatie met cel-sorteren of dode cel etikettering kits. Geen van deze stappen was echter niet nodig om de representatieve gegevens te produceren die in dit verslag werden gedeeld. Voor 2D- en 3D ECM-kweekmethoden kunnen deze protocollen worden gebruikt met andere structurele op eiwitten gebaseerde biomatrices, naast die welke worden gebruikt voor de hier gepresenteerde studies. Deze andere biomaterialen omvatten collageen, gelatine, commercieel verkrijgbare ECM-extracten en op maat gemaakte gedecellulariseerde ECM-afgeleide hydrogels25,26,28. Er zijn een paar tips voor het moeilijk schieten ECM gel uitdelen en het creëren van hoge kwaliteit agarose 3D Petri schotel inserts. Bij het gieten van ECM gels op kamerplaten, moet u snel werken en koude pipet tips gebruiken om voortijdige polymerisatie van de ECM in een buis of pipet tip te voorkomen voorafgaand aan het afgeven in de kweekschaal. Bij het gieten gesmolten agarose in de 3D Petri schotel mallen (voor 3D ECM-vrije cultuur), gebruik alleen warm en niet warm agarose om hoge kwaliteit gieten van de inserts met minimale variatie te garanderen, en controleer of de agarose volledig is afgekoeld tot kamertemperatuur en gestold voordat u probeert te verwijderen uit de mal. Agarose 3D Petri gerechten kunnen het beste voorzichtig worden behandeld met fijne tangen. Bij het verzamelen van organoïden voor fixatie, moet u werken onder een dissectie microscoop om de collectie van alle organoïden visualiseren. Organoïden kunnen vasthouden aan de plastic kant van cultuurgerechten en de binnenkant van pipet tips; glazen pipetten vertonen minder organoïde hechting dan plastic. Het bevestigen van organoïden terwijl nog steeds ingekapseld binnen of op de top van ECM is een meer uitdagend en delicaat proces dan het verwijderen van hen uit ECM voorafgaand aan fixatie. Weefselverwerkingsgel kan boven de ECM-organoïde constructie worden gegoten voordat deze uit de kweekkamer wordt verwijderd om de gel te versterken vóór fixatie39. Fixatie moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur om ECM hydrogels op te halen, omdat ze waarschijnlijk zullen de-polymeriseren als ze worden verlaagd tot 4 °C. Bovendien kan 0,1 % - 1,0 % glutaraldehyde aan de 4 % PFA-oplossing worden toegevoegd om de ECM verder te verbinden; deze methode verhoogt echter de autofluorescentie van het monster op de achtergrond.

Er zijn aanzienlijke kiemcelspecifieke beperkingen aan de resultaten die worden bereikt door de hierboven gepresenteerde organoïdegeneratiemethoden, die prioritaire gebieden voor toekomstige innovatie vertegenwoordigen. Kiemcellen worden slecht ondersteund over uitgebreide cultuur, worden alleen gemakkelijk waargenomen tijdens de eerste paar dagen van de cultuur en worden zelden waargenomen tegen het einde van de eerste week van de cultuur en op latere tijdstippen. Terwijl ongedifferentieerde spermatogonie kan worden gehandhaafd binnen de in vitro celcultuur met behoud van hun vermogen om spermatogenese te herstellen bij transplantatie in in vivo tubuli40, de tubule somatische micro-omgeving (d.w.z. directe Sertoli celinteracties) wordt verondersteld een voorwaarde te zijn voor het differentiëren van pre-meiotische kiemcellen in en door meiose en spermiogenese in vitro1,5,40,41. Testiculaire organoïden die spermatogonie op vroege tijdstippen binnen een structureel mimetische TLS bevatten, zouden het veld in staat kunnen stellen om niet-invasief somatisch-somatische en somatische kiemcelinteracties volledig in vitro te bestuderen. Optimalisatie van mediaadditieven en celpreparaat voorafgaand aan de kweek (bijvoorbeeld de integratie van middelen die worden gebruikt voor in vitro spermatogonale stamcelcultuur)42,43 kunnen de opbrengst van kiemcellen verhogen in toekomstige studies, vooral tijdens cultuurperiodes langer dan meerdere dagen. Omgekeerd vormen methoden om spermatogonia opnieuw in te voeren nadat TLS zich hebben gevormd, zoals door middel van microinjectie, een interessante kans om kiemcellen in organoïden te herstellen en het vermogen van in vitro georganiseerde somatische omgevingen te testen om kiemcellen te behouden. Andere biologische factoren zijn waargenomen om ex vivo explant cultuur beïnvloeden, met inbegrip van leeftijd / rijpheid45 en genetische achtergrond verschillen17. Deze zelfde variabelen moeten nog direct worden onderzocht op het gebied van de testiculaire organoïde biologie. Het is echter aannemelijk dat verschillende assemblage, morfologie en functionele fenotypen kunnen ontstaan wanneer organoïden worden gegenereerd uit cellen geïsoleerd van verschillende oude dieren (d.w.z. neonatale, jonge, volwassen) of dieren met een wisselende genetische achtergrond (bijvoorbeeld verschillende muizenstammen).

Samengevat, de technieken gedeeld in dit manuscript bieden vier nuttige modellen voor het bestuderen van cel-gedreven testiculaire constructie zelfassemblage, de generatie van twee afzonderlijke structureel mimetische testiculaire organoïde modellen, en de belangrijke verwezenlijking van TLS ontwikkeling en hormoon-responsieve endocriene functie in vitro. Deze modellen omvatten 2D en 3D ruimtelijke oriëntaties in ECM en ECM-omgevingen met minimaal complexe, volledig gedefinieerde cultuurmedia. Elke methode is zeer reproduceerbaar en maakt gebruik van alleen algemeen beschikbare kweekbronnen. Deze methoden kunnen voordelig blijken voor het bestuderen van testiculaire morfogenese in vitro en het optimaliseren van toekomstige kweekomstandigheden voor in vitro spermatogenese. Meer nog, 2D ECM en 3D ECM-vrije methoden bieden een nieuw hulpmiddel voor het bestuderen van het proces van de de novo weefsel compartimentering uniek voor de testis, in vitro tubulogenese, en somatisch-somatische en somatische-kiemcel interacties. Testiculaire organoïden bieden een flexibele en schaalbare mogelijkheid om de ontwikkeling en regulatie van somatische testiculaire fysiologische kenmerken te onderzoeken; met inbegrip van de bloedtestenbarrière en de productie en respons van endocriene; en, ook, een nuttig instrument voor de ontwikkeling van de volgende generatie translationeel onderzoek weefsel modellen. Deze omvatten de integratie van reproductieve hormonen in grotere modellen op systeemniveau, zoals tissue-on-a-CHIP en microfysiologische platforms45,46. Andere translationele doelstellingen waarop testiculaire organoïden op een dag kunnen worden toegepast, zijn reproductieve toxicologie en immunologische barrièretesten, mannelijke anticonceptieontwikkeling en innovatie op het gebied van geassisteerde voortplantingstechnologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door het National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, het National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 en 4UH3ES029073-03, en het Thomas J. Watkin's Memorial Professorship.

De auteurs zouden Eric W. Roth voor hun hulp met transmissieelektronenmicroscopie willen danken. Dit werk maakte gebruik van de BioCryo faciliteit van Northwestern University NUANCE Center, die steun heeft ontvangen van de Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); het MRSEC-programma (NSF DMR-1720139) van het Materials Research Center; het Internationaal Instituut voor Nanotechnologie (IIN); en de staat Illinois, via het IIN. Het maakte ook gebruik van de CryoCluster apparatuur, die steun heeft ontvangen van het MRI-programma (NSF DMR-1229693). Afbeeldingen in figuur 1 zijn ontworpen met behulp van BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 um Media Sterile Filters Millipore Sigma scgpu05re For sterile filtering media
3βHSD primary antibody Cosmo Bio Co K0607 Leydig cell marker, 1:500 dilution
AlexaFluor 568 α-Mouse Thermo Fisher Scientific A-21202 Fluorescence-tagged secondary antibody
AlexaFluor 568 α-Rabbit Thermo Fisher Scientific A10042 Fluorescence-tagged secondary antibody
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific 11-095-080 Base of culture media
Collagenase I Worthington Bio LS004197 For dissociation solution 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free Corning 354234 Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels
Countess Cell counter Thermo Fisher Scientific C10227 Autmated cell counter (hemacytometer machine)
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228 Hemacytometer slide for use with Countess automated counter
DDX4 primary antibody Abcam 138540 Spermatogonia marker, 1:500 dilution
Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) Worthington Bio LS002140 For dissociation solution 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl Thermo Fisher Scientific 14040182 For reconstituting Hyaluronidase
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg Thermo Fisher Scientific 14040117 PBS
Embryo Grade H2O MIllipore Sigma W1503 For reconstituting Collagenase I and Dnase I
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 For quencing enzyme dissocation solutions
Follicle stimulating hormone Abcam ab51888 For long-term organoid culture
Human chorionic gonadotropin Millipore Sigma C1063 For long-term organoid culture
Hyaluronidase, from bovine testes Millipore Sigma H4272 For dissociation solution 2
Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay Ansh Labs AL-107 Inhibin B ELISA Kit
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028 Serum source for Basal media
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) Millipore Sigma Z764051 For 3D ECM-Free organoid fabrication
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well Thermo Fisher Scientific 12-565-7 For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15-140-122 Antibiotic for media
Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 For aiding paraffin embedding
SOX9 primary antibody Millipore Sigma AB5535 Sertoli Marker, 1:500 dilution
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) Teklad Global 2920 Mouse food without phytoestrogens
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) Teklad Global 2916 Mouse food without phytoestrogens
Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay Calbiotech TE373S Testosterone ELISA Kit
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 For cell counting
αSMA primary antibody Millipore Sigma A2547 Peritubular marker, 1:500 dilution
βCatenin primary antibody BD Biosciences 610154 Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
  3. Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
  4. Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
  5. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  6. Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
  7. Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
  8. Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
  9. Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
  10. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
  11. Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
  12. Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
  13. Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
  14. Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
  15. Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
  16. Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
  17. Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
  18. Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
  19. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  20. Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
  21. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  23. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  24. Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
  25. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  26. Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
  27. Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
  28. Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
  29. Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
  30. Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
  31. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
  32. Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
  33. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  34. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  35. Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
  36. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
  37. Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
  38. Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  39. Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
  40. Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
  41. Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
  42. Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
  43. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
  44. Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
  45. Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
  46. Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
  47. Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Nummer 164 testis testiculaire organoïde extracellulaire matrix 2D 3D assemblage tubuli endocriene functie
Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Edmonds, M. E., Forshee, M. D.,… More

Edmonds, M. E., Forshee, M. D., Woodruff, T. K. Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids. J. Vis. Exp. (164), e61403, doi:10.3791/61403 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter