여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성
이 논문에서
요약
초록
고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및 내분비학을 연구하기위한 도구를 제공합니다. 고환 오르가노이드를 만들기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법의 대부분은 세포외 매트릭스에 의존 (ECM) 드 노보 조직 조립을 촉진하기 위해, 그러나, 생물 모방 형태와 조직의 기능 측면에서 방법 사이에 차이가있다. 또한 게시된 메서드에 대한 직접 비교는 거의 없습니다. 여기서, 직접적인 비교는 제공된 결과와 함께 오르가노이드 생성 프로토콜의 차이를 연구함으로써 이루어집니다. 4개의 고풍화 생성 방법: (1) 2D ECM 프리, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM 프리, 및 (4) 3D ECM 배양이 설명된다. 3개의 1차 벤치마크는 고환 오르간성 생성을 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이들은 세포 자기 조립, 주요 세포 모형의 포함 (세르톨리, Leydig, 세균 및 peritubular 세포), 및 적당하게 구획조직 건축입니다. 테스트된 4개의 환경 중, 2D ECM 및 3D ECM 없는 배양은 관과 간질 세포 유형의 드 노보 구획화, 튜블러 유사 구조의 개발 및 확립된 장기 내분비 기능을 포함하여 네이티브 고환과 가장 유사한 내부 형태와 함께 오르가노이드를 생성했습니다. 모든 방법은 분류되지 않은, 1 차적인 골린 고환 세포 현탁액을 활용하고 일반적으로 접근 가능한 배양 자원을 이용했습니다. 이러한 고환 기관지 생성 기술은 시험관 내 고환 기관발생 및 생리학에 대한 연구 이니셔티브를 위한 매우 접근가능하고 재현 가능한 툴킷을 제공합니다.
서론
고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및생리학을연구하기 위한 선구적인 기술이다1,2,,3,,4. 몇 가지 방법은 오르가노이드 생성을 위해 탐구되었습니다; 여기에는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 방향 모두에서 다양한 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM 프리 배양 시스템이 포함됩니다. 다른 세대 방법은 별개의 세포 조립 전략을 촉진 할 수있다; 이로 인해 게시된 오르가노이드 모델 간의 높은 수준의 형태학적 및 기능적 가변성을 초래합니다. 이 문서의 목적은 시험관 내 고환 모델의 현재 상태를 논의하고 고환 오르가노이드 실험을 설계 할 때 미래의 조사자를위한 템플릿 역할을하는 것입니다. 본 연구에서는, 4개의 상이한 배양 시스템 원형이 실험 과정 및 생물학적 결과로 정의되고 특징지입니다. 여기에는 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free 및 3D ECM 배양 방법이 포함됩니다. 여기에 제시된 전략은 다른 실험실과 연구 그룹 간에 간단하고 접근 가능하며 매우 재현할 수 있도록 하기 위한 것입니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 마우스 실험은 노스웨스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며, 모든 절차는 IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 효소 조직 해리 솔루션의 준비
- 기저 배양 배지 솔루션(BM)을 사용하여 만들어진 두 가지 효소 솔루션(솔루션 1 및 솔루션 2)을 사용합니다.
- BM을 준비하려면 혈청과 페니실린 연쇄 절제술을 최소 필수 매체에 각각 10%와 1%의 최종 농도에 추가합니다(특정 시약의 재료 표 참조). 그런 다음 0.22 μm 필터를 통해 BM을 걸레로 멸균하십시오. 세포와 사용하기 전에, 배양 접시에 분배하고 가습, 5 % CO2 인큐베이터 내에서 배치하여 중성 pH에 멸균 BM을 최소 1 h의 최소 37 ° C로 평형.
참고 : BM은 신선한 BM을 만들어야 하는 후 최대 1 주일 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다. - 콜라게나아제 1주식용액을 제조하기 위해 먼저 1mL의 콜라게나아제 1mL를 멸균배등급H2O(최종농도 10% m/v)로 녹이고, 반전 또는 소용돌이를 녹이고, 20μL 알리코를 -20°C에 저장하여 나중에 사용한다. 알리쿼트는 한 번만 해동해야 합니....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
오르가노이드 생성은 고환 세포가 배양의 72 h 이내에 자가 조립하지 않으면 실패한 것으로 간주되었지만, 여기에 제시된 모든 방법은 청소년 (5 dpp) 뮤린 세포를 사용할 때 24 시간 이내에 조립됩니다. 생물학적 구조 생성의 실패는 확장 배양(72h)이 후에도 자유롭게 중단된 세포(도 1에서0h 컬럼)의 연속으로 제시된다. 조직 자체 조립이 없는 경우, 모든 명백한 세포 클러스터는 부드러운 조작(즉, 파이펫팅)에도 따라 개별 세포로 쉽게 분산됩니다. 성공적으로 생성된 조직은 처음에 3D 셀 "클러스터"(그림 1의6h 열에 있는 노란색 화살표)로 관찰되었습니다. ECM이 없는 환경(2D 및 3D) 내에서, 이러한 구조는 특히 3D 아가로즈 페트리요리(그림 1A, C)에서문화의 처음 24h를 가로질러 "컴팩트"한 것으로 나타났습니다. ECM.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 organoid 생성 프로토콜이 완료되면 사용자는 ECM 또는 ECM이 없는 환경에서 고환 구조 및 오르가노이드를 조립할 수 있는 네 가지 문화 기술을 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 4가지 방법 모두를 통해 연구원은 시간 경과 화상 진찰 또는 비디오 기록을 통해 시간이 지남에 따라 비침습적으로 기관지 자기 조립을 관찰하고, 문화 도중 조직을 방해하지 않고, 분비한 호르몬과 사이토카인의 분석을 위해 조건부 된 미디어를 비침습적으로 수집할 수 있습니다. 모든 방법에서, 24h의 과정을 통해, 실험자는 세포 수가 허용하는 것처럼 수백 개의 오르가노이드 / 고환 구조를 생성할 수 있다. 이러한 방법은 다른 크기와 형태와 구조로 조직 자체 조립을 촉진; 오르가노이드 크기는 다른 오르가노이드보고서(34)에서볼 수 있듯이 배양에 사용되는 세포 수 및 농도에 따라 달라집니다. 오르가노이드 크기 나 직경을 줄이면 때로는 더 큰 오르가노이드에 있는 괴사의 내부 영역의 개발을 줄이는 데 도움이 될.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 보건원, 국립 아동 보건 및 인간 개발 연구소 (NICHD) F31 HD089693, 국립 환경 보건 과학 연구소 / 국립 환경 보건 센터 (NIEHS / NCATS) UH3TR01207 및 4UH3ES029073-03, 그리고 토마스 Jkin의 기념 교수에 의해 지원되었다.
저자는 전송 전자 현미경 검사법에 그들의 도움을 에릭 W. 로스 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 노스 웨스턴 대학의 NUANCE 센터의 BioCryo 시설을 사용, 이는 소프트 및 하이브리드 나노 기술 실험 (SHyNE) 자원 (NSF ECCS-1542205)의 지원을받고있다; 재료 연구 센터에서 MRSEC 프로그램 (NSF DMR-1720139); 국제 나노 기술 연구소 (IIN); 그리고 일리노이 주, IIN을 통해. 또한 MRI 프로그램(NSF DMR-1229693)의 지원을 받은 CryoCluster 장비를 사용했습니다. 그림 1의 그래픽은 BioRender.com 사용하여 설계되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 um 매체 메마른 여과 | Millipore 시그마 | scgpu05re | 메마른 거르는 매체를 위해 |
| 3β HSD 일차 항체 | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig 세포 마커, 1:500 희석 |
| AlexaFluor 568 &-마우스 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | 형광 태그 2차 항체 |
| AlexaFluor 568 &-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | 형광 태그 2차 항체 |
| 알파 최소 필수 매체 | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | 배양 매체의 기초 |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | 해리 용액 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | 2D 및 3D ECM 배양 젤 주조에 사용되는 세포 외 매트릭스 |
| Countess Cell counter Thermo | Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (혈구 측정기) |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | 백작 자동 카운터와 함께 사용하기 위한 혈구계 슬라이드 |
| DDX4 일차 항체 | Abcam | 138540 | 정자 마커, 1:500 희석 |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | 해리 용액 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | 히알루로니다아제 재구성 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | Collagenase I 및 Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 소변 담금질 용액 |
| Follicle 재구성용 자극 호르몬 | Abcam | ab51888 | 장기 오가노이드 배양용 |
| 인간 융모성 성선 자극 호르몬 | Millipore Sigma | C1063 | 장기 오가노이드 배양용 |
| Hyaluronidase, 소 고환 | Millipore Sigma | H4272 | 해리 용액 2 |
| Inhibin B 효소 결합 면역흡착 분석 | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA 키트 |
| KnockOut 세럼 교체용 | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | 용 혈청 소스 |
| 3D 페트리 접시 마이크로 몰드 스페로이드(24-35, 5x7 어레이) | Millipore Sigma | Z764051 | 3D ECM-Free 오가노이드 제조용 |
| Nunc, Lab Tek II 챔버 슬라이드 시스템, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | 2D ECM-free 및 2D, 3D ECM 배양용 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | 미디어용 항생제 |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, 검체 처리 젤 | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | 파라핀 매립 보조용 |
| SOX9 일차 항체 | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 희석 |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | 식물성 에스트로겐이 없는 마우스 식품 |
| Tedklad Global Mouse Chow (유지 보수) | Teklad Global | 2916 | 식물성 에스트로겐이 없는 쥐 음식 |
| 테스토스테론 효소 연결 면역흡착 분석 | Calbiotech | TE373S | 테스토스테론 ELISA 키트 |
| Trypan 블루 솔루션, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | 세포 계수 |
| &알파;SMA 주요 항체 | Millipore Sigma | A2547 | 주위 마커, 1:500 희석 |
| &베타; 카테닌 1차 항체 | BD Biosciences | 610154 | Sertoli 세포질 마커, 1:100 희석 |
참고문헌
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
