Summary
여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.
Abstract
고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및 내분비학을 연구하기위한 도구를 제공합니다. 고환 오르가노이드를 만들기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법의 대부분은 세포외 매트릭스에 의존 (ECM) 드 노보 조직 조립을 촉진하기 위해, 그러나, 생물 모방 형태와 조직의 기능 측면에서 방법 사이에 차이가있다. 또한 게시된 메서드에 대한 직접 비교는 거의 없습니다. 여기서, 직접적인 비교는 제공된 결과와 함께 오르가노이드 생성 프로토콜의 차이를 연구함으로써 이루어집니다. 4개의 고풍화 생성 방법: (1) 2D ECM 프리, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM 프리, 및 (4) 3D ECM 배양이 설명된다. 3개의 1차 벤치마크는 고환 오르간성 생성을 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이들은 세포 자기 조립, 주요 세포 모형의 포함 (세르톨리, Leydig, 세균 및 peritubular 세포), 및 적당하게 구획조직 건축입니다. 테스트된 4개의 환경 중, 2D ECM 및 3D ECM 없는 배양은 관과 간질 세포 유형의 드 노보 구획화, 튜블러 유사 구조의 개발 및 확립된 장기 내분비 기능을 포함하여 네이티브 고환과 가장 유사한 내부 형태와 함께 오르가노이드를 생성했습니다. 모든 방법은 분류되지 않은, 1 차적인 골린 고환 세포 현탁액을 활용하고 일반적으로 접근 가능한 배양 자원을 이용했습니다. 이러한 고환 기관지 생성 기술은 시험관 내 고환 기관발생 및 생리학에 대한 연구 이니셔티브를 위한 매우 접근가능하고 재현 가능한 툴킷을 제공합니다.
Introduction
고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및생리학을연구하기 위한 선구적인 기술이다1,2,,3,,4. 몇 가지 방법은 오르가노이드 생성을 위해 탐구되었습니다; 여기에는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 방향 모두에서 다양한 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM 프리 배양 시스템이 포함됩니다. 다른 세대 방법은 별개의 세포 조립 전략을 촉진 할 수있다; 이로 인해 게시된 오르가노이드 모델 간의 높은 수준의 형태학적 및 기능적 가변성을 초래합니다. 이 문서의 목적은 시험관 내 고환 모델의 현재 상태를 논의하고 고환 오르가노이드 실험을 설계 할 때 미래의 조사자를위한 템플릿 역할을하는 것입니다. 본 연구에서는, 4개의 상이한 배양 시스템 원형이 실험 과정 및 생물학적 결과로 정의되고 특징지입니다. 여기에는 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free 및 3D ECM 배양 방법이 포함됩니다. 여기에 제시된 전략은 다른 실험실과 연구 그룹 간에 간단하고 접근 가능하며 매우 재현할 수 있도록 하기 위한 것입니다.
역사적으로 고환에 대 한, 지정 "시험관", 고환 조직 및 세포의 몇 가지 다른 문화 방법에 대 한 사용 되었습니다. 이들 로는 조직/장기 배양 방법(즉, 절제배)5,분리된 반열성 관배기 배양6,고환 세포 배양7,및 드노보 조직 형태발생(즉, 생물학적 구조 및 오르가노이드)1을포함한다. 체외 정자 발생에 대한 첫 번째 조사는 약 100년 전에 수행되었으며, 1920년8년에토끼 고환의 배양, 그리고 1937년 후반에는 마우스 이식9로수행되었다. 이러한 초기 실험 내에서 정자는 문화의 첫 주에 걸쳐 크게 퇴화하는 것으로 관찰되었다, 일부 메이오티분스 분화 세포가 확인되었지만. 이러한 역사적 보고서를 연상시키는 고환 절제 문화는 2011년에 부활하여 최적화되어 testis10을연구할 수 있는 가능한 기술이 되었습니다. 2011년부터, 절제문화는다중 보고11,,12,13에서불임 유능한정자를생산하고 있다. 그러나, 기존의 네이티브 고환 튜블러에 대한 절제 문화의 의존으로 인해, 이러한 최근의 발전은 "ex vivo"고환 기능 및 정자 발생, 유기체의 신체에서 제거 시 유지되거나 재개된 조직 기능의 예로 보다 정확하게 설명된다. 문학에 그것의 보급에도 불구하고, 고환 이질 내의 장기 세균 세포 유지 및 분화는14,,15,,16,,17,,18,특히 완전히 체외 정자 발생 (인간20에서마우스19 및 74에서 35 일)에서 완전히 관찰하기에 충분한 기간 동안 복제하기 어렵다. 100년 전에 경험한 많은 도전들이 오늘날에도 전 생체 내 정자 발생에서 여전히 경험된다는 사실에 흥미롭습니다.
전 생체 내 접근법과 는 달리, 고환 오르가노이드는 세포 공급원(즉, 1차 고환 세포)으로부터 시험관내에서 완전히 생성된 데 노보 조립 마이크로티슈이다. 고환 오르가노이드는 기존의 토착 조직에 대한 필드의 역사적 의존을 회피하고 시험관 내에서 고환 생물학을 완전히 재구성하는 창의적인 전략을 제공합니다. 대부분의 오르가노이드 조직 모델에 의해 공유 되는 여러 요구 사항이 있다; 이들(1)은 생체-모방 조직 형태 또는 건축, (2) 전이 조직의 다중 주요 세포 유형, (3) 자체 조립 또는 자가 조직 생성, (4) 표현된 조직의 기능 및 생리학의 어느 수준을 시뮬레이션하는능력(21,,22,,23,,24)을포함한다. 고환의 경우, 이것은 4가지 주요 특징에서 포착될 수 있습니다: (1) 주요 고환 세포 모형의 포함, 세균, 세르톨리, 레이디그, 관류 및 기타 간질 세포, (2) 세포 지향 조직 조립, (3) 적절한 구획화된 세포 유형이 별도의 관구구체(세균 및 세르톨리) 및 간질 영역(다른 모든 세포 유형), 및 (4) 조직 기능(예를 들어, 생식 호르몬 비결 반응 및 조직 유지 관리)의 어느 정도. 생식 세포 분화 전 생체 외및 시험관 내의 역사적 과제를 고려하여, 생체 내 모방 고환 아키텍처(즉, 반전류 관과 유사한 구조)의 재구성은 고환 생리학의 시뮬레이션(예: 내분비 기능)을 생성하는 데 우선순위가 될 수 있습니다.
공표된 고환 오르가노이드 방법의 대부분은 시판되는 ECM(예를 들어, 콜라겐 또는 독점 ECM 제형)25,,26,,27 또는 맞춤형 C롬(즉, 탈세포화된 고환 ECM 유래 하이드로겔)28,,29,,30을이용한다. 외인성 ECM은 조직 생성을 위한 조립 지원 발판을 제공함으로써 드 노보 조직 형성을 촉진한다. ECM 방법은 일부 생식 세포 존재 및 조직 모방 형태25, 28을,포함하여 조직 형성의 인상적인 수준을부여하고있다. 그러나, 이들이 사용하는 EM은 항상 보편적으로 이용가능한 것은 아니며(즉, 세포제거 ECM 유래 하이드로겔) 및 일부 방법은 정교한 젤 및 세포 파종(예: ECM 및 3D 프린팅의 3층 그라데이션)을25,,,31,32로필요로 한다. 스캐폴드 없는 방법(예: 매달려 있는 드롭 및 비부착 배양 판)33,,34,,35도 ECM 젤이나 스캐폴드 없이 견고하고 재현성이 높은 오르가노이드를 생성하였다. 그러나, 이러한 비계없는 오르가노이드의 조직 형태는 종종 생체 내 고환과 유사하며, 이들 보고서의 대부분은 조직 형성을 촉진하기 위해 생화학 ECM 첨가제를통합33,,34,,36,또는 대안적으로, 강제 세포 집계 및 다짐에 대한 원심분리에 의존34, 세포 지향 적 이주 조직을 연구하는 데 덜 이상적으로 만들기.34
이 원고에 제시된 4개의 organoid 생성 방법은 세포 중심 의 오르가노이드 자기 조립을 가능하게 하는 간단한 세포 파종을 사용하여 각각 ECM 의존성 및 독립적인 전략을 둘 다 포함합니다. 모든 4가지 기술은 동일한 세포 현탁액에서 수행될 수 있거나 사용자 지정 및 세포 형 농축 된 집단을 사용할 수 있습니다. 이러한 방법의 강점은 오르가노이드가 실시간으로 자체 조립되는 것을 관찰하고 고환 구조가 다른 배양 마이크로환경 사이에서 어떻게 자체 조립되는지 직접 비교할 수 있는 능력입니다. 이 4개의 문화 방법 사이 현상 차는 연구 질문 또는 조사자의 주제에 그들의 영향에 대 한 고려 되어야 한다. 각 방법은 24시간 이하 의 생물학적 구조 또는 오르가노이드를 생성합니다. 결론적으로, 여기에 제시된 방법은 시험관 내 고환 기관지 조립, 조직 발달 및 고환 생리학을 연구하기 위한 오르가노이드 조립 기술의 툴킷을 제공한다.
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Protocol
모든 마우스 실험은 노스웨스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며, 모든 절차는 IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 효소 조직 해리 솔루션의 준비
- 기저 배양 배지 솔루션(BM)을 사용하여 만들어진 두 가지 효소 솔루션(솔루션 1 및 솔루션 2)을 사용합니다.
- BM을 준비하려면 혈청과 페니실린 연쇄 절제술을 최소 필수 매체에 각각 10%와 1%의 최종 농도에 추가합니다(특정 시약의 재료 표 참조). 그런 다음 0.22 μm 필터를 통해 BM을 걸레로 멸균하십시오. 세포와 사용하기 전에, 배양 접시에 분배하고 가습, 5 % CO2 인큐베이터 내에서 배치하여 중성 pH에 멸균 BM을 최소 1 h의 최소 37 ° C로 평형.
참고 : BM은 신선한 BM을 만들어야 하는 후 최대 1 주일 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다. - 콜라게나아제 1주식용액을 제조하기 위해 먼저 1mL의 콜라게나아제 1mL를 멸균배등급H2O(최종농도 10% m/v)로 녹이고, 반전 또는 소용돌이를 녹이고, 20μL 알리코를 -20°C에 저장하여 나중에 사용한다. 알리쿼트는 한 번만 해동해야 합니다.
- deoxyribonuclease I (DNase I) 스톡 솔루션을 준비하려면, 멸균 배아 등급 H2O (최종 농도 2 % m / v), 반전 또는 소용돌이 (소용돌이하지 않음) 1 mL에 DNase I 20 mg을 추가하고 나중에 사용하기 위해 -20 μL 알리코트20을 저장합니다. 알리쿼트는 한 번만 해동해야 합니다.
- 히알루로니다제 스톡 솔루션의 경우, 30 mg을 멸균 인산염 완충식 식염수(PBS; 최종 농도 3% m/v 히알루로니다아제)에 Ca++/Mg+++가함유된 PBS에 넣고, 반전 또는 소용돌이를 해소하고, 100μL 알리코트(-20°C)를 저장하여 나중에 사용할 수 있도록 -200°C에 저장하십시오.++ 알리쿼트(Aliquots)는 효소 활동을 잃지 않고 여러 번 해동및 재냉동할 수 있습니다.
- 해리용액 1을준비하려면 10 μL 콜라게나아제 I 및 10 μL DNase I를 멸균, 미리 평형된 BM 1mL에 추가하십시오(최종 농도: 1 mg/mL 콜라게나아제 I 및 5 μg/mL DNase I). 파이펫으로 부드럽게 삼중하여 용액을 혼합하고 조직과 사용하기 전에 37°C로 미리 데우십시오.
참고: 용액 2는 용액 1mL당 33 μL(37°C로 예열)을 추가하여 제조됩니다(1 mg/mL의 최종 농도). 이것은 아래 단계 2.5에서 고환 조직의 효소 해리를 통해 중간 방법으로 발생합니다.
2. 고환 조직 해리
참고: 모든 마우스는 폴리프로필렌 케이지 내에 보관되었고 음식과 물 광고 리비툼을 제공했습니다. 동물은 식물성 에스트로겐을 포함하지 않는 조사 차우를 공급했다. 청소년 CD-1 마우스, 5일 산후(dpp)는 이소플루란 기포화기(O2에서 2.5 L/min)에 부착된 마취챔버 내에서 안락사 및 조직 수집 전에 모든2실험및 마취에 사용되었다. 마우스는 발가락 찌르기에 대한 반응의 부재를 통해 전체 마취를 위해 확인되었으며, 그 후 마우스는 참수를 통해 안락사되었다.
- 이소플루란 챔버에서 마우스를 마취하고 발가락 찌르기를 통해 마취를 보장한 다음 날카로운 가위를 사용하여 마우스를 참수합니다. 안락사 마우스 수핀을 해부 매트에 놓고 70 %의 에탄올로 복부를 살균하십시오. 집게로 하복부의 피부를 텐트와 가위로 복부를 엽니다.
- 복부의 왼쪽 아래 및 오른쪽 잉구 부위에 있는 고환을 찾아내다. 꽃병 연기 및 모든 고정 결합 조직에 그들의 연결을 잘라, 다음 전체 고환을 들어 올립니다 (epididymis 여전히 부착) 동물에서. 미리 평형된 BM의 페트리 접시에 고환을 놓습니다.
- 해부 현미경과 멸균 필드 내에서, 작은 미세 절제 가위로 또는 두 개의 미세 포셉을 사용하여 부드럽게 찢어각 고환의 한쪽 끝에 튜니카 알부진에 작은 절개를합니다.
- 그런 다음 절개 반대쪽 끝에서 고환을 들고 있는 동안, 미세한 집게로 고환을 부드럽게 짜내고 튜니카의 구멍을 향해 부드럽게 스위핑 동작을 밀어 넣습니다. 이것은 하나의 응집력 조각으로 고환 조직을 풀어 놓을 것입니다.
- 고환을 더 작은 조각(≤ 2mm3)으로자르고 1mL의 사전 따뜻하게(37°C) 해리용액 1에 넣습니다.
- 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 10개 이상의 고환의 경우, 총 해리 용액 볼륨을 1mL로 늘려 10개의 고환당 최소 1mL의 해리 용액(예: 20고트용 2mL, 30개의 고환용 3mL 등)을 보장한다.
- P1000 파이펫을 사용하여 용액 1에서 50배(50배)의 고환 조각을 부드럽게 세리라세이트합니다. 튜블러가 서로 분리되어 이 시점에서 간질 조직으로부터 분리되는지 확인하십시오. 덩어리가 남아 있으면 5분 추가로 배양하고 다시 한 번(50배)을 세리하게 삼중시합니다.
- 용액 1mL당 33 μL의 히알루로니다제 스톡 용액(37°C에서 미리 데워져 1.5단계)을 1mL당 추가합니다(부분적으로 해리된 고환 조직 및 튜블러 포함). 히알루로니다아제를 추가한 후 이를 용액 2라고 합니다.
- P1000을 이용하여 삼위일체(50x)를 5분 동안 37°C에서 배양한다.
- P200 파이펫을 사용하여 삼위율(50배).
- 이 시점에서 눈에 보이는 튜블이나 세포의 덩어리가 존재하지 않는지 확인합니다. 덩어리가 지속되면 P200 파이펫(50x)을 사용하여 추가 트리튜레이션을 사용하여 최대 5분 동안 배양합니다.
- 태아소 혈청(FBS)을 용액 2의 총 부피의 10%에 추가하여 해리 효소를 담금질한다. P200 파이펫을 사용하여 여러 번 세리라테스하여 덩어리가 남지 않도록 하고 40 μm 셀 스트레이너를 통과하여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다.
- 원심분리기 세포는 7분 동안 100 x g로, 상신을 버리고, 신선한 BM에서 세포를 다시 분리한다.
- 혈종계에서 트라이판 블루 제외를 사용하여 총 및 실행 가능한 세포 농도를 계산합니다. 1:1 희석, 셀 서스펜션의 10 μL추가: 트라이판 블루 용액, 혈전계 세포 계수 챔버에 (재료의 표참조).
- 7 분 동안 100 x g에서 다시 원심 분리기 세포와 신선한 BM에서 다시 중단.
참고: 셀 농도 및 수를 계산하기 위해 실행 가능한 셀만 사용합니다. 유기체 생성을 위한 ≥ 80%의 생존가능성의 세포 현탁액만 사용하십시오. - 제3항에서 아래 프로토콜특이단계에 사용된 부피를 감안할 때 280,000개의 세포를 알리쿼트하기 위해 설명된 바와 같이 단일 세포 현탁액을 세포 농도로 준비: 2D ECM-Free – 0.56 x 106 세포/mL, 2D ECM – 0.56 x 106 셀/mL, 3D ECM-Free – 4.66 x 106 셀/mL, 3D ECM – 2.8 x 106 셀/mL.
참고: 여기에 제시된 모든 배양 실험은 배양당 280,000개의 세포로 시작됩니다. 이 숫자는 도 1, 그림 2, 도 3 및 그림 4의대표 데이터와 일치합니다.
- 7 분 동안 100 x g에서 다시 원심 분리기 세포와 신선한 BM에서 다시 중단.
3. 오르가노이드 배양 요리 준비 및 세포 파종
참고: 동질적인 ECM을 보장하기 위해 실험 전에 밤새 ECM의 냉동 알리쿼트를 미리 해동하십시오. ECM 알리쿼트(ECM aliquots)는 느리고 점진적인 온도 증가를 보장하기 위해 4°C 냉장고 또는 콜드룸 내에 얼음 양동이 내에 침수되어야 합니다. 모든 ECM은 BM에서 1:1 최종 희석에서 배양에 사용됩니다. 해동 된 ECM과 1:1 희석 ECM을 사용 직전까지 얼음에 보관하면 ECM이 조기에 중합 될 수 있습니다.
- 2D ECM 프리 배양의 경우, 특별한 준비가 필요하지 않으며, 플레이트 단세포 서스펜션(BM에서 0.56 x 106 셀/mL의 500 μL)을 4웰 챔버 슬라이드에 직접 배치하고 배양을 위한 35°C 인큐베이터에 배치한다.
참고: 세포는 배양의 처음 24 시간 내의 배양 접시의 바닥을 준수해야하며,이 같은 시간 내에 몇 가지 작은 3D 세포 클러스터를 나타낼 수 있습니다. - 2D ECM 배양의 경우, 100 μL의 차가운 1:1 희석된 세포외 외외 매트릭스 배지를 4웰 챔버 슬라이드에 분배하여 젤이 접시 바닥 전체를 덮도록 합니다.
- ECM이 젤로 중합할 수 있도록 챔버 슬라이드를 35°C 인큐베이터에 최소 30분 동안 배치합니다.
- 세포 현탁액(BM에서 0.56 x 106 셀/mL의 500 μL)을 2D 젤 의 상단에 직접 추가하면 중합된다.
참고: 셀은 함께 클러스터링하여 배양의 처음 24h 내에서 작은 3D 클러스터를 형성해야 합니다.
- 3D ECM 프리 배양을 위해 세포 배양을 시작하기 전에 아가로즈 3D 페트리 접시 인서트를 준비하십시오.
- 먼저, 100mL 비커에 1.5g아가로즈 파우더를 넣고 75mL 멸균, 증류수 및 전자레인지를 추가하여 3D 페트리 접시 주조를 위해 용융 2% 아가로즈를 생산합니다.
- 멸균 작업 공간 내에서 반월상 연골이 곰팡이의 측면과 수평이 될 때까지 3D 페트리 접시 금형에 용융 아가로즈를 분배합니다.
- 아가로즈가 식히고 굳어지도록 합니다. 단단하면, 금형을 거꾸로 뒤집어 아가로즈 3D 페트리 접시가 곰팡이에서 벗어날 때까지 부드럽게 반복적으로 구부립니다.
참고:이 시점에서, 하나는 많은 아가로즈 3D 페트리 요리를 준비하고 한 달 이상 4 ° C에서 멸균 H2O 또는 DPBS에 저장할 수 있습니다. - 배양하기 전에 아가로즈 3D 페트리 요리를 24개의 웰 컬처 디쉬에 넣고 BM 1mL로 덮습니다. 3D 페트리 요리가 BM에서 37°C 배양 인큐베이터 내에서 최소 30분 동안 평형화하게 하십시오. BM을 버리고 1mL 의 신선한 BM으로 다시 한 번 평형을 반복하십시오. BM에서 3D 페트리 요리를 평형 한 후, 그들은 BM (즉, 분홍색)과 같은 색상으로 나타납니다.
- 세포 시딩을 준비하려면 모든 BM을 우물에서 제거하고 신선한 BM의 200 μL을 분배하지만 3D 페트리 접시의 중앙 오목 내부는 빼지 않습니다. 또한, 마이크로웰 인서츠의 중앙 세포 파종 오목 내부에서 남은 BM을 수집한다.
- 단일 세포 현탁액(BM의 60 μL에서 4.66 셀/mL)을 아가로즈 3D 페트리 접시의 중앙 오목으로 분배한다. 세포를 혼합하고 배양 시작 시 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 위아래로 부드럽게 세번째화합니다.
- 가습 된 35 °C 인큐베이터에 배치하여 문화를 위해 하십시오. 다음 날, 마이크로웰 인서틀 주위에서 BM의 200 μL을 제거하고 신선한 BM 1mL로 대체하십시오. 이것은 전체 배양을 침수, 삽입의 평면 위의 액체 수준을 가져올 것이다.
- 아가로즈 3D 페트리 접시 의 외부에서 천천히 조심스럽게 제거 / 추가. 오르가노이드는 하룻밤 동안 압축되어 바닥에서 휴식을 취할 수 있게 하고 미디어 변경으로 인해 오르가노이드를 방해받지 않게 해야 합니다.
- 3D ECM 배양을 위해, BM의 세포 현탁액을 차갑고 사전 해동된 ECM(최종 농도 = 2.8 x 106 셀/mL)과 결합하여 단일 세포 현탁액을 준비한다.
- 즉시 세포-ECM 혼합물을 4웰 챔버 슬라이드에 분배하여 혼합물이 플레이트의 전체 바닥을 덮도록 합니다.
- 챔버 슬라이드를 인큐베이터에 35°C로 배치하고 그 내용이 중합되도록 합니다. 이 경우 최소 30분이 소요됩니다. 중합 후, 배양의 상단에 BM의 500 μL을 추가합니다.
참고: 세포는 배양의 처음 24시간 내에 작은 3D 골재를 형성하기 위해 함께 클러스터링해야 합니다.
4. 오르가노이드 유지 보수
- 35 °C에서 모든 오르가노이드 모델 유형을 배양합니다. 모든 문화 유형의 경우 2일마다 미디어의 절반을 신선한 BM으로 교환합니다. 매체를 교환하는 동안 오가노이드가 실수로 수집되지 않도록 하려면 챔버 슬라이드 접시의 모서리와 아가로스 3D 페트리 접시 외부의 외부 지점에서 천천히 미디어를 수집하십시오. 모든 매체는 면역 분석 또는 기타 분석(즉, 분비 생식 호르몬 또는 사이토카인의 정량화)과 함께 사용하기 위해 -20°C에 저장될 수 있다.
- 문화에서 7 일 후, 여포 자극 호르몬을 포함하는 BM을 사용 (최종 농도 20 mIU/mL) 및 인간의 chorionic 생식선 (최종 농도 4.5 IU/mL). 이는 모든 오르간성 배양 유형에 적용됩니다.
- 시간이 지남에 따라 자기 조립, 개발 및 성장의 오르간 형성및 정량화 메트릭을 특성화하기 위한 모든 오르가노이드 배양(예: 시간 경과 이미징)을 일상적으로 이미지화합니다.
5. 오르가노이드 컬렉션
참고: 모든 오르가노이드는 다운스트림 면역 라벨링 및 조직학적 분석을 위해 PBS에서 4% 파라포름알데히드로 고정할 수 있습니다. 회전시 실온에서 2시간 또는 4°C에서 하룻밤을 고정합니다.
- 2D ECM 이없는 배양물의 경우 먼저 샘플을 신선한 PBS로 헹구고 부착된 구문 위에 고정을 추가합니다.
- ECM(2D 및 3D) 배양 방법의 경우, PBS로 한 번 헹구고 ECM-오가노이드 샘플 의 상단에 직접 고정을 추가하거나(ECM 젤과 오르가노이드를 함께 고정하기 위해) 또는 오르가노이드를 위아래로 부드럽게 피펫하여 주변 ECM에서 자유롭게 하고, 별도의 튜브로 이송하여 수정을 위해 별도의 튜브로 옮김합니다.
- 3D ECM 프리 문화의 경우 아가로즈 3D 페트리 접시의 중앙 오목 내에서 오르가노이드를 위아래로 부드럽게 피펫합니다. 이렇게 하면 오가노이드가 파이펫으로 쉽게 컬렉션을 용이하게 합니다. 그런 다음 고정을 위해 별도의 튜브로 오가노이드를 옮기십시오.
- 파라핀으로 가공하기 전에, 조직 처리 젤의 소량(~30 μL) 내에 많은 오르가노이드(≥ 20)를 포함; 이렇게 하면 파라핀 블록 내의 작은 영역으로 오르가노이드를 방향을 지정하고 농축하여 파라핀 섹션 내에서 단면과 쉽게 시각적 식별을 할 때 보다 쉽게 관찰할 수 있습니다.
참고: 오가노이드는 파라핀을 포함시키고 마이크로토메에 절개한 후 식별하기가 어려울 수 있습니다.
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Representative Results
오르가노이드 생성은 고환 세포가 배양의 72 h 이내에 자가 조립하지 않으면 실패한 것으로 간주되었지만, 여기에 제시된 모든 방법은 청소년 (5 dpp) 뮤린 세포를 사용할 때 24 시간 이내에 조립됩니다. 생물학적 구조 생성의 실패는 확장 배양(72h)이 후에도 자유롭게 중단된 세포(도 1에서0h 컬럼)의 연속으로 제시된다. 조직 자체 조립이 없는 경우, 모든 명백한 세포 클러스터는 부드러운 조작(즉, 파이펫팅)에도 따라 개별 세포로 쉽게 분산됩니다. 성공적으로 생성된 조직은 처음에 3D 셀 "클러스터"(그림 1의6h 열에 있는 노란색 화살표)로 관찰되었습니다. ECM이 없는 환경(2D 및 3D) 내에서, 이러한 구조는 특히 3D 아가로즈 페트리요리(그림 1A, C)에서문화의 처음 24h를 가로질러 "컴팩트"한 것으로 나타났습니다. ECM 환경(2D 및 3D) 셀 클러스터에서 클러스터와 주변 환경 간의 명확한 마진을갖는다(도 1B,D). 세포 클러스터는 또한 ECM을 가로질러 마이그레이션하고 함께 융합하여 더 큰 클러스터(도 1B의빨간색 화살표)를 형성하는 것으로 관찰되었다. 별도의 자체 조립 구조를 평가하는 데 필요한 시간을 측정하였고, 2D와 3D ECM 프리 조건과 2D ECM 사이의 요구되는 시간에 는 유의한 차이가 없었지만, 3D ECM 배양은 다른 모든 문화방법(그림 1E)보다드 노보 구조를 조립하는 데 훨씬 더 많은 시간이 필요하였다. 2D ECM 프리 및 3D ECM 배양은 2D ECM 및 3D ECM 프리 배양 방법보다 크기가 현저히 작은 세포 클러스터를 생성; 3D ECM 프리 배양은 3D 아가로즈 페트리접시(그림 1C, F)의각 웰 내에 하나의 크고 컴팩트한 클러스터로 가장 큰 클러스터를 생산했습니다. 요약하자면, 이러한 데이터는 4개의 고풍스러운 배양 환경에서 청소년 마우스 1차 세포로부터 고환 생물학적 구조를 생성하고 이러한 상이한 배양 환경 내에서 다른 세포 지향 조립 표현형을 강조하는 용이성을 보여줍니다.
모든 오르간성 모델의 목표는 네이티브 조직의 내체 형태 모방을 재구성하는 것입니다. 이러한 결과를 평가하기 위해, 각 배양 조건 내에서 조립된 생물학적 구조는 72h를 배양한 다음 세포 특이적 마커를 위해 탐사한 다음 면역형광(그림2)으로시각화하였다. 조직 형태에 있는 가변성은 상이한 배양 방법 사이에서 관찰되었습니다. 2D ECM 프리 오르가노이드는 일부 세균 세포(DDX4, 팬 배아 세포 마커)를 함유한 세르톨리 세포(SOX9 및 βCatenin)의 클러스터로서 제시되었으며, 세르톨리, 심피큘러(αSMA), 및 레이디그 세포(3βD)를 포함한 많은 체세포가 함유되어 있는 2D 기저 컨할류 층 위에 부착되어있다.A-D 그림 2B-D는 5 μm 섹션이 아닌 전체 2D ECM 프리 샘플의 상피 형광 이미지입니다. 이를 통해 기저 체세포 층과 세르톨리와 세균 세포의 우수한 지향 응집체를 시각화할 수 있습니다. 대조적으로, 2D ECM 배양은 크게 다른 표현형으로 제시되었으며, 뚜렷한 테두리를 가진 명확한 생물학적 구조는 기저 ECM겔(그림 2E)의위에 쉽게 분별되었다. 이러한 구조는 관의 드 노보 구획화와 복잡한 내부 형태를 소유대. 고환의 중간 세포 유형, 그래서 성공적인 오르가노이드로 간주되었다. 관 영역은 세르톨리, 관류 및 세균 세포, 및 간질 영역이 레이디그, 관류 세포 및 비표지세포(그림 2F-H)를포함하였다. 마찬가지로, 3D ECM 프리 오르가노이드는 구획화된 내부 형태를 가지고 있어 성공적인 오르가노이드로 간주되었다. 특히, 3D ECM 프리 오르가노이드는 높은 충실도(그림 2 I-L)를 가진 세르톨리 및 세균 세포의 그룹을 중심으로 특별히 배향되는 관세포를 포함하는 관 영역으로 구별되었다(도 2I-L). 3D ECM 조립 된 구조는 정교한 형태를 소유하지 않았지만, 대신 간헐적인 세균및 Leydig 세포와 함께 세르톨리 세포의 클러스터로 관찰되었다. 이 샘플에서, 많은 세르톨리와 표시되지 않은 세포는 "스트로마와 같은" 방향(그림2M-P)에서오르가노이드 사이에 중단된 채로 남아 있었다. 이 데이터는 서로 다른 오르가노이드 생성 방법이 고환 구획화의 내적 형태를 가진 고환 오르가노이드의 생성을 위해 2D ECM 및 3D ECM 프리의 두 가지 특정 오르가노이드 조립 환경의 사용을 생성하고 지원하는 형태학적 표현형의 가변성을 강조합니다.
고환 오르가노이드 기능을 추가로 평가하기 위해 3D ECM 이없는 조립 된 오르가노이드를 더 심층 분석으로 선택했습니다. 이 연구를 위해, 이 오르가노이드는 14 일 동안 배양된 다음 세포 및 구조 특정 마커를 위해 조사되었습니다. 14일 면역형분석시, 3D ECM-프리 오가노이드는 생체내 고환(그림3A-D)과현저하게 유사한 관-유사 구조(TLS) 및 조직 구조를 포함하는 것으로 관찰되었다. 간질 세포는 TLS로부터 분리된 영역에 적절히 위치하였다. 조직 단면도는 팬 배아 세포 마커, DDX4, 정자 줄기 세포 마커, SALL4 및 메이오시스 마커, SCP3(도3E-G)를조사하였다. 희귀 DDX4 양성 및 SALL4 양성 세포가 관찰되었지만, SCP3 신호는 확인되지 않았다. TLS의 깊은 특성화시, 그들은 편광 된 세르톨리 세포와 각관 세포의 외부 단층(그림 3I-L)에둘러싸인 루멘 나타나는 공간을 포함하는 것으로 관찰되었다. Sertoli 세포는 또한 전송 전자 현미경 검사법과 ZO-1, 접합 단백질 및 혈액 고환 장벽의 구성 요소(도 3H, L)에대한 라벨로 서로 단단한 접합을 나타냈다. 다음으로, 3D ECM 프리 오르가노이드는 생식샘도트로핀 자극을 가진 12주, 장기 배양에서 내분비 기능을 위해 연구되었다(그림4). 테스토스테론과 inhibin B, 각각 Leydig와 세르톨리 세포에서 생식 호르몬, 모두 식별 하 고 오르가노이드 조건화 배지에서 정량화(그림 4A). 배양의 12 주 이상, 두 호르몬 크게 생식 나 돌핀 FSH와 hCG의 보충에 응답 하기 위해 측정 되었다 (빨간 화살표 보충의 시작을 나타냅니다., 주 동안 2 – 12). 완료 시 내분비 반응성이 보존되었는지 여부를 확인하기 위한 테스트를 수행했습니다. 생식선 에 대 한 제거 되었다 48 시간, 남성 호르몬과 inhibin B 농도 농도 크게 감소 하는 동안. 48 h 후, 생식선 호르몬은 배양으로 반환되었고 두 호르몬 농도는 최종 24 h를 통해 다시 크게 증가하여 적절한 내분비 반응성(그림 4B)을입증했습니다. 이러한 조직학적 및 내분비 분석 결과는 고환 오르간이고체 발달(즉, 노보 구획화 및 tubulogenesis) 및 체외 세포 고환 기능(예: 단단한 접합 형성 및 내분비 기능)을 연구하는 데 유용한 모델임을 보여줍니다.
그림 1: 오가노이드가 2D 및 3D, ECM 및 ECM 이없는 문화 조건에서 자체 조립합니다.
5 dpp 뮤린 고환 세포는 4개의 다른 조건에서 배양되었다: 2D ECM 프리 (행 A),2D ECM (행 B),3D ECM 프리 (행 C),및 3D ECM (행 D). 문화 방법을 묘사한 그래픽은 왼쪽 열에 제공됩니다. 대표적인 이미지 몽타주들은 라이브 문화 에서 포착된 타임랩스 이미지에서 조립되었습니다. 각 이미지의 시간 포인트는 맨 위 여백에 레이블이 지정됩니다. 시간 0 h는 어떤 오르가노이드 조립이 발생하기 전에, 시간 3 h는 지속적인 세포 구동 오르가노이드 조립 중이며, 시간 6 h 및 9 h는 대표, 성공적으로 형성 된 오르가노이드를 입증한다. 노란색 화살표는 셀 클러스터를 표시하고 빨간색 화살표는 별도의 셀 클러스터가 마이그레이션되고 병합된 위치를 표시합니다. 모든 스케일 바 = 1mm.(E)별도의 세포 클러스터가 각 조건에 대해 눈에 띄게 평가될 수 있기 전에 필요한 시간. 2DF = 2D ECM 프리; 2DE = 2D ECM; 3DF = 3D ECM 프리; 3DE = 3D ECM. (F)클러스터당 면적은 각 배양 조건에 대해 측정하였다. 이미지는 n= 3 – 5 개의 별도 실험에서 선택되었습니다. Tukey의 다중 비교 테스트를 통해 단방향 ANOVA가 1E 및 1F의 중요성을 결정하는 데 사용되었습니다. 그래프는 n=4 분리 실험의 수단에서 조립되었다. 이 그림은 에드먼드와 우드럽(37)에서수정되었습니다. © IOP 게시. 허가하에 복제됩니다. 판권. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 2D ECM 및 3D ECM 프리 배양 된 오르가노이드는 관 형 및 간질 세포 유형의 구획화를 나타낸다.
72h의 배양 후 자가 조립 된 오르가노이드의 대표적인 밝은 필드 및 면역 형광 이미지. 2D ECM 프리 샘플은 전체 마운트를 이미지화하였고, 다른 모든 샘플은 5 μm 조직 섹션에서 이미지화되었다. (A– D)2D ECM 프리 문화. (E- H)2D ECM 문화. (I– L)3D ECM 프리 문화. (M– P)3D ECM 문화. 분석에 사용되는 세포 특이적 마커는 최고 마진에 표시된다: 세르톨리 세포 핵(SOX9) 및 세포 체체(βCatenin), 세균 세포(DDX4, 팬 배아 세포 마커), Leydig 세포(3βHSD), 및 peritubular 세포(αSMA). 모든 형광 샘플은 DAPI와 DNA를 위해 공동 염색되었습니다. 노란색 화살표는 왼쪽에서 두 번째 열에서 DDX4 로 표시된 세균 세포를 가리키고 빨간색 화살표는 오른쪽 두 개의 열의 Sertoli 셀 클러스터를 가리킵니다. 밝은 필드 스케일 바 = 400 μm, 형광 스케일 바 = 100 μm. 이 그림은 에드먼드와 우드럽(37)에서수정되었습니다. © IOP 게시. 허가하에 복제됩니다. 판권. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 오르가노이드는 희귀 세균 세포에 의해 채워진 관과 같은 구조물을 개발합니다.
3D-ECM 프리 조립 오르가노이드는 14일 동안 배양되었다. (A-D) 대표적인 H&E 및 면역형 이미지는 관과 유사한 구조(TLS) 주변의 세포 유형 및 조직 특징을 자세히 설명합니다. 동일한 오르간노이드는 형태학적 특징의 나란히 비교를 가능하게 하는 인접 조직 섹션에서 묘사됩니다: Leydig 세포 (3βHSD), 관적 세포 (αSMA), 세르톨리 세포 체체 (βCatenin), 콜라겐 막 (COL IV), 및 세르톨리 세포 핵 (SOX9); 스케일 바 = 100 μm. (E– G) 면역형성 라벨링은 팬 배아 세포 마커(DDX4), 정자 줄기 세포 마커(SALL4) 및 메이오티컬 활성 정자 세포(SCP3)를 포함한 세균 세포에 대해 수행되었다. 높은 확대 된 인셋은 3E 및 3F의 노란색 패널에 의해 설명됩니다. 녹색 삼각형은 DDX4 표지셀을 가리킵니다. 적색 화살표는 SALL4 표지된 셀을 가리킵니다. (H)장기성 내의 세르톨리 세포 사이의 단단한 접합의 대표적인 투과 전자 현미경(TEM); TEM 스케일 바 = 100 nm. (I– L) 단단한 접합부(ZO1) 및 라미닌을 포함한 반열성 상피의 주요 특징을 위해 표기된 TLS의 높은 배율 대표 이미지. 동일한 TLS는 패널 I – L의 인접 조직 섹션에 묘사됩니다. 모든 형광 샘플은 DAPI와 DNA를 위해 공동 염색되었습니다. 이미지는 n=7 분리 생물학적 실험에서 선택되었다. 이 그림은 에드먼드와 우드럽(37)에서수정되었습니다. © IOP 게시. 허가하에 복제됩니다. 판권. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 오르가노이드는 고나돌핀 FSH와 hCG에 대한 응답으로 12 주 동안 남성 호르몬과 인히빈 B를 분비합니다.
3D-ECM 프리 오르가노이드로부터 수집된 조건부 미디어는 효소 연계 면역소벤트 분석(ELISA)을 통해 테스토스테론과 인히빈 B를 측정하였다. (A)오르가노이드는 12주 동안 배양되었고, FSH 와 hCG 보충제는 2-12주 동안 보충의 시작에 적색 화살표로 표시됨); 모든 값은 통계 시험을 위한 문화의 7일째와 비교되었습니다. (B)내분비 반응성이 12주 후에 보존되었는지 를 결정하기 위해 "재자극 시험"의 확대그래프. 테스트 기간은 4A의 회색 상자에 의해 설명됩니다. 문화에서 12 주 완료, 생식선 호르몬은 48 시간 동안 제거 하 고 문화의 마지막 24 h에 대 한 다시 보충. 호르몬은 생식샘호르몬 재자극 후 0, 2, 6, 12, 24시간에서 측정하였다. 적색 그늘진 영역은 FSH 및 hCG를 가진 문화 중 기간을 지정하며, 비그늘이 없는 영역은 FSH 및 hCG 없이 기간을 지정합니다. 지적된 p-값은 다시 자극 후 2h를 기준으로 합니다. Tukey의 다중 비교 시험을 가진 양방향 ANOVA는 모든 내분비 데이터, n=5 개별적인 생물학 실험에 대한 중요성을 결정하기 위하여 이용되었습니다. 이 그림은 에드먼드와 우드럽(37)에서수정되었습니다. © IOP 게시. 허가하에 복제됩니다. 판권. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 organoid 생성 프로토콜이 완료되면 사용자는 ECM 또는 ECM이 없는 환경에서 고환 구조 및 오르가노이드를 조립할 수 있는 네 가지 문화 기술을 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 4가지 방법 모두를 통해 연구원은 시간 경과 화상 진찰 또는 비디오 기록을 통해 시간이 지남에 따라 비침습적으로 기관지 자기 조립을 관찰하고, 문화 도중 조직을 방해하지 않고, 분비한 호르몬과 사이토카인의 분석을 위해 조건부 된 미디어를 비침습적으로 수집할 수 있습니다. 모든 방법에서, 24h의 과정을 통해, 실험자는 세포 수가 허용하는 것처럼 수백 개의 오르가노이드 / 고환 구조를 생성할 수 있다. 이러한 방법은 다른 크기와 형태와 구조로 조직 자체 조립을 촉진; 오르가노이드 크기는 다른 오르가노이드보고서(34)에서볼 수 있듯이 배양에 사용되는 세포 수 및 농도에 따라 달라집니다. 오르가노이드 크기 나 직경을 줄이면 때로는 더 큰 오르가노이드에 있는 괴사의 내부 영역의 개발을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 2D ECM 및 3D ECM 프리 프로토콜 방법의 특정 강도는 관과 간질 세포 유형의 드 노보 구획화를 포함하는 형태학적으로 모방 된 고환 오르가노이드를 생성하는 능력입니다. 또한, 3D ECM 이없는 조립 된 오르가노이드는 반열성 TLS의 드 노보 튜벌로발생을위한 모델을 제공하며 적절하게 구획화되고 지향적인 세르톨리와 복관 세포. 이것은 고환 오르가노이드를 연구하기위한 중요한 표현형이며, 여전히 다른 고환 오르가노이드 보고서 사이에 변수 결과입니다. 여러 개의 다른 보고서는 관과 간질 구획화가 부족하며 일부는 심지어 "내부 아웃 튜블러"표현형32,,33,,34,,38을개발한다. 본 원고에 제시된 오르가노이드 생성 방법 중 어느 것도 배양기간 동안 큰 세균 세포 집단을 유지하는 것을 특징으로 하지 않았지만, 세균 세포는 72h로 일찍 관찰되지 않았기 때문에, 2D ECM 및 3D ECM 프리 방법 모두 체외 관형성 및 정자의 체세포 성분을 연구하는 유용한 도구를 제공할 수 있다. 이 목표를 염두에 두고 고환 오르가노이드는 체외 발아 줄기 세포 유지, 메이오틱 진행 및 분화를 개선하기 위한 향후 프로토콜을 최적화할 수 있는 잠재적 플랫폼을 제공합니다.
이러한 프로토콜의 또 다른 장점은 오르가노이드 생성을 사용자 지정하고 확장할 수 있다는 점입니다. 사용자 정의, 약물 처리, 또는 엔지니어링 된 세포 집단을 대체 하거나, 1 차 마우스 고환 세포 이외에 사용할 수있습니다(37). 세포 현탁액이 낮은 생존가능성(&80%)인 경우 셀룰러 서스펜션의 세포 생존가능성을 개선하기 위한 방법을 취해야 한다. 여기에는 해리 매체에 소요되는 시간을 줄이고 조직 소화(단계 2.4.1 – 2.5.2 단계) 동안 트리튜레이션을 최소화하거나, 해리 후 세차 수를 늘리거나, 세포 분류 또는 죽은 세포 라벨링 키트로 해리 후 죽은 세포를 제거하는 것이 포함될 수 있다. 그러나 이 보고서에 공유된 대표 데이터를 생성하기 위해 이러한 단계는 필요하지 않았습니다. 2D 및 3D ECM 배양 방법의 경우, 이러한 프로토콜은 여기에 제시된 연구에 사용되는 것 외에도 다른 구조적 단백질 기반 생체 재료 행렬과 함께 사용될 수 있다. 이들 다른 생체 재료는 콜라겐, 젤라틴, 시판되는 ECM 추출물 및 맞춤형 탈세포형 ECM 유래 하이드로겔25,,26,,28을포함한다. 문제 촬영 ECM 젤 디스펜싱 및 고품질 아가로즈 3D 페트리 접시 삽입을 만들기위한 몇 가지 포인터가 있습니다. ECM 젤을 챔버 플레이트에 발주할 때는 빠르게 작동하고 차가운 파이펫 팁을 사용하여 배양 접시에 분배하기 전에 튜브 또는 파이펫 팁 내에서 ECM의 조기 중합을 방지해야 합니다. 3D 페트리 접시 금형 (3D ECM 프리 배양)에 용융 아가로즈를 캐스팅 할 때, 최소한의 변화로 인서트의 고품질 주조를 보장하기 위해 뜨겁고 따뜻하지 않은 아가로즈만 사용하고, 아가로즈가 완전히 실온으로 냉각되어 금형에서 제거하기 전에 고화되었는지 확인하십시오. 아가로즈 3D 페트리 요리는 미세한 집게로 부드럽게 취급하는 것이 가장 좋습니다. 고정을 위해 오르가노이드를 수집 할 때, 모든 오르가노이드의 컬렉션을 시각화하기 위해 해부 현미경에서 작동해야합니다. 오르가노이드는 문화 요리의 플라스틱 측면과 파이펫 팁의 내부에 충실 할 수 있습니다; 유리 파이펫은 플라스틱보다 오르가노이드 준수가 적습니다. ECM 의 내부 또는 상단에 캡슐화된 동안 오간이를 고정하는 것은 고정 하기 전에 ECM에서 그들을 제거 하는 것 보다 더 도전 적이 고 섬세한 과정. 조직 처리 젤은 배양 챔버로부터 제거하기 전에 ECM-오가노이드 구조 위에 캐스팅되어고정(39)전에겔을 강화할 수 있다. 고정은 4°C로 낮아지면 중합을 해제할 가능성이 있기 때문에 ECM 하이드로겔을 회수하기 위해 실온에서 수행되어야 합니다. 또한, 0.1 % - 1.0 % 글루타랄데히드를 4 % PFA 솔루션에 첨가하여 ECM을 추가로 교차 연결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 시료의 배경 자동 형광을 증가시킨다.
위에 제시된 오르가노이드 생성 방법에 의해 달성된 결과에 상당한 세균 세포 특이적 한계가 있으며, 이는 미래의 혁신을 위한 우선 순위 영역을 나타낸다. 세균 세포는 확장된 배양에 걸쳐 제대로 지원되지 않으며, 배양의 처음 며칠 동안만 쉽게 관찰되며 배양 첫 주 말과 후기 시점에서 거의 관찰되지 않습니다. 미분화 된 정자는 생체 내 튜튜블(40)로이식시 정자 발생을 회복시키는 능력을 유지하면서 체외 세포 배양 내에서 유지 될 수 있지만, 관체 체세포 미세 환경 (즉,, 직접 세르톨리 세포 상호 작용)은 시험관 내 의 메이오증 및 정자 발생을 통해 전 메이오성 세균 세포를 체외1,,5,,40,,41로분화하기 위한 전제 조건이 될 수 있다고 가설이다. 구조적으로 모방 한 TLS 내의 초기 시점에서 정자를 포함하는 고환 오르간노이드는 완전히 체세포, 체세포 및 체세포 생식 세포 상호 작용을 비 침습적으로 연구하는 필드를 가능하게 할 수 있습니다. 배양 전에 배지 첨가제 및 세포 제제의 최적화(예를 들어, 체외 정자 줄기 세포 배양에 사용되는 제제의 편입)42,,43은 향후 연구에서 세균 세포의 수율을 증가시킬 수 있으며, 특히 며칠 이상 배양 기간 동안. 반대로, 미세 주입을 통해 TLS가 형성된 후에 정자를 다시 소개하는 방법은, 오르가노이드 내의 세균 세포를 복원하고, 세균 세포를 유지하기 위하여 체외 조직된 체세포 환경의 기능을 시험하는 흥미로운 기회를 포즈합니다. 다른 생물학적 요인은 나이/성숙도45 및 유전적 배경차이(17)를포함하여 전 생체 내외 문화에 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 이 같은 변수는 고환 기관지 생물학의 필드 내에서 직접 조사되지 않았습니다. 그러나, 다른 조립, 형태학 및 기능적 표현형이 다른 노화 동물(즉, 신생아, 청소년, 성인) 또는 다양한 유전적 배경의 동물(예를 들어, 다른 마우스 균주)으로부터 분리된 세포로부터 생성될 때 다른 조립, 형태 및 기능적 표현형이 발생할 수 있다는 것은 그럴듯하다.
요약하자면, 이 원고에 공유된 기술은 세포 중심의 고환 구조 자가 조립, 두 개의 별도의 구조적 미고고 고환 오르노이드 모델의 생성, 그리고 시험관내에서 TLS 발달 및 호르몬 반응성 내분비 기능의 중요한 성취를 연구하기 위한 4가지 유용한 모델을 제공한다. 이러한 모델은 최소한 복잡하고 완전히 정의된 문화 미디어가 있는 ECM 및 ECM 환경에서 2D 및 3D 공간 방향을 포괄합니다. 각 메서드는 매우 재현 가능하며 일반적으로 사용 가능한 문화 권 자원만 사용합니다. 이러한 방법은 시험관 내의 고환 형태 발생을 연구하고 체외 정자 발생을 위한 미래 문화 조건을 최적화하는 데 유리할 수 있습니다. 더욱 이에 따라, 2D ECM 및 3D ECM 프리 방법은 고환, 체외 tubulogenesis, 체세포 및 체세포 및 세균 세포 상호 작용에 고유한 드 노보 조직 구획화의 과정을 연구하기 위한 새로운 도구를 제공합니다. 고환 오르간노이드는 신체 고환 생리학적 특징의 개발 및 조절을 조사할 수 있는 유연하고 확장 가능한 기회를 제공합니다. 혈액 -고환 장벽 및 내분비 생산 및 반응을 포함; 또한 차세대 번역 연구 조직 모델을 개발하기위한 유용한 도구입니다. 이들은 더 큰 시스템 수준 모형에 생식 호르몬을 통합하는 것을 포함합니다, 조직 에 칩 및 마이크로 생리플랫폼 과 같은45,,46. 언젠가 적용될 수 있는 고환 기관지검을 향한 다른 번역 목표는 생식 독성학 및 면역학 장벽 시험, 남성 피임 발달 및 보조 생식 기술 혁신을 포함합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원, 국립 아동 보건 및 인간 개발 연구소 (NICHD) F31 HD089693, 국립 환경 보건 과학 연구소 / 국립 환경 보건 센터 (NIEHS / NCATS) UH3TR01207 및 4UH3ES029073-03, 그리고 토마스 Jkin의 기념 교수에 의해 지원되었다.
저자는 전송 전자 현미경 검사법에 그들의 도움을 에릭 W. 로스 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 노스 웨스턴 대학의 NUANCE 센터의 BioCryo 시설을 사용, 이는 소프트 및 하이브리드 나노 기술 실험 (SHyNE) 자원 (NSF ECCS-1542205)의 지원을받고있다; 재료 연구 센터에서 MRSEC 프로그램 (NSF DMR-1720139); 국제 나노 기술 연구소 (IIN); 그리고 일리노이 주, IIN을 통해. 또한 MRI 프로그램(NSF DMR-1229693)의 지원을 받은 CryoCluster 장비를 사용했습니다. 그림 1의 그래픽은 BioRender.com 사용하여 설계되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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