Summary
Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.
Abstract
Hodenorganoide bieten ein Werkzeug für die Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Endokrinologie in vitro. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um Hodenorganoide zu erstellen. Viele dieser Methoden verlassen sich auf extrazelluläre Matrix (ECM), um de novo Gewebe-Montage zu fördern, jedoch gibt es Unterschiede zwischen Denkmethoden in Bezug auf biomimetische Morphologie und Funktion des Gewebes. Darüber hinaus gibt es nur wenige direkte Vergleiche veröffentlichter Methoden. Hier wird ein direkter Vergleich durch die Untersuchung von Unterschieden in Organoid-Generierungsprotokollen, mit bereitgestellten Ergebnissen gemacht. Vier archetypische Erzeugungsmethoden: (1) 2D ECM-frei, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-frei und (4) 3D-ECM-Kultur werden beschrieben. Zur Beurteilung der Hodenorganoid-Erzeugung wurden drei primäre Benchmarks verwendet. Dabei handelt es sich um zelluläre Selbstmontage, Die Einbeziehung wichtiger Zelltypen (Sertoli, Leydig, Keime und peritubäre Zellen) und entsprechend abgeschottete Gewebearchitektur. Von den vier getesteten Umgebungen erzeugten 2D ECM- und 3D-ECM-freie Kulturen Organoide mit internen Morphologien, die nativen Hoden am ähnlichsten sind, einschließlich der De-Novo-Abschottung von röhrenförmigen versus interstitiellen Zelltypen, der Entwicklung von Tubule-ähnlichen Strukturen und einer etablierten langfristigen endokrinen Funktion. Alle untersuchten Methoden nutzten unsortierte, primäre murine Hodenzellsuspensionen und nutzten allgemein zugängliche Kulturressourcen. Diese Hodenorganoid-Generierungstechniken bieten ein hochzugängliches und reproduzierbares Toolkit für Forschungsinitiativen zur Hodenorganogenese und Physiologie in vitro.
Introduction
Hodenorganoide sind eine bahnbrechende Technik zur Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Physiologie in vitro1,2,3,4. Mehrere Methoden wurden für die Organoid-Generierung erforscht; Dazu gehören eine Vielzahl von extrazellulären Matrix- (ECM) und ECM-freien Kultursystemen, sowohl in zweidimensionalen (2D) als auch dreidimensionalen (3D) Ausrichtungen. Unterschiedliche Erzeugungsmethoden können unterschiedliche zelluläre Montagestrategien fördern; Dies führt zu einer hohen morphologischen und funktionellen Variabilität zwischen veröffentlichten Organoidmodellen. Der Zweck dieses Artikels ist es, den aktuellen Zustand von In-vitro-Hodenmodellen zu diskutieren und als Vorlage für zukünftige Forscher bei der Entwicklung von Hodenorganoidexperimenten zu dienen. In der vorliegenden Studie werden vier verschiedene Kultursystemarchetypen definiert und in experimentellen Prozess- und biologischen Ergebnissen charakterisiert. Dazu gehören: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free und 3D ECM Kulturmethoden. Die hier vorgestellten Strategien sollen einfach, zugänglich und zwischen verschiedenen Laboratorien und Forschungsgruppen hochgradig reproduzierbar sein.
Historisch für die Hoden, die Bezeichnung "in vitro", wurde für mehrere verschiedene Kulturmethoden von Hodengeweben und -zellen verwendet. Dazu gehören organotypische Gewebe-/Organkulturmethoden (d.h. Explantkultur)5, isolierte seminiferöse Tubulenkultur6, Hodenzellkultur7und Methoden der de novo Gewebemorphogenese (d.h. biologische Konstrukte und Organoide)1. Die ersten Untersuchungen zur In-vitro-Spermatogenese wurden vor etwa 100 Jahren mit der Kultur der Kaninchen-Hodenexplantationen 19208und später 1937 mit Mausexplantationen9durchgeführt. Innerhalb dieser ersten Experimente wurden Spermatogonien beobachtet, die in der ersten Kulturwoche weitgehend degenerierten, obwohl einige meiotisch differenzierende Zellen identifiziert wurden. Erinnert an diese historischen Berichte, wurde die Testis-Explantationskultur 2011 wiederbelebt und optimiert, um eine praktikable Technik zum Studium der Hoden10zu werden. Seit 2011 hat explant kultur Fruchtbarkeit kompetente Spermien in mehreren Berichten produziert11,12,13. Doch aufgrund der Abhängigkeit der Explant-Kultur von bereits existierenden nativen Hobules werden diese jüngsten Fortschritte genauer als Beispiele für "ex vivo" Hodenfunktion und Spermatogenese beschrieben, Gewebefunktion, die bei der Entfernung aus dem Körper eines Organismus beibehalten oder wieder aufgenommen wurde. Trotz seiner Prävalenz in der Literatur, langfristige Keimzellerhaltung und Differenzierung innerhalb hoden Explants ist eine Herausforderung zu replizieren14,15,16,17,18, vor allem über Zeitrahmen lang genug, um vollständig zu beobachten In-vitro-Spermatogenese (35 Tage bei Mäusen19 und 74 beim Menschen20). Es ist faszinierend zu erkennen, dass viele der gleichen Herausforderungen, die vor 100 Jahren erlebt wurden, noch heute in der ex vivo Spermatogenese erlebt werden.
Im Unterscheidet sich von Ex-vivo-Ansätzen sind Hodenorganoide de novo zusammengesetzte Mikrotissues, die vollständig in vitro aus zellulären Quellen (d. h. primären Hodenzellen) erzeugt werden. Hodenorganoide bieten eine kreative Strategie, um die historische Abhängigkeit des Feldes von bereits vorhandenem nativem Gewebe zu umgehen und die Hodenbiologie vollständig in vitro zu rekapitulieren. Es gibt mehrere Anforderungen, die von den meisten organoiden Gewebemodellen geteilt werden; Dazu gehören (1) in vivo-mimetische Gewebemorphologie oder Architektur, (2) mehrere Hauptzelltypen des dargestellten Gewebes, (3) Selbstmontage oder Selbstorganisation in ihrer Erzeugung und (4) die Fähigkeit, eine gewisse Ebene der Funktion des dargestellten Gewebes und der Physiologie zu simulieren21,22,23,24. Für die Hoden kann dies in vier Hauptmerkmalen erfasst werden: (1) die Einbeziehung von Haupthodenzelltypen, Keim, Sertoli, Leydig, peritubular und andere interstitielle Zellen, (2) zellgesteuerte Gewebeanordnung, (3) entsprechend kompartalisierte Zelltypen in separate röhrenförmige Kompartimente (Keim und Sertoli) und interstitielle Regionen (alle anderen Zelltypen) und (4) ein gewisses Maß an Gewebefunktion (z. B. Reproduktivhormonsekretion oder Gewebereaktionen und Zellabhängigkeit). Unter Berücksichtigung der historischen Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Keimzelldifferenzierung ex vivo und in vitro sind die Rekapitulation in vivo-mimetischer Hodenarchitekturen (d. h. Strukturen, die seminiferous tubulis ähneln) mit zusätzlichen Markern, die auf die Simulation der Hodenphysiologie (z. B. endokrine Funktion) hindeuten, vorrangige Meilensteine zur Erzeugung von Organoiden, die eines Tages die in vitro erhaltene Spermatogenese aufrechterhalten könnten.
Die meisten veröffentlichten Hodenorganoid-Methoden nutzen kommerziell erhältliche ECM (z.B. Kollagen oder proprietäre ECM-Formulierungen)25,26,27 oder kundenspezifische ECMs (d.h. dezelluläre Hoden ECM-abgeleitete Hydrogele)28,29,30. Exogenes ECM fördert die De-Novo-Gewebebildung durch bereitstellung eines Montage-unterstützenden Gerüstes für die Gewebebildung. ECM-Methoden haben ein beeindruckendes Maß an Gewebebildung ermöglicht, einschließlich einiger Keimzellpräsenz und gewebemimetischer Morphologie25,28. Die von ihnen verwendeten ECMs sind jedoch nicht immer universell verfügbar (d. h. dezellularisierte ECM-abgeleitete Hydrogele), und einige Methoden erfordern ausgeklügelte Gel- und Zellsaatausrichtungen (z. B. 3-Schicht-Gradienten des ECM- und 3D-Drucks)25,31,32. Gerüstfreie Methoden (z.B. hängende Tropfen und nicht haftende Kulturplatten)33,34,35 haben auch robuste und hoch reproduzierbare Organoide ohne ECM-Gele oder Gerüste erzeugt. Jedoch, die Gewebemorphologie dieser Gerüst-freien Organoide ist oft unähnlich zu in vivo Hoden, und die meisten dieser Berichte enthalten eine biochemische ECM-Additiv zur Förderung der Gewebebildung33,34,36, oder alternativ, verlassen sich auf Zentrifugierung für erzwungene Zellaggregation und Verdichtung34, so dass sie weniger ideal für die Untersuchung zellgesteuerte Migration und Selbstorganisation.
Die vier in diesem Manuskript vorgestellten Organoid-Generierungsmethoden umfassen sowohl ECM-abhängige als auch unabhängige Strategien, die jeweils eine einfache Zellaussaat verwenden, die die Beobachtung der zellgesteuerten organoiden Selbstmontage ermöglicht. Alle vier Techniken können aus denselben Zellsuspensionen ausgeführt werden oder benutzerdefinierte und zelltypangereicherte Populationen verwenden. Eine Stärke dieser Methoden ist die Fähigkeit, Organoide in Echtzeit selbst zu beobachten und direkt zu vergleichen, wie hodenförmige Strukturen sich zwischen verschiedenen Kulturmikroumgebungen selbst zusammensetzen. Die phänotischen Unterschiede zwischen diesen vier Kulturmethoden sollten wegen ihrer Auswirkungen auf die Forschungsfrage oder das Thema des Prüfers berücksichtigt werden. Jede Methode produziert biologische Konstrukte oder Organoide innerhalb von 24 h oder weniger. Zusammenfassend lassen sich sagen, dass die hier vorgestellten Methoden ein Toolkit von organoiden Montagetechniken zum Studium der Hodenorganoid-Montage, Gewebeentwicklung und Hodenphysiologie in vitro bieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Mausexperimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Northwestern University genehmigt, und alle Verfahren wurden nach von der IACUC zugelassenen Protokollen durchgeführt.
1. Vorbereitung von enzymatischen Gewebedissoziationslösungen
- Verwenden Sie zwei verschiedene enzymatische Lösungen (Lösung 1 und Lösung 2), die beide mit einer Basalkultur-Medium-Lösung (BM) hergestellt werden.
- Zur Herstellung von BM serum und penicillin-streptomycin zu den minimalen essentiellen mittleren bis endgültigen Konzentrationen von 10% bzw. 1% hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien für spezifische Reagenzien). Anschließend filtert steril das BM durch einen 0,22-m-Filter. Vor der Anwendung mit Zellen steriles BM auf einen neutralen pH-Wert voraussetzen, indem man in2 eine Kulturschale ausgibt und in einen befeuchteten, 5% CO2-Inkubator bei 37 °C für mindestens 1 h legt.
HINWEIS: BM kann bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden, danach sollte frisches BM hergestellt werden. - Um Kollagennase zu zubereiten, lösen Sie zunächst 100 mg Kollagenase I in 1 ml sterilen Embryo gradH2O (Endkonzentration 10% m/v), invertieren oder wirbeln, um sich aufzulösen, und lagern Sie 20 l Aliquots bei -20 °C für die spätere Anwendung. Aliquots sollten nur einmal aufgetaut werden.
- Zur Herstellung von Desoxyribonuclease I (DNase I) Stocklösungen 20 mg DNase I in 1 ml sterilen Embryo GradH2O (Endkonzentration 2% m/v), invertieren oder wirbeln, um sich aufzulösen (nicht wirbeln), und 20 L Aliquots bei -20 °C für die spätere Anwendung lagern. Aliquots sollten nur einmal aufgetaut werden.
- Für Hyaluronidase-Stammlösungen 30 mg in 1 ml steriler Phosphatgepufferte Salzsäure (PBS; Endkonzentration 3% m/v Hyaluronidase in PBS enthaltend Ca++/Mg++), invertieren oder wirbeln, um sich aufzulösen, und 100 L Aliquots bei -20 °C für die spätere Verwendung aufbewahren. Aliquots können mehrmals aufgetaut und wieder eingefroren werden, ohne die enzymatische Aktivität zu verlieren.
- Zur Herstellung der Dissoziation Solution 1fügen Sie 10 l Kollagennase I und 10 l DNase I in 1 ml sterilen, vorausgeglichenen BM hinzu (Endkonzentrationen: 1 mg/ml Kollagennase I und 5 g/ml DNase I). Trituieren Sie vorsichtig mit einer Pipette, um die Lösung zu mischen, und vorerwärmen auf 37 °C vor der Verwendung mit dem Gewebe.
HINWEIS: Lösung 2 wird durch Zugabe von 33 l Hyaluronidase (vorgewärmt auf 37 °C) pro 1 ml Lösung 1 (auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml) hergestellt. Dies geschieht auf halbem Weg durch enzymatische Dissoziation von Hodengewebe bei Schritt 2.5 unten.
2. Testisgewebe-Dissoziation
HINWEIS: Alle Mäuse wurden in Polypropylenkäfigen untergebracht und mit Nahrung und Wasser ad libitum versorgt. Die Tiere wurden mit bestrahltem Chow gefüttert, das keine Phytoöstrogene enthält. Juvenile CD-1-Mäuse, 5 Tage nach dem Partum (dpp), wurden für alle Experimente verwendet und vor der Euthanasie und Gewebesammlung betäuisiert, innerhalb einer Anästhesiekammer, die an einem Isofluran-Verdampfer befestigt ist (2,5 l/min in O2). Mäuse wurden zur Vollanästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf Zehenstich bestätigt, nach dem Mäuse durch Enthauptung eingeschläfert wurden.
- Anästhesisieren Sie Mäuse in einer Isoflurankammer, sorgen Sie für Anästhesie über einen Zehenstich und enthaupten Sie die Maus dann mit einer scharfen Schere. Legen Sie die eingeschläferte Maus-Supine auf eine Seziermatte und sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Die Haut des Unterbauchs mit Zangen aufstellen und den Bauch mit einer Schere öffnen.
- Suchen Sie die Hoden in den unteren linken und rechten Leistenregionen des Bauches. Schneiden Sie ihre Verbindungen zu den Vas deferens und jedem verankernden Bindegewebe, dann heben Sie den gesamten Hoden (mit Epididymis noch befestigt) vom Tier. Legen Sie Diehoden in eine Petrischale aus vorausgeglichenen BM.
- Unter einem Seziermikroskop und in einem sterilen Feld einen kleinen Schnitt in der Tunika albuginea an einem Ende jedes Hodens entweder mit einer kleinen Mikrodissektionsschere oder durch sanftes Reißen mit zwei feinen Zangen machen.
- Dann, während Sie die Hoden vom entgegengesetzten Ende des Einschnitts halten, drücken Sie die Hoden vorsichtig mit feinen Zangen und schieben Sie in einer sanften Kehrbewegung in Richtung des Lochs in der Tunika; Dadurch wird das Hodengewebe als ein kohäsives Stück freigesetzt.
- Schneiden Sie die Hoden in kleinere Stücke (≤ 2 mm3) und legen Sie sie in 1 ml vorgewärmt (37 °C) Dissoziation Lösung 1.
- Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
- Bei mehr als 10 Tests erhöhen Sie das Gesamtvolumen der Dissoziationslösung um 1 ml, sodass mindestens 1 ml Dissoziationslösung pro 10 Hoden (z. B. 2 ml für 20 Hoden, 3 ml für 30 Hoden usw.) zur Folge haben.
- Die Hodenstücke 50-mal (50x) in Lösung 1 mit einer P1000 Pipette sanft trituieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Tubuli an dieser Stelle voneinander und vom interstitiellen Gewebe trennen. Wenn Klumpen bleiben, für weitere 5 min inkubieren und triturat noch einmal (50x).
- Fügen Sie 33 l Hyaluronidase-Stammlösung (vorgewärmt bei 37 °C, ab Schritt 1,5) pro 1 ml Lösung 1 Dissoziationsgemisch (mit dem teilweise dissoziierten Hodengewebe und den Tubuli) hinzu. Nach dem Hinzufügen von Hyaluronidase wird dies Lösung 2 genannt.
- Trituat (50x) mit einem P1000 und bei 37 °C für 5 min inkubieren.
- Trituat (50x) mit einer P200 Pipette.
- Stellen Sie sicher, dass an dieser Stelle keine sichtbaren Tubuli oder Zellklumpen vorhanden sind. Wenn Klumpen bestehen bleiben, inkubieren Sie bis zu 5 weitere min, mit weiterer Triturierung mit einer P200 Pipette (50x).
- Quench die Dissoziationsenzyme durch Zugabe von fetalem Rinderserum (FBS) zu 10% des Gesamtvolumens der Lösung 2. Trituieren Sie mehrmals mit einer P200-Pipette, um sicherzustellen, dass keine Klumpen verbleiben, und filtern Sie durch ein 40-m-Zellsieb, um eine einzellige Suspension zu erzeugen.
- Zentrifugenzellen bei 100 x g für 7 min, verwerfen sie den Überstand und setzen die Zellen in frischem BM wieder auf.
- Zählen Sie die Gesamt- und lebensfähigen Zellkonzentrationen mit Trypanblauausschluss auf einem Hämozytometer. Fügen Sie 10 L von 1:1 verdünnt, Zellsuspension: Trypan-Blau-Lösung, in die Hämozytometer-Zellzählkammer (siehe Tabelle der Materialien).
- Rezentrifugenzellen bei 100 x g für 7 min und in frischem BM wieder aufsetzen.
HINWEIS: Verwenden Sie nur lebensfähige Zellen zur Berechnung der Zellkonzentration und -zahl. Verwenden Sie nur Zellsuspensionen von ≥ 80% Lebensfähigkeit zur Erzeugung von Organoiden. - Bereiten Sie die einzelzellige Suspension in Zellkonzentrationen vor, wie beschrieben, um 280.000 Zellen zu aliquoten, wenn man die in den protokollspezifischen Schritten unten in Abschnitt 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 Zellen/ml verwendeten Volumen aliquotiert, 2D ECM – 0,56 x 106 Zellen/ml , 3D ECM-frei – 4,66 x 106 Zellen/ml, 3D ECM – 2,8 x 106 Zellen/ml.
HINWEIS: Alle hier vorgestellten Kulturexperimente beginnen mit 280.000 Zellen, die pro Kultur gut gesät werden. Diese Zahlen werden den repräsentativen Daten in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4) zugeordnet.
- Rezentrifugenzellen bei 100 x g für 7 min und in frischem BM wieder aufsetzen.
3. Zubereitung von organoiden Kulturgerichten und Aussaat von Zellen
ANMERKUNG: Um ein homogenes ECM zu gewährleisten, werden vor dem Experimentieren über Nacht gefrorene Aliquots von ECM vor dem Tauwetter eingefroren. ECM-Aliquots sollten in einem Eimer Eis in einem 4 °C-Kühlschrank oder Kühlraum untergetaucht werden, um einen langsamen, allmählichen Temperaturanstieg zu gewährleisten. Alle ECM werden bei einer 1:1-Endverdünnung in BM für Kultur verwendet. ECM und 1:1 verdünntes ECM bis unmittelbar vor Gebrauch auf Eis halten, sonst könnte das ECM vorzeitig polymerisieren.
- Für die 2D-ECM-freie Kultur ist keine spezielle Präparation erforderlich, Platteneinzelzellsuspensionen (500 l von 0,56 x 106 Zellen/ml in BM) direkt auf 4-Well-Kammer-Dias und in einen 35 °C-Inkubator für Kultur legen.
HINWEIS: Zellen sollten sich innerhalb der ersten 24 h kultur am Boden des Kulturgerichts halten und können innerhalb derselben Zeit einige kleine 3D-Zellcluster aufweisen. - Für die 2D-ECM-Kultur 100 l kaltes 1:1 verdünntes extrazelluläres Kellermatrixmedium in ein 4-Well-Kammer-Dia geben, um sicherzustellen, dass das Gel den gesamten Tellerboden abdeckt.
- Legen Sie das Kammerschieber mindestens 30 min in einen 35 °C-Inkubator, damit das ECM in ein Gel polymerisiert.
- Fügen Sie die Zellsuspension (500 x L von 0,56 x 106 Zellen/ml in BM) direkt auf die Oberseite des 2D-Gels, sobald es polymerisiert ist.
HINWEIS: Zellen sollten sich zu kleinen 3D-Clustern innerhalb der ersten 24 h Kultur zusammenschließen.
- Für 3D ECM-freie Kultur, bereiten Agarose 3D Petri Teller Einsätze vor dem Start der Zellkultur.
- Zuerst Autoklav 1,5 g AgarosePulver in einem 100 ml Becher, dann 75 ml steril, destilliertes Wasser und Mikrowelle hinzufügen, um geschmolzene 2% Agarose für 3D Petrischalenguss zu produzieren.
- In einem sterilen Arbeitsbereich geschmolzene Agarose in die 3D Petrischale geben, bis der Meniskus mit den Seiten der Form eben ist.
- Lassen Sie die Agarose abkühlen und erstarren. Wenn fest, drehen Sie die Form auf den Kopf und sanft biegen Sie wiederholt, bis die Agarose 3D Petrischale aus der Form fällt.
HINWEIS: An dieser Stelle kann man viele Agarose 3D Petrischalen zubereiten und sie in sterilenH2O oder DPBS bei 4 °C für mehr als einen Monat lagern. - Vor der Kultivierung, legen Sie Agarose 3D Petri-Gerichte in ein 24 Brunnen-Kultur-Gericht, und decken Sie sie mit 1 ml VON BM. Lassen Sie die 3D Petrischalen in BM für mindestens 30 min in einem 37 °C Kultur-Inkubator ausgrenzen. Entsorgen Sie den BM, und wiederholen Sie den Ausgleich noch einmal mit 1 ml frischem BM. Nach der Ausgleicherung von 3D Petrischalen in BM erscheinen sie in der gleichen Farbe wie die BM (d.h. rosa).
- Um sich auf die Zellaussaat vorzubereiten, entfernen Sie alle BM aus dem Brunnen und geben Sie 200 l frischeS BM herum, aber nicht innerhalb der mittleren Aussparung der 3D Petrischale. Sammeln Sie auch alle verbleibenden BM aus der Mitte Zelle-Saat-Aussparung des Mikrowell-Einsatzes.
- Geben Sie die einzellige Suspension (4,66 Zellen/ml in 60 l BM) in die mittlere Aussparung der Agarose 3D Petrischale. Sanft trituieren Sie nach oben und unten, um Zellen zu mischen und eine Einzelzellsuspension zu Beginn der Kultur zu garantieren.
- In einen befeuchteten 35 °C-Inkubator für Kultur geben. Entfernen Sie am nächsten Tag die 200 l BM aus der Umgebung des Mikrowell-Einsatzes und ersetzen Sie sie durch 1 ml frisches BM. Dadurch wird der Flüssigkeitsstand über die Ebene des Einsatzes gebracht, wodurch die gesamte Kultur untergetaucht wird.
- Entfernen/hinzufügen Sie medien von außerhalb der Agarose 3D Petrischale langsam und vorsichtig. Die Organoide sollten über Nacht verdichtet haben, so dass sie am Boden ruhen können und Medienwechsel organoide ungestört lassen.
- Für die 3D-ECM-Kultur eine Einzelzellsuspension vorbereiten, indem Sie zu gleichen Teilen die Zellsuspension in BM mit kaltem, vorgetautem ECM (Endkonzentration = 2,8 x 106 Zellen/ml) kombinieren.
- Geben Sie das Zell-ECM-Gemisch sofort in eine 4-Well-Kammer-Rutsche, um sicherzustellen, dass die Mischung den gesamten Boden der Platte bedeckt.
- Die Kammergleitet bei 35 °C in einen Inkubator stellen und ihren Inhalt polymerisieren lassen. Dies sollte mindestens 30 min dauern. Fügen Sie nach der Polymerisation 500 l BM auf die Oberseite der Kultur.
HINWEIS: Zellen sollten sich zu kleinen 3D-Aggregaten innerhalb der ersten 24 h kultur zusammengehäuft haben.
4. Organoide Wartung
- Kultur alle organoiden Modelltypen bei 35 °C. Für alle Kulturtypen tauschen Sie alle 2 Tage die Hälfte ihrer Medien mit frischem BM aus. Um sicherzustellen, dass Organoide nicht versehentlich beim Austausch von Medium gesammelt werden, sammeln Sie medienlangsam aus einer Ecke der Kammer-Diaschale, und von einem externen Punkt außerhalb der Agarose 3D Petri Schalen. Alle Medien können bei -20 °C zur Verwendung mit Immunoassays oder anderen Analysen später (d.h. Quantifizierung von abgesonderten Fortpflanzungshormonen oder Zytokinen) gespeichert werden.
- Verwenden Sie nach 7 Tagen kulturmittelmit Follikel-stimulierendem Hormon (Endkonzentration 20 mIU/ml) und humanem Choriongonadotropin (Endkonzentration 4,5 I.E./ml). Dies gilt für alle organoiden Kulturtypen.
- Bildalle Organoidkulturen (d. h. Zeitraffer-Bildgebung) zur Charakterisierung der Organoidbildung und zur Quantifizierung von Metriken der Selbstmontage, Entwicklung und des Wachstums im Laufe der Zeit.
5. Organoid-Sammlung
HINWEIS: Alle Organoide können mit 4% Paraformaldehyd in PBS für nachgeschaltete Immunkennzeichnung und histologische Analysen fixiert werden. Fix für 2 h bei Raumtemperatur mit Drehung oder über Nacht bei 4 °C.
- Für 2D-ECM-freie Kulturen zuerst spülen Sie die Probe mit frischem PBS, und fügen Sie dann Fixativ direkt auf die haftenden Konstrukte.
- Für ECM -Kulturmethoden (2D und 3D) einmal mit PBS ausspülen und dann entweder fixativ direkt auf der Oberseite der ECM-Organoidprobe hinzufügen (um das ECM-Gel und die Organoide zusammenzusetzen), oder alternativ die Organoide vorsichtig nach oben und unten pfeifen, um sie vom umgebenden ECM zu befreien, und sie zur Fixierung in ein separates Rohr zu übertragen.
- Für 3D ECM-freie Kultur, sanft Pipette die Organoide nach oben und unten in der mittleren Aussparung der Agarose 3D Petri schale; dies wird die Organoide ausspülen, um ihre einfache Sammlung mit einer Pipette zu erleichtern. Dann organoide in ein separates Rohr zur Fixierung übertragen.
- Vor der Verarbeitung in Paraffin, betten Sie viele Organoide (≥ 20) in einem kleinen Volumen (ca. 30 l) gewebeverarbeitendes Gel; Dies hilft, Organoide in einem kleinen Bereich innerhalb von Paraffinblöcken zu orientieren und zu konzentrieren, was eine einfachere Beobachtung beim Schnitt und eine einfachere visuelle Identifizierung innerhalb von Paraffinabschnitten erleichtert.
HINWEIS: Organoide können schwierig sein, nach Paraffineinbettung und Schnitt auf einem Mikrotom zu identifizieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoide Erzeugung wurde als erfolglos, wenn Hodenzellen nicht selbst-assemble innerhalb 72 h der Kultur, jedoch, alle Methoden hier präsentiert montieren innerhalb von 24 h bei der Verwendung von juvenilen (5 dpp) murinen Zellen. Versagen der biologischen Konstrukterzeugung als Fortsetzung frei schwebender Zellen dargestellt (0 h Spalte in Abbildung 1) auch nach erweiterter Kultur (72 h). In Ermangelung einer Gewebeselbstmontage dispergierten sich alle scheinbaren Zellcluster bei schonender Manipulation (d.h. Pipettierung) leicht in einzelne Zellen. Erfolgreich erzeugtes Gewebe wurde zunächst als 3D-Zelle "Cluster" beobachtet (gelbe Pfeile in 6 h Spalte von Abbildung 1). Innerhalb von ECM-freien Umgebungen (2D und 3D) schienen diese Konstrukte sichtbar über die ersten 24 h der Kultur zu "kompakten", besonders wenn sie in 3D-Agarose Petri-Schalen(Abbildung 1A,C) waren. In ECM-Umgebungen (2D und 3D) wiesen Zellcluster klare Ränder zwischen dem Cluster und ihrer Umgebung auf (Abbildung 1B,D). Zellcluster wurden auch beobachtet, um über das ECM zu migrieren und zusammen zu verschmelzen, die größere Cluster bilden (rote Pfeile in Abbildung 1B). Die Zeit, die benötigt wurde, um separate selbstgebaute Strukturen zu schätzen, wurde gemessen, und es gab keinen signifikanten Zeitunterschied zwischen 2D- und 3D-ECM-freien Bedingungen und 2D-ECM, jedoch benötigte die 3D-ECM-Kultur deutlich mehr Zeit, um de novo-Strukturen zu montieren als alle anderen Kulturmethoden(Abbildung 1E). 2D ECM-freie und 3D-ECM-Kultur generierte Zellcluster mit deutlich kleineren Größen als 2D ECM und 3D ECM-freie Kulturmethoden; 3D ECM-freie Kultur produzierte die größten Cluster mit einem einzigen großen und kompakten Cluster in jedem Brunnen der 3D-Agarose Petrischale (Abbildung 1C,F). Zusammenfassend zeigen diese Daten die Leichtigkeit, mit der hodenbiologische Konstrukte aus jugendlichen Mausprimärzellen in vier archetypischen Kulturumgebungen erzeugt werden können, und zeigen verschiedene zellgesteuerte Assembly-Phänotypen innerhalb dieser verschiedenen Kulturumgebungen hervor.
Ein Ziel aller Organoidmodelle ist es, eine innere Morphologie-Mimetik des nativen Gewebes zu rekapitulieren. Um dieses Ergebnis zu bewerten, wurden biologische Konstrukte, die innerhalb jeder Kulturbedingung zusammengebaut wurden, für 72 h kultiviert und dann auf zellspezifische Marker untersucht und mit Immunfluoreszenz visualisiert (Abbildung 2). Die Variabilität in der Gewebemorphologie wurde zwischen verschiedenen Kulturmethoden beobachtet. 2D ECM-freie Organoide, die als Cluster von Sertoli-Zellen (SOX9 und Catenin) mit einigen Keimzellen (DDX4, einem Pan-Keimzellmarker) präsentiert werden, die auf einer 2D-Basalkonfluentschicht mit vielen somatischen Zellen, einschließlich Sertoli, peritubular (SMA) und Leydig-Zellen (3-HSD) (Abbildung 2A-D) haften . Beachten Sie, dass Abbildung 2B-D epifluoreszierende Bilder der gesamten 2D-ECM-freien Probe sind und nicht ein Abschnitt von 5 m; Dies ermöglicht die Visualisierung sowohl der basalen somatischen Zellschicht als auch der überlegen orientierten Aggregate von Sertoli- und Keimzellen. Im Gegensatz dazu präsentierte sich die 2D-ECM-Kultur mit einem völlig anderen Phänotyp, da klare biologische Strukturen mit unterschiedlichen Grenzen leicht auf dem basalen ECM-Gel erkennbar waren (Abbildung 2E). Diese Strukturen besaßen eine komplexe innere Morphologie mit de novo-kompartalisierung von Tubule vs. interstitiellen Zelltypen der Hoden und wurden daher als erfolgreiche Organoide betrachtet. de novo Rohrregionen enthielten Sertoli-, Peritubular- und Keimzellen und interstitielle Regionen, die Leydig, peritubuläre Zellen und nicht-markierte Zellen enthielten (Abbildung 2F-H). In ähnlicher Weise besaßen 3D ECM-freie Organoide auch eine kompartalisierte innere Morphologie und wurden daher als erfolgreiche Organoide betrachtet. Insbesondere 3D ECM-freie Organoide wurden durch röhrenförmige Regionen unterschieden, die peritubuläre Zellen enthalten, die sich speziell um Gruppen von Sertoli und Keimzellen mit hoher Genauigkeit orientierten (Abbildung 2I-L). 3D ECM montierte Strukturen besaßen keine ausgeklügelte Morphologie, sondern wurden beobachtet, dass es sich um Cluster von Sertoli-Zellen mit gelegentlichen Keimen und Leydig-Zellen handelte. In diesen Proben blieben viele Sertoli- und nicht-beschriftete Zellen zwischen den Organoiden in einer "stromaartigen" Ausrichtung hängen (Abbildung 2M-P). Zusammen unterstreichen diese Daten die Variabilität morphologischer Phänotypen, die verschiedene Organoid-Generierungsmethoden erzeugen, und unterstützen die Verwendung von zwei spezifischen organoiden Baugruppenumgebungen, 2D ECM und 3D ECM-frei, für die Erzeugung von Hodenorganoiden mit einer inneren Morphologie, die hochmimetisch der Hodenkompartalisierung ist.
Zur weiteren Beurteilung der hodenförmigen Organoidfunktion wurden 3D ECM-freie zusammengesetzte Organoide für eine tiefere Langzeitanalyse ausgewählt. Für diese Studie wurden diese Organoide 14 Tage lang kultiviert und dann auf zell- und strukturspezifische Marker untersucht. Bei einer immunfluoreszenten Analyse nach 14 Tagen wurden 3D ECM-freie Organoide beobachtet, die Tubulen-ähnliche Strukturen (TLS) und eine Gewebearchitektur enthalten, die in vivo-Tests bemerkenswert ähnlich ist (Abbildung 3A-D). Interstitielle Zellen wurden angemessen in getrennten Regionen von TLS lokalisiert. Gewebeabschnitte wurden dann für den Pan-Keimzellmarker DDX4, den spermatogonialen Stammzellmarker SALL4 und den Meiose-Marker SCP3 (Abbildung 3E-G) untersucht. Seltene DDX4-positive und SALL4-positive Zellen wurden beobachtet, jedoch wurde kein SCP3-Signal identifiziert. Bei tieferer Charakterisierung von TLS wurden sie beobachtet, um einen lumen-erscheinenden Raum zu enthalten, der von polarisierten Sertoli-Zellen umgeben ist, und eine externe Monoschicht von peritubularen Zellen (Abbildung 3I-L). Sertoli-Zellen wiesen auch enge Verbindungen zwischeneinander auf, wie sie mit Transmissionselektronenmikroskopie und mit Kennzeichnung gegen ZO-1, ein Junctional-Protein und Bestandteil der Bluttestis-Barriere, visualisiert wurden (Abbildung 3H,L). Als nächstes wurden 3D ECM-freie Organoide für die endokrine Funktion in 12-wöchiger Langzeitkultur mit Gonadotropinstimulation untersucht (Abbildung 4). Testosteron und Inhibin B, Fortpflanzungshormone aus Leydig und Sertoli-Zellen, wurden sowohl identifiziert als auch quantifiziert von organoid konditionierten Medium (Abbildung 4A). Über 12-Wochen Kultur, beide Hormone wurden gemessen, um signifikant auf die Supplementierung der Gonadotropine FSH und hCG reagieren (roter Pfeil bezeichnet den Beginn der Supplementierung, in den Wochen 2 – 12). Nach Abschluss wurde ein Test durchgeführt, um festzustellen, ob die endokrine Reaktionsfähigkeit erhalten blieb. Gonadotropine wurden für 48 h entfernt, während der sowohl Testosteron und Inhibin B Konzentrationen deutlich in der Konzentration verringert. Nach 48 h wurden Gonadotropine in die Kultur zurückgeführt und beide Hormonkonzentrationen stiegen über die letzten 24 h signifikant an, was eine angemessene endokrine Reaktionsfähigkeit zeigte (Abbildung 4B). Zusammengenommen zeigen diese histologischen und endokrinen Assay-Ergebnisse, dass Hodenorganoide ein nützliches Modell für die Untersuchung der Hodenentwicklung (d. h. de novo-Kompartimentisierung und Tubulogenese) und der somatomatischen Zellhodenfunktion in vitro (z. B. enge Knotenbildung und endokrine Funktion) sind.
Abbildung 1: Organoide selbst montieren in 2D und 3D, ECM und ECM-freie Kultur Bedingungen.
5 dpp murine Hodenzellen wurden in vier verschiedenen Bedingungen kultiviert: 2D ECM-frei (Zeile A), 2D ECM (Zeile B), 3D ECM-frei (Zeile C) und 3D ECM (Zeile D). Grafiken, die die Kulturmethode darstellen, werden in der linken Spalte bereitgestellt. Repräsentative Bildmontagen wurden aus Zeitrafferbildern zusammengestellt, die während der Live-Kultur aufgenommen wurden. Zeitpunkte für jedes Bild werden am oberen Rand beschriftet. Zeit 0 h ist, bevor eine organoide Montage stattgefunden hat, Zeit 3 h ist während der laufenden zellgesteuerten Organoid-Montage, und mal 6 h und 9 h zeigen repräsentative, erfolgreich gebildete Organoide. Gelbe Pfeile markieren Zellcluster und rote Pfeile markieren Positionen, an denen separate Zellcluster migriert und zusammengeführt wurden. Alle Skalenstäbe = 1 mm. (E) Die Zeit, die benötigt wird, bevor separate Zellcluster sichtbar geschätzt werden konnten, wurde für jede Bedingung aufgezeichnet. 2DF = 2D ECM-frei; 2DE = 2D ECM; 3DF = 3D ECM-frei; 3DE = 3D ECM. (F) Die Fläche pro Cluster wurde für jede Kulturbedingung gemessen. Die Bilder wurden aus n= 3 – 5 separaten Experimenten ausgewählt. Einweg-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest wurde verwendet, um die Signifikanz in 1E und 1F zu bestimmen; Diagramme wurden mit Hilfe von n=4 separaten Experimenten zusammengesetzt. Diese Figur wurde von Edmonds und Woodruff37geändert. © IOP Publishing. Reproduziert mit Genehmigung. Alle Rechte vorbehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: 2D ECM und 3D ECM-freie kulturfreie Organoide weisen eine Abschottung von röhrenförmigen und interstitiellen Zelltypen auf.
Repräsentative Hellfeld- und Immunfluoreszenzbilder von selbst zusammengesetzten Organoiden nach 72 h Kultur. 2D ECM-freie Proben wurden ganze Halterung abgebildet, alle anderen Proben wurden in 5 m Gewebeabschnitten abgebildet. (A – D) 2D ECM-freie Kultur. (E – H) 2D ECM-Kultur. (I – L) 3D ECM-freie Kultur. (M – P) 3D ECM Kultur. Zellspezifische Marker, die für die Analyse verwendet werden, sind am oberen Rand beschriftet: Sertoli-Zellkerne (SOX9) und Zellkörper (Catenin), Keimzellen (DDX4, ein Pan-Keimzell-Marker), Leydig-Zellen (3-HSD) und peritubuläre Zellen (SMA). Alle fluoreszierenden Proben wurden für DNA mit DAPI mitgefärbt. Gelbe Pfeile zeigen auf DDX4-markierte Keimzellen in der zweiten Spalte von links, rote Pfeile auf Sertoli-Zellcluster in den rechten beiden Spalten. Helle Feldskalenstäbe = 400 m, fluoreszierende Skalenstäbe = 100 m. Diese Figur wurde von Edmonds und Woodruff37geändert. © IOP Publishing. Reproduziert mit Genehmigung. Alle Rechte vorbehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Organoide entwickeln tubuleähnliche Strukturen, die von seltenen Keimzellen bevölkert werden.
3D-ECM-freie zusammengesetzte Organoide wurden 14 Tage lang kultiviert. (A–D) Repräsentative H&E- und Immunfluoreszenzbilder, die Zelltypen und Gewebemerkmale um tubuleähnliche Strukturen (TLS) beschreiben; das gleiche Organoid ist in benachbarten Gewebeabschnitten dargestellt, die einen seite-an-Seite-Vergleich morphologischer Merkmale ermöglichen: Leydig-Zellen (3-HSD), peritubuläre Zellen (SMA), Sertoli-Zellkörper (Catenin), Kollagenmembran (COL IV) und Sertoli-Zellkerne (SOX9); Skalenstäbe = 100 m. (E – G) Immunfluoreszenz-Etikettierung wurde gegen Keimzellen durchgeführt, einschließlich eines Pankeimzellmarkers (DDX4), spermatogonialer Stammzellmarker (SALL4) und meiotisch aktiver Spermatozyten (SCP3). Stark vergrößerte Einschnitte werden durch gelbe Paneele in 3E und 3F umrissen. Grüne Dreiecke weisen auf DDX4-markierte Zellen hin; Rote Pfeile zeigen auf SALL4-markierte Zellen. (H) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) einer engen Verbindung zwischen Sertoli-Zellen innerhalb eines Organoids; TEM-Skala bar = 100 nm. (I – L) Repräsentative Bilder einer TLS mit hoher Vergrößerung, die für die wichtigsten Merkmale des Seminiferepithels einschließlich enger Verbindungen (ZO1) und Laminin gekennzeichnet sind. Die gleiche TLS ist in benachbarten Gewebeabschnitten in den Panels I – L dargestellt. Alle fluoreszierenden Proben wurden für DNA mit DAPI mitgefärbt. Die Bilder wurden aus n=7 separaten biologischen Experimenten ausgewählt. Diese Figur wurde von Edmonds und Woodruff37geändert. © IOP Publishing. Reproduziert mit Genehmigung. Alle Rechte vorbehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Organoide sezernieren Testosteron und Inhibin B über 12 Wochen Kultur als Reaktion auf Gonadotropine FSH und hCG.
Konditionierte Medien, die aus 3D-ECM-freien Organoiden gesammelt wurden, wurden über enzymgebundene Immunsorbent-Assay (ELISA) auf Testosteron und Inhibin B gemessen. (A) Organoide wurden zwölf Wochen lang kultiviert, mit FSH- und hCG-Supplementierung in den Wochen 2 – 12 (Beginn der Supplementierung ist mit einem roten Pfeil auf der x-Achse markiert); alle Werte wurden mit Tag 7 der Kultur für statistische Tests verglichen. (B) Vergrößerte Graphik eines "Restimulationstests", um festzustellen, ob die endokrine Reaktionsfähigkeit nach 12 Wochen erhalten blieb. Der Testzeitraum wird durch das graue Kästchen in 4A umrissen. Nach Abschluss der 12-Wochen in der Kultur, Gonadotropine wurden für 48 h entfernt und dann für eine letzte 24 h Kultur wieder ergänzt. Hormone wurden bei 0, 2, 6, 12 und 24 h nach Gonadotropin Restimulation gemessen; rotschattige Bereiche bezeichnen Zeiträume während der Kultur mit FSH und hCG, nicht schattierte Bereiche bezeichnen Zeiträume ohne FSH und hCG; die festgestellten p-Werte sind nach restimulation relativ zu 2 h. Zweiweg-ANOVA mit Tukeys Multiple-Vergleichstest wurde verwendet, um die Signifikanz für alle endokrinen Daten zu bestimmen, n=5 separate biologische Experimente. Diese Figur wurde von Edmonds und Woodruff37geändert. © IOP Publishing. Reproduziert mit Genehmigung. Alle Rechte vorbehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mit der Fertigstellung dieses Organoid-Generierungsprotokolls stehen dem Benutzer vier verschiedene Kulturtechniken für die Montage von Hodenkonstrukten und Organoiden in ECM- oder ECM-freien Umgebungen zur Verfügung. Wichtig ist, dass alle vier Methoden es dem Forscher ermöglichen, die organoide Selbstmontage im Laufe der Zeit durch Zeitraffer-Bildgebung oder Videoaufzeichnung nicht-invasiv zu beobachten und konditionierte Medien für die Analyse von abgesonderten Hormonen und Zytokinen zu sammeln, ohne das Gewebe während der Kultur zu stören. Bei allen Methoden kann ein Experimentator im Laufe von 24 h bis zu mehreren hundert Organoide/Hodenkonstrukte erzeugen, wie es die Zellzahlen erlauben. Diese Methoden fördern die Selbstmontage des Gewebes in Konstrukte mit unterschiedlichen Größen und Morphologien; Organoidgröße hängt von der Zellzahl und Konzentration in kultur verwendet, wie in anderen Organoid-Berichtegesehen 34. Die Verringerung der Organoidgröße oder des Durchmessers könnte dazu beitragen, die Entwicklung von inneren Regionen der Nekrose zu reduzieren, die manchmal in größeren Organoiden vorkommen. Eine besondere Stärke von 2D ECM und 3D ECM-freien Protokollmethoden sind ihre Fähigkeit, morphologisch mimetische Hodenorganoide zu erzeugen, die eine De-Novo-Kompartimalisation von röhrenförmigen versus interstitiellen Zelltypen enthalten. Darüber hinaus bieten 3D ECM-freie zusammengesetzte Organoide ein Modell für die de novo Tubulogenese von seminiferous TLS, mit entsprechend abgeteilten und orientierten Sertoli- und Peritubularzellen. Dies ist ein wichtiger Phänotyp für die Untersuchung von Hodenorganoiden, und ist immer noch ein variables Ergebnis unter verschiedenen Hodenorganoid-Berichte; mehrere andere Berichte fehlen Tubule versus Interstitium-Abschottung und einige entwickeln sogar einen "Inside-Out-Tubule"-Phänotyp32,33,34,38. Während keine der in der vorliegenden Handschrift vorgestellten Organoid-Generierungsmethoden charakterisiert wurden, um große Keimzellpopulationen über längere Kulturtage zu erhalten, da Keimzellen selten bereits 72 h beobachtet wurden, könnten sowohl 2D ECM- als auch 3D-ECM-freie Methoden ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der In-vitro-Tubulogenese und der somatischen Zellkomponente einer spermatogonialen Nischenumgebung darstellen. Mit diesem Ziel im Hinterkopf bieten Hodenorganoide eine potenzielle Plattform zur Optimierung zukünftiger Protokolle zur Verbesserung der Erhaltung von In-vitro-Keimbahnstammzellen, der meiotischen Progression und differenzierung.
Ein weiterer Vorteil dieser Protokolle ist die Fähigkeit, die Organoiderzeugung anzupassen und zu skalieren. Maßgeschneiderte, medikamentöse oder technisch hergestellte Zellpopulationen können primäre Maushodenzellen ersetzen oder zusätzlich verwendet werden37. Wenn Zellsuspensionen eine geringe Lebensfähigkeit haben (<80 %), sollten Methoden zur Verbesserung der Zelllebensfähigkeit der zellulären Suspension verwendet werden. Dazu gehören die Verkürzung der Zeit für Dissoziationsmedien und die Minimierung der Trituration während der Gewebeverdauung (Schritte 2.4.1 – 2.5.2), die Erhöhung der Anzahl von Wässen nach der Dissoziation oder das Entfernen abgestorbener Zellen nach der Dissoziation mit Zellsortierungs- oder Totzellen-Etikettierungskits. Keiner dieser Schritte war jedoch erforderlich, um die in diesem Bericht gemeinsam genutzten repräsentativen Daten zu erstellen. Für 2D- und 3D-ECM-Kulturmethoden können diese Protokolle zusätzlich zu den hier vorgestellten Studien mit anderen strukturellen proteinbasierten Biomaterialmatrizen verwendet werden. Diese anderen Biomaterialien umfassen Kollagen, Gelatine, handelsübliche ECM-Extrakte und maßgeschneiderte dezellularisierte ECM-abgeleitete Hydrogele25,26,28. Es gibt ein paar Hinweise für Fehler-Shooting ECM Gel Dosierung und die Schaffung von hochwertigen Agarose 3D Petri Teller Einsätze. Beim Gießen von ECM-Gelen auf Kammerplatten sollten Sie schnell arbeiten und kalte Pipettenspitzen verwenden, um eine vorzeitige Polymerisation des ECM innerhalb einer Rohr- oder Pipettenspitze vor dem Dosieren in der Kulturschale zu verhindern. Beim Gießen von geschmolzener Agarose in die 3D Petrischalenformen (für 3D ECM-freie Kultur), verwenden Sie nur heiße und nicht warme Agarose, um eine qualitativ hochwertige Gussleistung der Einsätze mit minimaler Variation zu gewährleisten, und überprüfen Sie, ob die Agarose vollständig auf Raumtemperatur abgekühlt und verfestigt ist, bevor Sie versuchen, aus der Form zu entfernen. Agarose 3D Petri-Gerichte lassen sich am besten schonend mit feinen Zangen behandeln. Achten Sie beim Sammeln von Organoiden zur Fixierung darauf, unter einem Seziermikroskop zu arbeiten, um die Sammlung aller Organoide zu visualisieren. Organoide können auf der Kunststoffseite von Kulturgerichten und dem Inneren von Pipettenspitzen kleben; Glaspipetten weisen weniger organoide Haftung auf als Kunststoff. Die Fixierung von Organoiden, während sie noch innerhalb oder auf dem ECM gekapselt sind, ist ein schwierigerer und empfindlicherer Prozess als das Entfernen von Organoiden aus dem ECM vor der Fixierung. Gewebeverarbeitungsgel kann vor der Entfernung aus der Kulturkammer über das ECM-Organoidkonstrukt gegossen werden, um das Gel vor der Fixierung zu verstärken39. Die Fixierung sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um ECM-Hydrogele abzurufen, da sie wahrscheinlich depolymerisieren, wenn sie auf 4 °C gesenkt werden. Zusätzlich können der 4 %igen PFA-Lösung 0,1 % - 1,0 % Glutaraldehyd zugesetzt werden, um die Verknüpfung des ECM weiter zu vernetzen; Diese Methode erhöht jedoch die Hintergrundautofluoreszenz der Probe.
Die oben vorgestellten Organoid-Erzeugungsmethoden, die vorrangige Bereiche für zukünftige Innovationen darstellen, sind hinsichtlich der ergebnisseweise erheblich eingeschränkt. Keimzellen werden über eine erweiterte Kultur schlecht unterstützt, sind nur in den ersten Tagen der Kultur leicht zu beobachten und werden selten am Ende der ersten Kulturwoche und später beobachtet. Während undifferenzierte Spermatogonie innerhalb der In-vitro-Zellkultur aufrechterhalten werden kann, während ihre Fähigkeit zur Wiederherstellung der Spermatogenese bei der Transplantation in in vivo tubules40erhalten bleibt, wird die tubule somatische Mikroumgebung (d.h. direkte Sertoli-Zell-Wechselwirkungen) als Voraussetzung für die Differenzierung prämetikulischer Keimzellen in und durch Meiose und Spermiogenese in vitro1,,5,, 41 ,,41, vermutet.40 Hodenorganoide, die Spermatogonie zu frühen Zeitpunkten innerhalb einer strukturell mimetischen TLS enthalten, könnten es dem Feld ermöglichen, somatisch-somatische und somatische Zell-Wechselwirkungen vollständig in vitro zu untersuchen. Optimierung von Medienadditiven und Zellpräparation vor der Kultur (z.B. Einbindung von Wirkstoffen, die für die in vitro spermatogonale Stammzellkultur verwendet werden)42,43 könnte die Ausbeute von Keimzellen in zukünftigen Studien erhöhen, insbesondere über Kulturperioden von mehr als mehreren Tagen. Umgekehrt stellen Methoden zur Wiedereinführung von Spermatogonien nach DER Entstehung von TLS, wie z. B. durch Mikroinjektion, eine interessante Gelegenheit dar, Keimzellen innerhalb von Organoiden wiederherzustellen und die Fähigkeit in vitro organisierter somatischer Umgebungen zur Erhaltung von Keimzellen zu testen. Andere biologische Faktoren wurden beobachtet, um ex vivo Explant kultur zu beeinflussen, einschließlich Alter/Reife45 und genetische Hintergrundunterschiede17. Dieselben Variablen müssen noch direkt im Bereich der Hodenorganoidbiologie untersucht werden. Es ist jedoch plausibel, dass verschiedene Assembler-, Morphologie- und funktionelle Phänotypen entstehen können, wenn Organoide aus Zellen erzeugt werden, die von unterschiedlich gealterten Tieren (z. B. neonatalen, jung, ausgewachsenen) oder VonTieren unterschiedlichen genetischen Hintergrunds (z. B. verschiedenen Mausstämmen) isoliert wurden.
Zusammenfassend lassen sich sagen, dass die in diesem Manuskript geteilten Techniken vier nützliche Modelle für die Untersuchung der zellgesteuerten Hodenbau-Selbstmontage, die Erzeugung von zwei separaten strukturell mimetischen Hodenorganoidmodellen und die wichtige Errungenschaft der TLS-Entwicklung und der hormonresponsiven endokrinen Funktion in vitro liefern. Diese Modelle umfassen 2D- und 3D-Raumorientierungen in ECM- und ECM-Umgebungen mit minimal komplexen, vollständig definierten Kulturmedien. Jede Methode ist sehr reproduzierbar und verwendet nur allgemein verfügbare Kulturressourcen. Diese Methoden können sich als vorteilhaft für die Untersuchung der hodenartären Morphogenese in vitro und die Optimierung zukünftiger Kulturbedingungen für die In-vitro-Spermatogenese erweisen. Mehr noch, 2D ECM und 3D ECM-freie Methoden bieten ein neuartiges Werkzeug für die Untersuchung des Prozesses der de novo Gewebekompartimtalisation einzigartig für die Hoden, In-vitro-Tubulogenese, und somatic-somatic und somatic-germ-Zell-Wechselwirkungen. Hodenorganoide bieten eine flexible und skalierbare Möglichkeit, die Entwicklung und Regulierung somatischer hologischer Merkmale zu untersuchen; einschließlich der Bluttestis-Barriere und der endokkrinen Produktion und Reaktion; und auch ein nützliches Werkzeug für die Entwicklung von translationalen Forschungsgewebemodellen der nächsten Generation. Dazu gehören die Einbeziehung von Fortpflanzungshormonen in größere System-Level-Modelle, wie Tissue-on-a-CHIP und mikrophysiologische Plattformen45,46. Weitere translationale Ziele, auf die eines Tages Hodenorganoide angewendet werden könnten, sind Reproduktivtotologie und immunologische Barrieretests, die Entwicklung männlicher Verhütungsmittel und Innovationen in der Reproduktionstechnologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, dem National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, dem National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 und 4UH3ES029073-03 und der Thomas J. Watkin es Memorial Professorship finanziert.
Die Autoren danken Eric W. Roth für die Unterstützung bei der Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Arbeit wurde von der BioCryo-Anlage des NUANCE Center der Northwestern University genutzt, die von der Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205) unterstützt wurde. das MRSEC-Programm (NSF DMR-1720139) am Materials Research Center; das Internationale Institut für Nanotechnologie (IIN); und dem Staat Illinois durch die IIN. Es nutzt auch die CryoCluster-Ausrüstung, die vom MRT-Programm (NSF DMR-1229693) unterstützt wurde. Grafiken in Abbildung 1 wurden mit BioRender.com entworfen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
