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Developmental Biology

अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स आधारित और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स-मुरीन वृषण ऑर्गेनॉइड की मुक्त पीढ़ी

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/61403
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Summary

यहां, प्राथमिक नवजात मुरीन वृषण कोशिकाओं से वृषण ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए चार तरीकों का वर्णन किया गया है यानी, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) और ईसीएम-फ्री 2डी और 3डी कल्चर वातावरण । इन तकनीकों में कई शोध अनुप्रयोग हैं और विट्रो में वृषण विकास और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं।

Abstract

वृषण ऑर्गेनॉइड विट्रो में वृषण विकास, शुक्राणुओं की कैंसर और एंडोक्राइनोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करते हैं। वृषण ऑर्गेनॉइड बनाने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। इनमें से कई विधियां डी नोवो ऊतक असेंबली को बढ़ावा देने के लिए एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स (ईसीएम) पर भरोसा करती हैं, हालांकि, बायोमिमेटिक आकृति विज्ञान और ऊतकों के कार्य के संदर्भ में तरीकों के बीच अंतर हैं। इसके अलावा, प्रकाशित तरीकों की कुछ सीधी तुलनाएं हैं। यहां, ऑर्गेनॉइड जनरेशन प्रोटोकॉल में अंतर का अध्ययन करके एक सीधी तुलना की जाती है, जिसमें परिणाम दिए जाते हैं। चार ठेठ पीढ़ी के तरीके: (1) 2D ECM मुक्त, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM मुक्त, और (4) 3 डी ईसीएम संस्कृति का वर्णन किया गया है । वृषण ऑर्गेनॉइड उत्पादन का आकलन करने के लिए तीन प्राथमिक बेंचमार्क का उपयोग किया गया था। ये सेलुलर आत्म-असेंबली, प्रमुख सेल प्रकारों (सेर्टोली, लेडिग, रोगाणु और पेरिट्यूबुलर कोशिकाओं) को शामिल करना, और उचित रूप से विभाजित ऊतक वास्तुकला है। परीक्षण किए गए चार वातावरणों में से, 2D ईसीएम और 3 डी ईसीएम-मुक्त संस्कृतियों ने देशी टेस्ट के समान आंतरिक मॉर्फोलोजी के साथ ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किए, जिसमें ट्यूबलर बनाम इंटरस्टिशियल सेल प्रकारों का डी नोवो कंपार्टमेंटलाइजेशन, ट्यूबल जैसी संरचनाओं का विकास और एक स्थापित दीर्घकालिक अंतकालीन कार्य शामिल है। सभी तरीकों का अध्ययन किया unsorted, प्राथमिक murine वृषण सेल निलंबन और आमतौर पर सुलभ संस्कृति संसाधनों का इस्तेमाल किया । ये वृषण ऑर्गेनॉइड जनरेशन तकनीकें विट्रो में वृषण ऑर्गेनोजेनेसिस और फिजियोलॉजी में अनुसंधान पहलों के लिए एक अत्यधिक सुलभ और प्रजनन योग्य टूलकिट प्रदान करती हैं।

Introduction

वृषण ऑर्गेनॉइड विट्रो1,,2,,3,,4में वृषण विकास, शुक्राणुओं की कैंसर और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक अग्रणी तकनीक है। ऑर्गेनॉइड उत्पादन के लिए कई तरीकों का पता लगाया गया है; इनमें दो आयामी (2D) और त्रि-आयामी (3 डी) झुकाव दोनों में विभिन्न प्रकार के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) और ईसीएम-मुक्त संस्कृति प्रणालियां शामिल हैं। विभिन्न पीढ़ी के तरीके अलग सेलुलर असेंबली रणनीतियों को बढ़ावा दे सकते हैं; इसके परिणामस्वरूप प्रकाशित ऑर्गेनॉइड मॉडल के बीच उच्च स्तर का रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनशीलता होती है। इस लेख का उद्देश्य इन विट्रो वृषण मॉडल की वर्तमान स्थिति पर चर्चा करना है, और वृषण ऑर्गेनॉइड प्रयोगों को डिजाइन करते समय भविष्य के जांचकर्ताओं के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम करना है। वर्तमान अध्ययन के भीतर, चार अलग-अलग संस्कृति प्रणाली के आदर्शों को परिभाषित किया गया है और प्रायोगिक प्रक्रिया और जैविक परिणाम में विशेषता है। इनमें शामिल हैं: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, और 3D ECM संस्कृति विधियां। यहां प्रस्तुत रणनीतियों का उद्देश्य विभिन्न प्रयोगशालाओं और अनुसंधान समूहों के बीच सरल, सुलभ और अत्यधिक प्रजनन योग्य होना है।

ऐतिहासिक रूप से टेस्टिस के लिए, पदनाम "इन विट्रो", वृषण ऊतकों और कोशिकाओं के कई अलग-अलग संस्कृति विधियों के लिए उपयोग किया गया है। इनमें ऑर्गेनोटिपिक टिश्यू/ऑर्गन कल्चर मेथड्स(यानीएक्सप्लांट कल्चर) 5, अलग-अलग सेमिनिफेरस ट्यूबल कल्चर6,टेस्टिकुलर सेल कल्चर7और डी नोवो टिश्यू मॉर्फोजेनेसिस (यानी बायोलॉजिकल स्ट्रेंट्स एंड ऑर्गेनॉइड)केतरीके शामिल हैं । इन विट्रो स्पर्मेटोजेनेसिस की पहली जांच लगभग 100 साल पहले की गई थी, जिसमें खरगोश टेस्टिस एक्सप्लांट की संस्कृति 1 9 208में और बाद में 1 9 37 में माउस एक्सप्लांट9के साथ हुई थी। इन प्रारंभिक प्रयोगों के भीतर शुक्राणुओं को संस्कृति के पहले सप्ताह में काफी हद तक पतित करने के लिए मनाया गया था, हालांकि कुछ meiotically अंतर कोशिकाओं की पहचान की गई थी । इन ऐतिहासिक रिपोर्टों की याद ताजा करते हुए, टेस्टिस एक्सप्लांट संस्कृति को पुनर्जीवित किया गया और 2011 में अनुकूलित किया गया ताकि टेस्टिस10का अध्ययन करने के लिए एक व्यवहार्य तकनीक बन सके। वर्ष 2011 से, एक्सप्लांट संस्कृति ने कईरिपोर्टों 11 , 12,,1313में प्रजनन सक्षम शुक्राणु का उत्पादन किया है। फिर भी, पहले से मौजूद देशी टेस्टिस ट्यूबल पर एक्सप्लांट संस्कृति की निर्भरता के कारण, इन हालिया अग्रिमों को "पूर्व वीवो" वृषण समारोह और शुक्राणुओं के उदाहरणों के रूप में अधिक सटीक रूप से वर्णित किया गया है, ऊतक समारोह जिसे किसी जीव के शरीर से हटाने पर बनाए रखा गया था या फिर से शुरू किया गया था। साहित्य में इसकी व्यापकता के बावजूद, वृषण विस्तार के भीतर दीर्घकालिक रोगाणु कोशिका,रखरखाव और भेदभाव14, 15, 16,,1517,,18को दोहराने के लिए चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से समय सीमा के साथ पूरी तरह से विट्रो शुक्राणुओं में निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त (मनुष्यों में चूहों में ~ 35 दिन19 और 74 मनुष्यों में20)।,18 यह सराहना करते है कि एक ही चुनौतियों के कई १०० साल पहले अनुभवी पेचीदा है, आज भी पूर्व वीवो शुक्राणुओं के भीतर अनुभव कर रहे हैं ।

पूर्व वीवो दृष्टिकोणों से अलग, वृषण ऑर्गेनॉइड डी नोवो असेंबल माइक्रोटिस्यूस हैं जो पूरी तरह से सेलुलर स्रोतों (यानी प्राथमिक वृषण कोशिकाओं) से विट्रो में उत्पन्न होते हैं। वृषण ऑर्गेनॉइड पहले से मौजूद देशी ऊतक पर क्षेत्र की ऐतिहासिक निर्भरता को दरकिनार करने और विट्रो में पूरी तरह से वृषण जीव विज्ञान को फिर से काटना करने के लिए एक रचनात्मक रणनीति प्रदान करते हैं। अधिकांश ऑर्गेनॉइड ऊतक मॉडल द्वारा साझा की गई कई आवश्यकताएं हैं; इनमें (1) वीवो-मिमेटिक ऊतक आकृति विज्ञान या वास्तुकला में, (2) प्रतिनिधित्व ऊतक के कई प्रमुख सेल प्रकार, (3) स्व-असेंबली या स्व-संगठन अपनी पीढ़ी में, और (4) प्रतिनिधित्व ऊतक के कार्य और शरीर विज्ञान के,कुछ स्तर21,22, 23,,,24।23 टेस्टिस के लिए, इसे चार प्रमुख हॉलमार्क में कैप्चर किया जा सकता है: (1) प्रमुख वृषण कोशिका प्रकारों को शामिल करना, रोगाणु, सेर्टोली, लेडिग, पेरिटुब्यूबुलर, और अन्य इंटरस्टिशियल कोशिकाएं, (2) सेल-निर्देशित ऊतक असेंबली, (3) उचित रूप से विभाजित कोशिका प्रकारों को अलग ट्यूबलर डिब्बों (रोगाणु और सेर्टोली) और इंटरस्टिशियल क्षेत्रों (अन्य सभी सेल प्रकार) में, और (4) ऊतक समारोह की कुछ डिग्री (जैसे, प्रजनन हार्मोन गुप्त या ऊतक प्रतिक्रियाएं, और रोगाणु सेल और प्रजनन और प्रजनन रोगाणु कोशिका भेदभाव पूर्व वीवो और विट्रो में बनाए रखने में ऐतिहासिक चुनौतियों को ध्यान में रखते हुए, वीवो-मिमेटिक वृषण वास्तुकला (यानी, सेमिनिफेरस ट्यूबुल्स जैसी संरचनाएं) में अतिरिक्त मार्कर के साथ वृषण फिजियोलॉजी (जैसे, एंडोक्राइन फ़ंक्शन) के अनुकरण का सुझाव देने वाले लक्षणों को प्राथमिकता दी जाती है जो एक दिन विट्रो शुक्राणुओं में बनाए रख सकते हैं।

अधिकांश प्रकाशित वृषण ऑर्गेनॉइड विधियां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईसीएम (जैसे, कोलेजन या मालिकाना ईसीएम फॉर्मूलेशन)25,26, 27या कस्टम-सोर्स ईसीएम,(यानी, डिसेल्यूलराइज्ड टेस्टिस ईसीएम-व्युत्पन्न हाइड्रोगेल),28,29,,30का लाभ उठाते हैं।, एक्सोजेनस ईसीएम ऊतक पीढ़ी के लिए एक असेंबली-सहायक पाड़ प्रदान करने के माध्यम से डी नोवो ऊतक गठन को बढ़ावा देता है। ईसीएम विधियों ने ऊतक गठन का एक प्रभावशाली स्तर प्रदान किया है, जिसमें कुछ रोगाणु कोशिका उपस्थिति और ऊतक-मिमेटिक आकृति विज्ञान25,,28शामिल हैं। हालांकि, वे जिन ईसीएमएस का उपयोग करते हैं, वे हमेशा सार्वभौमिक रूप से उपलब्ध नहीं होते हैं (यानी, डीसेलुलराइज्ड ईसीएम-व्युत्पन्न हाइड्रोगेल), और कुछ तरीकों के लिए परिष्कृत जेल और सेल सीडिंग झुकाव (जैसे, ईसीएम और 3 डी प्रिंटिंग के 3-लेयर ग्रेडिएंट)25,31,,32की आवश्यकता होती है।, पाड़ मुक्त तरीकों (उदाहरण के लिए, हैंगिंग ड्रॉप और नॉनहेडेरेंट कल्चर प्लेट्स)33,,34,,35 ने ईसीएम जैल या मचान की आवश्यकता के बिना मजबूत और अत्यधिक प्रजनन योग्य ऑर्गेनॉइड भी उत्पन्न किए हैं। हालांकि, इन पाड़-मुक्त ऑर्गेनॉइड की ऊतक आकृति विज्ञान अक्सर वीवो टेस्ट में भिन्न होती है, और इनमें से अधिकांश रिपोर्टों में ऊतकगठन 33, 34, 36,,या वैकल्पिक रूप से, जबरन सेल एकत्रीकरण और कॉम्पिटिशन,34के लिए अपकेंद्रित्रण पर भरोसा करने के लिए एक जैव रासायनिक ईसीएम योजक शामिल होता है, जिससे उन्हें सेल निर्देशित माइग्रेशन और स्व-संगठन का अध्ययन करने के लिए कम आदर्श बना दिया जाता है।3436

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत चार ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के तरीकों में ईसीएम-निर्भर और स्वतंत्र रणनीतियां दोनों शामिल हैं, प्रत्येक सरल सेल सीडिंग का उपयोग करके जो सेल-चालित ऑर्गेनॉइड सेल्फ-असेंबली के अवलोकन को सक्षम बनाता है। सभी चार तकनीकों को एक ही सेल निलंबन से किया जा सकता है या कस्टम और सेल-प्रकार समृद्ध आबादी का उपयोग कर सकते हैं। इन तरीकों की एक ताकत वास्तविक समय में ऑर्गेनॉइड स्वयं को इकट्ठा करने की क्षमता है, और सीधे तुलना करने के लिए कि कैसे वृषण संरचनाएं विभिन्न संस्कृति माइक्रोएनवायरमेंट्स के बीच स्वयं को इकट्ठा करती हैं। इन चार संस्कृति विधियों के बीच फेनोटाइपिक मतभेदों को अनुसंधान प्रश्न या अन्वेषक के विषय पर उनके प्रभाव के लिए माना जाना चाहिए । प्रत्येक विधि 24 घंटे या उससे कम के भीतर जैविक निर्माण या ऑर्गेनॉइड का उत्पादन करती है। अंत में, यहां प्रस्तुत किए गए तरीके विट्रो में वृषण ऑर्गेनॉइड असेंबली, ऊतक विकास और वृषण शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए ऑर्गेनॉइड असेंबली तकनीकों का एक टूलकिट प्रदान करते हैं।

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों को नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सभी प्रक्रियाओं को IACUC-अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत किया गया था ।

1. एंजाइमेटिक ऊतक-वियोजन समाधान की तैयारी

  1. बेसल कल्चर मीडियम सॉल्यूशन (बीएम) का उपयोग करके दो अलग-अलग एंजाइमेटिक समाधान (समाधान 1 और समाधान 2) का उपयोग करें।
  2. बीएम तैयार करने के लिए, क्रमशः 10% और 1% की अंतिम सांद्रता के लिए न्यूनतम आवश्यक माध्यम में सीरम और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें (विशिष्ट अभिकर्मकों के लिए सामग्री की तालिका देखें)। फिर बाँझ एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बीएम फिल्टर। कोशिकाओं के साथ उपयोग करने से पहले, एक संस्कृति पकवान में वितरण और एक आर्द्रीकृत के भीतर रखने के द्वारा एक तटस्थ पीएच के लिए पूर्व संतुलन बाँझ बीएम, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 1 घंटे के लिए।
    नोट: बीएम को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, जिसके बाद ताजा बीएम बनाया जाना चाहिए।
  3. कोलेजनेस आई स्टॉक सॉल्यूशंस तैयार करने के लिए, सबसे पहले 100 मिलीग्राम कोलेजनेस I को बाँझ भ्रूण ग्रेड एच2ओ (अंतिम एकाग्रता 10% मीटर/v), उलटा या भंग करने के लिए भंवर के 1 मिलीएमएल में भंग करें, और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 माइक्रोल एलिकोट्स स्टोर करें। अलीकोट केवल एक बार गल जाना चाहिए।
  4. डिऑक्सीरिबोक्यूक्लीज I (DNase I) स्टॉक सॉल्यूशंस तैयार करने के लिए, बाँझ भ्रूण ग्रेड एच 2 ओ (अंतिम एकाग्रता 2% m/v), उलटा या भंवर भंग करने के लिए 20 μL aliquots के 1 mL में20मिलीग्राम जोड़ें (भंवर नहीं), और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 μL aliquots स्टोर । अलीकोट केवल एक बार गल जाना चाहिए।
  5. हायलुरोनिडेस स्टॉक समाधानों के लिए, बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस; अंतिम एकाग्रता 3% m/v हाइलुरोनिडेस सीए++/एमजी++),उलटा या भंवर वाले पीबीएस में 1 एमएल में 30 मिलीग्राम जोड़ें, और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोल एलिकोट्स स्टोर करें। अलीकोट को एंजाइमेटिक गतिविधि के नुकसान के बिना कई बार गल और फिर से जमे हुए किया जा सकता है।
  6. वियोजन समाधान 1तैयार करने के लिए, बाँझ, पूर्व समतुलित बीएम (अंतिम सांद्रता: 1 मिलीग्राम/ समाधान को मिलाने के लिए एक पिपेट के साथ धीरे-धीरे ट्रिट करें, और ऊतक के साथ उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें।
    नोट: समाधान 2 को समाधान 1 के प्रति 1 मिलीएल हाइलुरोनिडेस (37 डिग्री सेल्सियस से पूर्ववत) जोड़कर तैयार किया जाता है, (1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए)। यह नीचे चरण 2.5 पर टेस्टिस ऊतक के एंजाइमेटिक वियोजन के माध्यम से मध्य मार्ग होता है।

2. टेस्टिस ऊतक वियोजन

नोट: सभी चूहों पॉलीप्रोपाइलीन पिंजरों के भीतर रखे गए थे और भोजन और पानी विज्ञापन libitum के साथ प्रदान की गई । जानवरों को विकिरणित चाउ खिलाया गया जिसमें फाइटोएस्ट्रोजेन नहीं होते हैं। किशोर सीडी-1 चूहों, 5 दिनों के बाद पार्टम (डीपीपी), सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया और इच्छामृत्यु और ऊतक संग्रह से पहले एनेस्थेटाइज्ड, एक एनेस्थीसिया एक आइसोफ्लोरैन वाष्पीकरण (2.5 एल/O2में मिनट) से जुड़े कक्ष के भीतर । चूहों को अंगुली-चुभन के जवाब की अनुपस्थिति के माध्यम से पूर्ण संज्ञाहरण के लिए पुष्टि की गई थी, जिसके बाद चूहों को डेपुटेशन के माध्यम से इच्छामृत्यु दी गई थी।

  1. एक आइसोफ्लुने कक्ष में चूहों को एनेस्थेटाइज करें, एक टो-चुभन के माध्यम से संज्ञाहरण सुनिश्चित करें, और फिर एक तेज कैंची का उपयोग करके माउस को काटना। एक विच्छेदन चटाई पर इच्छामृत्यु माउस रीपाइन रखें और 70% इथेनॉल के साथ पेट को स्टरलाइज करें। पेट के निचले हिस्से की त्वचा को संदंश के साथ तम्बू करें और पेट को कैंची से खोलें।
  2. पेट के निचले बाएं और दाएं इंगिनल क्षेत्रों में टेस्ट का पता लगाएं। वेस डिफेरेंस और किसी भी एंकरिंग कनेक्टिव ऊतक के लिए उनके कनेक्शन काटें, फिर जानवर से पूरे टेस्टिस (एपीडिडिमिस के साथ अभी भी संलग्न) उठाएं। पूर्व समतुल्य बीएम के पेट्री डिश में टेस्ट रखें।
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत और एक बाँझ क्षेत्र के भीतर, प्रत्येक टेस्टिस के एक छोर पर ट्यूनिका एल्बुगिया में एक छोटा सा चीरा बनाएं या तो एक छोटे माइक्रोडिसेक्शन कैंची के साथ या धीरे-धीरे दो ठीक संदंश का उपयोग करके फाड़ कर।
    1. फिर, चीरा के विपरीत छोर से टेस्टिस को पकड़ते समय, धीरे-धीरे टेस्टिस को ठीक संदंश के साथ निचोड़ें और ट्यूनिका में छेद की ओर एक सौम्य व्यापक गति में धक्का दें; यह एक एकजुट टुकड़े के रूप में वृषण ऊतक जारी करेगा।
  4. टेस्ट को छोटे टुकड़ों (≤ 2मिमी 3)में काट लें और उन्हें प्री-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) वियोजन समाधान 1 के 1 मिलील में रखें।
    1. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    2. 10 से अधिक वृषणों के लिए, कुल वियोजन समाधान की मात्रा को 1 एमएल तक बढ़ाएं, प्रति 10 वृषणों में कम से कम 1 मिलियन का वियोजन समाधान सुनिश्चित करें (उदाहरण के लिए, 20 वृषणों के लिए 2 एमएल, 30 टेस्ट के लिए 3 एमएल आदि)।
    3. P1000 पिपेट का उपयोग करके समाधान 1 में टेस्टिस टुकड़ों को धीरे-धीरे ट्राय करें। सुनिश्चित करें कि ट्यूबल एक दूसरे से अलग और इस बिंदु पर मध्यवर्ती ऊतक से। यदि झुरमुट रहते हैं, तो अतिरिक्त 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और एक बार और (50x) ट्रिट करें।
  5. समाधान 1 वियोजन मिश्रण (आंशिक रूप से अलग वृषण ऊतक और ट्यूबल युक्त) के प्रति 1 एमएल से हाइलुरोनिडेस स्टॉक समाधान (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गरम) का 33 माइक्रोन जोड़ें। हाइलुरोनिडेस जोड़ने के बाद, इसे समाधान 2 कहा जाता है।
    1. एक P1000 का उपयोग करके ट्राइटुरेट (50x) और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. P200 पिपेट का उपयोग करके ट्राइटुरेट (50x)।
    3. सुनिश्चित करें कि इस बिंदु पर कोशिकाओं के कोई दृश्यमान ट्यूबल या झुरमुट मौजूद नहीं हैं। यदि झुरमुट बने रहते हैं, तो P200 पिपेट (50x) का उपयोग करके आगे की त्रिनाभ के साथ 5 और मिनट तक के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. समाधान 2 की कुल मात्रा का 10% करने के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) जोड़कर वियोजन एंजाइमों को बुझाएं। Triturate कई बार एक P200 पिपेट का उपयोग करने के लिए कोई झुरमुट रहने सुनिश्चित करने के लिए, और एक एकल सेल निलंबन का उत्पादन करने के लिए एक ४० μm सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर ।
  7. 7 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं, सुपरनैंट को त्यागें, और कोशिकाओं को ताजा बीएम में फिर से खर्च करें।
  8. हीमोसाइटोमीटर पर ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन का उपयोग करके कुल और व्यवहार्य कोशिका सांद्रता की गणना करें। 1:1 पतला, सेल निलंबन के 10 माइक्रोन जोड़ें: हीमोसाइटोमीटर सेल काउंटिंग चैंबर (सामग्री की तालिकादेखें) में ट्राइपैन ब्लू समाधान।
    1. 7 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर री-सेंट्रलाइज कोशिकाएं और ताजा बीएम में रीसस्पेंड।
      नोट: केवल कोशिका एकाग्रता और संख्या की गणना के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं का उपयोग करें। केवल ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए 80% व्यवहार्यता ≥ के सेल निलंबन का उपयोग करें।
    2. धारा 3 में नीचे दिए गए प्रोटोकॉल विशिष्ट चरणों में उपयोग की जाने वाली मात्रा को देखते हुए 280,000 कोशिकाओं को अलीकोट करने के लिए वर्णित कोशिका सांद्रता में एकल सेल निलंबन तैयार करें: 2D ईसीएम-मुक्त - 0.56 x10 6 कोशिकाएं/ 2D ईसीएम - 0.56 x10 6 कोशिकाएं/एमएल, 3D ईसीएम-फ्री - 4.66 x10 6 कोशिकाएं/एमएल, 3D ईसीएम - 2.8 x 106 कोशिकाएं/एमएल।
      नोट: सभी संस्कृति प्रयोगों यहां प्रस्तुत २८०,००० संस्कृति के प्रति अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के साथ शुरू करते हैं । इन नंबरों का मिलान चित्र 1 , चित्रा 2, चित्र 3और चित्र 4 में प्रतिनिधि आंकड़ों से किया जाता है।

3. ऑर्गेनॉइड संस्कृति व्यंजन तैयार करना और कोशिकाओं का सीडिंग करना

नोट: एक समरूप ईसीएम सुनिश्चित करने के लिए, प्रयोग से पहले रातोंरात ईसीएम के पूर्व-गल जमे हुए एलिकोट्स। ईसीएम एलिकोट को तापमान में धीमी, क्रमिक वृद्धि की गारंटी देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर या ठंडे कमरे के भीतर बर्फ की एक बाल्टी के भीतर जलमग्न किया जाना चाहिए। सभी ईसीएम संस्कृति के लिए बीएम में एक 1:1 अंतिम कमजोर पड़ने पर प्रयोग किया जाता है । उपयोग से तुरंत पहले तक बर्फ पर गल ईसीएम और 1:1 पतला ईसीएम रखें, अन्यथा ईसीएम समय से पहले बहुलक हो सकता है।

  1. 2D ECM मुक्त संस्कृति के लिए, कोई विशेष तैयारी आवश्यक है, प्लेट एकल सेल निलंबन (0.56 x 106 कोशिकाओं/बीएम में एमएल के 500 माइक्रोन) सीधे 4-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड पर, और संस्कृति के लिए एक 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह है।
    नोट: कोशिकाओं को संस्कृति के पहले 24 घंटे के भीतर संस्कृति पकवान के नीचे का पालन करना चाहिए और इस एक ही समय के भीतर कुछ छोटे 3 डी सेल समूहों का प्रदर्शन कर सकते हैं ।
  2. 2D ईसीएम संस्कृति के लिए, 100 माइक्रोन ठंड 1:1 पतला बाह्य तहखाने मैट्रिक्स माध्यम को 4 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में बांटें, यह सुनिश्चित करते हुए कि जेल डिश बॉटम की संपूर्णता को कवर करता है।
    1. ईसीएम को जेल में बहुलक बनाने की अनुमति देने के लिए न्यूनतम 30 मिनट के लिए 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में चैंबर स्लाइड रखें।
    2. सेल सस्पेंशन (बीएम में 0.56 x 106 कोशिकाओं/एमएल के 500 माइक्रोन) को सीधे 2D जेल के शीर्ष पर जोड़ें एक बार यह बहुलक हो जाता है।
      नोट: कोशिकाओं को संस्कृति के पहले 24 घंटे के भीतर छोटे 3 डी समूहों के रूप में एक साथ क्लस्टर चाहिए ।
  3. 3डी ईसीएम-फ्री कल्चर के लिए सेल कल्चर शुरू करने से पहले एगर उठे 3डी पेट्री डिश आवेषण तैयार करें।
    1. सबसे पहले, 100 एमएल बीकर में 1.5 g agarose पाउडर ऑटोक्लेव, फिर 3 डी पेट्री डिश कास्टिंग के लिए पिघला हुआ 2% agarose का उत्पादन करने के लिए 75 एमएल बाँझ, आसुत पानी और माइक्रोवेव जोड़ें।
    2. एक बाँझ कार्यक्षेत्र के भीतर, पिघला हुआ एग्राम को 3 डी पेट्री डिश मोल्ड में तब तक बांटें जब तक कि मेनिस्कस मोल्ड के किनारों के साथ स्तर न हो जाए।
    3. एगर उठे को ठंडा और जमना दें। ठोस होने पर, मोल्ड को उल्टा करें और धीरे-धीरे फ्लेक्स को बार-बार तब तक घुमाएं जब तक कि एगर उठे 3 डी पेट्री डिश मोल्ड से मुक्त न हो जाए।
      नोट: इस बिंदु पर, कोई भी कई एगरल्ड 3 डी पेट्री व्यंजन तैयार कर सकता है और उन्हें एक महीने के ऊपर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ एच2ओ या डीपीबीएस में स्टोर कर सकता है।
    4. खेती से पहले, 24 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान में 3 डी पेट्री व्यंजन रखें, और उन्हें बीएम के 1 एमएल के साथ कवर करें। 3डी पेट्री व्यंजन बीएम में 37 डिग्री सेल्सियस संस्कृति इनक्यूबेटर के भीतर कम से कम 30 मिनट के लिए समान रखें। बीएम को त्यागें, और 1 एमएल फ्रेश बीएम के साथ एक बार फिर संतुलन दोहराएं। बीएम में 3डी पेट्री डिश के संतुलन के बाद, वे बीएम (यानी, गुलाबी) के रूप में एक ही रंग दिखाई देगा।
    5. सेल सीडिंग के लिए तैयार करने के लिए, अच्छी तरह से सभी बीएम को हटा दें और चारों ओर ताजा बीएम के 200 माइक्रोन बांटें, लेकिन 3डी पेट्री डिश के केंद्र अवकाश के अंदर नहीं। इसके अलावा, माइक्रोवेल डालने के केंद्र सेल-सीडिंग अवकाश के अंदर से किसी भी शेष बीएम को इकट्ठा करें।
    6. एकल सेल निलंबन (बीएम के 60 माइक्रोन में 4.66 कोशिकाओं/एमएल) को एग्राज हुई 3 डी पेट्री डिश के केंद्र अवकाश में वितरित करें। धीरे-धीरे कोशिकाओं को मिलाने के लिए ऊपर और नीचे ट्रिटेट करें और संस्कृति की शुरुआत में एक एकल कोशिका निलंबन की गारंटी करें।
    7. संस्कृति के लिए एक आर्द्रीकृत 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। अगले दिन, माइक्रोवेल डालने के आसपास से बीएम के 200 माइक्रोल को हटा दें, और ताजा बीएम के 1 एमएल के साथ बदलें। इससे तरल स्तर को डालने के विमान से ऊपर लाया जा सकेगा, जिससे पूरी संस्कृति जलमग्न हो जाएगी।
    8. धीरे-धीरे और ध्यान से हटाओ/agarose 3 डी पेट्री डिश के बाहर से मीडिया जोड़ें । ऑर्गेनॉइड को रातोंरात संकुचित होना चाहिए था, जिससे उन्हें नीचे आराम करने और मीडिया परिवर्तनों को ऑर्गेनॉइड को अव्यवस्थित छोड़ने में सक्षम बनाने की अनुमति मिलती है।
  4. 3 डी ईसीएम संस्कृति के लिए, समान भागों में, ठंड के साथ बीएम में सेल निलंबन, पूर्व-गल ईसीएम (अंतिम एकाग्रता = 2.8 x 106 कोशिकाओं/एमएल) के संयोजन से एक एकल सेल निलंबन तैयार करें।
    1. तुरंत सेल-ईसीएम मिश्रण को 4 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में बांटें, यह सुनिश्चित करते हुए कि मिश्रण प्लेट के पूरे नीचे को कवर करता है।
    2. एक इनक्यूबेटर में 35 डिग्री सेल्सियस पर कक्ष स्लाइड रखें और इसकी सामग्री को बहुलक बनाने की अनुमति दें। इसमें कम से कम 30 मिनट का समय लगना चाहिए। बहुलीकरण के बाद, संस्कृति के शीर्ष पर बीएम के 500 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: कोशिकाओं को संस्कृति के पहले 24 घंटे के भीतर छोटे 3 डी समुच्चय बनाने के लिए एक साथ संकुल होना चाहिए ।

4. ऑर्गेनॉइड रखरखाव

  1. संस्कृति सभी ऑर्गेनॉइड मॉडल प्रकार 35 डिग्री सेल्सियस पर। सभी संस्कृति प्रकार के लिए हर 2 दिनों में ताजा बीएम के साथ अपने मीडिया का आधा आदान-प्रदान करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि मध्यम का आदान-प्रदान करते समय ऑर्गेनॉइड गलती से एकत्र नहीं होते हैं, हमेशा मीडिया को कक्ष स्लाइड डिश के एक कोने से धीरे-धीरे इकट्ठा करें, और एग्राजिंग 3 डी पेट्री व्यंजनों के बाहर एक बाहरी बिंदु से। सभी मीडिया को बाद में इम्यूनोसे या अन्य विश्लेषणों के साथ उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (यानी, स्रावित प्रजनन हार्मोन या साइटोकिन्स का मात्राकरण)।
  2. संस्कृति में 7 दिनों के बाद, कूप उत्तेजक हार्मोन (अंतिम एकाग्रता 20 mIU/mL) और मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन (अंतिम एकाग्रता ४.५ आईयू/एमएल) युक्त बीएम का उपयोग करें । यह सभी ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रकारों पर लागू होता है।
  3. नियमित रूप से ऑर्गेनॉइड गठन और समय के साथ आत्म-असेंबली, विकास और विकास के मैट्रिक्स की मात्रा की विशेषता के लिए सभी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों (यानी, समय-चूक इमेजिंग) की छवि।

5. ऑर्गेनॉइड कलेक्शन

नोट: सभी ऑर्गेनॉइड को डाउनस्ट्रीम इम्यूनोलाबेलिंग और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषणों के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया जा सकता है। रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ठीक करें, या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।

  1. 2D ECM मुक्त संस्कृतियों के लिए, पहले ताजा PBS के साथ नमूना कुल्ला, और फिर पालन निर्माण के शीर्ष पर सीधे फिक्सेटिव जोड़ें ।
  2. ईसीएम (2D और 3D) संस्कृति विधियों के लिए, पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला, और फिर या तो ईसीएम-ऑर्गेनॉइड नमूने (ईसीएम जेल और ऑर्गेनॉइड को एक साथ ठीक करने के लिए) के शीर्ष पर सीधे फिक्सेटिव जोड़ें, या वैकल्पिक रूप से, धीरे-धीरे ऑर्गेनॉइड को आसपास के ईसीएम से मुक्त करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें, और निर्धारण के लिए एक अलग ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 3 डी ईसीएम-मुक्त संस्कृति के लिए, धीरे-धीरे ऑर्गेनॉइड को 3 डी पेट्री डिश के केंद्र अवकाश के भीतर ऊपर और नीचे पिपेट करें; यह ऑर्गेनॉइड को एक पिपेट के साथ उनके आसान संग्रह को सुविधाजनक बनाने से बाहर निकाल देगा। फिर ऑर्गेनॉइड को फिक्सेशन के लिए एक अलग ट्यूब में ट्रांसफर करें।
  4. पैराफिन में प्रसंस्करण से पहले, ऊतक प्रसंस्करण जेल की एक छोटी मात्रा (~ 30 माइक्रोन) के भीतर कई ऑर्गेनॉइड (≥ 20) एम्बेड करें; यह पैराफिन ब्लॉक के भीतर एक छोटे से क्षेत्र में ऑर्गेनॉइड को उन्मुख और केंद्रित करने में मदद करता है, पैराफिन वर्गों के भीतर अनुभागिंग और आसान दृश्य पहचान को आसान अवलोकन की सुविधा देता है।
    नोट: ऑर्गेनॉइड पैराफिन एम्बेडिंग और माइक्रोटॉम पर सेक्शनिंग के बाद पहचानना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

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Representative Results

ऑर्गेनॉइड पीढ़ी को असफल माना जाता था यदि वृषण कोशिकाएं संस्कृति के 72 घंटे के भीतर स्वयं इकट्ठा नहीं होती हैं, हालांकि, किशोर (5 डीपीपी) मुरीन कोशिकाओं का उपयोग करते समय यहां प्रस्तुत सभी विधियां 24 घंटे के भीतर इकट्ठा होती हैं। जैविक निर्माण उत्पादन की विफलता स्वतंत्र रूप से निलंबित कोशिकाओं (चित्रा 1में 0 एच कॉलम) की निरंतरता के रूप में प्रस्तुत की गई, यहां तक कि विस्तारित संस्कृति (72 एच) के बाद भी। ऊतक स्वयं विधानसभा की अनुपस्थिति में, किसी भी स्पष्ट कोशिका समूहों को भी कोमल हेरफेर (यानी, pipetting) पर व्यक्तिगत कोशिकाओं में आसानी से फैलाया । सफलतापूर्वक उत्पन्न ऊतकों को शुरू में 3 डी सेल "क्लस्टर" (चित्र 1के 6 एच कॉलम में पीले तीर) के रूप में देखा गया था। ईसीएम-मुक्त वातावरण (2D और 3 डी) के भीतर, ये निर्माण संस्कृति के पहले 24 घंटे में "कॉम्पैक्ट" दिखाई दिए, खासकर जब 3 डी में पेट्री व्यंजन(चित्रा 1ए, सी)। ईसीएम वातावरण (2D और 3D) सेल क्लस्टर में क्लस्टर और उनके आसपास के वातावरण(चित्रा 1बी, डी)के बीच स्पष्ट मार्जिन था। सेल क्लस्टर भी ईसीएम भर में स्थानांतरित करने के लिए और बड़े समूहों (चित्रा 1Bमें लाल तीर) बनाने के साथ फ्यूज करने के लिए मनाया गया । अलग-अलग आत्म-इकट्ठे संरचनाओं की सराहना करने के लिए आवश्यक समय को मापा गया था, और 2D और 3D ईसीएम-मुक्त स्थितियों और 2D ईसीएम दोनों के बीच आवश्यक समय में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, हालांकि, 3 डी ईसीएम संस्कृति को अन्य सभी संस्कृति विधियों(चित्रा 1E)की तुलना में डी नोवो संरचनाओं को इकट्ठा करने के लिए काफी अधिक समय की आवश्यकता थी। 2D ईसीएम-फ्री और 3डी ईसीएम कल्चर जनित सेल क्लस्टर 2डी ईसीएम और 3डी ईसीएम-फ्री कल्चर विधियों की तुलना में काफी छोटे आकार के साथ; 3 डी ईसीएम-मुक्त संस्कृति ने 3 डी एगरैद पेट्री डिश(चित्रा 1सी, एफ)के प्रत्येक कुएं के भीतर एक बड़े और कॉम्पैक्ट क्लस्टर के साथ सबसे बड़े समूहों का उत्पादन किया। संक्षेप में, ये डेटा चार ठेठ संस्कृति वातावरण में किशोर माउस प्राथमिक कोशिकाओं से वृषण जैविक निर्माण का उत्पादन करने में आसानी प्रदर्शित करते हैं और इन विभिन्न संस्कृति वातावरण के भीतर विभिन्न सेल-निर्देशित असेंबली-फेनोटाइप को उजागर करते हैं।

सभी ऑर्गेनॉइड मॉडल का एक लक्ष्य देशी ऊतक के एक आंतरिक आकृतिविज्ञान मिमेटिक को फिर से काटना है। इस परिणाम के लिए आकलन करने के लिए, प्रत्येक संस्कृति की स्थिति के भीतर इकट्ठे जैविक निर्माण ों को 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर सेल-विशिष्ट मार्कर के लिए जांच की गई थी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस(चित्र 2)के साथ कल्पना की गई थी। ऊतक आकृति विज्ञान में परिवर्तनशीलता विभिन्न संस्कृति विधियों के बीच देखी गई थी। 2D ECM मुक्त ऑर्गेनॉइड कुछ रोगाणु कोशिकाओं (DDX4, एक पैन रोगाणु सेल मार्कर) के साथ Sertoli कोशिकाओं (SOX9 और catecatenin) के समूहों के रूप में प्रस्तुत एक 2D बेसल ढुलमुल परत के शीर्ष पर पालन किया, जिसमेंFigure 2A-Dसेर्टोली, पेरिटुबुलर (αSMA), और Leydig कोशिकाएं (3 ध्यान दें कि चित्रा 2बी-डी पूरे 2D ईसीएम-मुक्त नमूने की epifluorescent छवियां हैं, न कि 5 माइक्रोन अनुभाग; यह बेसल दैहिक कोशिका परत और सेर्टोली और रोगाणु कोशिकाओं के बेहतर उन्मुख समुच्चय दोनों के दृश्य को सक्षम बनाता है। इसके विपरीत, 2डी ईसीएम संस्कृति को काफी हद तक अलग फेनोटाइप के साथ प्रस्तुत किया गया, क्योंकि अलग-अलग सीमाओं के साथ स्पष्ट जैविक संरचनाओं को बेसल ईसीएम जेल(चित्रा 2E)के शीर्ष पर आसानी से समझा गया था। इन संरचनाओं में एक जटिल आंतरिक आकृति विज्ञान था जिसमें ट्यूबल बनाम इंटरस्टिशियल सेल प्रकार के टेनिस के डी नोवो कंपार्टमेंटलाइजेशन थे, और इसलिए सफल ऑर्गेनॉइड समझा गया। ट्यूबलर क्षेत्रों में सेर्टोली, पेरिटुबुलर और रोगाणु कोशिकाएं शामिल थीं, और मध्यवर्ती क्षेत्रों में लेडिग, पेरिटुब्युबुलर कोशिकाएं और गैर-लेबल कोशिकाएं(चित्रा 2एफ-एच)शामिल थीं। इसी तरह, 3 डी ईसीएम-मुक्त ऑर्गेनॉइड में भी एक कंपार्टमेंटेड आंतरिक आकृति विज्ञान था और इसलिए सफल ऑर्गेनॉइड समझा गया। विशेष रूप से, 3 डी ईसीएम-मुक्त ऑर्गेनॉइड को ट्यूबलर क्षेत्रों द्वारा प्रतिष्ठित किया गया था जिसमें पेरिट्युबुलर कोशिकाएं शामिल थीं जो विशेष रूप से उच्च निष्ठा(चित्रा 2I-L)के साथ सेर्टोली और रोगाणु कोशिकाओं के समूहों के आसपास उन्मुख होती हैं। 3 डी ईसीएम असेंबल संरचनाओं में एक परिष्कृत आकृति विज्ञान नहीं था, लेकिन इसके बजाय कभी-कभी रोगाणु और लेडिग कोशिकाओं के साथ सेर्टोली कोशिकाओं के समूह ों को देखा गया। इन नमूनों में, कई सेर्टोली और गैर-लेबल कोशिकाएं ऑर्गेनॉइड के बीच में "स्ट्रोमा-जैसे" अभिविन्यास(चित्रा 2एम-पी)में निलंबित रहीं। साथ में, ये डेटा रूपात्मक फेनोटाइप में परिवर्तनशीलता को उजागर करते हैं जो विभिन्न ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के तरीकों का उत्पादन करते हैं और दो विशिष्ट ऑर्गेनॉइड असेंबली वातावरण, 2D ईसीएम और 3 डी ईसीएम-मुक्त के उपयोग का समर्थन करते हैं, एक आंतरिक आकृति विज्ञान के साथ वृषण कंपार्टमेंटलाइजेशन के अत्यधिक मिमेटिक के साथ वृषण ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी के लिए।

वृषण ऑर्गेनॉइड फ़ंक्शन का और आकलन करने के लिए, 3 डी ईसीएम-फ्री असेंबल ऑर्गेनॉइड को गहरे दीर्घकालिक विश्लेषण के लिए चुना गया था। इस अध्ययन के लिए, इन ऑर्गेनॉइड को 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर सेल और संरचना विशिष्ट मार्कर के लिए जांच की गई थी। 14 दिनों में इम्यूनोफ्लोरोसेंट विश्लेषण पर, ट्यूबल-जैसी संरचनाओं (टीएलएस) और एक ऊतक वास्तुकला को शामिल करने के लिए 3 डी ईसीएम-मुक्त ऑर्गेनॉइड देखे गए थे, जो वीवो टेस्ट(चित्रा 3ए-डी)के समान उल्लेखनीय रूप से होते हैं। इंटरस्टिशियल सेल टीएलएस से अलग-अलग क्षेत्रों में उचित रूप से स्थित थे। इसके बाद टिश्यू सेक्शन की जांच पैन जर्म सेल मार्कर, DDX4, स्पर्मटोगोनियल स्टेम सेल मार्कर, SALL4 और मेयोसिस मार्कर, SCP3(चित्रा 3ई-जी)के लिए की गई । दुर्लभ DDX4-सकारात्मक और SALL4-सकारात्मक कोशिकाओं को देखा गया, हालांकि, कोई SCP3 संकेत की पहचान की गई थी । टीएलएस के गहरे लक्षण वर्णन पर, उन्हें ध्रुवीकृत सेर्टोली कोशिकाओं से घिरे एक ल्यूमेन-प्रदर्शित होने वाली जगह और पेरिटुबुलर कोशिकाओं(चित्र 3आई-एल)के बाहरी मोनोलेयर को शामिल करने के लिए देखा गया था। सेर्टोली कोशिकाओं ने एक-दूसरे के बीच तंग जंक्शनों का भी प्रदर्शन किया, जैसा कि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना की गई थी और जेडओ-1 के खिलाफ लेबलिंग के साथ, एक जंक्शनल प्रोटीन और रक्त-टेस्टिस बैरियर(चित्रा 3एच, एल)का घटक है। इसके बाद, 12 सप्ताह में एंडोक्राइन फंक्शन के लिए 3डी ईसीएम-फ्री ऑर्गेनॉइड का अध्ययन किया गया, गोनाडोट्रोपिन उत्तेजना(चित्रा 4)के साथ दीर्घकालिक संस्कृति। टेस्टोस्टेरोन और इनहिबिन बी, क्रमशः लेडिग और सेर्टोली कोशिकाओं से प्रजनन हार्मोन, ऑर्गेनॉइड वातानुकूलित माध्यम(चित्रा 4A)से पहचाने गए और मात्रा निर्धारित की गई। संस्कृति के 12 सप्ताह से अधिक, दोनों हार्मोन को गोनाडोट्रोपिन एफएसएच और एचसीजी के पूरकता का काफी जवाब देने के लिए मापा गया था (लाल तीर पूरकता की शुरुआत को दर्शाता है, सप्ताह 2 - 12 के दौरान)। पूरा होने पर, यह निर्धारित करने के लिए एक परीक्षण किया गया था कि क्या एंडोक्राइन जवाबदेही को संरक्षित किया गया था। गोनाडोट्रोपिन को 48 एच के लिए हटा दिया गया था, जिसके दौरान टेस्टोस्टेरोन और इनहिबिन बी सांद्रता दोनों एकाग्रता में काफी कमी आई। 48 घंटे के बाद, गोंडोट्रोपिन संस्कृति में लौट आए और दोनों हार्मोन सांद्रता में अंतिम 24 घंटे में फिर से वृद्धि हुई, उचित एंडोक्राइन-जवाबदेही(चित्रा 4B) काप्रदर्शन किया गया। सामूहिक रूप से, ये हिस्टोलॉजिकल और एंडोक्राइन परख परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि वृषण ऑर्गेनॉइड वृषण विकास (यानी, डी नोवो कंपार्टमेंटलाइजेशन और ट्यूबुलोजेनेसिस) और दैहिक सेल वृषण समारोह इन विट्रो (जैसे, तंग जंक्शन गठन और एंडोक्राइन फ़ंक्शन) का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ऑर्गेनॉइड 2डी और 3डी, ईसीएम और ईसीएम-मुक्त संस्कृति स्थितियों में स्वयं इकट्ठा होते हैं।
5 डीपीपी मुरीन वृषण कोशिकाओं को चार अलग-अलग स्थितियों में सुसंस्कृत किया गया था: 2D ईसीएम-फ्री (पंक्ति ए),2D ईसीएम (पंक्ति बी),3D ईसीएम-मुक्त (पंक्ति सी),और 3 डी ईसीएम (पंक्ति डी)। संस्कृति विधि को चित्रित करने वाले ग्राफिक्स बाएं हाथ के कॉलम में प्रदान किए जाते हैं। प्रतिनिधि छवि असेंबल लाइव संस्कृति के दौरान कब्जा कर लिया समय चूक छवियों से इकट्ठे हुए थे । प्रत्येक छवि के लिए समय अंक शीर्ष मार्जिन पर लेबल कर रहे हैं । समय 0 एच किसी भी ऑर्गेनॉइड असेंबली के घटित होने से पहले है, समय 3 एच चल रहे सेल-संचालित ऑर्गेनॉइड असेंबली के दौरान है, और 6 घंटे और 9 घंटे का प्रदर्शन प्रतिनिधि, सफलतापूर्वक ऑर्गेनॉइड का गठन किया जाता है। पीले तीर सेल क्लस्टर और लाल तीर उन स्थानों को चिह्नित करते हैं जहां अलग-अलग सेल क्लस्टर चले गए और एक साथ विलय हो जाते हैं। सभी पैमाने पर सलाखों = 1 मिमी .(ई)समय अलग सेल समूहों से पहले आवश्यक दिख सकता है की सराहना की प्रत्येक हालत के लिए दर्ज की गई थी । 2DF = 2D ईसीएम-मुक्त; 2DE = 2D ईसीएम; 3DF = 3 डी ईसीएम-मुक्त; 3DE = 3डी ईसीएम। (एफ)प्रत्येक संस्कृति की स्थिति के लिए प्रति क्लस्टर क्षेत्र मापा गया था । छवियों को एन = 3 - 5 अलग-अलग प्रयोगों से चुना गया था। टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ वन-वे एवरोवा का उपयोग 1E और 1F में महत्व निर्धारित करने के लिए किया गया था; रेखांकन एन = 4 अलग-अलग प्रयोगों के साधनों से इकट्ठे किए गए थे। इस आंकड़े को एडमंड्स और वुड्रफ37से संशोधित किया गया है। आईओपी प्रकाशन ©। अनुमति के साथ पुन: पेश किया गया। सभी अधिकार सुरक्षित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 2डी ईसीएम और 3 डी ईसीएम-मुक्त सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड ट्यूबलर और इंटरस्टिशियल सेल प्रकारों के विभाजन का प्रदर्शन करते हैं।
संस्कृति के 72 घंटे के बाद स्वयं-इकट्ठे ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड और इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां। 2D ECM मुक्त नमूनों पूरे माउंट छवि थे, अन्य सभी नमूनों 5 माइक्रोन ऊतक वर्गों में छवि थे। (A- D)2D ECM मुक्त संस्कृति। (ई - एच)2डी ईसीएम संस्कृति। (I- L)3D ECM मुक्त संस्कृति। (एम - पी)3डी ईसीएम संस्कृति। विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल-विशिष्ट मार्कर शीर्ष मार्जिन पर लेबल किए जाते हैं: सेर्टोली सेल न्यूक्लियी (SOX9) और सेल निकाय (οCatenin), रोगाणु कोशिकाएं (DDX4, एक पैन रोगाणु सेल मार्कर), लेडिग कोशिकाएं (3, 30HSD), और पेरिटुब्युबुलर कोशिकाएं (αSMA)। सभी फ्लोरोसेंट नमूनों को DAPI के साथ डीएनए के लिए सह दाग थे । पीले तीर बाएं से दूसरे कॉलम में DDX4-चिह्नित रोगाणु कोशिकाओं को इंगित करते हैं, लाल तीर सही दो स्तंभों में सेर्टोली सेल क्लस्टर को इंगित करते हैं। उज्ज्वल क्षेत्र पैमाने सलाखों = 400 माइक्रोन, फ्लोरोसेंट स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े को एडमंड्स और वुड्रफ37से संशोधित किया गया है। आईओपी प्रकाशन ©। अनुमति के साथ पुन: पेश किया गया। सभी अधिकार सुरक्षित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ऑर्गेनॉइड दुर्लभ रोगाणु कोशिकाओं द्वारा आबादी वाली ट्यूबल जैसी संरचनाएं विकसित करते हैं।
3डी-ईसीएम-फ्री असेंबल ऑर्गेनॉइड को 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। (ए-डी) प्रतिनिधि एच एंड ई और इम्यूनोफ्लोर्सेंट छवियां ट्यूबल जैसी संरचनाओं (टीएलएस) के आसपास सेल प्रकार और ऊतक सुविधाओं का ब्यौरा देती हैं; एक ही ऑर्गेनॉइड को आसन्न ऊतक खंडों में चित्रित किया गया है जो रूपात्मक विशेषताओं की साथ-साथ तुलना को सक्षम करते हैं: लेडिग कोशिकाएं (3 एएचएसडी), पेरिटुब्युबुलर कोशिकाएं (αSMA), सेर्टोली सेल निकाय (αCatenin), कोलेजन झिल्ली (कर्नल IV), और सेर्टोली सेल न्यूक्लिई (SOX9); स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ई - जी) इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग रोगाणु कोशिकाओं के खिलाफ किया गया था, जिसमें एक पैन रोगाणु सेल मार्कर (DDX4), शुक्राणुतोगोनियल स्टेम सेल मार्कर (SALL4) और meiotically सक्रिय शुक्राणुओं (SCP3) शामिल हैं । अत्यधिक बढ़ाया इंसेट 3E और 3F में पीले पैनलों द्वारा उल्लिखित हैं। हरे त्रिकोण DDX4-लेबल कोशिकाओं को इंगित करते हैं; लाल तीर SALL4-लेबल कोशिकाओं को इंगित करते हैं। (ज)एक ऑर्गेनॉइड के भीतर सेर्टोली कोशिकाओं के बीच एक तंग जंक्शन के प्रतिनिधि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (TEM); TEM स्केल बार = 100 एनएम। (मैं - एल) तंग जंक्शनों (ZO1) और लेमिनिन सहित सेमिनिफेरस एपिथेलियम की प्रमुख विशेषताओं के लिए लेबल किए गए टीएलएस की उच्च आवर्धन प्रतिनिधि छवियां। एक ही टीएलएस पैनलों मैं - एल में आसन्न ऊतक वर्गों में चित्रित किया गया है। सभी फ्लोरोसेंट नमूनों को DAPI के साथ डीएनए के लिए सह दाग थे । छवियों को एन = 7 अलग जैविक प्रयोगों से चुना गया था। इस आंकड़े को एडमंड्स और वुड्रफ37से संशोधित किया गया है। आईओपी प्रकाशन ©। अनुमति के साथ पुन: पेश किया गया। सभी अधिकार सुरक्षित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ऑर्गेनॉइड गोनाडोट्रोपिन एफएसएच और एचसीजी के जवाब में संस्कृति के 12 सप्ताह से अधिक टेस्टोस्टेरोन और इनहिबिन बी को स्रावित करते हैं।
3डी-ईसीएम-फ्री ऑर्गेनॉइड से एकत्र किए गए वातानुकूलित मीडिया को एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) के माध्यम से टेस्टोस्टेरोन और इनहिबिन बी के लिए मापा गया था। (A)ऑर्गेनॉइड बारह हफ्तों के लिए सुसंस्कृत थे, 2 सप्ताह के दौरान एफएसएच और एचसीजी पूरकता के साथ - 12 (पूरकता की शुरुआत एक्स-एक्सिस पर लाल तीर के साथ चिह्नित है); सभी मूल्यों सांख्यिकीय परीक्षणों के लिए संस्कृति के दिन 7 की तुलना में थे । (ख)12 सप्ताह के बाद एंडोक्राइन जवाबदेही को संरक्षित किया गया था या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए "पुनः उत्तेजना परीक्षण" का बढ़ाया ग्राफ। परीक्षण की अवधि 4A में ग्रे बॉक्स द्वारा उल्लिखित है। संस्कृति में 12 सप्ताह के पूरा होने पर, gonadotropins ४८ एच के लिए हटा दिया गया था और फिर संस्कृति के एक अंतिम 24 घंटे के लिए फिर से पूरक । गोनाडोट्रोपिन पुनः उत्तेजना के बाद हार्मोन को 0, 2, 6, 12 और 24 घंटे में मापा गया; लाल छायांकित क्षेत्र एफएसएच और एचसीजी के साथ संस्कृति के दौरान समय अवधि निर्धारित करते हैं, गैर-छायांकित क्षेत्र एफएसएच और एचसीजी के बिना समय अवधि निर्धारित करते हैं; विख्यात पी-मान फिर से उत्तेजना के बाद 2 घंटे के सापेक्ष हैं। तुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ दो तरह के ANOVA सभी अंतःस्रावी डेटा, n = 5 अलग जैविक प्रयोगों के लिए महत्व निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस आंकड़े को एडमंड्स और वुड्रफ37से संशोधित किया गया है। आईओपी प्रकाशन ©। अनुमति के साथ पुन: पेश किया गया। सभी अधिकार सुरक्षित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस ऑर्गेनॉइड जनरेशन प्रोटोकॉल के पूरा होने के साथ, उपयोगकर्ता के पास ईसीएम या ईसीएम-मुक्त वातावरण में वृषण निर्माण और ऑर्गेनॉइड को इकट्ठा करने के लिए उनके पास चार अलग-अलग संस्कृति तकनीकें उपलब्ध होंगी। महत्वपूर्ण बात यह है कि सभी चार विधियां शोधकर्ता को समय-चूक इमेजिंग या वीडियो रिकॉर्डिंग के माध्यम से समय के साथ ऑर्गेनॉइड सेल्फ-असेंबली का निरीक्षण करने की अनुमति देती हैं, और संस्कृति के दौरान ऊतकों को परेशान किए बिना गुप्त हार्मोन और साइटोकिन्स के विश्लेषण के लिए वातानुकूलित मीडिया एकत्र करती हैं। सभी तरीकों में, 24 घंटे के दौरान, एक प्रयोगकर्ता सेल संख्या की अनुमति के रूप में कई सौ ऑर्गेनॉइड/वृषण निर्माण के रूप में कई उत्पन्न कर सकता है । ये विधियां ऊतक आत्म-असेंबली को विभिन्न आकारों और मॉर्फोलोजी के साथ निर्माण में बढ़ावा देती हैं; ऑर्गेनॉइड आकार सेल नंबर और संस्कृति में उपयोग की जाने वाली एकाग्रता पर निर्भर करता है, जैसा कि अन्य ऑर्गेनॉइड रिपोर्ट34में देखा गया है । ऑर्गेनॉइड आकार या व्यास को कम करने से परिगलन के आंतरिक क्षेत्रों के विकास को कम करने में मदद मिल सकती है जो कभी-कभी बड़े ऑर्गेनॉइड में प्रस्तुत होते हैं। 2डी ईसीएम और 3 डी ईसीएम-मुक्त प्रोटोकॉल विधियों की एक विशेष ताकत रूपात्मक रूप से मिमेटिक टेस्टिकुलर ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने की उनकी क्षमता है, जिसमें ट्यूबलर बनाम इंटरस्टिटियल सेल प्रकारों के डी नोवो कंपार्टमेंटलाइजेशन शामिल हैं। इसके अलावा, 3 डी ईसीएम-फ्री असेंबल ऑर्गेनॉइड सेमिनिफेरस टीएलएस के डी नोवो टबुलोजेनेसिस के लिए एक मॉडल प्रदान करते हैं, जिसमें उचित रूप से विभाजित और उन्मुख सेर्टोली और पेरिट्यूबुलर कोशिकाएं होती हैं। यह वृषण ऑर्गेनॉइड का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण फेनोटाइप है, और अभी भी विभिन्न वृषण ऑर्गेनॉइड रिपोर्ट के बीच एक चर परिणाम है; कई अन्य रिपोर्टों में ट्यूबल बनाम इंटरस्टिटियम कंपार्टमेंटलाइजेशन की कमी है और कुछ लोग "इनसाइड-आउट ट्यूबल" फेनोटाइप32,33 ,34,,38भी विकसित करते हैं ।34 जबकि वर्तमान पांडुलिपि में प्रस्तुत ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के किसी भी तरीके को संस्कृति के विस्तारित दिनों में बड़ी रोगाणु कोशिका आबादी को बनाए रखने की विशेषता नहीं थी, क्योंकि रोगाणु कोशिकाओं को शायद ही कभी 72 घंटे के रूप में देखा जाता था, दोनों 2D ईसीएम और 3 डी ईसीएम-मुक्त विधियां विट्रो ट्यूबुगोजेनेसिस और शुक्राणुओं के वातावरण के दैहिक कोशिका घटक में अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकती हैं। इस लक्ष्य को ध्यान में रखते हुए, वृषण ऑर्गेनॉइड इन विट्रो जर्मलाइन स्टेम सेल रखरखाव, मेयोटिक प्रगति और भेदभाव में सुधार करने के लिए भविष्य के प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए एक संभावित मंच प्रदान करते हैं।

इन प्रोटोकॉल का एक और लाभ ऑर्गेनॉइड पीढ़ी को अनुकूलित और स्केल करने की क्षमता है। अनुकूलित, दवा का इलाज, या इंजीनियर सेल आबादी की जगह ले सकते हैं, या प्राथमिक माउस वृषण कोशिकाओं३७के अलावा इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि सेल निलंबन कम व्यवहार्यता (<80%) के हैं, तो सेलुलर निलंबन की सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए तरीके उठाए जाने चाहिए। इनमें वियोजन मीडिया में बिताए गए समय को कम करना और ऊतक पाचन के दौरान ट्रिट्यूशन को कम करना (चरण 2.4.1 - 2.5.2), वियोजन के बाद वॉश की संख्या बढ़ाना, या सेल-सॉर्टिंग या डेड-सेल लेबलिंग किट के साथ वियोजन के बाद मृत कोशिकाओं को हटाना शामिल हो सकता है। हालांकि, इस रिपोर्ट में साझा किए गए प्रतिनिधि डेटा को पेश करने के लिए इनमें से कोई भी कदम जरूरी नहीं था । 2डी और 3डी ईसीएम संस्कृति विधियों के लिए, इन प्रोटोकॉल का उपयोग यहां प्रस्तुत अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले अध्ययनों के अलावा अन्य संरचनात्मक प्रोटीन-आधारित बायोमटेरियल मैट्रिस के साथ किया जा सकता है। इन अन्य बायोमैटेरियल्स में कोलेजन, जिलेटिन, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईसीएम अर्क, और कस्टम-निर्मित डिसेलुलरीकृत ईसीएम-व्युत्पन्न हाइड्रोगेल25,26, 28,28शामिल हैं।, मुसीबत-शूटिंग ईसीएम जेल वितरण और उच्च गुणवत्ता वाले एगरल्ड 3 डी पेट्री डिश आवेषण बनाने के लिए कुछ संकेत हैं। जब चैंबर प्लेटों पर ईसीएम जैल कास्टिंग, जल्दी से काम करने के लिए और एक ट्यूब या पिपेट टिप के भीतर ECM के समय से पहले बहुलीकरण को रोकने के लिए ठंडे पिपेट युक्तियों का उपयोग करने के लिए संस्कृति पकवान में वितरण से पहले सुनिश्चित करें । जब कास्टिंग पिघला हुआ 3 डी पेट्री डिश मोल्ड्स (3 डी ईसीएम-मुक्त संस्कृति के लिए) में पैदा हुआ, तो न्यूनतम भिन्नता के साथ आवेषण की उच्च गुणवत्ता वाली कास्टिंग सुनिश्चित करने के लिए केवल गर्म और गर्म agarose का उपयोग करें, और जांच करें कि एगर उठे पूरी तरह से कमरे के तापमान को ठंडा कर दिया गया है और मोल्ड से हटाने के प्रयास से पहले जम गया है। एगर उठे 3 डी पेट्री व्यंजन सबसे अच्छा ठीक संदंश के साथ धीरे से संभाला जाता है। निर्धारण के लिए ऑर्गेनॉइड एकत्र करते समय, सभी ऑर्गेनॉइड के संग्रह की कल्पना करने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत काम करना सुनिश्चित करें। ऑर्गेनॉइड संस्कृति व्यंजनों के प्लास्टिक पक्ष और पिपेट टिप्स के अंदर से चिपके रह सकते हैं; ग्लास पिपेट प्लास्टिक की तुलना में कम ऑर्गेनॉइड पालन प्रदर्शित करते हैं। ईटीएम के भीतर या शीर्ष पर अभी भी समझाया हुआ ऑर्गेनॉइड फिक्सिंग करना निर्धारण से पहले उन्हें ईसीएम से हटाने की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण और नाजुक प्रक्रिया है। ऊतक प्रसंस्करण जेल को संस्कृति कक्ष से हटाने से पहले ईसीएम-ऑर्गेनॉइड निर्माण के ऊपर डाला जा सकता है ताकि फिक्सेशन39से पहले जेल को मजबूत करने में मदद मिल सके। ईसीएम हाइड्रोगेल को पुनः प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर निर्धारण किया जाना चाहिए क्योंकि यदि उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस तक कम किया जाता है तो वे डी-पॉलीमराइज होने की संभावना रखते हैं। इसके अतिरिक्त, ईसीएम को क्रॉस-लिंक करने में मदद करने के लिए 4% पीएफए समाधान में 0.1% - 1.0% ग्लूटारल्डिहाइड जोड़ा जा सकता है; हालांकि, यह विधि नमूने की पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस को बढ़ाती है।

ऊपर प्रस्तुत ऑर्गेनॉइड जनरेशन विधियों द्वारा प्राप्त परिणामों के लिए काफी रोगाणु कोशिका-विशिष्ट सीमाएं हैं, जो भविष्य के नवाचार के लिए प्राथमिकता वाले क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करती हैं। रोगाणु कोशिकाओं को विस्तारित संस्कृति पर खराब समर्थन दिया जाता है, संस्कृति के पहले कुछ दिनों के दौरान केवल आसानी से मनाया जाता है और संस्कृति के पहले सप्ताह के अंत तक और बाद के समय बिंदुओं पर शायद ही कभी मनाया जाता है। जबकि अविविवि कोशिका संस्कृति के भीतर अविफरीकृत शुक्राणुओं को बनाए रखा जा सकता है, जबकि वीवो ट्यूबल्स40में प्रत्यारोपण पर शुक्राणुओं को बहाल करने की उनकी क्षमता को बनाए रखते हुए, ट्यूबल दैहिक माइक्रोएनवायरमेंट (यानी, डायरेक्ट सेर्टोली सेल इंटरैक्शन) को प्री-मेयोटिक रोगाणु कोशिकाओं में और,विट्रो,1,5,40,41में मेयियोसिस और शुक्राणुओं के माध्यम से अंतर करने के लिए एक शर्त होने की परिकल्पना की गई है।, संरचनात्मक रूप से मिमेटिक टीएलएस के भीतर शुरुआती समय के बिंदुओं पर शुक्राणुओं वाले वृषण ऑर्गेनॉइड क्षेत्र को पूरी तरह से विट्रो में दैहिक-दैहिक अध्ययन करने और दैहिक-रोगाणु कोशिका बातचीत करने में सक्षम बना सकते हैं। संस्कृति से पहले मीडिया एडिटिव्स और सेल तैयारी का अनुकूलन (उदाहरण के लिए, इन विट्रो स्पर्मेटोगोनियल स्टेम सेल कल्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले एजेंटों का समावेश)42,,43 भविष्य के अध्ययनों में रोगाणु कोशिकाओं की उपज में वृद्धि कर सकता है, विशेष रूप से संस्कृति अवधि में कई दिनों से अधिक समय तक। इसके विपरीत, टीएलएस के गठन के बाद शुक्राणुओं को फिर से पेश करने के तरीके, जैसे माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से, ऑर्गेनॉइड के भीतर रोगाणु कोशिकाओं को बहाल करने का एक दिलचस्प अवसर पैदा करते हैं, और रोगाणु कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए इन विट्रो संगठित दैहिक वातावरण की क्षमता का परीक्षण करते हैं। आयु/परिपक्वता४५ और आनुवंशिक पृष्ठभूमि अंतर17सहित पूर्व वीवो एक्सप्लांट संस्कृति को प्रभावित करने के लिए अन्य जैविक कारकों को देखा गया है । ये वही चर अभी तक सीधे वृषण ऑर्गेनॉइड जीव विज्ञान के क्षेत्र के भीतर जांच की जानी है । हालांकि, यह प्रशंसनीय है कि विभिन्न असेंबली, आकृति विज्ञान और कार्यात्मक फेनोटाइप तब हो सकते हैं जब ऑर्गेनॉइड अलग-अलग उम्रदराज जानवरों (यानी नवजात, किशोर, वयस्क) या अलग-अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के जानवरों (जैसे, विभिन्न माउस उपभेदों) से अलग कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं।

संक्षेप में, इस पांडुलिपि में साझा की गई तकनीकें सेल-चालित वृषण निर्माण आत्म-असेंबली का अध्ययन करने के लिए चार उपयोगी मॉडल प्रदान करते हैं, दो अलग-अलग संरचनात्मक मिमेटिक वृषण ऑर्गेनॉइड मॉडल की पीढ़ी, और वीस्ट्रो में टीएलएस विकास और हार्मोन-उत्तरदायी एंडोक्राइन समारोह की महत्वपूर्ण उपलब्धि। इन मॉडलों में ईसीएम और ईसीएम-वातावरण में न्यूनतम जटिल, पूरी तरह से परिभाषित संस्कृति मीडिया के साथ 2डी और 3डी स्थानिक झुकाव शामिल हैं। प्रत्येक विधि अत्यधिक प्रजनन योग्य है और केवल आमतौर पर उपलब्ध संस्कृति संसाधनों का उपयोग करती है। ये विधियां विट्रो में वृषण मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने और इन विट्रो शुक्राणुओं के लिए भविष्य की संस्कृति स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए लाभप्रद साबित हो सकती हैं। इससे भी अधिक, 2डी ईसीएम और 3डी ईसीएम-मुक्त विधियां टेस्टिस, इन विट्रो ट्यूबुलोजेनेसिस, और दैहिक-दैहिक और दैहिक-रोगाणु कोशिका इंटरैक्शन के लिए अद्वितीय डी नोवो ऊतक कंपार्टमेंटेशन की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान करती हैं। वृषण ऑर्गेनॉइड दैहिक वृषण शारीरिक पहचान के विकास और विनियमन की जांच करने के लिए एक लचीला और स्केलेबल अवसर प्रदान करते हैं; रक्त-टेस्टिस बाधा और एंडोक्राइन उत्पादन और प्रतिक्रिया सहित; और, साथ ही, अगली पीढ़ी के अनुवाद अनुसंधान ऊतक मॉडल विकसित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण। इनमें प्रजनन हार्मोन को बड़े सिस्टम-लेवल मॉडल में शामिल करना शामिल करना शामिल है, जैसे टिश्यू-ऑन-ए-चिप और माइक्रो-फिजियोलॉजिकल प्लेटफॉर्म४५,,४६। जिन अन्य अनुवादात्मक लक्ष्यों की ओर वृषण ऑर्गेनॉइड एक दिन लागू हो सकते हैं उनमें प्रजनन विष विज्ञान और इम्यूनोलॉजिक बैरियर परीक्षण, पुरुष गर्भनिरोधक विकास और सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकी नवाचार शामिल हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान (NICHD) F31 HD089693, पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान के लिए राष्ट्रीय केंद्र/राष्ट्रीय ट्रांसलेशनल साइंसेज को आगे बढ़ाने के लिए केंद्र (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 और 4UH3ES029073-03, और थॉमस जे वाटकिन के मेमोरियल प्रोफेसरशिप प्रोफेसर द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

लेखक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए एरिक डब्ल्यू रोथ का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस काम ने नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी के एनयूANCE सेंटर की बायोक्रेयो सुविधा का उपयोग किया, जिसे सॉफ्ट एंड हाइब्रिड नैनोटेक्नोलॉजी एक्सपेरिमेंटल (SHyNE) संसाधन (एनएसएफ ईसीसीएस-1542205) से समर्थन मिला है; सामग्री अनुसंधान केंद्र में एमआरएसईसी कार्यक्रम (एनएसएफ डीएमआर-1720139); इंटरनेशनल इंस्टीट्यूट फॉर नैनोटेक्नोलॉजी (आईईएन); और इलिनोइस राज्य, आईईन के माध्यम से। इसमें क्रायोक्लस्टर उपकरण का भी इस्तेमाल किया गया, जिसे एमआरआई प्रोग्राम (एनएसएफ डीएमआर-1229693) से सपोर्ट मिला है। चित्रा 1 में ग्राफिक्स BioRender.com का उपयोग करके डिजाइन किए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 um Media Sterile Filters Millipore Sigma scgpu05re For sterile filtering media
3βHSD primary antibody Cosmo Bio Co K0607 Leydig cell marker, 1:500 dilution
AlexaFluor 568 α-Mouse Thermo Fisher Scientific A-21202 Fluorescence-tagged secondary antibody
AlexaFluor 568 α-Rabbit Thermo Fisher Scientific A10042 Fluorescence-tagged secondary antibody
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific 11-095-080 Base of culture media
Collagenase I Worthington Bio LS004197 For dissociation solution 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free Corning 354234 Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels
Countess Cell counter Thermo Fisher Scientific C10227 Autmated cell counter (hemacytometer machine)
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228 Hemacytometer slide for use with Countess automated counter
DDX4 primary antibody Abcam 138540 Spermatogonia marker, 1:500 dilution
Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) Worthington Bio LS002140 For dissociation solution 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl Thermo Fisher Scientific 14040182 For reconstituting Hyaluronidase
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg Thermo Fisher Scientific 14040117 PBS
Embryo Grade H2O MIllipore Sigma W1503 For reconstituting Collagenase I and Dnase I
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 For quencing enzyme dissocation solutions
Follicle stimulating hormone Abcam ab51888 For long-term organoid culture
Human chorionic gonadotropin Millipore Sigma C1063 For long-term organoid culture
Hyaluronidase, from bovine testes Millipore Sigma H4272 For dissociation solution 2
Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay Ansh Labs AL-107 Inhibin B ELISA Kit
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028 Serum source for Basal media
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) Millipore Sigma Z764051 For 3D ECM-Free organoid fabrication
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well Thermo Fisher Scientific 12-565-7 For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15-140-122 Antibiotic for media
Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 For aiding paraffin embedding
SOX9 primary antibody Millipore Sigma AB5535 Sertoli Marker, 1:500 dilution
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) Teklad Global 2920 Mouse food without phytoestrogens
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) Teklad Global 2916 Mouse food without phytoestrogens
Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay Calbiotech TE373S Testosterone ELISA Kit
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 For cell counting
αSMA primary antibody Millipore Sigma A2547 Peritubular marker, 1:500 dilution
βCatenin primary antibody BD Biosciences 610154 Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution

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References

  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
  3. Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
  4. Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
  5. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  6. Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
  7. Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
  8. Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
  9. Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
  10. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
  11. Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
  12. Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
  13. Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
  14. Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
  15. Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
  16. Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
  17. Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
  18. Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
  19. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  20. Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
  21. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  23. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  24. Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
  25. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  26. Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
  27. Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
  28. Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
  29. Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
  30. Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
  31. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
  32. Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
  33. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  34. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  35. Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
  36. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
  37. Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
  38. Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  39. Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
  40. Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
  41. Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
  42. Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
  43. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
  44. Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
  45. Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
  46. Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
  47. Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 164 टेस्टिस वृषण ऑर्गेनॉइड एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स 2D 3D असेंबली ट्यूबल एंडोक्राइन फ़ंक्शन
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Edmonds, M. E., Forshee, M. D., Woodruff, T. K. Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids. J. Vis. Exp. (164), e61403, doi:10.3791/61403 (2020).

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