Summary
Здесь описаны четыре метода генерации органоидов яичек из первичных неонатальных яичек, т.е. внеклеточной матрицы (ECM) и 2D и 3D-культуры ECM. Эти методы имеют несколько исследовательских применений и особенно полезны для изучения развития яичек и физиологии in vitro.
Abstract
Органоиды яичек обеспечивают инструмент для изучения развития яичек, сперматогенеза и эндокринологии in vitro. Несколько методов были разработаны для того, чтобы создать органоиды яичек. Многие из этих методов полагаются на внеклеточную матрицу (ЭКМ) для содействия сборке тканей de novo, однако существуют различия между методами с точки зрения биомиметического морфологии и функции тканей. Кроме того, существует мало прямых сравнений опубликованных методов. Здесь прямое сравнение делается путем изучения различий в протоколах генерации органоидов, с предоставленными результатами. Описаны четыре метода архетипического поколения: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free и (4) 3D ECM культура. Для оценки генерации органоидов яичек были использованы три основных эталона. Это клеточная самосвека, включение основных типов клеток (Сертоли, Лейдиг, зародыш и перитубулярные клетки), а также соответствующая разобщенные архитектуры тканей. Из четырех протестированных сред 2D ECM и 3D ECM-свободные культуры генерировали органоиды с внутренними морфологиями, наиболее похожими на отечественные яички, включая де-ново-разобщенизацию трубчатых и интерстициальных типов клеток, развитие трубчатых структур и установленную долгосрочную эндокринную функцию. Все изучаемые методы использовали несортированные, первичные суспензии яичек мурина и использовали общедоступные культурные ресурсы. Эти методы генерации органоидов яичек обеспечивают очень доступный и воспроизводимый инструментарий для исследовательских инициатив в области органогенеза яичек и физиологии in vitro.
Introduction
Органоиды яичек являются новаторской техникой для изучения развития яичек, сперматогенеза ифизиологии в пробирке 1,,2,,3,,4. Было изучено несколько методов для генерации органоидов; к ним относятся различные внеклеточные матричные (ЭКМ) и системы культуры, свободные от ЭКМ, как в двухмерных (2D), так и в трехмерных (3D) ориентациях. Различные методы генерации могут способствовать разработке различных стратегий клеточной сборки; это приводит к высокому уровню морфологической и функциональной изменчивости между опубликованными органоидными моделями. Цель этой статьи состоит в том, чтобы обсудить текущее состояние в пробирке тестикулярных моделей, и служить в качестве шаблона для будущих исследователей, при разработке яичек органоидных экспериментов. В рамках настоящего исследования в экспериментальном процессе и биологическом исходе определены и охарактеризованы четыре различных архетипа системы культуры. К ним относятся: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free и 3D ECM методы культуры. Представленные в настоящем деле стратегии призваны быть простыми, доступными и воспроизводимыми между различными лабораториями и исследовательскими группами.
Исторически для яичка, обозначение "in vitro", был использован для нескольких различных методов культуры яичек тканей и клеток. К ним относятся органотипические ткани / орган культуры методы (т.е.эксплант культуры) 5, изолированные семенной трубчатойкультуры 6,яичек клеточной культуры 7, и методы де Новотканиморфогенез (т.е., биологические конструкции и органоиды) 1 . Первые исследования в пробирке сперматогенез были проведены около 100 лет назад, с культурой кролика яичка explants в 19208, а затем в 1937 году с мышью explants9. В рамках этих первоначальных экспериментов сперматозоиды наблюдались в значительной степени вырождаются в течение первой недели культуры, хотя некоторые мейотически дифференциации клеток были определены. Напоминая эти исторические отчеты, тестис explant культуры был возрожден и оптимизирован в 2011 году, чтобы стать возможным методом для изучения яичка10. С 2011 года, explant культуры производится плодородия компетентных спермыв нескольких докладах 11,12,13. Тем не менее, из-за explant культуры зависимость от уже существующих местных труб яички, эти последние достижения более точно описаны как примеры "ex vivo" функции яичек и сперматогенез, функции тканей, которая была сохранена или возобновлена после удаления из организма организма. Несмотря на свою распространенность в литературе, долгосрочное поддержание зародышевых клеток и дифференциации в яичках explants является сложнойзадачей для репликации 14,15,16,17,18, особенно в течение таймфреймов достаточнодолго,чтобы полностью наблюдать в пробирке сперматогенез (35дней у мышей 19 и 74 у людей20). Это интригует, чтобы оценить, что многие из тех же проблем, с которыми сталкиваются 100 лет назад, все еще испытываются в ex vivo сперматогенез сегодня.
В отличается от подходов ex vivo, органоиды яичек de novo собраны микротызы, полностью генерируемые в пробирке из клеточных источников (т.е. первичных яичек). Тестикулярные органоиды обеспечивают творческую стратегию, чтобы обойти историческую зависимость поля от уже существующих местных тканей, и резюмировать биологии яичек полностью in vitro. Есть несколько требований, разделяемых большинством моделей органоидных тканей; к ним относятся (1) виво-миметическая морфология тканей или архитектура, (2) несколько основных типов клеток представленной ткани, (3) самосделки или самоорганизации в их поколении, и (4) способность имитировать некоторый уровень функциипредставленной ткани и физиологии 21,22,23,24. Для яичка, это может быть захвачено в четырех основных признаков: (1) включение основных типов яичек клеток, зародыши, Сертоли, Лейдиг, перитубулярные и другие интерстициальные клетки, (2) клеточной сборки тканей, (3) надлежащим образом разобщенные типы клеток в отдельные трубчатые отсеки (зародыши и сертолии) и интерстициальные области (все другие типы клеток), и (4) некоторую степень функции тканей (например, секреция репродуктивных гормонов или тканей). Учитывая исторические проблемы в поддержании дифференциации зародышевых клеток ex vivo и in vitro, повторение виво-миметических архитектур яичек (т.е. структур, напоминающих семенные трубочки) с дополнительными маркерами, предполагающими моделирование физиологии яичек (например, эндокринная функция), являются приоритетными вехами в направлении генерации органоидов, которые в один прекрасный день могут выдержать в пробирке.
Большинство опубликованных методов органоидов яичка воспользоваться коммерчески доступны ECM (например, коллагена или собственной ECM формулировки)25,26,27 или пользовательских источников ECMs (т.е. децеллюляризованных яичка ECM полученных гидрогели)28,29,30. Экзогенный ECM способствует образованию тканей de novo путем предоставления сборочно-поддерживающего эшафота для генерации тканей. ECM методы позволили впечатляющий уровень формирования тканей, в том числе некоторые присутствия зародышевых клеток и ткани-мимететическойморфологии 25,28. Тем не менее, ECMs они используют не всегда универсально доступны (т.е., decellularized ECM полученных гидрогели), и некоторые методы требуют сложных гель и клеточных ориентаций посева (например, 3-слойные градиенты ECM и 3D-печати)25,31,32. Методы, свободные от строительных лесов (например, висячие капли и неадъедерные пластины культуры)33,,34,35 такжесоздали надежные и высоко воспроизводимые органоиды без необходимости ECM гелей или эшафотов. Тем не менее, морфология тканей этих эшафот-свободных органоидов часто отличается от in vivo яички, и большинство из этих докладов включают биохимические добавки ECM длясодействия образованию тканей 33,34,36, или в качестве альтернативы, полагаться на центрифугации для принудительной агрегации клеток и уплотнения34, что делает их менее идеальными для изучения клеточной миграции и самоорганизации.
Четыре метода генерации органоидов, представленные в этой рукописи, включают как зависимые от ЭКМ, так и независимые стратегии, каждая из которых использует простое клеточное посевное, позволяющее осуществлять наблюдение за клеточной органоидной самосожжением. Все четыре метода могут быть выполнены из тех же подвесок клеток или могут использовать пользовательские и клеточного типа обогащенных популяций. Сила этих методов является способность наблюдать органоидов самостоятельно собираться в режиме реального времени, и непосредственно сравнить, как яичек структуры самостоятельной сборки между различными микроокноронами культуры. Фенотипические различия между этими четырьмя методами культуры должны быть рассмотрены для их воздействия на исследовательский вопрос или предмет следователя. Каждый метод производит биологические конструкции или органоиды в пределах 24 ч или менее. В заключение, методы, представленные здесь обеспечивают инструментарий органоидных методов сборки для изучения органоидной сборки яичек, развития тканей и физиологии яичек в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с мышью были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Северо-Западного университета, и все процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными МАКУК протоколами.
1. Подготовка энзиматических растворов для диссоциации тканей
- Используйте два различных энзиматических решения (Solution 1 и Solution 2), оба из них сделаны с использованием базального среднего решения культуры (BM).
- Для приготовления БМ добавьте сыворотку и пенициллин-стрептомицин к минимальным необходимым средним и окончательным концентрациям 10% и 1% соответственно (см. таблицу материалов для конкретных реагентов). Затем стерильный фильтр БМ через фильтр 0,22 мкм. Перед использованием с клетками, предварительно эквилибрировать стерильные БМ до нейтрального рН, распределяя в культуре блюдо и размещение в увлажненной, 5% CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию, как минимум 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: БМ может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 1 недели, после чего свежие БМ должны быть сделаны. - Чтобы подготовить коллагеназы I фондовых решений, сначала растворить 100 мг коллагеназы I в 1 мл стерильных эмбрионов класса H2O (окончательная концентрация 10% м / в), инвертировать или вихрь, чтобы раствориться, и хранить 20 йл aliquots при -20 КК для более длительного использования. Алициты следует разморозить только один раз.
- Для подготовки деоксирибонуклеазы I (DNase I) фондовые растворы, добавить 20 мг DNase I в 1 мл стерильного эмбриона класса H2O (окончательная концентрация 2% м / в), инвертировать или вихрь, чтобы раствориться (не вихрь), и хранить 20 йл aliquots при -20 градусов по Цельсию для более длительного использования. Алициты следует разморозить только один раз.
- Для растворов запасов гиалуронидазы добавьте 30 мг в 1 мл стерильного фосфатного буферного солевого раствора (PBS; окончательная концентрация 3% м/в гиалуронидазы в PBS, содержащейCaq/Mg), инвертировать или вихрь растворить, и хранить 100 йл aliquots при -20 C для более позднего использования. Aliquots можно разморозить и повторно заморозить несколько раз без потери энзиматической активности.
- Для подготовки диссоциации Раствор 1, добавить 10 йл коллагеназы I и 10 Л DNase I в 1 мл стерильных, предварительно equilibrated БМ (Окончательные концентрации: 1 мг / МЛ коллагеназы I и 5 мкг / мл DNase I). Тритурировать осторожно с пипеткой, чтобы смешать раствор, и предварительно разогреть до 37 градусов по Цельсию перед использованием с тканью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 2 готовится путем добавления 33 л гиалуронидазы (предварительно до 37 градусов по Цельсию) на 1 мл раствора 1 (до конечной концентрации 1 мг/мл). Это происходит на полупути через энзиматические диссоциации ткани яичка на шаге 2,5 ниже.
2. Диссоциация тканей яичка
ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши были размещены в полипропилеиновых клетках и обеспечены пищей и водой ad libitum. На животных кормили облученной чау, которая не содержит фитоэстрогенов. Несовершеннолетние мыши CD-1, 5 дней послеродовой (dpp), были использованы для всех экспериментов и анестезии до эвтаназии и сбора тканей, в анестезии камеры прилагается к изофлюран испаритель (2,5 л / мин в O2). Мыши были подтверждены для полной анестезии из-за отсутствия ответа на палец-колоть, после чего мышей усыыли через обезглавливание.
- Обезболивать мышей в изофлюрановой камере, обеспечивать анестезию через палец-колоть, а затем обезглавить мышь с помощью острых ножниц. Поместите усыпляемую мышь на коврик для вскрытия и стерилизовать живот 70% этанола. Палатка кожи нижней части живота с типами и открыть живот ножницами.
- Найдите яички в левом нижнем и правом паховой областях живота. Отрежьте их соединения к vas deferens и любой якорной соединительной ткани, после этого поднимите весь яичко (с epididymis все еще прикрепленным) от животного. Поместите яички в чашку Петри предварительно equilibrated BM.
- Под микроскопом вскрытия и в стерильном поле, сделать небольшой разрез в туника albuginea на одном конце каждого яичка либо с небольшой ножницой микродиссекции или разрывая осторожно с помощью двух тонких типсов.
- Затем, удерживая яички с противоположного конца разреза, аккуратно сожмите яички мелкими типсами и нажмите нежным радикальным движением к отверстию в тунике; это выпустит ткани яичка, как один сплоченный кусок.
- Разрежьте яички на более мелкие кусочки (≤ 2мм 3) и поместите их в 1 мл предварительно разогретого (37 градусов по Цельсию) диссоциации Раствор 1.
- Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Для более чем 10 яиц увеличьте общий объем раствора диссоциации на 1 мл, обеспечив минимум 1 мл раствора диссоциации на 10 яиц (например, 2 мл для 20 тестов, 3 мл для 30 яиц и т.д.).
- Аккуратно тритурировать кусочки яичка 50 раз (50x) в растворе 1 с помощью P1000 пипетки. Убедитесь, что трубоубийки отделены друг от друга и от интерстициальной ткани в этой точке. Если сгустки остаются, инкубировать еще 5 минут и тритурировать еще раз (50x).
- Добавьте 33 МКЛ раствора запаса гиалуронидазы (предварительно разогретого при 37 градусов по Цельсию, из шага 1,5) на 1 мл раствора 1 диссоциарной смеси (содержащей частично разобщенной ткани яичек и трубочков). После добавления гиалуронидазы, это называется раствором 2.
- Тритурат (50x) с использованием P1000 и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
- Тритурат (50x) с использованием P200 пипетки.
- Убедитесь, что на данный момент нет видимых трубок или скопления клеток присутствуют. Если сгустки сохраняются, инкубировать еще до 5 минут, с дальнейшей тритурации с помощью P200 пипетки (50x).
- Утолить ферменты диссоциации, добавив сыворотку крупного рогатого скота плода (FBS) до 10% от общего объема раствора 2. Тритурат несколько раз с помощью P200 пипетки, чтобы обеспечить отсутствие комков остаются, и фильтр через 40 мкм ситечко клеток для производства одноклеточной подвески.
- Центрифуга клеток на 100 х г в течение 7 мин, отказаться от супернатанта, и повторного перерасхода клеток в свежем БМ.
- Подсчитайте общие и жизнеспособные концентрации клеток с помощью trypan синего исключения на гемоцитометре. Добавьте 10 МКЛ из 1:1 разбавленной, клеточной подвески: трипан синий раствор, в камеру подсчета гемоцитометра ячейки (см. Таблицу материалов).
- Ре-центрифуга клеток на 100 х г в течение 7 мин и повторно в свежем БМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только жизнеспособные клетки для расчета концентрации клеток и их количества. Используйте только клеточные суспензии ≥ 80% жизнеспособности для генерации органоидов. - Подготовка одноклеточной подвески в концентрации клеток, как описано для того, чтобы aliquot 280000 клеток с учетом объемов, используемых в протоколе конкретные шаги ниже в разделе 3: 2D ECM-Free - 0,56 х 106 клеток / мл, 2D ECM - 0,56 x 106 ячеек/мл, 3D ECM-Free - 4,66 x 106 ячеек/мл, 3D ECM - 2,8 х 106 ячеек/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все культурные эксперименты, представленные здесь, начинаются с 280 000 клеток, посеянных на культуру хорошо. Эти цифры соответствуют репрезентативным данным на рисунке 1, рисунке 2, рисунке 3 и рисунке 4.
- Ре-центрифуга клеток на 100 х г в течение 7 мин и повторно в свежем БМ.
3. Приготовление органоидных культурных блюд и посев клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения однородной ECM, до оттепели замороженных aliquots ECM ночь перед экспериментами. ECM aliquots должны быть погружены в ведро со льдом в холодильнике 4 градусов по Цельсию или холодной комнате, чтобы гарантировать медленное, постепенное повышение температуры. Все ECM используется на 1:1 окончательного разбавления в БМ для культуры. Храните размороженный ECM и 1:1 разбавленный ECM на льду до непосредственно перед использованием, в противном случае ECM может полимеризировать преждевременно.
- Для 2D ECM-свободной культуры, никакой специальной подготовки не требуется, пластины одноклеточных суспензий (500 МКЛ из 0,56х 10 6 клеток / мл в БМ) непосредственно на 4-колодец камерных слайдов, и поместить в 35 градусов по Цельсию инкубатор для культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны придерживаться нижней части культуры блюдо в течение первых 24 ч культуры и может проявлять некоторые небольшие кластеры 3D клеток в течение этого же времени. - Для 2D ECM культуры, обойтись 100 йл холодной 1:1 разбавленной внеклеточной среде матрицы подвала в 4 хорошо камеры слайд, обеспечивая гель охватывает всю тарелку дно.
- Поместите камерную горку в инкубатор на 35 градусов Цельсия в течение как минимум 30 минут, чтобы ECM м полимеризуется в гель.
- Добавьте подвеску клетки (500 МКЛ 0,56 х 106 клеток/мл в БМ) прямо на верхней части 2D-геля после полимеризации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны группируются вместе, чтобы сформировать небольшие 3D-кластеры в течение первых 24 ч культуры.
- Для 3D ECM-свободной культуры, подготовить агарозы 3D Петри блюдо вставки перед началом клеточной культуры.
- Во-первых, автоклав 1,5 г порошка агарозы в стакане 100 мл, затем добавить 75 мл стерильной, дистиллированной воды и микроволновой печи для производства расплавленной 2% агары для 3D Петри литья блюдо.
- В стерильном рабочем пространстве, обойтись расплавленной агарозы в 3D Петри блюдо формы до мениска на уровне со сторонами формы.
- Дайте агарозе остыть и затвердеть. Когда твердые, перевернуть плесень с ног на голову и осторожно гибкой неоднократно, пока агароза 3D Петри блюдо падает свободной от плесени.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, можно подготовить много агарозы 3D Петри блюда и хранить их в стерильных H2O или DPBS при 4 КК в течение более одного месяца. - Перед культивированием поместите блюда агарозы 3D Petri в блюдо из 24 хорошо культуры и накройте их 1 мл БМ. Пусть 3D Петри блюда equilibrate в БМ, по крайней мере 30 минут в рамках 37 КК культуры инкубатора. Отбросьте БМ и повторите эквилибровирование еще раз с помощью 1 мл свежего БМ. После эквилибрации 3D-чашек Петри в БМ они будут выглядеть того же цвета, что и БМ (т.е. розовый).
- Чтобы подготовиться к посеву клеток, удалите все БМ из колодец и выпределите 200 МКЛ свежего БМ вокруг, но не внутри центральной ниши 3D чашки Петри. Кроме того, собирать любые оставшиеся БМ изнутри центра клеточного посева углубление микроуэлла вставки.
- Выпределите одноклеточную суспензию (4,66 клетки/мл в 60 МКЛ БМ) в центральную нить чаши агарозы 3D Петри. Аккуратно тритурировать вверх и вниз, чтобы смешать клетки и гарантировать одноклеточную подвеску в начале культуры.
- Поместите в в увлажненной 35 C инкубатор для культуры. На следующий день снимите 200 МКЛ БМ со всей микроуровня и замените 1 мл свежего БМ. Это приведет к уровню жидкости над плоскости вставки, погружая всю культуру.
- Медленно и осторожно удалить / добавить средства массовой информации из-за пределов агарозы 3D Петри блюдо. Органоиды должны были уплотняться на ночь, позволяя им отдыхать внизу и позволяя изменениям в средствах массовой информации оставить органоиды нетронутыми.
- Для 3D-культуры ECM подготовьтесь к одной клеточной подвеске, объединив в равных частях подвеску клетки в БМ с холодным, предварительно оттаявным ECM (окончательная концентрация 2,8 х 106 клеток/мл).
- Немедленно раздай смесь клетки-ECM в 4 хорошо камеры слайд, обеспечивая смесь охватывает все дно пластины.
- Поместите слайды камеры при 35 градусов по Цельсию в инкубатор и позвольте ее содержимому полимеризироваться. Это должно занять не менее 30 минут. После полимеризации добавьте 500 МКЛ БМ поверх культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны были группируются вместе, чтобы сформировать небольшие 3D агрегаты в течение первых 24 ч культуры.
4. Органоидное обслуживание
- Культура всех видов органоидных моделей при 35 градусов по Цельсию. Для всех видов культуры обмен половины своих средств массовой информации со свежим БМ каждые 2 дня. Чтобы органоиды не были случайно собраны при обмене средой, всегда собирайте мультимедиа медленно из угла камерной слайд-тарелки, а с внешней точки за пределами агарозы 3D-чашек Петри. Все средства массовой информации могут храниться при -20 градусов по Цельсию для использования с иммуноанализом или другими анализами позже (т.е. количественной оценкой секретных репродуктивных гормонов или цитокинов).
- После 7 дней в культуре, использовать БМ, содержащий фолликулостимулирующего гормона (окончательная концентрация 20 МИУ/мл) и человека хорионический гонадотропин (окончательная концентрация 4,5 МЕ/мл). Это относится ко всем типам органоидной культуры.
- Регулярно изображение всех органоидных культур (т.е. замедленной визуализации) для характеристики органоидного образования и количественной оценки метрик самос сборки, развития и роста с течением времени.
5. Органоидная коллекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Все органоиды могут быть исправлены с 4% параформальдегида в PBS для ниже по течению иммунолабеля и гистологических анализов. Исправить на 2 ч при комнатной температуре с вращением, или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
- Для 2D культур, свободных от ECM, сначала промойте образец свежим PBS, а затем добавьте фиксатор непосредственно поверх прилипаемых конструкций.
- Для ECM (2D и 3D) методы культуры, промыть один раз с PBS, а затем либо добавить фиксации непосредственно на верхней части ECM-органоидный образец (исправить ECM гель и органоиды вместе), или же, мягко пипетки органоидов вверх и вниз, чтобы освободить их от окружающих ECM, и перейти к отдельной трубке для фиксации.
- Для 3D ECM-свободной культуры, нежно pipette органоиды вверх и вниз в пределах центральной рецессии чашки агарозы 3D Петри; это будет смыть органоиды из облегчения их легкой коллекции с пипеткой. Затем перенесите органоиды в отдельную трубку для фиксации.
- Перед обработкой в парафин, вставлять много органоидов (≥ 20) в пределах небольшого объема (30 йл) геля обработки тканей; это помогает ориентировать и концентрировать органоиды на небольшой площади в парафиновых блоков, облегчая наблюдение при разделе и легче визуальной идентификации в парафиновых секциях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут быть сложными для идентификации после встраивания парафина и секции на микротоме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Органоидное поколение считалось неудачным, если клетки яичек не собирались в пределах 72 ч от культуры, однако, все методы, представленные здесь, собираются в пределах 24 ч при использовании несовершеннолетних (5 dpp) murine клеток. Отказ поколения биологической конструкции представлен как продолжение свободно подвешенных клеток (0 h колонка на рисунке 1) даже после расширенной культуры (72 ч). При отсутствии самосожжения тканей любые видимые клеточные кластеры легко рассеиваются на отдельные клетки даже при нежных манипуляциях (т.е. трубоуправных). Успешно сгенерированные ткани первоначально наблюдались как 3D-клеточные "кластеры" (желтые стрелки в 6-часовой колонке рисунка 1). В среде, свободной от ECM (2D и 3D), эти конструкции заметно, как представляется, "компактный" через первые 24 ч культуры, особенно когда в 3D агароза Петри блюда (Рисунок 1A,C). В средах ECM (2D и 3D) кластеры ячеек обладали четкой маржой между кластером и окружающейсредой (рисунок 1B,D). Было также отмечено, что кластеры клеток мигрируют через ECM и объединяются, образуя более крупные кластеры (красные стрелки на рисунке 1B). Время, необходимое для оценки отдельных самосборных структур, было измерено, и не было существенной разницы во времени, необходимом между 2D и 3D ECM-свободными условиями и 2D ECM, однако, 3D ECM культура требует значительно больше времени для сборки de novo структур, чем все другие методы культуры (Рисунок 1E). Культура 2D ECM и 3D ECM генерируется кластерами ячеек со значительно меньшими размерами, чем 2D ECM и 3D-методы культуры, свободные от ECM; Культура, свободная от 3D ECM, создала самые большие кластеры с одним большим и компактным кластером в каждой колодец 3D-чаши Агарозы Петри(рисунок 1C,F). Таким образом, эти данные демонстрируют легкость производства яичек биологических конструкций из несовершеннолетних мыши первичных клеток в четырех архетипических сред культуры и выделить различные клетки направленной сборки фенотипов в этих различных культурных средах.
Цель всех органоидных моделей состоит в том, чтобы резюмировать внутреннюю морфологию миметического родной ткани. Для оценки этого результата, биологические конструкции, собранные в каждом состоянии культуры были культурны для 72 ч, а затем исследовали для клеточных маркеров и визуализированы с иммунофлуоресценции (Рисунок 2). Между различными методами культуры наблюдалась изменчивость морфологии тканей. Органоиды, свободные от ЭКМ, представленные как кластеры клеток сертоли (SOX9 и «Катенин») с некоторыми зародышевыми клетками (DDX4, маркер зародышевых клеток) придерживались поверх 2D базального слоя, содержащего множество соматическихклеток, включаяСертоли, перитубулярные (ЗСМА) и лейдиг-клетки(3)HSD). Обратите внимание, что рисунок 2B-D являются эпифлуоресцентными изображениями всего образца без 2D ECM, а не секцией 5 мкм; это позволяет визуализировать как базально-соматический клеточный слой, так и превосходно ориентированные агрегаты сертоли и зародышевых клеток. В отличие от этого, 2D ECM культуры представлены в значительной степени различные фенотипа, как четкие биологические структуры с различными границами были легко различимы на вершине базального геля ECM (Рисунок 2E). Эти структуры обладали сложной внутренней морфологией с де-ново-разобщенности трубчатых против интерстициальных типов клеток яичка, и поэтому были признаны успешными органоидами. de novo Трубчатые области содержали сертоли, перитубубулярные и зародышевые клетки, а интерстициальные области содержали Лейдиг, перитубулярные клетки и не помеченные клетки(рисунок 2F-H). Аналогичным образом, органоиды, свободные от 3D ECM, также обладали разобщенной внутренней морфологией и поэтому считались успешными органоидами. В частности, органоиды, свободные от 3D ECM, отличались трубчатыми регионами, содержащими перитубулярные клетки, которые специально ориентирулись вокруг групп сертоли и зародышевых клеток с высокой точностью(рисунок 2I-L). Собранные 3D ECM структуры не обладали сложной морфологией, но вместо этого наблюдались кластеры клеток Сертоли, с редкими зародышами и клетками Лейдига. В этих образцах многие сертоли и не помеченные клетки оставались подвешенными между органоидами в «стромо-подобной» ориентации(рисунок 2M-P). В совокупности эти данные подчеркивают изменчивость морфологических фенотипов, которые различные методы генерации органоидов производят и поддерживают использование двух специфических сред органоидной сборки, 2D ECM и 3D ECM-free, для генерации органоидов яичек с внутренней морфологией, высоко миметической разобщенностью яичек.
Для дальнейшей оценки органоидной функции яичек для более глубокого долгосрочного анализа были отобраны 3D-органоиды, свободные от ЭКМ. Для этого изучения, эти organoids были культурны на 14 дней и после этого probed для маркеров клетки и структуры специфически. При иммунофлуоресцентном анализе в течение 14 дней, 3D ECM-свободных органоидов были замечены содержат трубчатые структуры (TLS) и архитектуры тканей удивительно похож на in vivo яички (Рисунок 3A-D). Интерстициальные ячейки были надлежащим образом расположены в отдельных регионах от ТЛС. Ткань разделы затем были проверены на маркер зародышевых клеток, DDX4, сперматогониальный маркер стволовых клеток, SALL4, и маркер мейоза, SCP3 (Рисунок 3E-G). Редкие DDX4-положительные и SALL4-положительные клетки были замечены, однако, сигнал SCP3 не был идентифицирован. При более глубокой характеристике TLS, они были замечены, чтобы содержать люмен-появление пространства, окруженного поляризованных клеток Сертоли и внешний монослой перитубубных клеток (Рисунок 3I-L). Sertoli клетки также выставлены жесткие соединения друг с другом, как визуализированы с передачей электронной микроскопии и с маркировкой против ЗО-1, стыковочные белка и компонента гемпротезного барьера (Рисунок 3H,L). Далее, 3D ECM-свободных органоидов были изучены для эндокринной функции в 12-недельной, долгосрочной культуры с гонадотропин стимуляции (Рисунок 4). Тестостерон и инибин B, репродуктивные гормоны из Лейдига и Сертоли клетки соответственно, были определены и количественно из органоидных кондиционированных средних (Рисунок 4A). За 12 недель культуры, оба гормона были измерены, чтобы значительно реагировать на добавки гонадотропинов ПГГ и ХГЧ (красная стрелка обозначает начало добавок, в течение недели 2 - 12). По завершении, тест был проведен, чтобы определить, если эндокринная отзывчивость была сохранена. Гонадотропины были удалены на 48 ч, во время которых концентрации тестостерона и игибина В значительно снизились в концентрации. После 48 ч гонадотропины были возвращены в культуру, и обе концентрации гормонов значительно увеличились снова в течение последних 24 ч, демонстрируя правильную эндокринную реакцию(рисунок 4B). В совокупности эти гистологические и эндокринные результаты анализа показывают, что органоиды яичек являются полезной моделью для изучения развития яичек (т.е. де-ново-разобщенизации и тубулогенеза) и функции соматических клеток в пробирке (например, плотное образование соединения и эндокринная функция).
Рисунок 1: Органоиды самостоятельно собираются в условиях культуры, свободной от 2D и 3D, ECM и ECM.
5 dpp murine яичка клетки были культурны в четырех различных условиях: 2D ECM-бесплатно (рядA ), 2D ECM (ряд B), 3D ECM-бесплатно (ряд C), и 3D ECM (ряд D). Графика, изображающая метод культуры, представлена в левой колонке. Представитель изображения монтажи были собраны из замедленного изображения, снятые во время живой культуры. Точки времени для каждого изображения помечены с верхней маржи. Время 0 ч, прежде чем какой-либо органоидной сборки произошло, время 3 ч во время текущей клеточной органоидной сборки, и раз 6 ч и 9 ч продемонстрировать представитель, успешно сформированные органоиды. желтые стрелки отмечают кластеры ячееок и красные стрелки отмечают места, где отдельные кластеры ячеев мигрировали и слились вместе. Для каждого состояния было записано все полосы масштаба - 1мм. (E) Время, необходимое для того, чтобы отдельные кластеры ячеек могли быть заметно оценены. 2DF и 2D ECM-бесплатно; 2DE и 2D ЭКМ; 3DF и 3D ECM-бесплатно; 3DE и 3D ЭКМ. (F)Площадь на кластер была измерена для каждого состояния культуры. Изображения были выбраны из n' 3 - 5 отдельных экспериментов. Для определения значимости в 1E и 1F использовалась однократная ANOVA с помощью многократного теста сравнения Tukey; графики были собраны из средств отдельных экспериментов No4. Эта цифра была изменена из Эдмондс и Вудрафф37. © IOP Издательский. Воспроизводится с разрешения. Все права зарезервированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: 2D ECM и 3D ECM-бесплатные культурные органоиды демонстрируют разобщенную трубчатую и интерстициарные типы клеток.
Представитель ярких и иммунофлюоресцентных образов самосборных органоидов после 72 ч культуры. Образцы, свободные от 2D ECM, были изображены целыми креплениями, все остальные образцы были изображены в 5 секциях тканей. (A- D) 2D ECM-свободной культуры. (E- H) 2D ECM культуры. (I- L) 3D ECM-свободной культуры. (M- P) 3D ECM культуры. Клеточные маркеры, используемые для анализа, помечены на верхнем краю: ядра клеток Sertoli (SOX9) и клеточные тела (Катенин), зародышевые клетки (DDX4, маркер зародышевых клеток), клетки Лейдига (3 ХГСД) и перитубулярные клетки (ЗСМА). Все флуоресцентные образцы были совместно окрашены для ДНК с DAPI. желтые стрелки указывают на DDX4-маркированную зародышевые клетки во второй колонке слева, красные стрелки указывают на скопления клеток Sertoli в правых двух столбцах. Яркие полосы масштаба поля - 400 мкм, флуоресцентные полосы шкалы - 100 мкм. Эта цифра была изменена из Эдмондс и Вудрафф37. © IOP Издательский. Воспроизводится с разрешения. Все права зарезервированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Органоиды развивают трубчатые структуры, населенные редкими зародышевых клетками.
Собранные органоиды без 3D-ECM были выуфированы в течение 14 дней. (A-D) Представитель H и E и иммунофлуоресцентные изображения с подробным описанием типов клеток и особенностей тканей вокруг трубчатых структур (TLS); тот же органоид изображен в смежных участках тканей, позволяющих бок о бок сравнивать морфологические особенности: лейдиг-клетки (3 ГХС), перитубулярные клетки (ЗСМА), тел клеток Сертоли (Катенин), коллагеновую мембрану (COL IV) и ядра клеток Сертоли (SOX9); шкала баров 100 мкм. (E- G) Иммунофлуоресцентная маркировка была выполнена против зародышевых клеток, включая маркер зародышевых клеток (DDX4), маркер сперматогониальных стволовых клеток (SALL4) и мейотически активные сперматозоиды (SCP3). Высокоувеличенные вяла очерчены желтыми панелями в 3E и 3F. Зеленые треугольники указывают на ячейки с маркировкой DDX4; Красные стрелки указывают на ячейки с маркировкой SALL4. (H)Представитель передачи электронного микрографа (TEM) плотного соединения между клетками Сертоли в органоиде; Бар шкалы TEM 100 нм. (Я- L) Высокое увеличение репрезентативных изображений TLS помечены для ключевых особенностей семенной эпителия, включая жесткие соединения (ЗО1) и ламинин. Тот же TLS изображен в смежных секциях тканей в панелях I - L. Все флуоресцентные образцы были совместно окрашены для ДНК с DAPI. Изображения были отобраны из отдельных биологических экспериментов No7. Эта цифра была изменена из Эдмондс и Вудрафф37. © IOP Издательский. Воспроизводится с разрешения. Все права зарезервированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Органоиды выделяет тестостерон и игибин B в течение 12 недель культуры в ответ на гонадотропины ПГГ и ХГЧ.
Условные средства массовой информации, собранные из органоидов, свободных от 3D-ECM, измерялись на тестостерон и интибин B с помощью связанного с ферментом иммуносорбентного анализа (ELISA). (A) Органоиды были культурны в течение двенадцати недель, с FSH и HCG добавок в течение недели 2 - 12 (начало добавок отмечен красной стрелкой на х-оси); все значения были сопоставлены с 7-м днем культуры для статистических тестов. (B)Увеличенный график "повторного стимуляции тест", чтобы определить, если эндокринная отзывчивость была сохранена после 12 недель. Период теста очерчен серой коробкой в 4A. По завершении 12 недель в культуре, гонадотропины были удалены в течение 48 ч, а затем вновь дополнены для окончательного 24 ч культуры. Гормоны измерялись на уровне 0, 2, 6, 12 и 24 ч после повторной стимуляции гонадотропина; красно-затененные области обозначают периоды времени во время культуры с FSH и hCG, не затененные области обозначают периоды времени без FSH и hCG; отметил р-значения по отношению к 2 ч после повторной стимуляции. Двухгочковая ANOVA с тестом множественного сравнения Tukey была использована для определения значимости для всех эндокринных данных, n'5 отдельных биологических экспериментов. Эта цифра была изменена из Эдмондс и Вудрафф37. © IOP Издательский. Воспроизводится с разрешения. Все права зарезервированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С завершением этого протокола генерации органоидов, пользователь будет иметь четыре различных методов культуры доступны для них для сборки яичек конструкций и органоидов в ecM или ECM-свободной среде. Важно отметить, что все четыре метода позволяют исследователю неинвазивно наблюдать органоидную самосъему с течением времени с помощью замедленной визуализации или видеозаписи, а также неинвазивно собирать условные средства массовой информации для анализа секретных гормонов и цитокинов, не нарушая ткани во время культуры. Во всех методах, в течение 24 ч, экспериментатор может генерировать до нескольких сотен органоидов / яичек конструкций, как позволяют числа клеток. Эти методы способствуют самосвеху тканей в конструкции с различными размерами и морфологией; размер органоида зависит от количества клеток и концентрации, используемой в культуре, как видно из других органоидныхотчетов 34. Уменьшение размера или диаметра органоидов может помочь уменьшить развитие внутренних областей некроза, которые иногда представлены в больших органоидах. Особую силу 2D ECM и 3D ECM-бесплатных протокольных методов являются их способность генерировать морфологически миметические органоиды яичек, содержащие de novo compartmentalization трубчатых и интерстициальных типов клеток. Кроме того, 3D ECM-свободные собранные органоиды обеспечивают модель для de novo tubulogenesis seminiferous TLS, с соответствующим образом разрозненными и ориентированными Сертоли и перитубулярными клетками. Это важный фенотип для изучения органоидов яичек, и до сих пор переменный результат среди различных докладов органоидов яичек; несколько других докладов отсутствие трубчатых против интерстиций разобщенных и некоторые даже развивать "внутри трубоубий"фенотип 32,33,34,38. Хотя ни один из методов генерации органоидов, представленных в настоящей рукописи, не был охарактеризован для поддержания больших популяций зародышевых клеток в течение длительных дней культуры, так как зародышевые клетки редко наблюдались уже в 72 ч, как 2D ECM, так и 3D ECM-бесплатные методы могли бы стать полезным инструментом для изучения в пробирке тубулогенеза и соматический клеточный компонент сперматозоидной ниши. С этой целью, яички органоиды обеспечивают потенциальную платформу для оптимизации будущих протоколов для улучшения в пробирке содержание зародышевых стволовых клеток, мейотическая прогрессия, и дифференциации.
Еще одним преимуществом этих протоколов является возможность настройки и масштабирования органоидного поколения. Индивидуальные, обработанные наркотиками или спроектированные популяции клеток могут заменить или использоваться в дополнение к первичным клеткам яичек мыши37. Если подвески клеток имеют низкую жизнеспособность (Lt;80%), следует принять меры для повышения жизнеспособности клеток клеточной подвески. Они могут включать в себя сокращение времени, затяженного в диссоциации средств массовой информации и минимизации тритурации во время пищеварения тканей (шаги 2.4.1 - 2.5.2), увеличение числа моет после диссоциации, или удаление мертвых клеток после диссоциации с клеточной сортировки или мертвых клеток маркировки комплектов. Однако ни один из этих шагов не был необходим для получения репрезентативных данных, опубликованных в настоящем докладе. Для методов культуры 2D и 3D ECM эти протоколы могут быть использованы с другими структурными биоматериалами на основе белка в дополнение к тем, которые используются для исследований, представленных здесь. Эти другие биоматериалы включают коллаген, желатин, коммерчески доступные экстракты ECM, и изготовленные на заказ децеллюляризованные гидрогели ECM25,26,28. Есть несколько указателей для устранения неполадок ECM гель дозирования и создания высококачественных агарозы 3D Петри чашки вставки. При литье ECM гели на камерные пластины, не забудьте работать быстро и использовать холодные советы пипетки для предотвращения преждевременной полимеризации ECM в трубке или пипетки отзыв до дозирования в культуре блюдо. При литье расплавленной агарозы в 3D Петри блюдо формы (для 3D ECM-свободной культуры), использовать только горячие и не теплые агарозы для обеспечения высокого качества литья вставки с минимальными вариациями, и убедитесь, что агароза полностью охлаждается до комнатной температуры и затвердеет, прежде чем пытаться удалить из формы. Agarose 3D Петри блюда лучше всего обрабатываются мягко с тонкой типсов. Собирая органоиды для фиксации, обязательно работай под микроскопом вскрытия, чтобы визуализировать коллекцию всех органоидов. Органоиды могут прилипать к пластиковой стороне культуры блюд и внутри пипетки советы; стеклянные пипетки обладают меньше органоидной приверженности, чем пластик. Фиксация органоидов в то же время инкапсулированы внутри или на вершине ECM является более сложным и деликатным процессом, чем удаление их из ECM до фиксации. Ткань обработки гель может быть отлит выше ECM-органоидной конструкции до удаления из камеры культуры, чтобы помочь укрепить гель до фиксации39. Фиксация должна быть выполнена при комнатной температуре для извлечения гидрогелей ECM, поскольку они могут де-полимеризировать, если опустить до 4 градусов по Цельсию. Кроме того, 0,1 % - 1,0% глутаралдегид может быть добавлен к 4% pfa решение, чтобы помочь дальнейшему перекрестному звену ECM; однако этот метод увеличивает фоновое аутофторесценцию образца.
Существуют значительные специфические ограничения зародышевых клеток на результаты, достигнутые представленными выше методами органоидного поколения, которые представляют собой приоритетные области для будущих инноваций. Зародышевые клетки плохо поддерживаются в течение расширенной культуры, только легко наблюдаются в течение первых нескольких дней культуры и редко наблюдаются к концу первой недели культуры и в более поздние моменты времени. В то время как недифференцированные сперматозоиды могут быть сохранены в культуре клеток in vitro, сохраняя при этом их способность восстанавливать сперматогенез при трансплантации в вивотрубочные трубы 40,трубчатая соматическая микронвидиония (т.е. прямое взаимодействие клеток Сертоли) является предпосылкой,для дифференциации,,предмейотических зародышевых клеток в и через41мейози спермиозв Яичек органоидов, содержащих сперматогонии в ранние моменты времени в структурно миметических TLS может позволить области неинвазивно изучать соматические соматические, и соматические зародышевые клеточные взаимодействия полностью in vitro. Оптимизация медиа-добавок и подготовки клеток до культуры (например, включение агентов, используемых для in vitro сперматозоидов культурыстволовых клеток) 42,43 можетувеличить выход зародышевых клеток в будущих исследованиях, особенно в периоды культуры дольше, чем несколько дней. Обратно, методы для того чтобы re-introduce spermatogonia после того как TLS сформировали, such as через microinjection, представляют интересную возможность восстановить клетки зародыша внутри organoids, и испытать способность in vitro организованных somatic окружающей среды поддерживать клетки зародыша. Другие биологические факторы наблюдались, чтобы повлиять на ex vivo explant культуры, в том числе возраст /зрелость 45 и генетические различия фона17. Эти же переменные до сих пор непосредственно не исследованы в области органоидной биологии яичек. Тем не менее, вполне вероятно, что различные сборки, морфологии и функциональных фенотипов может привести, когда органоиды генерируются из клеток, изолированных от различных возрастных животных (например, неонатальных, несовершеннолетних, взрослых), или животных различного генетического фона (например, различные штаммы мыши).
Таким образом, методы, опубликованные в этой рукописи, предоставляют четыре полезные модели для изучения клеточной конструкции яичек самосвечения, генерации двух отдельных структурно миметических органоидных моделей яичек, а также важное достижение развития TLS и гормоно-реагирующей эндокринной функции in vitro. Эти модели охватывают 2D и 3D пространственные ориентации в ECM и ECM-средах с минимально сложными, полностью определенными культурными средствами массовой информации. Каждый метод воспроизводим и использует только общедоступные культурные ресурсы. Эти методы могут оказаться выгодными для изучения яичек морфогенеза in vitro и оптимизации будущих культурных условий для in vitro сперматогенеза. Более того, 2D ECM и 3D ECM-бесплатные методы обеспечивают новый инструмент для изучения процесса разобщенизации тканей de novo, уникального для яичка, in vitro tubulogenesis и соматических и соматических и соматических взаимодействий зародышевых клеток. Органоиды яичек предоставляют гибкую и масштабируемую возможность исследовать разработку и регуляции соматических физиологических признаков яичек; включая барьер анализа крови и эндокринное производство и реакцию; а также полезный инструмент для разработки моделей переводческих тканей нового поколения. К ним относятся включение репродуктивных гормонов в более крупные модели системного уровня, такие как ткани-на-CHIP и микро-физиологическихплатформ 45,46. Другие трансляционные цели, к которым в один прекрасный день могут быть применены органоиды яичек, включают репродуктивную токсикологию и иммунологическое тестирование барьеров, развитие мужских контрацептивов и вспомогательные инновации в области репродуктивных технологий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом детского здоровья и развития человека (NICHD) F31 HD089693, Национальным институтом экологических наук здоровья / Национальным центром продвижения трансляционных наук (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 и 4UH3ES029073-03, а также Мемориальным профессором Томаса Дж.
Авторы хотели бы поблагодарить Эрика В. Рота за помощь в передаче электронной микроскопии. В этой работе использовался объект BioCryo Центра NUANCE Северо-Западного университета, который получил поддержку от ресурса мягкой и гибридной нанотехнологии (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); программа MRSEC (NSF DMR-1720139) в Научно-исследовательском центре материалов; Международный институт нанотехнологий (IIN); и штата Иллинойс, через IIN. Он также использовал оборудование CryoCluster, которое получило поддержку от программы МРТ (NSF DMR-1229693). Графика на рисунке 1 была разработана с использованием BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
