Summary
כאן, ארבע שיטות ליצירת אורגנואידים אשכים מתאי אשכים מורין ילודים ראשוניים מתוארים כלומר, מטריצה חוץ תאית (ECM) וסביבות תרבות 2D ותלת-מיוד ללא ECM. טכניקות אלה יש יישומי מחקר מרובים והם שימושיים במיוחד ללימוד פיתוח האשכים ופיזיולוגיה במבחנה.
Abstract
אורגנואידים אשכים מספקים כלי לחקר התפתחות האשכים, spermatogenesis, אנדוקרינולוגיה במבחנה. מספר שיטות פותחו על מנת ליצור אורגנואידים האשכים. רבות משיטות אלה מסתמכות על מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי לקדם את הרכבת רקמת דה נובו, עם זאת, ישנם הבדלים בין שיטות במונחים של מורפולוגיה ביומימטית ותפקוד של רקמות. יתר על כן, יש כמה השוואות ישירות של שיטות שפורסמו. כאן, השוואה ישירה נעשתה על ידי לימוד הבדלים בפרוטוקולים דור אורגנואיד, עם תוצאות שסופקו. ארבע שיטות לדור ארכיטיפי: (1) ללא ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) ללא ECM תלת-מיוד, ו-(4) תרבות ECM תלת-מיידה מתוארות. שלושה מבחני ביצועים עיקריים שימשו להערכת דור אורגנואיד האשכים. אלה הם הרכבה עצמית תאית, הכללה של סוגי תאים עיקריים (Sertoli, Leydig, נבט, ותאים פריטבולר), וארכיטקטורת רקמות ממופרת כראוי. מתוך ארבע סביבות שנבדקו, תרביות 2D ECM ו-3D-ECM שנוצרו אורגנואידים עם מורפולולוגיות פנימיות הדומות ביותר לאשכים מקומיים, כולל מידור דה נובו של סוגי תאים צינוריים לעומת תאי בין-עירוניים, פיתוח מבנים דמויי צינור, ותפקוד אנדוקריני ארוך טווח מבוסס. כל השיטות שנבדקו מנוצל לא ממוין, מתלים ראשיים של תאים אשכים murine והשתמשו במשאבי תרבות נגישים בדרך כלל. טכניקות אלה של דור אורגנואידים באשכים מספקות ערכת כלים נגישה ותועתקת ביותר ליוזמות מחקר לתוך אורגנוגנזה אשכים ופיזיולוגיה במבחנה.
Introduction
אורגנואידים אשכים הם טכניקה חלוצית ללימוד התפתחות האשכים, spermatogenesis, ופיזיולוגיהבמבחנה 1,,2,,3,,4. מספר שיטות נחקרו עבור דור אורגנואיד; אלה כוללים מגוון של מערכות תרבות חוץ-תאיות (ECM) ו-ECM ללא ECM, הן בכיוון דו-ממדי (דו-ממדי) והן בכיוון תלת-ממדי (תלת-ממדי). שיטות ייצור שונות יכולות לקדם אסטרטגיות הרכבה תאיות נפרדות; התוצאה היא רמה גבוהה של השתנות מורפולוגית ופונקציונלית בין מודלים אורגנואידים שפורסמו. מטרת מאמר זה היא לדון במצב הנוכחי של מודלים אשכים במבחנה, ולשמש כתבנית עבור חוקרים עתידיים, בעת עיצוב ניסויי אורגנואיד האשכים. במסגרת המחקר הנוכחי, ארבעה ארכיטיפים שונים של מערכת תרבות מוגדרים ומאופיין בתהליך ניסיוני ותוצאה ביולוגית. אלה כוללים: שיטות תרבות ECM ללא ECM 2D, 3D-ללא ECM ותו לא. האסטרטגיות המוצגות בהן נועדו להיות פשוטות, נגישות ותורמות מאוד בין מעבדות וקבוצות מחקר שונות.
מבחינה היסטורית עבור האשכים, הכינוי "במבחנה", שימש עבור מספר שיטות תרבות שונות של רקמות אשכים ותאים. אלה כוללים שיטות רקמות אורגנוטיפיקות / תרבות איברים (כלומר, תרבות explant)5,תרבות צינורית סמיניפריתמבודדת 6,תרבות תאהאשכים 7, ושיטותשל מורפוגנזה רקמת דה נובו (כלומר, מבנים ביולוגיים אורגנואידים)1. החקירות הראשונות בזרע חוץ-חוץ-כוכבי בוצעו לפני כ-100 שנה, כאשר תרבות האשכים של הארנבים נתלו ב-19208- ומאוחר יותר ב-1937עם תפוצות עכבר 9. בתוך ניסויים ראשוניים אלה spermatogonia נצפו במידה רבה מנוון לאורך השבוע הראשון של התרבות, אם כי כמה תאים מבדיל meiotically זוהו. מזכיר דוחות היסטוריים אלה, testis explant תרבות התחדשה אופטימיזציה 2011 כדי להפוך טכניקה אפשרית ללימוד האשכיםהוא 10. מאז 2011, תרבות explant הפיקה זרע כשיר פוריות במספר דיווחים11,12,13. עם זאת, בשל ההסתמכות של תרבות explant על צינורות אשכים מקומיים קיימים מראש, אלה ההתקדמות האחרונה מתוארים בצורה מדויקת יותר כדוגמאות של "ex vivo" תפקוד האשכים spermatogenesis, פונקציית רקמות ש נשמרה או חודשה עם הסרת מגופו של אורגניזם. למרות השכיחות שלה בספרות, תחזוקה ארוכת טווח של תאי נבט והידול בתוך explants האשכים מאתגרלשכפל 14 , 15,16,17,18,במיוחד על פני מסגרותזמן מספיק זמן כדי להתבונן באופן מלא זרע חוץית (~ 35 ימיםבעכברים 19 ו 74 בבניאדם 20). זה מסקרן להעריך כי רבים מאותם אתגרים שחוו לפני 100 שנים, עדיין מנוסים בתוך זרע ויו לשעבר היום.
שונה מאשר גישות ויוו לשעבר, אורגנואידים האשכים הם דה נובו מורכב microtissues שנוצר כולו במבחנה ממקורות סלולריים (כלומר, תאי האשכים העיקריים). אורגנואידים אשכים מספקים אסטרטגיה יצירתית לעקוף את ההסתמכות ההיסטורית של השדה על רקמה מקומית קיימת מראש, ולסיכום הביולוגיה האשכים לחלוטין במבחנה. ישנן דרישות מרובות המשותפות על ידי רוב מודלים רקמת אורגנואיד; אלה כוללים (1) מורפולוגיה או ארכיטקטורה של רקמות vivo-mimetic, (2) סוגי תאים עיקריים מרובים של הרקמה המיוצגת, (3) הרכבה עצמית או ארגון עצמי בדורם, ו-(4) את היכולת לדמות רמה מסוימת של תפקוד הרקמה המיוצגתופיזיולוגיה 21,22,23,,24. עבור האשכים, זה יכול להיות נתפס בארבעה סימני היכר עיקריים: (1) הכללה של סוגי תאי אשכים עיקריים, נבט, Sertoli, Leydig, peritubular, ותאים interstitial אחרים, (2) הרכבת רקמות בהכוונה תא, (3) מתאים ממודר סוגי תאים לתאים צינוריים נפרדים (נבט וSertoli) ואזורים interstitial (כל סוגי התאים האחרים), ו (4) מידה מסוימת של תפקוד רקמות (למשל, הפרשת הורמון הרבייה או תגובות רקמות, ותחזוקת תא נבט ושונות). בהתחשב באתגרים ההיסטוריים בשמירה על בידול תאי הנבט אקס ויוו ובמבחנה, היוון של ארכיטקטורות אשכים vivo-mimetic (כלומר, מבנים הדומים צינורות סמיניפרים) עם סמנים נוספים מציע סימולציה של פיזיולוגיה אשכים (למשל, פונקציה אנדוקרינית), הם אבני דרך עדיפות לקראת יצירת איברים אשר עשוי יום אחד לקיים במבחנה spermgenesis.
רוב שיטות האורגנואידים האשכים שפורסמו לנצל ECM זמין מסחרית (למשל, קולגן או קניינית ניסוחים ECM)25,26,27 או ECMs ממקור מותאם אישית (כלומר, אשכים decellularized נגזר ECM הידרוג'לים)28,,29,30. ECM אקסוגני מקדם היווצרות רקמת דה נובו באמצעות מתן פיגומים תומכים הרכבה עבור יצירת רקמות. שיטות ECM העניקו רמה מרשימה של היווצרות רקמות, כולל כמה נוכחות תא נבט מורפולוגיה רקמות-mimetic25,28. עם זאת, ECMs הם משתמשים אינם תמיד זמינים אוניברסלית (כלומר, הידרוג'לים נגזר ECM decellularized), ושיטות מסוימות דורשות ג'ל מתוחכם ותאים זריעה כיוונית (למשל, מעברי צבע תלת שכבתיים של ECM והדפסה 3D)25,,31,,32. שיטות ללא פיגומים (למשל, צניפה תלויה וצלחות תרבות לא דביקות)33,34,35יצרו גם אורגנואידים חזקים ותו לא רקים ללא צורך בג'לים או פיגומים של ECM. עם זאת, מורפולוגיה רקמות של אורגנואידים אלה ללא פיגומים הוא לעתים קרובות שונה במבחן vivo, ורוב הדיווחים האלה לשלב תוסף ECM ביוכימיכדי לקדם היווצרות רקמות 33,34,36, או לחילופין, להסתמך על צנטריפוגה עבור צנטריפוגה של תאיםכפויים וקומפקטיות 34, מה שהופך אותם פחות אידיאליים ללימוד הגירה מכוונת תא וארגון עצמי.
ארבע שיטות דור האורגנואידים המוצגות בכתב יד זה כוללות הן אסטרטגיות תלויות ECM והן אסטרטגיות עצמאיות, שכל אחת מהן משתמשת בזרעת תאים פשוטה המאפשרת תצפית על הרכבה עצמית של אורגנואידים מונחי תאים. ניתן לבצע את כל ארבע הטכניקות מאותן מתלי תאים או לעשות שימוש באוכלוסיות מועשרות מותאמות אישית וסוג תא. כוחן של שיטות אלה הוא היכולת להתבונן באורגניואידים בהרכבה עצמית בזמן אמת, ולהשוות ישירות את האופן שבו מבנים אשכים מרכיבים את עצמם בין מיקרו-סביבה של תרבות שונה. ההבדלים הפנוטיפיים בין ארבע שיטות תרבות אלה צריכים להיחשב להשפעתם על שאלת המחקר או הנושא של החוקר. כל שיטה מייצרת מבנים ביולוגיים או אורגנואידים בתוך 24 שעות או פחות. לסיכום, השיטות המוצגות כאן מספקות ערכת כלים של טכניקות הרכבה אורגנואידית ללימוד הרכבה אורגנואיד אשכים, פיתוח רקמות, ופיזיולוגיה אשכים במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי העכבר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של אוניברסיטת נורת'ווסטרן, וכל ההליכים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על-ידי IACUC.
1. הכנת פתרונות לדיסוציאציה אנזימטית לרקמות
- השתמש בשני פתרונות אנזימטיים שונים (פתרון 1 ופתרון 2), שניהם מיוצרים באמצעות פתרון בינוני של תרבות בזל (BM).
- כדי להכין BM, להוסיף סרום ופניצילין-סטרפטומיצין לריכוזים בינוניים חיוניים מינימליים של 10% ו 1% בהתאמה (ראה טבלת חומרים עבור reagents ספציפיים). לאחר מכן סטרילי לסנן את BM באמצעות מסנן 0.22 μm. לפני השימוש עם תאים, pre-equilibrate סטרילי BM ל-pH נייטרלי על ידי חלוקה לתוך צלחת תרבות והצבת בתוך לח, 5% CO2 אינקובטור ב 37 ° C למינימום של 1 שעות.
הערה: ניתן לאחסן BM ב- 4 °C למשך שבוע אחד בלבד, לאחר מכן BM טרי צריך להיעשות. - כדי להכין collagenase אני פתרונות מלאי, הראשון להמיס 100 מ"ג של קולגנאז אני לתוך 1 מ"ל של עובר סטרילי כיתה H2O (ריכוז סופי 10% m / v), להפוך או מערבולת כדי להתמוסס, ולאחסן 20 μL aliquots ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. צריך להפשיר את אליקוט רק פעם אחת.
- כדי להכין deoxyribonuclease I (DNase I) פתרונות מניות, להוסיף 20 מ"ג של DNase I לתוך 1 מ"ל של עובר סטרילי כיתה H2O (ריכוז סופי 2% m / v), להפוך או להסתחרר כדי להתמוסס (לא מערבולת), ולאחסן 20 μL aliquots ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. צריך להפשיר את אליקוט רק פעם אחת.
- עבור פתרונות מניות hyaluronidase, להוסיף 30 מ ג לתוך 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט סטרילי (PBS; ריכוז סופי 3% m/v hyaluronidase ב PBS המכיל Ca++/ Mg++), היפוך או מערבולת כדי להתמוסס, ולאחסן 100 μL aliquots ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. Aliquots ניתן להפשיר ולהקפיא מחדש מספר פעמים ללא אובדן של פעילות אנזימטית.
- כדי להכין פתרון דיסוציאציה 1, להוסיף 10 μL קולגנאז אני ו 10 μL DNase אני לתוך 1 מ"ל של סטרילי, pre-equilibrated BM (ריכוזים סופיים: 1 מ"ג / מ"ל קולגנאז אני ו 5 μg / mL DNase I). לערבב בעדינות עם פיפטה כדי לערבב את הפתרון, וחם מראש עד 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש עם הרקמה.
הערה: פתרון 2 מוכן על ידי הוספת 33 μL של hyaluronidase (מראש 37 °C) לכל 1 מ"ל של פתרון 1, (לריכוז הסופי של 1 מ"ג / מ"ל). מצב זה מתרחש באמצע הדרך באמצעות דיסוציאציה אנזימטית של רקמת האשכים בשלב 2.5 להלן.
2. פירוק רקמת טטיס
הערה: כל העכברים היו שכולנים בתוך כלובי פוליפרופילן וסיפקו עם מזון ומים אד libitum. בעלי חיים האכילו אוכל מוקרן שאינו מכיל פיטואסטרוגן. עכברי CD-1 לנוער, 5 ימים לאחר הלידה (dpp), שימשו עבור כל הניסויים והרדמה לפני המתת חסד ואיסוף רקמות, בתוך תא הרדמה המצורף לאיידוי isoflurane (2.5 L/min ב O2). עכברים אושרו להרדמה מלאה באמצעות היעדר תגובה לדקירת בוהן, שלאחריה עכברים הומתו באמצעות עריפת ראש.
- להרדים עכברים בתא isoflurane, להבטיח הרדמה באמצעות בהון, ולאחר מכן לערוף את ראשו של העכבר באמצעות מספריים חד. מניחים את העכבר המתת חסד על מחצלת ניתוח ולחטא את הבטן עם 70% אתנול. אוהל העור של הבטן התחתונה עם מורסות ולפתוח את הבטן עם מספריים.
- אתר את האשכים באזורים השמאליים הימניים והימניים של הבטן. לנתק את הקשרים שלהם vas deferens וכל רקמת חיבור עיגון, לאחר מכן להרים את האשכים כולו (עם אפידימיס עדיין מחובר) מן החיה. מניחים את האשכים בצלחת פטרי של BM שוויון מראש.
- תחת מיקרוסקופ פירוק ובתוך שדה סטרילי, לעשות חתך קטן ב albuginea tunica בקצה אחד של כל אשכים עם מספריים microdissection קטן או על ידי קרעת בעדינות באמצעות שני ממחצויות עדינות.
- לאחר מכן, בעודו מחזיק את האשכים מהקצוות הנגדיים של החתך, סוחטים בעדינות את האשכים במלחציים עדינים ודוחפים בתנועה סוחפת עדינה לעבר החור בטוניקה; זה ישחרר את רקמת האשכים כחתיכה אחת מלבנית.
- חותכים את האשכים לחתיכות קטנות יותר (≤ 2מ"מ 3)וממקם אותם ל-1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה חם מראש (37°C) 1.
- דגירה ב 37 °C במשך 10 דקות.
- עבור יותר מ-10 אשכים, הגדל את נפח פתרון הדיסוציאציה הכולל ב-1 מ"ל, תוך הבטחת מינימום של 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה לכל 10 אשכים (למשל, 2 מ"ל ל-20 אשכים, 3 מ"ל ל-30 אשכים וכו').
- בעדינות triturate את חתיכות האשכים 50 פעמים (50x) בפתרון 1 באמצעות פיפטה P1000. ודא כי הצינורות מופרדים זה מזה ומרקמות interstitial בשלב זה. אם הגושים נשארים, דגירה במשך 5 דקות נוספות וטריטורה פעם נוספת (50x).
- להוסיף 33 μL של תמיסת מניות hyaluronidase (מראש חימם ב 37 ° C, מ שלב 1.5) לכל 1 מ"ל של תערובת דיסוציאציה פתרון 1 (המכיל רקמת האשכים וצינורות תותכים מפורק חלקית). לאחר הוספת hyaluronidase, זה נקרא פתרון 2.
- טריטורה (50x) באמצעות P1000 דגירה ב 37 °C במשך 5 דקות.
- טריטורט (50x) באמצעות פיפטה P200.
- ודא כי בשלב זה לא קיימים צינורות גלויים או גושי תאים. אם גושים נמשכים, דגירה עד 5 דקות נוספות, עם טריטורציה נוספת באמצעות P200 pipette (50x).
- הרוו את אנזימי הדיסוציאציה על-ידי הוספת סרום בקר עוברי (FBS) ל-10% מהנפח הכולל של פתרון 2. לתמזה מספר פעמים באמצעות פיפטה P200 כדי להבטיח שלא יישארו גושים, וסנן באמצעות מסננת תא של 40 μm כדי לייצר מתלה של תא יחיד.
- תאי צנטריפוגה ב- 100 x g למשך 7 דקות, נפטרים מהסופרנט ופנסים מחדש את התאים ב-BM טרי.
- לספור את ריכוזי התא הכולל ו קיימא באמצעות הדרה כחול trypan על hemocytometer. להוסיף 10 μL של 1:1 מדולל, מתלה תא: פתרון כחול trypan, לתוך תא ספירת תאים hemocytometer (ראה טבלת חומרים).
- תאים צנטריפוגה מחדש ב 100 x g עבור 7 דקות וssuspend ב BM טרי.
הערה: השתמש בתאים מעשיים רק לחישוב ריכוז ומספר תאים. השתמש רק מתלי תאים של ≥ 80% קיום ליצירת אורגנואידים. - הכן את מתלי התא הבודד לריכוזי תאים כמתואר על מנת לצטט 280,000 תאים בהתחשב בנפחים המשמשים בפרוטוקול שלבים ספציפיים להלן בסעיף 3: 2D ECM-חינם – 0.56 x 106 תאים/מ"ל, 2D ECM – 0.56 x 106 תאים/מ"ל, 3D ECM-חינם – 4.66 x10 6 תאים/ מ"ל, 3D ECM – 2.8 x 106 תאים / מ"ל.
הערה: כל ניסויי התרבות המוצגים כאן מתחילים עם 280,000 תאים שנזרעו היטב לכל תרבות. מספרים אלה תואמים לנתונים המייצגים בדמות 1, איור 2, איור 3 ואיור 4.
- תאים צנטריפוגה מחדש ב 100 x g עבור 7 דקות וssuspend ב BM טרי.
3. הכנת מנות תרבות אורגנואיד ותרעת תאים
הערה: כדי להבטיח ECM הומוגני, pre-פשרה קפוא aliquots של ECM לילה לפני ניסויים. ECM aliquots צריך להיות שקוע בתוך דלי של קרח בתוך מקרר 4 מעלות צלזיוס או חדר קר כדי להבטיח עלייה איטית, הדרגתית בטמפרטורה. כל ECM משמש 1:1 דילול סופי BM לתרבות. שמור ECM מופרך ו- ECM מדולל 1:1 על קרח עד מיד לפני השימוש, אחרת ECM עלול לפולימר בטרם עת.
- עבור תרבות 2D ECM ללא, אין צורך בהכנה מיוחדת, מתלים תא יחיד צלחת (500 μL של 0.56 x10 6 תאים / מ"ל ב BM) ישירות על 4- גם שקופיות תא, ומקום לתוך 35 ° C אינקובטור לתרבות.
הערה: תאים צריכים לדבוק בתחתית צלחת התרבות בתוך 24 השעות הראשונות של התרבות, עשויים להציג כמה אשכולות תאים תלת-מית-מירביים קטנים בתוך זמן זה. - עבור תרבות ECM 2D, לוותר 100 μL של קר 1:1 מדולל מטריצה חוץ תאית מטריצה לתוך שקופית 4 באר תא, להבטיח את הג'ל מכסה את כל תחתית המנה.
- מניחים את השקופית התא באינקובטור 35 °C למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר ECM פולימר לתוך ג'ל.
- הוסף את מתלה התא (500 μL של 0.56 x10 6 תאים /מ"ל ב BM) ישירות על החלק העליון של ג'ל 2D ברגע שיש לו polymerized.
הערה: תאים צריכים להתקבץ יחד כדי ליצור אשכולות תלת-מית-מירביים קטנים בתוך 24 השעות הראשונות של התרבות.
- עבור תרבות ללא ECM 3D, להכין agarose 3D פטרי צלחת תוספות לפני תחילת תרבות התא.
- ראשית, autoclave 1.5 g אבקת agarose ב 100 מ"ל בפיק, לאחר מכן להוסיף 75 מ"ל סטרילי, מים מזוקקים ומיקרוגל כדי לייצר מותך 2% agarose עבור יציקת צלחת פטרי 3D.
- בתוך סביבת עבודה סטרילית, לחלק agarose מותך לתוך תבנית צלחת פטרי 3D עד המניסקוס הוא ברמה עם צידי התבנית.
- אפשרו לאגרוז להתקרר ולגבש. כאשר מוצק, להפוך את התבנית בעדינות להתכופף שוב ושוב עד צלחת פטרי 3D agarose נופל חופשי מהתבנית.
הערה: בשלב זה, ניתן להכין הרבה מנות agarose 3D פטרי ולאחסן אותם ב- H2O או DPBS סטרילי ב 4 ° C עבור כלפי מעלה של חודש אחד. - לפני ההתפלה, מניחים את מנות הפטרי 3D של Agarose במנה תרבותית של 24 באר, ומכסים אותן ב-1 מ"ל BM. תנו לתמזי ה-3D של פטרי להסתוות ל-BM למשך 30 דקות לפחות בתוך חממת תרבות של 37 מעלות צלזיוס. בטל את ה-BM וחזור על השיוויון פעם נוספת עם BM טרי של 1 מ"ל. לאחר שיווי משקל של מנות פטרי 3D ב BM, הם יופיעו באותו צבע כמו BM (כלומר, ורוד).
- כדי להתכונן זריעת תאים, להסיר את כל BM מהבאר ולחלק 200 μL של BM טרי מסביב, אבל לא בתוך ההפסקה המרכזית של צלחת פטרי 3D. כמו כן, לאסוף את כל BM הנותרים מתוך הפסקה זריעת התא המרכזי של מוסף microwell.
- לחלק את מתלה תא יחיד (4.66 תאים / מ"ל ב 60 μL של BM) לתוך ההפסקה המרכזית של צלחת agarose 3D פטרי. בעדינות לתלת למעלה ומטה כדי לערבב תאים ולהבטיח מתלה תא יחיד בתחילת התרבות.
- מניחים באינקובטור לח של 35 מעלות צלזיוס לתרבות. למחרת, להסיר את 200 μL של BM מסביב להוכנס microwell, ולהחליף עם 1 מ"ל של BM טרי. זה יביא את הרמה הנוזלית מעל מישור של הכנס, שקוע התרבות כולה.
- לאט ובזהירות להסיר / להוסיף מדיה מחוץ לצלחת agarose 3D פטרי. האורגנואידים היו אמורים להידחק בן לילה, ולאפשר להם לנוח בתחתית ולאפשר לשינויים בתקשורת להשאיר אורגנואידים ללא הפרעה.
- עבור תרבות ECM 3D, להכין מתלה תא יחיד על ידי שילוב, בחלקים שווים, מתלה התא BM עם קר, PRE-הפשיר ECM (ריכוז סופי = 2.8 x 106 תאים / מ"ל).
- מיד לחלק את תערובת התא-ECM לתוך שקופית 4 באר תא, להבטיח את התערובת מכסה את החלק התחתון כולו של הצלחת.
- מניחים את שקופיות התא ב-35°C באינקובטור ומאפשרים לתכולתו לפולימר. זה צריך לקחת לפחות 30 דקות. לאחר הפולימר, להוסיף 500 μL של BM על החלק העליון של התרבות.
הערה: תאים היו צריכים להתקבץ יחד כדי ליצור אגרגטים תלת-מית-דיים קטנים בתוך 24 השעות הראשונות של התרבות.
4. תחזוקת אורגנואידים
- תרבות כל סוגי מודלים אורגנואידים ב 35 °C. עבור כל סוגי התרבות להחליף מחצית מהמדיה שלהם עם BM טרי כל 2 ימים. כדי להבטיח כי אורגנואידים לא נאספים בטעות בעת החלפת מדיום, תמיד לאסוף מדיה לאט מפינה של צלחת שקופיות התא, ומן נקודה חיצונית מחוץ צנרת agarose 3D פטרי. ניתן לאחסן את כל אמצעי התקשורת ב-20°C לשימוש עם immunoassays או ניתוחים אחרים מאוחר יותר (כלומר, כימות של הורמוני רבייה הפרשה או ציטוקיני).
- לאחר 7 ימים בתרבות, להשתמש BM המכיל הורמון מגרה זקיק (ריכוז סופי 20 mIU / מ"ל) וגונדוטרופין כוריוני אנושי (ריכוז סופי 4.5 IU / מ"ל). זה חל על כל סוגי תרבות האורגן.
- באופן שגרתי תדמיתי את כל תרבויות האורגניואידים (כלומר, הדמיית זמן-זמן) לאפיון היווצרות אורגנואידים וכמת מדדים של הרכבה עצמית, פיתוח וצמיחה לאורך זמן.
5. אוסף אורגנואידים
הערה: ניתן לתקן את כל האורגנואידים עם 4% paraformaldehyde ב PBS עבור אימונולת במורד הזרם וניתוחים היסטולוגיים. תקן במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם סיבוב, או לילה ב 4 °C.
- עבור תרבויות ללא ECM 2D, תחילה לשטוף את המדגם עם PBS טרי, ולאחר מכן להוסיף קיבעון ישירות על גבי המבנים דבק.
- עבור שיטות תרבות ECM (2D ו- 3D), לשטוף פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן גם להוסיף קיבעון ישירות על החלק העליון של מדגם ECM-אורגנואיד (כדי לתקן את ג'ל ECM אורגנואידים יחד), או לחילופין, בעדינות pipette אורגנואידים למעלה ו למטה כדי לשחרר אותם ECM שמסביב, ולעבור צינור נפרד קיבעון.
- עבור תרבות נטולת ECM תלת-מית, בעדינות pipette אורגנואידים למעלה ומטה בתוך ההפסקה המרכזית של צלחת agarose 3D פטרי; זה יהיה לשטוף את האורבנואידים החוצה להקל על האוסף הקל שלהם עם פיפטה. לאחר מכן להעביר אורגנואידים לצינור נפרד עבור קיבעון.
- לפני עיבוד לתוך פרפין, להטביע אורגנואידים רבים (≥ 20) בתוך נפח קטן (~ 30 μL) של ג'ל עיבוד רקמות; זה עוזר לכוון ולרכז אורגנואידים לתוך אזור קטן בתוך בלוקי פרפין, להקל על תצפית קלה יותר בעת מקטע וזיהוי חזותי קל יותר בתוך מקטעים פרפין.
הערה: אורגנואידים יכולים להיות מאתגרים לזהות לאחר הטבעת פרפין וניתוח על microtome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דור אורגנואיד נחשב לא מוצלח אם תאי האשכים לא הרכבה עצמית בתוך 72 שעות של תרבות, עם זאת, כל השיטות המוצגות כאן להרכיב בתוך 24 שעות בעת שימוש בתאים מורין ילדותי (5 dpp). כשל בדור המבנה הביולוגי הוצג כהמשך של תאים מושעים באופן חופשי (עמודה של 0 שעות באות 1) גםלאחר תרבות מורחבת (72 ש).) בהיעדר הרכבה עצמית של רקמות, כל אשכולות תאים לכאורה התפזרו בקלות לתאים בודדים על מניפולציה עדינה אפילו (כלומר, pipetting). רקמות שנוצרו בהצלחה נצפו בתחילה כתא תלת-מיואש "אשכולות" (חצים צהובים בעמודה של 6 שעות של איור 1). בתוך סביבות ללא ECM (2D ו 3D), מבנים אלה הופיעו באופן ניכר "קומפקטי" על פני 24 השעות הראשונות של תרבות, במיוחד כאשר במנות 3D agarose פטרי(איור 1,C). בסביבות ECM (2D ו- 3D) אשכולות תאים היו בעלי שוליים ברורים בין האשכול והסביבה שלהם(איור 1B,D). אשכולות תאים נצפו גם כדי להעביר על פני ECM ולהתמזג יחד יצירת אשכולות גדולים יותר (חצים אדומים באות 1B). הזמן הנדרש כדי להעריך מבנים נפרדים המורכבים עצמית נמדד, ולא היה הבדל משמעותי בזמן הנדרש בין תנאים דו-מיוד ותלת-מיוד ECM ואק"מ דו-מידוד, עם זאת, תרבות ECM תלת-מידוד דרשה זמן רב יותר באופן משמעותי להרכבת מבני דה נובו מאשר כל שיטות התרבותהאחרות (איור 1E). תרבות ECM 2D ללא ECM ותלת-מידות יצרה אשכולות תאים בגדלים קטנים משמעותית משיטות ECM 2D ושיטות תרבות ללא ECM תלת-מידות; תרבות ללא ECM תלת-מית הפיקה את האשכולות הגדולים ביותר עם אשכול גדול וקומפקטי אחד בתוך כל באר של צלחת 3D agarose Petri(איור 1C,F). לסיכום, נתונים אלה מדגימים את הקלות שבה ניתן לייצר מבנים ביולוגיים אשכים מתאי עכבר ראשוניים צעירים בארבע סביבות תרבות ארכיטיפיות ולהדגיש פנוטיפים שונים של הרכבה-פנוטיפים שונים בבימוי תאים בסביבות תרבות שונות אלה.
המטרה של כל מודלים אורגנואידים היא לסיכום פנטומימטה מורפולוגיה פנימית של רקמה מקורית. כדי להעריך את התוצאה הזו, מבנים ביולוגיים שנאספו בתוך כל מצב תרבות היו תרבותיים במשך 72 שעות ולאחר מכן נבדקו עבור סמנים ספציפיים לתא ודמיינו עם אימונופלואורסנציה(איור 2). שונות מורפולוגיה רקמות נצפתה בין שיטות תרבות שונות. אורגנואידים נטולי ECM דו-מיינד המוצגים כאשכולות של תאי סרטולי (SOX9 ו-βCatenin) עם כמה תאי נבט (DDX4, סמן תא נבט פאן) דבק על גבי שכבת confluent בזל 2D המכיל תאים סומטיים רבים, כולל Sertoli, הצפק (αSMA), ותאי Leydig (3βHSD) (איור 2לערך). שים לב כי איור 2B-D הן תמונות epifluorescent של כל מדגם 2D ECM ללא, לא סעיף 5 μm; הדבר מאפשר הדמיה של שכבת התאים הבסאלית והן של אגרגטים מונחים בצורה מעולה של תאי סרטולי ונבט. לעומת זאת, תרבות ECM 2D הציג עם פנוטיפ שונה במידה רבה, כמו מבנים ביולוגיים ברורים עם גבולות ברורים היו להבחין בקלות על גבי ג'ל ECM בסיסי (איור 2E). מבנים אלה היו מורפולוגיה פנימית מורכבת עם מידור דה נובו של צינור לעומת סוגי תאים interstitial של האשכים, ולכן נחשבו אורגנואידים מוצלחים. אזורים צינוריים הכילו תאי סרטולי, צפק ונבט, ואזורים בין-גזעיים הכילו את Leydig, תאים צפק ותאים שאינם מסומנים(איור 2F-H). באופן דומה, אורגנואידים נטולי ECM תלת-מית היו בעלי מורפולוגיה פנימית ממסחרית ולכן נחשבו אורגנואידים מוצלחים. בפרט, אורגנואידים 3D ECM ללא היו ייחודיים על ידי אזורים צינוריים המכילים תאים צפק כי במיוחד מכוון סביב קבוצות של Sertoli ותאי נבט עם נאמנות גבוהה(איור 2I-L). מבנים 3D ECM התאספו לא היה מורפולוגיה מתוחכמת, אבל במקום נצפו להיות אשכולות של תאי Sertoli, עם תאי נבט ומדי פעם Leydig. בדגימות אלה, תאים רבים Sertoli ותאי לא מתויג נשאר תלוי בין אורגנואידים בכיוון "דמוי סטרומה"(איור 2M-P). יחד, נתונים אלה מדגישים את השונות בפנוטיפים מורפולוגיים ששיטות שונות של דור אורגנואידים מייצרות ותומכות בשימוש בשתי סביבות הרכבה אורגנואידיות ספציפיות, 2D ECM ו-3D-ECM- ללא, לדור של אורגנואידים אשכים עם מורפולוגיה פנימית מאוד פנטומימטית של מידור האשכים.
כדי להעריך עוד יותר את תפקוד האורגניואיד האשכים, אורגנואידים מורכבים ללא ECM תלת-מימד נבחרו לניתוח ארוך טווח עמוק יותר. עבור מחקר זה, אורגנואידים אלה היו תרבותיים במשך 14 ימים ולאחר מכן נחקר עבור תאים ומבנה סמנים ספציפיים. לאחר ניתוח immunofluorescent ב 14 ימים, אורגנואידים 3D ECM ללא נצפו להכיל צינור כמו מבנים (TLS) וארכיטקטורת רקמות דומה להפליא באבחנים vivo(איור 3לערך). תאים בין-גזעיים היו ממוקמים כראוי באזורים נפרדים מ- TLS. מקטעים רקמה נבדקו לאחר מכן עבור סמן תא נבט פאן, DDX4, סמן תאי גזע spermatogonial, SALL4, ו סמן מיוזיס, SCP3(איור 3E-G). תאים נדירים DDX4 חיובי ו-SALL4 חיובי נצפו, עם זאת, לא זוהה אות SCP3. לאחר אפיון עמוק יותר של TLS, הם נצפו להכיל מרחב לומן מופיע מוקף תאי Sertoli מקוטבים מונו שכבת חיצונית של תאים צפק(איור 3I-L). תאי סרטולי גם הציגו צמתים הדוקים זה לזה, כפי שמתואר במיקרוסקופ אלקטרונים שידור ועם תיוג נגד ZO-1, חלבון צומתי ורכיב של מחסום בדיקת הדם(איור 3H,L). לאחר מכן, אורגנואידים נטולי ECM 3D נחקרו לתפקוד האנדוקרינית בתרבות ארוכת טווח של 12 שבועות עם גירוי גונדוטרופין(איור 4). טסטוסטרון וinhibin B, הורמוני הרבייה מתאי Leydig ו Sertoli בהתאמה, היו שניהם מזוהים וכמתו מ בינוני אורגנואיד מותנה(איור 4A). מעל 12 שבועות של תרבות, שני ההורמונים נמדדו להגיב באופן משמעותי לתוספים של גונדוטרופין FSH ו hCG (חץ אדום מציין את תחילת התוספים, במהלך שבועות 2 – 12). בסיום, בוצעה בדיקה כדי לקבוע אם ההיענות האנדוקרינית נשמרה. Gonadotropins הוסרו במשך 48 שעות, במהלכן גם טסטוסטרון וגם ריכוזי תום B ירד באופן משמעותי בריכוז. לאחר 48 שעות, גונדוטרופינים הוחזרו לתרבות ושני ריכוזי ההורמונים גדלו באופן משמעותי שוב על פני 24 שעות סופיות, מדגים תגובתיות אנדוקרינית נכונה(איור 4B). יחד, תוצאות אסאי היסטולוגיות ואנדוקריניות אלה מוכיחות כי אורגנואידים האשכים הם מודל שימושי ללימוד התפתחות האשכים (כלומר, מידול דה נובו וטובולוגנזה) ותפקוד אשכים סומטי במבחנה (למשל, היווצרות צומת הדוקה ותפקוד אנדוקריני).
איור 1: אורגנואידים מרכיבים את העצמי בתנאי תרבות תלת-מית-מית-מית-מית, ECM ו-ECM.
5 dpp תאי אשכים murine היו תרבותיים בארבעה תנאים שונים: 2D ECM חינם (שורה A),ECM 2D (שורה B),3D ECM חינם (שורה C),ו ECM 3D (שורה D). גרפיקה המתארת את שיטת התרבות מסופקת בעמודה השמאלית. מונטאז'ים של תמונות מייצגות הורכבו מתמונות שצולמו במהלך התרבות החיה. נקודות זמן עבור כל תמונה מסומנים בשוליים העליונים. זמן 0 h הוא לפני כל הרכבה אורגנואיד התרחשה, זמן 3 h הוא במהלך הרכבת אורגנואידים מונחה תא מתמשך, ופעמים 6 h ו 9 h להפגין נציג, נוצר בהצלחה אורגנואידים. חצים צהובים מסמנים אשכולות תאים וחצים אדומים מסמנים מיקומים שבהם אשכולות תאים נפרדים הועברו והתמזגו יחד. כל הסורגים בקנה מידה = 1 מ"מ.(E)הזמן הנדרש לפני אשכולות תאים נפרדים ניתן להעריך באופן ניכר נרשם עבור כל תנאי. 2DF = ללא ECM 2D; 2DE = ECM 2D; 3DF = ללא ECM תלת-מיוד; 3DE = ECM תלת-מיוד. (F)אזור לכל אשכול נמדד עבור כל תנאי תרבות. התמונות נבחרו מתוך n= 3 – 5 ניסויים נפרדים. ANOVA חד-דרך עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey שימש לקביעת משמעות ב- 1E ו- 1F; גרפים הורכבו מהאמצעים של n = 4 ניסויים נפרדים. נתון זה שונה מתוך אדמונדס ו-וודרוף37. © IOP. שוחזר ברשות. כל הזכויות שמורות לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: 2D ECM ו 3D-ללא ECM אורגנואידים תרבותיים להפגין מידר של סוגי תאים צינוריים interstitial.
נציג brightfield ותמונות אימונופלורסנט של אורגנואידים שנאספו עצמית לאחר 72 שעות של תרבות. דגימות 2D ECM ללא היו בתמונה הר שלם, כל הדגימות האחרות נתו ב 5 μm רקמות מקטעים. (A – D)תרבות דו-מית-פרטית ללא ECM. (ה– ח)תרבות ECM 2D. (I– L)תרבות ללא ECM תלת-מיוד. (M – P)תרבות ECM 3D. סמנים ספציפיים לתא המשמשים לניתוח מסומנים בשוליים העליונים: גרעין תאי סרטולי (SOX9) וגופים סלולריים (βCatenin), תאי נבט (DDX4, סמן תא נבט פאן), תאי Leydig (3βHSD) ותאים פריטוניים (αSMA). כל דגימות הפלורסנט היו מוכתמים בשותף לדנ"א עם DAPI. חצים צהובים מצביעים על תאי נבט המסומנים ב- DDX4 בעמודה השניה משמאל, חצים אדומים מצביעים על אשכולות תאים של Sertoli בשתי העמודות הימניות. פסים בקנה מידה שדה בהיר = 400 μm, פסים בקנה מידה פלורסנט = 100 μm. נתון זה שונה מתוך אדמונדס ו-וודרוף37. © IOP. שוחזר ברשות. כל הזכויות שמורות לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: אורגנואידים מפתחים מבנים דמויי צינור המאוכלסים בתאי נבט נדירים.
אורגנואידים ללא ECM ללא 3D-ECM היו תרבותיים במשך 14 ימים. (א-ד) מה אתה עושה? תמונות מייצגות של H&E ו-immunofluorescent המפרטות סוגי תאים ותכונות רקמות סביב מבנים כמו צינור (TLS); אותו אורגנואיד מתואר בקטעי רקמות סמוכים המאפשרים השוואה זה לצד זה של תכונות מורפולוגיות: תאי Leydig (3βHSD), תאים ניצבים (αSMA), גופים תאי Sertoli (βCatenin), קרום קולגן (COL IV), ו גרעין תאי סרטולי (SOX9); סולות קנה מידה = 100 μm. (E– G) מה אתה עושה? תיוג אימונופלורסנט בוצע נגד תאי נבט, כולל סמן תא נבט פאן (DDX4), סמן תאי גזע זרע (SALL4) ו spermatocytes פעיל meiotically (SCP3). ערכות מוגדלות ביותר מתוארות על-ידי לוחות צהובים ב- 3E ו- 3F. משולשים ירוקים מצביעים על תאים בעלי תווית DDX4; חצים אדומים מצביעים על תאים בעלי תווית SALL4. (H)מיקרוגרף אלקטרונים שידור מייצג (TEM) של צומת הדוק בין תאי Sertoli בתוך אורגנואיד; סרגל קנה מידה TEM = 100 נה"מ. (I– L) תמונות מייצגות הגדלה גבוהה של TLS המסויגות עבור תכונות עיקריות של האפיתל החצי-ניפרי, כולל צמתים הדוקים (ZO1) ולמינין. אותו TLS מתואר בקטעי רקמות סמוכים בלוחות I – L. כל דגימות הפלורסנט היו מוכתמים בשותף לדנ"א עם DAPI. התמונות נבחרו מתוך n = 7 ניסויים ביולוגיים נפרדים. נתון זה שונה מתוך אדמונדס ו-וודרוף37. © IOP. שוחזר ברשות. כל הזכויות שמורות לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: אורגנואידים מפרישים טסטוסטרון וhibin B מעל 12 שבועות של תרבות בתגובה gonadotropins FSH ו hCG.
מדיה מותנית שנאספו מתוך 3D-ECM-ללא אורגנואידים נמדד עבור טסטוסטרון וinhibin B באמצעות אנזים מקושר ים חיסונים (ELISA). (A)אורגנואידים היו תרבותיים במשך שנים עשר שבועות, עם תוספי FSH ו hCG במהלך שבועות 2 – 12 (תחילת תוספים מסומן עם חץ אדום על ציר x); כל הערכים הושוו ליום 7 של תרבות למבחנים סטטיסטיים. (ב)גרף מוגדל של "בדיקת גירוי מחדש" כדי לקבוע אם ההיענות האנדוקרינית נשמרה לאחר 12 שבועות. תקופת הבדיקה מתוארת על-ידי התיבה האפורה ב- 4A. בסיום 12 שבועות בתרבות, גונדוטרופינים הוסרו במשך 48 שעות ולאחר מכן בתוספת מחדש עבור 24 שעות אחרונות של תרבות. הורמונים נמדדו ב 0, 2, 6, 12, ו 24 שעות לאחר גירוי מחדש גונדוטרופין; אזורים מוצלים באדום מייעדים פרקי זמן במהלך תרבות עם FSH ו- hCG, אזורים לא מוצללים מייעדים פרקי זמן ללא FSH ו- hCG; ערכי p-הם יחסיים ל- 2 שעות לאחר גירוי מחדש. ANOVA דו-דרךית עם הבדיקה של ההשוואה המרובה של Tukey שימשה לקביעת משמעות עבור כל הנתונים האנדוקרינית, n = 5 ניסויים ביולוגיים נפרדים. נתון זה שונה מתוך אדמונדס ו-וודרוף37. © IOP. שוחזר ברשות. כל הזכויות שמורות לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם השלמת פרוטוקול זה דור אורגנואיד, המשתמש יהיו ארבע טכניקות תרבות שונות זמינות להם להרכבת מבנים אשכים אורגנואידים בסביבות ECM או ECM ללא. חשוב לציין, כל ארבע השיטות מאפשרות לחוקר להתבונן באופן לא פולשני בהרכבה עצמית של אורגנואידים לאורך זמן באמצעות הדמיית זמן או הקלטת וידאו, ולאסוף באופן לא פולשני מדיה מותנית לניתוח הורמונים וציטוקינות הפרשה, ללא רקמות מטרידות במהלך התרבות. בכל השיטות, במהלך 24 שעות, ניסוי יכול ליצור כמה מאות אורגנואידים / מבנים אשכים, כפי שמספרי תאים מאפשרים. שיטות אלה לקדם הרכבה עצמית רקמות לתוך מבנים בגדלים שונים מורפולוגיות; גודל אורגנואיד תלוי במספר התא וריכוז המשמשים בתרבות, כפי שניתן לראות בדיווחים אורגנואיד אחרים34. הפחתת גודל אורגנואיד או קוטר עשוי לעזור להפחית את ההתפתחות של אזורים פנימיים של נמק אשר לפעמים מציגים אורגנואידים גדולים יותר. כוח מסוים של 2D ECM ושיטות פרוטוקול ECM 3D ללא הם היכולת שלהם ליצור אורגנואידים אשכים mimetic מורפולוגי, המכיל מידר דה נובו של צינוריות לעומת סוגי תאים interstitial. יתר על כן, 3D ECM ללא אורגנואידים מורכבים לספק מודל עבור de novo tubulogenesis של TLS seminiferous, עם ממסחר כראוי מונחה Sertoli ותאים פריטובריים. זהו פנוטיפ חשוב לחקר אורגנואידים האשכים, והוא עדיין תוצאה משתנה בין דוחות אורגנואיד אשכים שונים; מספר דיווחים אחרים חסר צינור לעומת מידור interstitium וחלקם אפילו לפתח פנוטיפ "צינור מבפניםהחוצה" 32,33,34,38. בעוד אף אחת משיטות דור האורגנואידים שהוצגו בכתב היד הנוכחי התאפיינה כדי לשמור על אוכלוסיות תאי נבט גדולות לאורך ימים ממושכים של תרבות, כמו תאי נבט נצפו רק לעתים נדירות כבר 72 שעות, הן 2D ECM ושיטות 3D ECM ללא עשוי לספק כלי שימושי ללמוד במבחנה טובולוגנזה ורכיב התא סומטי של סביבת נישה spermatogonial. עם מטרה זו בראש, אורגנואידים האשכים לספק פלטפורמה פוטנציאלית למיטוב פרוטוקולים עתידיים כדי לשפר במבחנה נבט תחזוקת תאי גזע, התקדמות meiotic, בידול.
יתרון נוסף של פרוטוקולים אלה הוא היכולת להתאים אישית והיקף דור אורגנואיד. אוכלוסיות תאים מותאמות אישית, מטופלות בסמים או מהונדסות יכולות להחליף, או לשמש בנוסף לתאי אשך עכברראשיים 37. אם מתלים של תאים הם בעלי יכולת כדאיות נמוכה (<80 %), יש לנקוט בשיטות כדי לשפר את כדאיות התא של המתלים הסלולריים. אלה יכולים לכלול צמצום הזמן שהושקע במדיה דיסוציאציה ומזעור טריטורציה במהלך עיכול רקמות (שלבים 2.4.1 – 2.5.2), הגדלת מספר השטיפה לאחר הניתיקה, או הסרת תאים מתים לאחר דיסוציאציה עם ערכות תיוג תא או תא מת. עם זאת, אף אחד מהצעדים הללו לא היה הכרחי כדי להפיק את הנתונים המייצגים המשותפים בדוח זה. עבור שיטות תרבות ECM 2D ו 3D, פרוטוקולים אלה יכולים לשמש עם מטריצות ביו-חומריות מבוססות חלבון מבניות אחרות בנוסף לאלה המשמשות עבור המחקרים המוצגים כאן. חומרים ביולוגיים אחרים אלה כוללים קולגן, ג'לטין, תמציות ECM זמינות מסחרית, הידרוג'לים נגזרים ECM בהתאמה אישית25,26,28. יש כמה עצות עבור בעיות ירי ECM ג'ל חלוקת ויצירת באיכות גבוהה agarose 3D פטרי צלחת תוספות. בעת הטלת ג'לים ECM על צלחות תא, הקפד לעבוד במהירות ולהשתמש טיפים פיפטה קרה כדי למנוע פולימר מוקדם של ECM בתוך צינור או קצה פיפטה לפני חלוקת צלחת התרבות. בעת הטלת agarose מותך לתוך תבניות צלחת פטרי 3D (עבור תרבות 3D ECM ללא), להשתמש רק חם ולא חם agarose כדי להבטיח יציקה באיכות גבוהה של תוספות עם וריאציה מינימלית, ולבדוק כי agarose התקרר באופן מלא לטמפרטורת החדר ומוצק לפני שמנסה להסיר מהתבנית. מנות Agarose 3D Petri מטופלות בצורה הטובה ביותר בעדינות עם מפסים עדינים. בעת איסוף אורגנואידים עבור קיבעון, הקפד לעבוד תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לדמיין את האוסף של כל organoids. אורגנואידים יכולים להיצמד לצד הפלסטיק של מנות תרבות והאיברים הפנימיים של טיפים פיפטה; פיפטות זכוכית מפגינות פחות דבקות אורגנואידית מפלסטיק. תיקון אורגנואידים בעוד עדיין עטוף בתוך או על גבי ECM הוא תהליך מאתגר ועדין יותר מאשר הסרתם ECM לפני קיבעון. ג'ל עיבוד רקמות ניתן להטיל מעל מבנה ECM-organoid לפני ההסרה מתא התרבות כדי לעזור לחזק את הג'ל לפני קיבעון39. קיבעון צריך להתבצע בטמפרטורת החדר כדי לאחזר הידרוג'לים ECM כפי שהם צפויים de-polymerize אם הורידו ל 4 ° C. בנוסף, 0.1% - 1.0% גלוטראלדהייד ניתן להוסיף לפתרון 4 % PFA כדי לסייע בקישור צולב נוסף ECM; עם זאת, שיטה זו מגבירה את שפעת אוטומטית ברקע של המדגם.
קיימות מגבלות ניכרות ספציפיות לתא הנבט לתוצאות שהושגו על ידי שיטות דור אורגנואיד המוצגות לעיל, המייצגות תחומי עדיפות לחדשנות עתידית. תאי נבט נתמכים בצורה גרועה על פני תרבות מורחבת, נצפים בקלות רק בימים הראשונים של התרבות, הם נצפים לעתים נדירות עד סוף השבוע הראשון של התרבות ובנקודות זמן מאוחרות יותר. בעוד spermatogonia מוערך ניתן לשמור בתוך תרבות תא המבחנה תוך שמירה על יכולתם לשחזר spermatogenesis עם השתלה לתוך צינורות vivo40, microenvironment סומטי צינורית (כלומר, אינטראקציות תאי Sertoli ישיר) הוא שיער להיות תנאי מוקדם להבדיל תאי נבט טרום מיוטי לתוך ודרך meiosis ו spermiogenesisבמבחנה 1,5,,40,41. אורגנואידים אשכים המכילים spermatogonia בנקודות זמן מוקדמות בתוך TLS mimetic מבנית עשוי לאפשר את השדה ללמוד באופן לא פולשני סומטי-סומטי, ואינטראקציות תא נבט סומטי לחלוטין במבחנה. אופטימיזציה של תוספי מדיה והכנת תאים לפני התרבות (למשל, שילוב של סוכנים המשמשים לתרבות תאי גזע זרע חוץית)42, 43,43 עשוי להגדיל את התשואה של תאי נבט במחקרים עתידיים, במיוחד על פני תקופות תרבות יותר מכמה ימים. הפוך, שיטות להציג מחדש spermatogonia לאחר TLS נוצרו, כגון באמצעות microinjection, מהווים הזדמנות מעניינת לשחזר תאי נבט בתוך אורגנואידים, ולבדוק את היכולת של במבחנה מאורגן סביבות סומטיות כדי לשמור על תאי נבט. גורמים ביולוגיים אחרים נצפו להשפיע על תרבות explant vivo לשעבר, כולל גיל /בגרות 45 הבדלי רקע גנטי17. אותם משתנים טרם נחקרו ישירות בתחום הביולוגיה של אורגנואיד האשכים. עם זאת, סביר כי הרכבה שונה, מורפולוגיה, ופנוטיפים פונקציונליים עלולים לגרום כאשר אורגנואידים נוצרים מתאי מבודדים מבעלי חיים בגילאים שונים (כלומר, יילודים, ילדותיים, מבוגרים), או בעלי חיים בעלי רקע גנטי שונה (למשל, זנים שונים של העכבר).
לסיכום, הטכניקות המשותפות בכתב יד זה מספקות ארבעה מודלים שימושיים לחקר התא מונחה אשכים לבנות הרכבה עצמית, הדור של שני מודלים נפרדים מבנית פנטומימאתיים אשכים organoid, ואת ההישג החשוב של פיתוח TLS ותפקוד אנדוקרינית תגובתית הורמון במבחנה. דגמים אלה כוללים כיוונים מרחביים תלת-מיודיים וסביבות ECM עם מדיות תרבות מורכבות ומוגדרות לחלוטין. כל שיטה היא לשחזור מאוד ומשתמשת רק במשאבי תרבות זמינים בדרך כלל. שיטות אלה עשויות להוכיח יתרון ללימוד מורפוגנזה האשכים במבחנה ואופטימיזציה של תנאי תרבות עתידיים עבור זרע חוץ מבין. יותר מכך, שיטות 2D ECM ו 3D ECM ללא לספק כלי חדשני לחקר התהליך של מידול רקמת דה נובו ייחודי אשכים, במבחנה tubulogenesis, ואינטראקציות סומטיות-סומטיות-נבט-נבט. אורגנואידים אשכים מספקים הזדמנות גמישה ומדרגית לחקור את הפיתוח והרגולציה של סימני היכר פיזיולוגיים אשכים סומטיים; כולל מחסום בדיקות הדם וייצור אנדוקריני ותגובה; וגם, כלי שימושי לפיתוח מודלים של רקמת מחקר תרגום מהדור הבא. אלה כוללים שילוב הורמוני רבייה לתוך מודלים גדולים יותר ברמת המערכות, כגון רקמה על שבב ופלטפורמות מיקרופיזיולוגיות 45,46. מטרות תרגום אחרות שיום אחד עשויות להיות מיושמות על ידי אורגנואידים באשכים כוללות טוקסיקולוגיה של הרבייה ובדיקות מחסום חיסוני, פיתוח אמצעי מניעה גבריים וחדשנות טכנולוגית רבייה בסיוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) F31 HD089693, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה / המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 ו 4UH3ES029073-03, ואת הפרופסור לזכר תומאס J. Watkin.
המחברים רוצים להודות לאריק ו. רות' על עזרתם במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו עשתה שימוש במתקן BioCryo של מרכז NUANCE של אוניברסיטת נורת'ווסטרן, אשר קיבל תמיכה ממשאב ננוטכנולוגיה רכה והיברידית (SHyNE) משאבים (NSF ECCS-1542205); תוכנית MRSEC (NSF DMR-1720139) במרכז לחקר החומרים; המכון הבינלאומי לננוטכנולוגיה (IIN); ו מדינת אילינוי, דרך ה-IIN. הוא גם עשה שימוש בציוד CryoCluster, אשר קיבל תמיכה מתכנית MRI (NSF DMR-1229693). גרפיקה באות 1 תוכננה באמצעות BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
