Summary
Her beskrives fire metoder til generering af testikelorganoider fra primære neonatal murine testikelceller, dvs. Disse teknikker har flere forskningsapplikationer og er især nyttige til at studere testikeludvikling og fysiologi in vitro.
Abstract
Testikelorganoider giver et værktøj til at studere testikeludvikling, spermatogenese og endokrinologi in vitro. Der er udviklet flere metoder til at skabe testikelorganoider. Mange af disse metoder er afhængige af ekstracellulære matrix (ECM) for at fremme de novo vævssamling, men der er forskelle mellem metoder med hensyn til biomimetisk morfologi og vævs funktion. Desuden er der kun få direkte sammenligninger af offentliggjorte metoder. Her foretages en direkte sammenligning ved at studere forskelle i organoid generationsprotokoller, med forudsat resultater. Fire arketypiske generationsmetoder: (1) 2D ECM-fri, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-fri, og (4) 3D ECM kultur er beskrevet. Der blev anvendt tre primære benchmarks til vurdering af testikelorganoidproduktionen. Disse er cellulære selvsamling, inddragelse af større celletyper (Sertoli, Leydig, kim, og peritubular celler), og passende opdelt væv arkitektur. Af de fire testede miljøer genererede 2D ECM og 3D ECM-frie kulturer organoider med interne morfologier, der minder mest om indfødte testikler, herunder de novo compartmentalization af rørformede versus interstitielle celletyper, udvikling af tubullignende strukturer og en etableret langsigtet endokrine funktion. Alle undersøgte metoder udnyttede usorterede, primære murine testikelcellesuspensioner og anvendte almindeligt tilgængelige kulturressourcer. Disse testikelorganoide generationsteknikker udgør en meget tilgængelig og reproducerbar værktøjskasse til forskningsinitiativer inden for testikelorganogenese og fysiologi in vitro.
Introduction
Testikelorganoider er en banebrydende teknik til at studere testikeludvikling, spermatogenese og fysiologi in vitro1,,2,,3,4. Flere metoder er blevet undersøgt for organoid generation; disse omfatter en række ekstracellulære matrix (ECM) og ECM-fri kultur systemer, i både to-dimensionelle (2D) og tre-dimensionelle (3D) retninger. Forskellige generation metoder kan fremme forskellige cellulære samling strategier; dette resulterer i en høj grad af morfologisk og funktionel variation mellem offentliggjorte organoidmodeller. Formålet med denne artikel er at diskutere den aktuelle tilstand af in vitro testikelmodeller, og at tjene som en skabelon for fremtidige efterforskere, når designe testikel organoid eksperimenter. I denne undersøgelse defineres og karakteriseres fire forskellige kultursystemarktyper i forsøgsprocessen og det biologiske resultat. Herunder: 2D ECM-fri, 2D ECM, 3D ECM-fri og 3D ECM-kultur. Strategierne heri er beregnet til at være enkle, tilgængelige og meget reproducerbare mellem forskellige laboratorier og forskningsgrupper.
Historisk for testikerne, betegnelsen "in vitro", er blevet brugt til flere forskellige kultur metoder testikelvæv og celler. Disse omfatter organotypiske vævs-/organkulturmetoder (dvs. eksplantkultur)5, isoleret seminiferøs tubulekultur6, testikelcellekultur7og metoder til de novo tissue morfoogenese (dvs. biologiske konstruktioner og organoider)1. De første undersøgelser af in vitro spermatogenese blev udført omkring 100 år siden, med kulturen i kanin testis explants i 19208, og senere i 1937 med mus explants9. Inden for disse første forsøg spermatogoni blev observeret for stort set degenerere i hele den første uge af kulturen, selv om nogle meiotisk differentiere celler blev identificeret. Minder om disse historiske rapporter, testis explant kultur blev genoplivet og optimeret i 2011 at blive en mulig teknik til at studeretestikerne 10. Siden 2011 har explant kultur produceret fertilitet kompetente sædceller i flere rapporter11,12,13. Men på grund af explant kultur afhængighed af allerede eksisterende native testikler tubuli, disse seneste fremskridt er mere præcist beskrevet som eksempler på "ex vivo" testikelfunktion og spermatogenese, vævsfunktion, der blev opretholdt eller genoptaget ved fjernelse fra en organisme krop. På trods af sin udbredelse i litteraturen, langsigtede kim celle vedligeholdelse og differentiering inden testikel explants er udfordrende atreplikere 14,,15,,16,17,18, især over tidsrammer længe nok til fuldt ud at observere in vitro spermatogenese (~ 35 dage i mus19 og 74 hos mennesker20). Det er spændende at forstå, at mange af de samme udfordringer oplevet for 100 år siden, er stadig opleves inden for ex vivo spermatogenesis i dag.
Testikelorganoider, der adskiller sig fra ex vivo-tilgange, er de novo-forsamlede mikrotissu'er, der udelukkende genereres fra cellulære kilder (dvs. primære testikelceller). Testikelorganoider giver en kreativ strategi for at omgå feltets historiske afhængighed af allerede eksisterende indfødte væv, og at opsummere testikelbiologi helt in vitro. Der er flere krav deles af de fleste organoid væv modeller; disse omfatter (1) in vivo-mimetisk væv morfologi eller arkitektur, (2) flere større celletyper af det repræsenterede væv, (3) selvsamling eller selvorganisation i deres generation, og (4) evnen til at simulere en vis grad af det repræsenterede vævs funktion og fysiologi21,22,23,24. For testikler kan dette opfanges i fire hovedstempler: 1) medtagelse af større testikelcelletyper, kim, Sertoli, Leydig, peritubular og andre interstitielle celler, (2) celle-rettet vævssamling, (3) passende opdelte celletyper i separate rørformede rum (kim og Sertoli) og interstitielle regioner (alle andre celletyper) og (4) en vis grad af vævsfunktion (f.eks. reproduktionshortsekretion eller vævsreaktioner samt kimvedligeholdscelle og -differentiering). I betragtning af de historiske udfordringer i opretholdelsen af kimcelledifferentiering ex vivo og in vitro, rekapitulation af in vivo-mimetiske testikelarkitekturer (dvs. strukturer, der ligner seminiferøse tubuli) med yderligere markører, der tyder på simulering af testikelfysiologi (f.eks. endokrine funktion), er prioriterede milepæle i retning af at generere organoider, som en dag kan opretholde in vitro spermgeneatose.
De fleste offentliggjorte testikelorganoide metoder udnytter kommercielt tilgængelige ECM -produkter (f.eks. kollagen eller proprietære ECM-formuleringer)25,26,27 eller specialfremstillede ECM'er (dvs. decellulaliserede testikler ECM-afledte hydrogels)28,29,30. Eksogent ECM fremmer de novo vævsdannelse ved at levere et samlingsfremmende stillads til vævsgeneration. ECM-metoder har givet et imponerende niveau af vævsdannelse, herunder en vis kimcelletilstedeværelse og vævs-mimetisk morfologi25,28. De ECM'er, de anvender, er imidlertid ikke altid universelt tilgængelige (dvs. decellulære ECM-afledte hydrogels), og nogle metoder kræver avancerede gel- og cellesåningsretninger (f.eks. 3-lags gradienter af ECM- og 3D-print)25,31,32. Stilladsfri metoder (f.eks. hængende dråbe og ikke-vedhæftige dyrkningsplader)33,34,35 har også genereret robusteogmeget reproducerbare organoider uden behov for ECM-geler eller stilladser. Men væv morfologi af disse stillads-fri organoider er ofte ulig in vivo testikler, og de fleste af disse rapporter indeholder en biokemisk ECM tilsætningsstof til at fremme vævdannelse 33,34,36, eller alternativt, stole på centrifugering for tvungen celle aggregering og komprimering34, hvilket gør dem mindre ideelle til at studere celle-rettet migration og selvorganisering.
De fire organoid generation metoder præsenteret i dette manuskript omfatter både ECM-afhængige og uafhængige strategier, hver ved hjælp af simple celle såning, der gør det muligt at observation af celle-drevet organoid selvsamling. Alle fire teknikker kan udføres fra de samme celle suspensioner eller kan gøre brug af brugerdefinerede og celle-type beriget populationer. En styrke af disse metoder er evnen til at observere organoider selv-samle i realtid, og til direkte at sammenligne, hvordan testikelstrukturer selv-samle mellem forskellige kultur mikromiljøer. De fæotypiske forskelle mellem disse fire dyrkningsmetoder bør overvejes for deres indvirkning på investigators forskningsspørgsmål eller emne. Hver metode producerer biologiske konstruktioner eller organoider inden for 24 timer eller derunder. Afslutningsvis, de metoder, der præsenteres her giver en værktøjskasse af organoid samling teknikker til at studere testikel organoid samling, væv udvikling, og testikelfysiologi in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Northwestern University, og alle procedurer blev udført i henhold til IACUC-godkendte protokoller.
1. Udarbejdelse af enzymatiske vævsdesociationsopløsninger
- Brug to forskellige enzymatiske opløsninger (Løsning 1 og Løsning 2), begge fremstillet ved hjælp af en basalkultur medium opløsning (BM).
- For at forberede BM tilsættes serum og penicillin-streptomycin til minimum væsentlige medium til endelige koncentrationer på henholdsvis 10% og 1% (se Tabel over Materialer for specifikke reagenser). Sterilt filtrere bm gennem et 0,22 μm filter. Før brug med celler skal forækibrer steril BM til en neutral pH ved at dispensere i en dyrkningsskål og anbringe 5 % CO2-inkubator i en befugtet, 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C i mindst 1 time.
BEMÆRK: BM kan opbevares ved 4 °C i op til 1 uge, hvorefter der skal foretages frisk BM. - For at forberede kollagenase I lager opløsninger, først opløses 100 mg kollagen i 1 ml steril embryo grade H2O (endelig koncentration 10% m / v), invertere eller hvirvle til at opløse, og gemme 20 μL aliquots ved -20 °C til senere brug. Aliquots bør optøs kun én gang.
- For at forberede deoxyribonuclease I (DNase I) lageropløsninger tilsættes 20 mg DNase I i 1 ml steril embryokvalitet H2O (slutkoncentration 2% m/v), invertere eller hvirvle til opløsning (ikke vortex) og opbevares 20 μL aliquots ved -20 °C til senere brug. Aliquots bør optøs kun én gang.
- For hyaluronidase lageropløsninger tilsættes 30 mg i 1 ml sterilt fosfatbufferetal (PBS; slutkoncentration 3% m/v hyaluronidase i PBS indeholdende Ca++/Mg++),inverter eller hvirvler til opløsning, og opbevares 100 μL aliquots ved -20 °C til senere brug. Aliquots kan optøes og re-frosset flere gange uden tab af enzymatisk aktivitet.
- For at forberede dissociation Opløsning 1tilsættes 10 μL kollagenase I og 10 μL DNase I i 1 ml steril, præ-ækvilibreret BM (Slutkoncentrationer: 1 mg/ml kollagenase I og 5 μg/mL DNase I). Triturate forsigtigt med en pipette til at blande opløsningen, og forvard til 37 °C før brug med vævet.
BEMÆRK: Opløsning 2 fremstilles ved tilsætning af 33 μL hyaluronidase (på forankret til 37 °C) pr. 1 ml opløsning 1 (til en endelig koncentration på 1 mg/ml). Dette sker midtvejs gennem enzymatisk dissociation af testisvæv ved trin 2.5 nedenfor.
2. Testis vævssensensensesering
BEMÆRK: Alle mus blev anbragt i polypropylen bure og forsynet med mad og vand ad libitum. Dyr blev fodret bestrålet chow, som ikke indeholder fytoestrogener. Unge CD-1 mus, 5 dage post-partum (dpp), blev brugt til alle eksperimenter og bedøvet før dødshjælp og væv indsamling, inden for en anæstesi kammer knyttet til en isoflurane vaporizer (2,5 L / min i O2). Mus blev bekræftet for fuld anæstesi via fraværet af et svar på tå-prik, hvorefter mus blev aflivet via halshugning.
- Bedøve mus i en isoflurane kammer, sikre anæstesi via en tå-prik, og derefter halshugge musen ved hjælp af en skarp saks. Placer aflivede mus liggende på en dissektion mat og sterilisere maven med 70% ethanol. Telt huden på underlivet med snævler og åbne maven med en saks.
- Find testiklerne i nederste venstre og højre lyskelige områder af maven. Skær deres forbindelser til vas deferens og enhver forankring bindevæv, derefter løfte hele testiklerne (med epididymis stadig fastgjort) fra dyret. Sæt testiklerne i en petriskål af præ-ligevægtet BM.
- Under en dissektion mikroskop og inden for et sterilt felt, foretage et lille snit i tunica albuginea i den ene ende af hver testik med enten en lille microdissection saks eller ved at rive forsigtigt ved hjælp af to fine fakturer.
- Derefter, mens du holder testikerne fra den modsatte ende af snittet, forsigtigt klemme testikerne med fine scefæcein og skubbe i en blid fejende bevægelse mod hullet i tunica; dette vil frigive testikelvævet som ét sammenhængende stykke.
- Testiklerne skæres i mindre stykker (≤ 2 mm3) og de sættes i 1 ml forvarm (37 °C) dissociationsopløsning 1.
- Inkuberes ved 37 °C i 10 min.
- For mere end 10 testikler øges det samlede dissociationsopløsningsvolumen med 1 ml, hvilket sikrer mindst 1 ml dissociationsopløsning pr. 10 testikler (f.eks. 2 ml for 20 testikler, 3 ml til 30 testikler osv.).
- Triturere forsigtigt testisstykkerne 50 gange (50x) i opløsning 1 ved hjælp af en P1000-pipette. Sørg for, at tubuliene er adskilt fra hinanden og fra interstitielt væv på dette tidspunkt. Hvis klumper forbliver, inkuberes i yderligere 5 min og triturate igen (50x).
- Der tilsættes 33 μL hyaluronidase stock-opløsning (forvarmt ved 37 °C fra trin 1.5) pr. 1 ml opløsning 1 dissociationsblanding (indeholdende det delvist afslåede testikelvæv og tubuli). Efter tilføjelse hyaluronidase, kaldes dette løsning 2.
- Triturate (50x) ved hjælp af en P1000 og inkubere ved 37 °C i 5 min.
- Triturate (50x) ved hjælp af en P200 pipette.
- Sørg for, at der på dette tidspunkt ikke er synlige tubuli eller klumper af celler til stede. Hvis klumper fortsætter, inkuberes i op til 5 minutter mere, med yderligere trituration ved hjælp af en P200 pipette (50x).
- Afbryd dissociationsenzymerne ved at tilsætte føtalt kvægserum (FBS) til 10 % af det samlede volumen af opløsning 2. Triturate flere gange ved hjælp af en P200 pipette for at sikre, at der ikke er klumper tilbage, og filtrer gennem en 40 μm cellestien for at opnå en enkeltcellesuspension.
- Centrifugeceller ved 100 x g i 7 min. kasseres supernatanten og opslæmmes cellerne i frisk BM.
- Tæl de samlede og levedygtige cellekoncentrationer ved hjælp af trypan blå udelukkelse på et hæmocytometer. Der tilsættes 10 μL 1:1 fortyndet celleaffjedring: trypanblå opløsning i hæmocytometercelletællingskammeret (se Materialetabel).
- Centrifugeceller igen ved 100 x g i 7 min. og resuspenderet i frisk BM.
BEMÆRK: Brug kun levedygtige celler til beregning af cellekoncentration og -tal. Brug kun cellesuspensioner af ≥ 80% levedygtighed til generering af organoider. - Encellesuspensionen klargøres i cellekoncentrationer som beskrevet for at få 280.000 celler til at blive klar i betragtning af de mængder, der er anvendt i nedenstående protokolspecifikke trin i afsnit 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 celler/ml 2D ECM – 0,56 x 106 celler/ml, 3D ECM-Fri – 4,66 x 106 celler/ml, 3D ECM – 2,8 x 106 celler/ml.
BEMÆRK: Alle kultureksperimenter præsenteret her starter med 280.000 celler seedet pr kultur godt. Disse tal matches med de repræsentative data i figur 1, figur 2, figur 3 og figur 4.
- Centrifugeceller igen ved 100 x g i 7 min. og resuspenderet i frisk BM.
3. Udarbejdelse af organoidkulturretter og såning af celler
BEMÆRK: For at sikre en homogen ECM, pre-tø frosne aliquots af ECM natten før forsøg. ECM-aliquots skal nedsænkes i en spand is i et køleskab på 4 °C eller et kølerum for at sikre en langsom og gradvis temperaturstigning. Al ECM anvendes ved en 1:1 endelig fortynding i BM for kultur. Optøm eKG og 1:1 fortyndet ECM på is indtil umiddelbart før brug, ellers kan ECM polymerisere for tidligt.
- Til 2D ECM-fri kultur er der ikke behov for særlig forberedelse, pladesedecellesuspensioner (500 μL på 0,56 x 106 celler/ml i BM) direkte på 4- brøndkammerdias og placeres i en 35 °C inkubator til kultur.
BEMÆRK: Celler skal holde sig til bunden af kulturskålen inden for de første 24 timer af kulturen og kan udvise nogle små 3D-celleklynger inden for samme tid. - Til 2D ECM-kultur skal der dispenseres 100 μL kold 1:1 fortyndet ekstracellulær kældermatrixmed i et 4-brøndkammerslid, hvilket sikrer, at gelen dækker hele skålbunden.
- Kammerets rutsjebanen hældes i en 35 °C-inkubator i mindst 30 minutter, så ECM kan polymeriseres i en gel.
- Tilsæt cellesuspensionen (500 μL på 0,56 x 106 celler/ml i BM) direkte på toppen af 2D-gelen, når den har polymeriseret.
BEMÆRK: Celler skal klynge sammen for at danne små 3D-klynger inden for de første 24 timers kultur.
- Til 3D ECM-fri kultur skal du forberede agarose 3D Petri-skålindsatser, før cellekulturen startes.
- Først autoklave 1,5 g agarose pulver i en 100 ml bægerglas, derefter tilføje 75 ml steril, destilleret vand og mikrobølgeovn til at producere smeltet 2% agarose til 3D Petri fad støbning.
- Inden for en steril arbejdsplads, dispensere smeltet agarose i 3D Petri fad skimmel, indtil menisken er i niveau med siderne af formen.
- Lad agarose afkøle og størkne. Når fast, drej formen på hovedet og forsigtigt flex gentagne gange, indtil agarose 3D Petri parabol falder fri fra formen.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan man forberede mange agarose 3D petriskåle og opbevare dem i sterile H2O eller DPBS ved 4 °C i op mod en måned. - Før dyrkning, sted agarose 3D Petri retter i en 24 brønd kultur skål, og dække dem med 1 ml BM. 3D Petriskåle skal være ligevægt i BM i mindst 30 minutter inden for en 37 °C dyrkuvøse. BM kasseres, og equilibrationen gentages igen med 1 ml frisk BM. Efter ækvilibrering af 3D Petri retter i BM, vil de fremstå som den samme farve som BM (dvs. pink).
- For at forberede cellesåning fjernes al BM fra brønden og der dispenseres 200 μL frisk BM rundt, men ikke inde i 3D Petriskålens midterdybning. Også indsamle eventuelle resterende BM inde fra midten celle-seeding fordybning af microwell indsætte.
- Enkeltcellesuspensionen (4,66 celler/ml i 60 μL BM) afsender den i midten af agarose 3D Petriskålen. Triturere forsigtigt op og ned for at blande celler og garantere en enkelt celle suspension i starten af kulturen.
- I en befugtet 35 °C-inkubator til kultur. Den følgende dag fjernes 200 μL BM fra omkring mikrobrøndeindsatsen, og den udskiftes med 1 ml frisk BM. Dette vil bringe væskeniveauet over indsatsens plan og nedsænke hele kulturen.
- Fjern/tilsæt forsigtigt medier uden for agarose 3D Petriskålen. De organoider bør have komprimeret natten, så de kan hvile i bunden og gør det muligt for medierne ændringer til at forlade organoids uforstyrret.
- For 3D ECM-kultur skal en enkelt cellesuspension kombinere cellesuspensionen i BM i lige store dele med kold, fortøbt ECM (slutkoncentration = 2,8 x 106 celler/ml).
- Straks dispensere celle-ECM blandingen i en 4 godt kammer dias, sikre blandingen dækker hele bunden af pladen.
- Kammerets objektglas ved 35 °C i en kuvøse og lad dets indhold polymerisere. Dette bør tage mindst 30 min. Efter polymeriseringen tilsættes 500 μL BM på toppen af kulturen.
BEMÆRK: Celler skal have grupperet sig sammen for at danne små 3D-aggregater inden for de første 24 timer af kulturen.
4. Organoid vedligeholdelse
- Kultur alle organoid modeltyper ved 35 °C. For Alle kulturtyper udveksler halvdelen af deres medier med frisk BM hver 2. For at sikre, at organoider ikke ved et uheld indsamles under udveksling af medium, skal du altid indsamle medier langsomt fra et hjørne af kammeret slide parabol, og fra et eksternt punkt uden for agarose 3D Petri retter. Alle medier kan opbevares ved -20 °C til brug med immunassays eller andre analyser senere (dvs. kvantificering af udskilles reproduktive hormoner eller cytokiner).
- Efter 7 dage i kultur, bruge BM indeholder follikel stimulerende hormon (endelig koncentration 20 mIU/ml) og humane chorionon gonadotropin (endelig koncentration 4.5 IU/mL). Dette gælder for alle organoid kultur typer.
- Rutinemæssigt billede alle organoid kulturer (dvs. time-lapse billeddannelse) for at karakterisere organoid dannelse og kvantificere målinger af selv-samling, udvikling og vækst over tid.
5. Organoid Indsamling
BEMÆRK: Alle organoider kan fastgøres med 4% paraformaldehyd i PBS til downstream immunmærkning og histologiske analyser. Fastgør i 2 timer ved stuetemperatur med omdrejning eller natten over ved 4 °C.
- Til 2D ECM-frie kulturer skylles prøven først med frisk PBS, og der tilsættes derefter fiksativ direkte oven på de klæbede konstruktioner.
- For ECM-dyrkningsmetoder (2D og 3D) skylles én gang med PBS, og derefter enten tilsættes fiksering direkte på toppen af ECM-organoidprøven (for at fastgøre ECM-gelen og organoiderne sammen) eller alternativt forsigtigt pipette organoiderne op og ned for at frigøre dem fra det omgivende ECM, og overføres til et separat rør til fiksering.
- Til 3D ECM-fri kultur pipetters forsigtigt organoiderne op og ned i midterfordybningen af agarose 3D Petriskålen; dette vil skylle organoids ud lette deres nemme samling med en pipette. Overfør derefter organoider til et separat rør til fiksering.
- Før behandling til paraffin, indlejre mange organoider (≥ 20) inden for et lille volumen (~ 30 μL) af vævsbehandling gel; dette hjælper med at orientere og koncentrere organoider i et lille område inden for paraffinblokke, hvilket letter observationen ved sektionsafsnit og lettere visuel identifikation i paraffinsektioner.
BEMÆRK: Organoider kan være udfordrende at identificere efter paraffin indlejring og sektion på en mikrotom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoid generation blev anset for mislykket, hvis testikelceller ikke selv samles inden for 72 h af kultur, men alle metoder, der præsenteres her samles inden for 24 timer, når du bruger unge (5 dpp) murin celler. Svigt i den biologiske konstruktørproduktion, der præsenteres som en fortsættelse af frit suspenderede celler (0 h kolonne i figur 1) selv efter udvidet kultur (72 h). I mangel af selvopsamling af væv kan eventuelle synlige celleklynger let spredes til individuelle celler ved selv blid manipulation (dvs. pipettering). Vellykket genereret væv blev oprindeligt observeret som 3D-celle "klynger" (gule pile i 6 h kolonne af figur 1). Inden for ECM-fri miljøer (2D og 3D), disse konstruktioner synligt syntes at "kompakt" på tværs af de første 24 timer af kultur, især når i 3D agarose Petri retter (Figur 1A, C). I ECM-miljøer (2D og 3D) havde celleklynger klare margener mellem klyngen og deres omgivende miljø (figur 1B,D). Celleklynger blev også observeret for at migrere over ECM og sammen smelter sammen danner større klynger (røde pile i figur 1B). Den tid, der kræves for at forstå separate selvsamlede strukturer, blev målt, og der var ingen signifikant forskel i tid, der kræves mellem både 2D og 3D ECM-frie forhold og 2D ECM, men 3D ECM-kulturen krævede betydeligt mere tid til at samle de novo strukturer end alle andre kulturmetoder (Figur 1E). 2D ECM-fri og 3D ECM-kultur genererede celleklynger med betydeligt mindre størrelser end 2D ECM og 3D ECM-fri kulturmetoder; 3D ECM-fri kultur produceret de største klynger med en enkelt stor og kompakt klynge inden for hver brønd af 3D agarose Petri fad (Figur 1C, F). Sammenfattende viser disse data, hvor let det er at producere testikelbiologiske konstruktioner fra unge musecelleceller i fire arketypiske kulturmiljøer og fremhæver forskellige cellerettede samlingsfænotyper inden for disse forskellige kulturmiljøer.
Et mål for alle organoid modeller er at opsummere en indre morfologi mimetiske af indfødte væv. For at vurdere dette resultat blev biologiske konstruktioner samlet inden for hver kulturtilstand dyrket i 72 timer og derefter undersøgt for cellespecifikke markører og visualiseret med immunfluorescens (Figur 2). Variabilitet i vævsmorfologi blev observeret mellem forskellige dyrkningsmetoder. 2D ECM-frie organoider præsenteret som klynger af Sertoli celler (SOX9 og βCatenin) med nogle kimceller (DDX4, en pan kimcelle markør) klæbet oven på en 2D basal sammenløbslag indeholder mange somatiske celler, herunder Sertoli, peritubular (αSMA), og Leydig celler (3βHSD) Figur (2A-D). Bemærk, at figur 2B-D er epifluorescerende billeder af hele den 2D ECM-frie prøve, ikke en 5 μm sektion; dette muliggør visualisering af både det basale somatiske cellelag og de overlegent orienterede aggregater af Sertoli- og kimceller. I modsætning hertil blev 2D ECM-kultur præsenteret for en stort set anderledes fænotype, da klare biologiske strukturer med forskellige grænser let kunne skelnes oven på den basale ECM-gel (figur 2E). Disse strukturer havde en kompleks indre morfologi med de novo opdeling af tubulat vs interstitielle celletyper af testikler, og så blev anset for vellykkede organoider. Rørformede områder indeholdt sertoli-, peritubular- og kimceller, og interstitielle områder indeholdt Leydig, peritubularceller og celler, der ikke er mærket (Figur 2F-H). Tilsvarende 3D ECM-fri organoider også havde en opdelt indre morfologi og så blev anset for vellykket organoids. Især blev 3D ECM-frie organoider skelnet ved rørformede områder, der indeholder peritubularceller, der specifikt orienteret omkring grupper af sertoli- og kimceller med høj nøjagtighed (Figur 2I-L). 3D ECM samlede strukturer havde ikke en sofistikeret morfologi, men i stedet blev observeret for at være klynger af Sertoli celler, med lejlighedsvise kim og Leydig celler. I disse prøver forblev mange sertoli og umærkede celler suspenderet mellem organoider i en "stroma-lignende" orientering (Figur 2M-P). Tilsammen fremhæver disse data variabiliteten i morfologiske fænotyper, som forskellige organoidgenerationsmetoder producerer og understøtter brugen af to specifikke organoidsamlingsmiljøer, 2D ECM og 3D ECM-fri, til generering af testikelorganoider med en indre morfologi meget mimetisk testikelindrænkning.
For yderligere at vurdere testikelorganoidfunktion blev 3D ECM-fri samlede organoider udvalgt til en dybere langtidsanalyse. Til denne undersøgelse blev disse organoider dyrket i 14 dage og derefter undersøgt for celle- og strukturspecifikke markører. Efter immunfluorescerende analyse efter 14 dage blev 3D ECM-frie organoider observeret for at indeholde tubullignende strukturer (TLS) og en vævsarkitektur, der bemærkelsesværdigt ligner in vivo-testiklerne (Figur 3A-D). Interstitielle celler var passende placeret i separate områder fra TLS. Vævssektioner blev derefter undersøgt for pan kimcellemarkøren, DDX4, spermatogonial stamcellemarkør, SALL4 og meiosemarkør, SCP3 (Figur 3E-G). Sjældne DDX4-positive og SALL4-positive celler blev observeret, men, ingen SCP3 signal blev identificeret. Ved dybere karakterisering af TLS, blev de observeret til at indeholde en lumen-vises rum omgivet af polariserede Sertoli celler og en ekstern monolayer af peritubular celler (Figur 3I-L). Sertoli celler også udstillet stramme vejkryds mellem hinanden, som visualiseret med transmission elektron mikroskopi og med mærkning mod ZO-1, en junctional protein og komponent af blod-testis barriere (Figur 3H, L). Dernæst blev 3D ECM-fri organoider undersøgt for endokrine funktion i 12-ugers, langsigtet kultur med gonadotropin stimulation (Figur 4). Testosteron og inhibin B, reproduktive hormoner fra henholdsvis Leydig og Sertoli celler, blev både identificeret og kvantificeret fra organoid konditioneret medium (Figur 4A). Over 12-ugers kultur, begge hormoner blev målt til væsentligt at reagere på tilskud af gonadotropiner FSH og hCG (rød pil betegner begyndelsen af tilskud, i løbet af uge 2 – 12). Ved afslutningen blev der udført en test for at afgøre, om endokrine reaktionsevne blev bevaret. Gonadotropiner blev fjernet i 48 timer, hvor både testosteron og inhibin B koncentrationer signifikant faldt i koncentration. Efter 48 timer blev gonadotropiner returneret til kulturen, og begge hormonkoncentrationer steg betydeligt igen over de sidste 24 timer, hvilket viste korrekt endokrin-reaktionsevne (Figur 4B). Samlet set viser disse histologiske og endokrine analyseresultater, at testikelorganoider er en nyttig model til undersøgelse af testikeludvikling (dvs. de novo-segmentering og tubulogenese) og somatiske celletestialitetsfunktion in vitro (f.eks. tæt vejkrydsdannelse og endokrine funktion).
Figur 1: Organoider samler sig selv i 2D og 3D, ECM og ECM-fri kulturforhold.
5 dpp murine testikelceller blev dyrket under fire forskellige forhold: 2D ECM-fri (række A),2D ECM (række B),3D ECM-fri (række C)og 3D ECM (række D). Grafik, der viser kulturmetoden, findes i venstre kolonne. Repræsentative billedmontage blev samlet fra time-lapse billeder taget under live kultur. Tidspunkter for hvert billede er mærket i den øverste margen. Tid 0 h er før nogen organoid forsamling har fundet sted, tid 3 h er under igangværende celle-drevet organoid forsamling, og gange 6 h og 9 h demonstrere repræsentative, held dannet organoids. Gule pile markerer celleklynger, og røde pile markerer placeringer, hvor separate celleklynger overflyttede og flettes sammen. Alle skalastænger = 1 mm. (E) Den tid, der kræves, før separate celleklynger kunne værdsættes synligt, blev registreret for hver betingelse. 2DF = 2D ECM-fri; 2DE = 2D ECM; 3DF = 3D ECM-fri; 3DE = 3D ECM. (F)Arealet pr. klynge blev målt for hver kulturtilstand. Billeder blev udvalgt fra n= 3 – 5 separate eksperimenter. Envejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligningstest blev brugt til at bestemme betydningen i 1E og 1F; grafer blev samlet ved hjælp af n = 4 separate eksperimenter. Dette tal er blevet ændret fra Edmonds og Woodruff37. © IOP Publishing. Gengivet med tilladelse. Alle rettigheder forbeholdes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: 2D ECM og 3D ECM-fri dyrkede organoider udviser opdeling af rørformede og interstitielle celletyper.
Repræsentative brightfield og immunofluorescerende billeder af selvsamlede organoider efter 72 timers kultur. 2D ECM-fri prøver blev afbildet hele mount, alle andre prøver blev afbildet i 5 μm væv sektioner. A– D) 2D ECM-fri kultur. (E – H) 2D ECM kultur. 3DECM-fri kultur. (M – P) 3D ECM kultur. Cellespecifikke markører, der anvendes til analyse, er mærket på topmarginen: Sertolicellekerner (SOX9) og cellestoffer (βCatenin), kimceller (DDX4, en pan kimcellemarkør), Leydig-celler (3βHSD) og peritutrceller (αSMA). Alle fluorescerende prøver blev co-plettet for DNA med DAPI. Gule pile peger på DDX4-markerede kimceller i den anden kolonne fra venstre, røde pile peger på Sertoli-celleklynger i højre to kolonner. Lyse feltskalastænger = 400 μm, fluorescerende skalastænger = 100 μm. Dette tal er blevet ændret fra Edmonds og Woodruff37. © IOP Publishing. Gengivet med tilladelse. Alle rettigheder forbeholdes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Organoider udvikler tubuli-lignende strukturer befolket af sjældne kønsceller.
3D-ECM-fri samlede organoider blev dyrket i 14 dage. (A-D) Repræsentative H & E og immunofluorescerende billeder beskriver celletyper og væv funktioner omkring tubul-lignende strukturer (TLS); det samme organoid er afbildet i tilstødende vævssektioner, der muliggør sammenligning side om side af morfologiske egenskaber: Leydig-celler (3βHSD), peritubularceller (αSMA), Sertolicellestoffer (βCatenin), kollagenmembran (COL IV) og Sertolicellekerne (SOX9); skalastænger = 100 μm. (E – G) Immunofluorescerende mærkning blev udført mod kimceller, herunder en pan kimcellemarkør (DDX4), spermatogonial stamcellemarkør (SALL4) og meiotisk aktive spermatocytter (SCP3). Stærkt forstørrede indlæg er skitseret af gule paneler i 3E og 3F. Grønne trekanter peger på DDX4-mærkede celler. Røde pile peger på celler med SALL4-mærkater. H)Repræsentativ transmissionseleknmikrograf (TEM) af et tæt kryds mellem Sertoli-celler i et organoid TEM skala bar = 100 nm. (I - L) Høj forstørrelse repræsentative billeder af en TLS mærket for centrale funktioner i seminiferous epitel, herunder stramme vejkryds (ZO1) og laminin. Den samme TLS er afbildet i tilstødende væv sektioner i paneler I - L. Alle fluorescerende prøver blev co-plettet for DNA med DAPI. Billeder blev udvalgt fra n = 7 separate biologiske eksperimenter. Dette tal er blevet ændret fra Edmonds og Woodruff37. © IOP Publishing. Gengivet med tilladelse. Alle rettigheder forbeholdes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Organoider udskiller testosteron og inhibin B over 12-ugers kultur som reaktion på gonadotropiner FSH og hCG.
Betingede medier indsamlet fra 3D-ECM-fri organoider blev målt for testosteron og inhibin B via enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA). (A) Organoids blev dyrket i tolv uger, med FSH og hCG tilskud i uge 2 til 12 (begyndelsen af tilskud er markeret med en rød pil på x-aksen); alle værdier blev sammenlignet med kulturdag 7 for statistiske test. (B) Forstørret graf over en "re-stimulation test" for at afgøre, om endokrine reaktionsevne blev bevaret efter 12 uger. Testens periode er beskrevet af den grå boks i 4A. Ved afslutningen af 12-ugers kultur, gonadotropiner blev fjernet i 48 h og derefter re-suppleret til en endelig 24 h kultur. Hormoner blev målt ved 0, 2, 6, 12, og 24 h efter gonadotropin re-stimulation; rødskydede områder betegner perioder under kultur med FSH og hCG, ikke-skraverede områder, der betegner tidsperioder uden FSH og hCG p-værdier er i forhold til 2 timer efter genstimulering. Tovejs ANOVA med Tukey's multisammenligningstest blev brugt til at bestemme betydningen for alle endokrine data, n=5 separate biologiske eksperimenter. Dette tal er blevet ændret fra Edmonds og Woodruff37. © IOP Publishing. Gengivet med tilladelse. Alle rettigheder forbeholdes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med færdiggørelsen af denne organoid generation protokol, vil brugeren have fire forskellige kultur teknikker til rådighed for dem til montering af testikelkonstruktioner og organoider i enten ECM eller ECM-fri miljøer. Vigtigere er det, at alle fire metoder gør det muligt for forskeren at ikke-invasivt observere organoid selvsamling over tid gennem time-lapse-billeddannelse eller videooptagelse, og at ikke-invasivt indsamler betinget medier til analyse af hemmelige hormoner og cytokiner uden at forstyrre væv under kulturen. I alle metoder, i løbet af 24 timer, kan en eksperimentator generere så mange som flere hundrede organoider / testikelkonstruktioner, som celletal tillader. Disse metoder fremme væv selv-samling i konstruktioner med forskellige størrelser og morfologier; organoidstørrelse afhænger af det cellenummer og den koncentration, der anvendes i kulturen, som det ses i andre organoidrapporter34. Reduktion af organoid størrelse eller diameter kan bidrage til at reducere udviklingen af indre regioner af nekrose, som undertiden er gaver i større organoids. En særlig styrke af 2D ECM og 3D ECM-fri protokol metoder er deres evne til at generere morfologisk mimetiske testikelorganoider, der indeholder de novo segmentering af rørformede versus interstitielle celletyper. Desuden giver 3D ECM-fri samlede organoider en model for de novo tubulogenese af seminiferous TLS, med passende opdelte og orienterede Sertoli og peritubular celler. Dette er en vigtig fænotype til undersøgelse af testikelorganoider, og er stadig et varierende resultat blandt forskellige testikel organoid rapporter; flere andre rapporter mangler tubule versus interstitium segmentering og nogle endda udvikle en "inside-out tubule" fænotype32,,33,,34,38. Mens ingen af de organoidgenerationsmetoder, der præsenteres i det nuværende manuskript, var karakteriseret til at opretholde store kimcellepopulationer over længere kulturdage, da kimceller sjældent blev observeret så tidligt som 72 timer, kan både 2D ECM- og 3D ECM-frie metoder være et nyttigt redskab til at studere in vitro-tubulogenese og den somatiske cellekomponent i et spermatogonialt nichemiljø. Med dette mål for øje, testikel organoider giver en potentiel platform for optimering af fremtidige protokoller til at forbedre in vitro kønscelle vedligeholdelse, meiotisk progression, og differentiering.
En anden fordel ved disse protokoller er evnen til at tilpasse og skala organoid generation. Tilpassede, lægemiddelbehandlede eller manipulerede cellepopulationer kan erstatte eller bruges som supplement til primære musetestikelceller37. Hvis cellesuspensioner er af lav levedygtighed (<80 %), bør der tages metoder til at forbedre cellesus levedygtigheden af cellesuspensionen. Disse kan omfatte at reducere den tid, der bruges i dissociation medier og minimere trituration under vævsfordøjelse (trin 2.4.1 til 2.5.2), øge antallet af vaske efter dissociation, eller fjerne døde celler efter dissociation med cellesortering eller døde celler mærkning kits. Ingen af disse trin var imidlertid nødvendige for at frembringe de repræsentative data, der blev delt i denne rapport. For 2D- og 3D ECM-dyrkningsmetoder kan disse protokoller anvendes sammen med andre strukturelle proteinbaserede biomaterialer og matricer ud over dem, der anvendes til de undersøgelser, der præsenteres her. Disse andre biomaterialer omfatter kollagen, gelatine, kommercielt tilgængelige ECM ekstrakter, og skræddersyede decellulære ECM-afledte hydrogels25,26,28. Der er et par tips til at optage problemer med ECM-geludfriskning og skabe agarose 3D Petri-skær af høj kvalitet. Når du støber ECM-geler på kammerplader, skal du sørge for at arbejde hurtigt og bruge kolde pipettespidser for at forhindre for tidlig polymerisering af ECM i et rør eller en pipettespids, før du dispenserer i kulturskålen. Når støbning smeltet agarose i 3D Petri fad forme (for 3D ECM-fri kultur), kun bruge varme og ikke varm agarose for at sikre høj kvalitet støbning af skær med minimal variation, og kontrollere, at agarose er fuldt afkølet til stuetemperatur og størknet før du forsøger at fjerne fra formen. Agarose 3D petriskåle håndteres bedst med fine berænsk. Når du indsamler organoids til fiksering, skal du sørge for at arbejde under en dissektion mikroskop til at visualisere indsamling af alle organoider. Organoids kan holde sig til plast side af kultur retter og indersiden af pipette tips; glaspipetter udviser mindre organoid klæbende end plast. Fastsættelse organoids mens du stadig indkapslet i eller på toppen af ECM er en mere udfordrende og delikat proces end at fjerne dem fra ECM før fiksering. Vævsbehandling gel kan kastes over ECM-organoid konstruktion før fjernelse fra kulturkammeret til at hjælpe med at styrke gelen før fiksering39. Fiksering bør udføres ved stuetemperatur for at hente ECM hydrogels, da de sandsynligvis vil af polymerisere, hvis de sænkes til 4 °C. Derudover kan der tilsættes 0,1 % - 1,0 % glutaraldehyd til PFA-opløsningen på 4 % for yderligere at krydse LED i ECM. Denne metode øger dog prøvens baggrundssynelige 100%.
Der er betydelige kønsspecifikke begrænsninger i de resultater, der opnås med de organoidgenereringsmetoder, der er beskrevet ovenfor, og som udgør prioriterede områder for fremtidig innovation. Kimceller er dårligt understøttet over udvidet kultur, er kun let observeres i løbet af de første par dage af kultur og er sjældent observeret ved udgangen af den første uge af kultur og på senere tidspunkt punkter. Mens udifferentieret spermatogoni kan opretholdes inden for in vitro cellekultur og samtidig bevare deres evne til at genoprette spermatogenese ved transplantation i in vivo tubuli40, den tubulasatiske mikromiljø (dvs. direkte Sertoli celle interaktioner) er en hypotese at være en forudsætning for at differentiere præ-meiotiske kønsceller i og gennem meiose og spermiogenese in vitro1,5,40,41. Testikelorganoider, der indeholder spermatogoni på tidlige tidssteder inden for en strukturelt mimetisk TLS kan gøre det muligt for feltet at ikke-invasivt undersøgelse somatiske-somatiske, og somatiske-kim celle interaktioner helt in vitro. Optimering af medietilsætningsstoffer og cellepræparater før kultur (f.eks. inkorporering af agenser, der anvendes til in vitro spermatogonial stamcellekultur)42,43 kanøge udbyttet af kimceller i fremtidige undersøgelser, især over kulturperioder på mere end flere dage. Omvendt, metoder til at genindføre spermatogoni efter TLS har dannet, såsom gennem mikroinjektion, udgør en interessant mulighed for at genoprette kimceller i organoider, og teste evnen til in vitro organiseret somatiske miljøer til at opretholde kimceller. Andre biologiske faktorer er blevet observeret for at påvirke ex vivo explant kultur, herunder alder / modenhed45 og genetiske baggrund forskelle17. De samme variabler er endnu ikke direkte undersøgt inden for testikelorganoid biologi. Det er dog sandsynligt, at der kan opstå forskellige samlings-, morfologi- og funktionelle fænotyper, når der dannes organoider fra celler, der er isoleret fra dyr, der er forskellige år (dvs. neonatal, ungfisk, voksen) eller dyr med varierende genetisk baggrund (f.eks. forskellige musestammer).
Sammenfattende giver de teknikker, der deles i dette manuskript, fire nyttige modeller til at studere celledrevet testikelkonstruktion selvsamling, generering af to separate strukturelt mimetiske testikelorganoidmodeller og det vigtige resultat af TLS-udvikling og hormonresponsiv endokrine funktion in vitro. Disse modeller omfatter 2D- og 3D-rumlige orienteringer i ECM- og ECM-miljøer med minimalt komplekse, helt definerede kulturmedier. Hver metode er meget reproducerbar og bruger kun almindeligt tilgængelige kulturressourcer. Disse metoder kan vise sig at være en fordel for at studere testikretsegens in vitro og optimere fremtidige kulturbetingelser for in vitro spermatogenese. Mere så, 2D ECM og 3D ECM-fri metoder giver et nyt værktøj til at studere processen med de novo væv compartmentalisering unikke for testikler, in vitro tubulogenese, og somatiske-somatiske og somatiske-kim celle interaktioner. Testikelorganoider giver en fleksibel og skalerbar mulighed for at undersøge udviklingen og reguleringen af somatiske testikelfysiologiske kendetegn; herunder blodtestisbarrieren og endokrine produktion og reaktion og også et nyttigt redskab til udvikling af næste generations translationelle forskningsvævsmodeller. Disse omfatter indarbejde reproduktive hormoner i større systemer-niveau modeller, såsom væv-on-a-CHIP og mikro-fysiologiske platforme45,46. Andre translationelle mål, som testikelorganoider en dag kan anvendes hen imod, omfatter reproduktionstoksikologi og immunologisk barrieretest, udvikling af mandlige præventionsmidler og assisteret innovation inden for reproduktiv teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 og 4UH3ES029073-03 og Thomas J. Watkins memorial professorat.
Forfatterne vil gerne takke Eric W. Roth for deres hjælp med transmission elektron mikroskopi. Dette arbejde gjorde brug af BioCryo facilitet Northwestern University's NUANCE Center, som har modtaget støtte fra Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); MRSEC-programmet (NSF DMR-1720139) på Materials Research Center; Det Internationale Institut for Nanoteknologi (IIN) og staten Illinois, gennem IIN. Det gjorde også brug af CryoCluster udstyr, som har modtaget støtte fra MR-programmet (NSF DMR-1229693). Grafikken i figur 1 er designet ved hjælp af BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
