Summary
Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.
Abstract
Testis organoidleri in vitro testis gelişimi, spermatogenez ve endokrinolojiyi incelemek için bir araç sağlar. Testis organoidleri oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çoğu de novo doku montajını teşvik etmek için hücre dışı matriks (ECM) güveniyor, ancak, biyomimetik morfolojisi ve dokuların fonksiyonu açısından yöntemler arasında farklılıklar vardır. Ayrıca, yayınlanan yöntemlerin birkaç doğrudan karşılaştırmalar vardır. Burada organoid üretim protokollerinde sağlanan sonuçlarla ilgili farklılıklar incelenerek doğrudan bir karşılaştırma yapılır. Dört arketipik nesil yöntemi: (1) 2D ECM'siz, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM'siz ve (4) 3D ECM kültürü tanımlanmıştır. Testis organoid neslini değerlendirmek için üç ana kriter kullanıldı. Bunlar hücresel öz-montaj, büyük hücre tiplerinin dahil edilmesi (Sertoli, Leydig, mikrop ve peritubüler hücreler) ve uygun şekilde bölümlere ayrılmış doku mimarisidir. Test edilen dört ortamdan 2D ECM ve 3D ECM'siz kültürler, tübüler ve interstisyel hücre tiplerinin de novo kompartmanlaşması, tübüle benzeri yapıların geliştirilmesi ve uzun süreli endokrin fonksiyon dahil olmak üzere iç morfolojilere sahip organoidler üretti. İncelenen tüm yöntemlerde sıralanmamış, primer murine testis hücre süspansiyonları kullanılmıştır ve yaygın olarak erişilebilir kültür kaynakları kullanılmıştır. Bu testis organoid oluşturma teknikleri, testis organogenezi ve in vitro fizyolojisi araştırma girişimleri için son derece erişilebilir ve tekrarlanabilir bir araç seti sağlar.
Introduction
Testis organoidleri testis gelişimi, spermatogenez ve in vitro1,2,,3,,4fizyolojisi üzerinde çalışmak için öncü bir tekniktir. Organoid nesil için çeşitli yöntemler araştırılmıştır; bunlar, hem iki boyutlu (2B) hem de üç boyutlu (3D) oryantasyonlarda çeşitli hücre dışı matris (ECM) ve ECM içermeyen kültür sistemlerini içerir. Farklı nesil yöntemleri farklı hücresel montaj stratejileri teşvik edebilir; bu da yayınlanmış organoid modeller arasında yüksek düzeyde morfolojik ve fonksiyonel değişkenlik ile sonuçlanır. Bu makalenin amacı in vitro testis modellerinin mevcut durumunu tartışmak ve testis organoid deneylertasarlarken, gelecekteki araştırmacılar için bir şablon olarak hizmet etmektir. Bu çalışmada, deneysel süreç ve biyolojik sonuç olarak dört farklı kültür sistemi arketipi tanımlanmış ve karakterize edilse de. Bunlar: 2D ECM'siz, 2D ECM, 3D ECM-Free ve 3D ECM kültür yöntemleri. Burada sunulan stratejilerin farklı laboratuvarlar ve araştırma grupları arasında basit, erişilebilir ve son derece tekrarlanabilir olması amaçlanmıştır.
Tarihsel testisler için, "in vitro" adı, testis dokuları ve hücrelerinin birkaç farklı kültür yöntemleri için kullanılmıştır. Bunlar arasında organotipik doku/organ kültürü yöntemleri (örn. eksplant kültürü)5,izole seminiferous tübül kültürü6, testis hücre kültürü7, de novo doku morfogenezi (yani, biyolojik yapılar ve organoidler)1. In vitro spermatogenez ile ilgili ilk araştırmalar yaklaşık 100 yıl önce, tavşan testis explants kültürü ile 19208, ve daha sonra 1937 yılında fare eksplants9ile yapılmıştır . Bu ilk deneylerde spermatogonia'nın kültürün ilk haftasında büyük ölçüde dejenere olduğu gözlenmiştir, ancak bazı meiotically ayırıcı hücreler tanımlanmıştır. Bu tarihsel raporları hatırlatan testis explant kültürü 2011 yılında yeniden canlandırıldı ve testis10'unincelenmesi için uygun bir teknik haline getirilmiş ve optimize edilebilmektedir. 2011 yılından bu yana, eksplant kültürü birden fazla rapor11,12,,13doğurganlık yetkili sperm üretti. Ancak, explant kültürünün önceden var olan yerli testis tübüllerine olan güveni nedeniyle, bu son gelişmeler daha doğru bir şekilde "ex vivo" testiküler fonksiyon ve spermatogenez, bir organizmanın vücudundan çıkarıldıktan sonra sürdürülen veya sürdürülen doku fonksiyonunun örnekleri olarak tanımlanır. Literatürde yaygınlığına rağmen, testis ekseksilerde uzun süreli germ hücre bakımı ve farklılaşması14, 15,,1616,17,18, özellikle in vitro spermatogenezi tam olarak gözlemlemek için yeterince uzun zaman dilimleri nde (~35 gün farelerde19 ve 74 insanlarda20)çoğaltmak zordur. Bu 100 yıl önce yaşanan aynı zorlukların çoğu, hala ex vivo spermatogenesis bugün içinde deneyimli olduğunu takdir etmek ilginçtir.
Ex vivo yaklaşımlardan farklı olarak, testis organoidleri hücresel kaynaklardan (yani primer testis hücrelerinden) tamamen in vitro olarak üretilen de novo birleştirilmiş mikrodokulardır. Testis organoidleri, alanın önceden var olan doğal dokuya olan tarihsel güvenini aşmak ve testis biyolojisini tamamen in vitro olarak yeniden özetlemek için yaratıcı bir strateji sağlar. Çoğu organoid doku modeli tarafından paylaşılan birden fazla gereksinim vardır; bunlar arasında (1) in vivo-mimetik doku morfolojisi veya mimarisi, (2) temsil edilen dokunun birden fazla ana hücre tipi, (3) kendi kuşağında kendi kendini birleştirme veya kendi kendine örgütlenme, ve (4) temsil edilen dokunun fonksiyonu ve fizyolojisinin bir kısmını simüle etme yeteneği21,22,23 ,23,24. Testisler için, bu dört ana işaretle yakalanabilir: (1) majör testis hücre tiplerinin dahil edilmesi, mikrop, Sertoli, Leydig, peritubular ve diğer interstisyel hücreler, (2) hücre yönelimli doku montajı, (3) uygun şekilde bölümlere ayrılmış hücre tipleri ayrı tübüler bölmelere (mikrop ve Sertoli) ve interstisyel bölgelere (diğer tüm hücre tipleri) ve (4) bir derecedoku fonksiyonu (örneğin, üreme hormonu salgılanması veya doku yanıtları ve germ bakım hücre ve selamiasyon). Germ hücre farklılaşması ex vivo ve in vitro bakımında tarihsel zorluklar göz önüne alındığında, in vivo-mimetik testis mimarileri recapitulation (yani, seminiferous tübüller benzeyen yapılar) testis fizyolojisi simülasyonu öneren ek belirteçleri ile (örneğin, endokrin fonksiyon), bir gün vitrospermatoto sürdürmek olabilir organoidler üreten doğru öncelikli kilometre taşlarıdır.
Yayınlanan testis organoid yöntemlerin çoğunluğu ticari olarak kullanılabilir ECM yararlanmak (örneğin, kollajen veya tescilli ECM formülasyonları)25,26,27 veya özel kaynaklı EMI'ler (yani, hücreli testis ECM kaynaklı hidrojeller)28,29,30. Eksojen ECM doku üretimi için montaj destekleyici iskele sağlayarak de novo doku oluşumunu teşvik eder. ECM yöntemleri doku oluşumu etkileyici bir düzeyde, bazı germ hücre varlığı ve doku-mimetikmorfolojisi 25,,28dahil olmak üzere göze almış. Ancak, kullandıkları EkM'ler her zaman evrensel olarak mevcut değildir (örneğin, hücredışı ECM kaynaklı hidrojeller) ve bazı yöntemler sofistike jel ve hücre tohumlama oryantasyonları gerektirir (örneğin, ECM ve 3D baskı 3 katmanlı degradeler)25,31,32. İskele içermeyen yöntemler (örneğin, asma damla ve yapışmaz kültür plakaları)33,34,35 de ECM jelleri veya iskeleler gerek kalmadan sağlam ve son derece tekrarlanabilir organoidler üretti. Ancak, bu iskele içermeyen organoidlerin doku morfolojisi genellikle in vivo testisler farklı, ve bu raporların çoğu doku oluşumunu teşvik etmek için bir biyokimyasal ECM katkı dahil33,34,36, ya da alternatif olarak, zorla hücre toplama ve sıkıştırma için santrifüj güveniyor34, onları hücre yönelimli göç ve kendi kendine organizasyon eğitimi için daha az ideal hale.
Bu el yazmasında sunulan dört organoid üretim yöntemi, her biri hücre güdümlü organoid öz montajın gözlemlenmesini sağlayan basit hücre tohumlamalarını kullanan, Hem ECM'ye bağlı hem de bağımsız stratejileri içermektedir. Dört teknik de aynı hücre süspansiyonlarından gerçekleştirilebilir veya özel ve hücre tipi zenginleştirilmiş popülasyonlardan yararlanabilir. Bu yöntemlerin bir gücü organoidlerin gerçek zamanlı olarak kendi kendine biraraya gelip testis yapılarının farklı kültür mikroortamları arasında nasıl biraraya getirildiğini doğrudan karşılaştırma yeteneğidir. Bu dört kültür yöntemi arasındaki phenotipik farklılıklar araştırma sorusu veya araştırmacının konusu üzerindeki etkileri açısından göz önünde bulundurulmalıdır. Her yöntem 24 saat veya daha az içinde biyolojik yapılar veya organoidler üretir. Sonuç olarak, burada sunulan yöntemler, testis organoid montaj, doku gelişimi ve testis fizyolojisi in vitro incelenmesi için organoid montaj teknikleri bir araç seti sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare deneyleri Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve tüm prosedürler IACUC onaylı protokoller altında gerçekleştirildi.
1. Enzimatik doku-dissosiyasyon çözeltilerinin hazırlanması
- Her ikisi de bazal kültür orta çözeltisi (BM) kullanılarak yapılan iki farklı enzimatik çözüm (Çözüm 1 ve Çözüm 2) kullanın.
- BM hazırlamak için serum ve penisilin-streptomisini sırasıyla %10 ve %1'lik son konsantrasyonlara en az gerekli ortama ekleyin (bkz. belirli reaktifler için Malzemeler Tablosu). Daha sonra BM'yi 0,22 μm'lik bir filtreden filtreleyin. Hücrelerle kullanmadan önce, steril BM'yi bir kültür yemeğine dağıtarak ve 37 °C'de en az 1 saat nemlendirilmiş, %5 CO2 kuluçka makinesinin içine yerleştirerek nötr bir pH'ya önceden dengeleyin.
NOT: BM 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir ve daha sonra taze BM yapılmalıdır. - Kollajenaz i stok çözeltileri hazırlamak için, ilk olarak 100 mg kollajenaz I'ı steril embriyo sınıfı H2O 'nun 1 mL'sine (son konsantrasyon %10 m/v) eritin, erimek için ters çevirin veya girdaplayın ve daha sonra kullanım için -20 °C'de 20°L aliquots saklayın. Aliquots sadece bir kez çözülmelidir.
- Deoksiribonükle azm (DNase I) stok çözeltileri hazırlamak için, steril embriyo sınıfı H2O 'nun 1 mL'sine 20 mg DNase I ekleyin (son konsantrasyon %2 m/v), erimek için ters çevirin veya girdap (girdap etmeyin) ve daha sonra kullanım için -20 °C'de 20°L aliquots saklayın. Aliquots sadece bir kez çözülmelidir.
- Hyaluronidase stok çözeltileri için, 30 mg içine 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS; son konsantrasyon% 3 m / v hyaluronidase PBS ca++/ Mg++), ters veya girdap eritmek için ve saklamak içine -20 ° C daha sonra kullanmak için. Aliquots çözülmüş ve enzimatik aktivite kaybı olmadan birkaç kez yeniden dondurulmuş olabilir.
- Dissosiasyon Solüsyonu 1'ihazırlamak için 10 l kollajenaz I ve 10 μL DNase I'i 1 mL steril, önceden dengelenmiş BM'ye ekleyin (Son konsantrasyonlar: 1 mg/mL kollajenaz I ve 5 μg/mL DNase I). Çözeltiyi karıştırmak için bir pipetle hafifçe triturate ve doku ile kullanmadan önce 37 °C önceden ısıtın.
NOT: Çözelti 2, 1 mL çözeltisi 1 mL başına 33 μL hyaluronidaz (önceden ısıtılmış 37 °C) eklenerek hazırlanır (1 mg/mL'lik son konsantrasyona). Bu adım 2.5 aşağıda testis dokusunun enzimatik dissociation yoluyla orta yol oluşur.
2. Testis doku dissociasyonu
NOT: Tüm fareler polipropilen kafesler içinde bulunan ve gıda ve su reklam libitum ile sağlanmıştır. Hayvanlar fitoöstrojen içermeyen ışınlanmış chow beslendi. Juvenil CD-1 fareler, 5 gün post-partum (dpp), tüm deneyler için kullanıldı ve ötanazi ve doku toplama öncesinde anestezi, bir izofluran buharlaştırıcı bağlı bir anestezi odası içinde (O22 L/dk). Fareler, parmak dikeni yanıtı yokluğunda tam anestezi için doğrulandı, daha sonra fareler decapitation yoluyla ötenazi edildi.
- Bir izofluran e-posta odasında fareler anestezi, bir parmak dikeni ile anestezi sağlamak ve sonra keskin bir makas kullanarak fare nin kafasını kesmek. Bir diseksiyon mat üzerinde ötenazi fare supine yerleştirin ve% 70 etanol ile karın sterilize. Forceps ile alt karın derisi çadır ve makas ile karın açın.
- Karın alt sol ve sağ inguinal bölgelerinde testisler bulun. Vas deferens ve herhangi bir çapa bağ dokusu ile bağlantılarını kesin, sonra hayvan dan tüm testis (epididim hala bağlı) kaldırın. Önceden dengelendirilen BM'nin Petri kabına testisler yerleştirin.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında ve steril bir alan içinde, küçük bir mikrodisze makas ile ya da hafifçe iki ince forseps kullanarak yırtılma ile her testis bir ucunda tunica albuginea küçük bir kesi yapmak.
- Daha sonra, kesinin karşı ucundan testis tutarken, hafifçe ince forseps ile testis sıkmak ve tunica deliğe doğru hafifçe süpürme hareketi ile itin; bu tek bir uyumlu parça olarak testis dokusu serbest bırakacaktır.
- Testisleri daha küçük parçalara kesin (≤ 2 mm3)ve önceden ısıtılmış (37 °C) dissociation Solution 1'e 1 mL'lik bir alana yerleştirin.
- 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
- 10'dan fazla testis için, toplam dissosiasyon çözeltisi hacmini 1 mL artırarak 10 testis başına en az 1 mL dissosiasyon çözeltisi (örneğin, 20 testis için 2 mL, 30 testis için 3 mL vb.) sağlar.
- P1000 pipetkullanarak testis parçalarını çözelti 1'de 50 kez (50x) hafifçe triturate. Bu noktada tübüllerin birbirinden ve interstisyel dokudan ayrı olduğundan emin olun. Kümeler kalırsa, ek bir 5 dakika kuluçka ve bir kez daha triturate (50x).
- Çözelti 1 mL 1 ayrışma karışımı (kısmen ayrıştırılmış testis dokusu ve tübüliçeren) başına 33 μL hyaluronidase stok çözeltisi (37 °C'de önceden ısıtılmış, adım 1.5) ekleyin. Hyaluronidase ekledikten sonra, bu çözüm 2 denir.
- P1000 kullanarak triturate (50x) ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- P200 pipeti kullanarak triturate (50x).
- Bu noktada görünür tübülveya hücre kümelerinin bulunmadığından emin olun. Kümeler devam ederse, P200 pipet (50x) kullanarak daha fazla triturasyon ile 5 dakikaya kadar daha fazla kuluçkaya yatırın.
- Fetal büyükbaş serum (FBS) ekleyerek çözeltinin toplam hacminin %10'una dissosilasyon enzimlerini söndürün 2. Kümelerin kalmamasını sağlamak için P200 pipetini kullanarak birkaç kez triturate ve tek hücreli süspansiyon üretmek için 40 μm hücreli süzgeç ten filtre.
- 7 dk için 100 x g'lık santrifüj hücreleri, supernatant'ı atın ve taze BM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
- Hemositometrede trippan mavisi dışlama kullanarak toplam ve canlı hücre konsantrasyonlarını sayın. 1:1 seyreltilmiş, hücre süspansiyon 10 μL ekleyin: trypan mavi çözeltisi, hemositometre hücre sayma odasına (Malzeme Tablosubakınız).
- 7 dk için 100 x g'de yeniden santrifüj hücreleri ve taze BM'de yeniden askıya alın.
NOT: Sadece hücre konsantrasyonu ve sayısını hesaplamak için canlı hücreleri kullanın. Organoidler üretmek için sadece ≥% 80 canlılık hücre süspansiyonları kullanın. - Bölüm 3'teki protokole özgü adımlarda kullanılan hacimler göz önüne alındığında 280.000 hücreyi aliquot etmek için tek hücreli süspansiyonu açıklandığı gibi hücre konsantrasyonlarına hazırlayın: 2D ECM-Free – 0.56 x 106 hücre/mL, 2D ECM – 0.56 x 106 hücre/mL, 3D ECM-Free – 4.66 x 106 hücre/mL, 3D ECM – 2.8 x 106 hücre/mL.
NOT: Burada sunulan tüm kültür deneyleri, kültür başına 280.000 hücre ile başlar. Bu sayılar Şekil 1 , Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4'tekitemsili verilerle eşleşir.
- 7 dk için 100 x g'de yeniden santrifüj hücreleri ve taze BM'de yeniden askıya alın.
3. Organoid kültür yemeklerinin hazırlanması ve hücrelerin tohumlanması
NOT: Homojen bir ECM sağlamak için, denemeden önce bir gecede Dondurulmuş ECM'nin dondurulmuş aliquotlarını önceden eritin. ECM aliquots sıcaklık yavaş, kademeli bir artış garanti etmek için 4 ° C buzdolabı veya soğuk oda içinde buz bir kova içinde batırılmış olmalıdır. Tüm ECM kültür için BM'de 1:1 son seyreltme kullanılır. ECM ve 1:1 seyreltilmiş ECM'yi kullanıma başlamadan hemen önceye kadar buzüzerinde tut, aksi takdirde ECM erken polimerize olabilir.
- 2D ECM'siz kültür için, plaka tek hücreli süspansiyonlara (BM'de 500 μL 0,56 x 106 hücre/mL) doğrudan 4 kuyuluk oda slaytlarına ve kültür için 35 °C'lik bir kuluçka makinesine yer meye gerek yoktur.
NOT: Hücreler kültürün ilk 24 saat içinde kültür çanak altına yapışmalıdır ve bu aynı süre içinde bazı küçük 3D hücre kümeleri sergileyebilir. - 2B ECM kültürü için, jel in çanak alt tüm kapsar sağlanması, 4 kuyu odası slayt içine soğuk 1:1 seyreltilmiş ekstrasellüler bodrum matris orta 100 μL dağıtmak.
- ECM'nin bir jel haline getirebilmesi için haznesini en az 30 dakika boyunca 35 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin.
- Hücre süspansiyonu (BM'de 0,56 x 106 hücre/mL 500 μL) polimerize olduktan sonra doğrudan 2D jelin üstüne ekleyin.
NOT: Hücreler, kültürün ilk 24 saat içinde küçük 3B kümeler oluşturmak için birlikte kümelenmelidir.
- 3D ECM'siz kültür için, hücre kültürünü başlatmadan önce agarose 3D Petri kabı ekler hazırlayın.
- İlk olarak, 100 mL beher otoklav 1.5 g agarose toz, daha sonra 3D Petri çanak döküm için erimiş% 2 agarose üretmek için 75 mL steril, distile su ve mikrodalga ekleyin.
- Steril bir çalışma alanı içinde, menisküs kalıbın kenarları ile seviye kadar 3D Petri çanak kalıbına erimiş agarose dağıtmak.
- Agarose soğumasını ve katılaşmasını bekleyin. Katı olduğunda, kalıbı ters çevirin ve agarose 3D Petri kabı kalıptan çıkana kadar tekrar tekrar esnetin.
NOT: Bu noktada, birçok agarose 3D Petri yemekleri hazırlamak ve steril H2O veya DPBS 4 ° c bir ay yukarı için saklayabilirsiniz. - Culturing önce, bir 24 iyi kültür çanak içine agarose 3D Petri yemekleri yerleştirin ve BM 1 mL ile kaplayın. 3D Petri tabakları BM'de 37 °C'lik bir kültür kuluçka makinesi içinde en az 30 dakika boyunca dengelesin. BM'yi atın ve 1 mL taze BM ile dengeyi bir kez daha tekrarlayın. BM'de 3D Petri yemekleri nin dengelendikten sonra, BM ile aynı renkte görünürler (yani pembe).
- Hücre tohumlama için hazırlamak için, kuyudan tüm BM kaldırmak ve etrafında taze BM 200 μL dağıtmak, ancak 3D Petri kabın merkezi girinti içinde değil. Ayrıca, microwell eklemek merkezi hücre tohumlama girinti içinde kalan BM toplamak.
- Tek hücreli süspansiyonu (60°L BM'de 4,66 hücre/mL) agarose 3D Petri kabının orta girintisine dağıtın. Hücreleri karıştırmak ve kültürün başlangıcında tek bir hücre süspansiyonu garanti etmek için yavaşça yukarı ve aşağı triturate.
- Kültür için nemlendirilmiş 35 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. Ertesi gün, 200 μL BM'yi microwell insertin insasından çıkarın ve 1 mL taze BM ile değiştirin. Bu, sıvı seviyesini kesici uç düzleminin üzerine çıkararak tüm kültürü sular altında getirecektir.
- Agarose 3D Petri kabının dışından yavaşça ve dikkatlice ortamı çıkarın/ekleyin. Organoidler bir gecede sıkıştırılmış olmalı, onları alt dinlenme ye izin ve medya değişiklikleri organoidler rahatsız bırakmadan sağlayan.
- 3D ECM kültürü için, BM'deki hücre süspansiyonunun soğuk, önceden çözülmüş ECM ile (son konsantrasyon = 2,8 x 106 hücre/mL) eşit parçalar halinde birleştirilmesiyle tek bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Hemen bir 4 kuyu odası slayt içine hücre-ECM karışımı dağıtmak, karışımı plakanın tüm alt kapsar sağlanması.
- Hazne slaytlarını 35 °C'de bir kuvöze yerleştirin ve içindekilerin polimerleşmesini bekleyin. Bu en az 30 dakika sürer. Polimerizasyondan sonra, kültürün üstüne 500 μL BM ekleyin.
NOT: Hücrelerin, kültürün ilk 24 saat içinde küçük 3B agregalar oluşturmak için bir araya toplanmış olması gerekir.
4. Organoid bakım
- Kültür tüm organoid model tipleri 35 °C'de. Tüm kültür tipleri için her 2 günde bir taze BM ile medyalarının yarısını alışverişi. Organoidlerin orta alışverişi sırasında kazara toplanmamasını sağlamak için, her zaman oda kaydırak kabının bir köşesinden ve agarose 3D Petri yemeklerinin dışındaki bir dış noktadan medya toplayın. Tüm ortamlar immünoassays veya diğer analizler daha sonra (yani, gizli üreme hormonları veya sitokinler nicelik) ile kullanılmak üzere -20 °C'de saklanabilir.
- Kültürde 7 gün sonra, folikül uyarıcı hormon (son konsantrasyon 20 mIU/mL) ve insan koryonik gonadotropin (son konsantrasyon 4.5 IU/mL) içeren BM kullanın. Bu tüm organoid kültür türleri için geçerlidir.
- Organoid oluşumunu karakterize etmek ve zaman içinde kendi kendine montaj, gelişme ve büyüme ölçümlerini ölçmek için tüm organoid kültürleri (yani hızlandırılmış görüntüleme) rutin olarak görselleştirin.
5. Organoid Toplama
NOT: Tüm organoidler downstream immünetiketleme ve histolojik analizler için PBS'de %4 paraformaldehit ile düzeltilebilir. Oda sıcaklığında dönüşle veya geceleme 4 °C'de 2 saat için düzeltin.
- 2B ECM'siz kültürler için, önce numuneyi taze PBS ile durulayın ve ardından yapıştırılanın yapılı yapının üzerine doğrudan fiksatif ekleyin.
- ECM (2D ve 3D) kültür yöntemleri için, PBS ile bir kez durulayın ve sonra doğrudan ECM-organoid örneğinin üstüne fiksatif ekleyin (ECM jel ve organoidleri birlikte düzeltmek için), ya da alternatif olarak, organoidleri çevreleyen ECM'den kurtarmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve fiksasyon için ayrı bir tüpe aktarın.
- 3D ECM içermeyen kültür için, organoidleri agarose 3D Petri kabının orta girintisinde hafifçe inve yukarı inir; bu bir pipet ile kolay toplama kolaylaştırmak organoidler dışarı floş olacaktır. Sonra fiksasyon için ayrı bir tüp için organoidler aktarın.
- Parafin içine işleme den önce, doku işleme jeli küçük bir hacim (~ 30° L) içinde birçok organoidler (≥ 20) gömmek; bu, organoidleri parafin blokları içinde küçük bir alana yönlendirmeye ve yoğunlaştırılmasına yardımcı olur, kesit yaparken daha kolay gözlem ve parafin kesitleri içinde daha kolay görsel tanımlamayı kolaylaştırır.
NOT: Organoidler parafin katıştırma ve bir mikrotome kesit sonra tanımlamak için zor olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoid nesil, testis hücrelerinin kültürün 72 saat içinde kendi kendine biraraya gelmemesi durumunda başarısız olarak kabul edilirken, burada sunulan tüm yöntemler juvenil (5 dpp) murine hücreleri kullanılırken 24 saat içinde bir araya getirilmiştir. Biyolojik yapı oluşumunun başarısızlığı, genişletilmiş kültürden (72 saat) sonra bile serbestçe askıda olan hücrelerin devamı olarak sunulmuştur (Şekil 1'de0 saat sütun). Doku kendi kendine montaj yokluğunda, herhangi bir görünür hücre kümeleri kolayca bile nazik manipülasyon (yani, pipetleme) üzerine tek tek hücrelere dağılmış. Başarıyla oluşturulan dokular başlangıçta 3B hücre "kümeleri" olarak gözlenmiştir (Şekil 1'in6 h sütunundaki sarı oklar). ECM içermeyen ortamlarda (2D ve 3D) bu yapılar, özellikle 3Boyutlu agarose Petri kaplarında(Şekil 1A,C)kültürün ilk 24 saat boyunca gözle görülür bir şekilde "kompakt" olarak ortaya çıkmıştır. ECM ortamlarında (2D ve 3B) hücre kümeleri küme ve çevre çevreleri arasında net kenar boşluklarına sahipti (Şekil 1B,D). Hücre kümelerinin ecm boyunca göç ve daha büyük kümeler (Şekil 1Bkırmızı oklar) oluşturan birlikte kaynaşmak gözlenmiştir. Ayrı bir araya getirilmiş yapıları takdir etmek için gereken süre ölçüldü ve 2D ve 3D ECM'siz koşullar ile 2D ECM'siz koşullar arasında gerekli olan zaman arasında anlamlı bir fark yoktu, ancak 3D ECM kültürü de novo yapılarını diğer tüm kültür yöntemlerine göre birleştirmek için önemli ölçüde daha fazla zamana ihtiyaç dıyordu(Şekil 1E). 2D ECM içermeyen ve 3D ECM kültürü, 2B ECM ve 3D ECM içermeyen kültür yöntemlerinden önemli ölçüde daha küçük boyutlarda hücre kümeleri oluşturmaktadır; 3D ECM'siz kültür, 3D agarose Petri kabının her kuyusu içinde tek bir büyük ve kompakt kümeye sahip en büyük kümeleri üretti(Şekil 1C,F). Özetle, bu veriler dört arketipik kültür ortamlarında genç fare birincil hücrelerinden testis biyolojik yapılar üretmek için hangi kolaylığı göstermek ve bu farklı kültür ortamlarında farklı hücre yönelimli montaj-fenotipleri vurgulamak.
Tüm organoid modellerin bir amacı yerli doku bir iç morfoloji mimetik özetlemektir. Bu sonucu değerlendirmek için, her kültür koşulu nda biraraya getirilen biyolojik yapılar 72 saat kültürlendi ve hücreye özgü belirteçler için incelendi ve immünororesans ile görselleştirildi (Şekil 2). Doku morfolojisinde farklı kültür yöntemleri arasında değişkenlik gözlendi. Sertoli, peritubular (αSMA) ve Leydig hücreleri (3βHSD)(Şekil 2A-D)dahil olmak üzere birçok somatik hücre içeren 2D bazal konfluent tabakasının üzerine, bazı germ hücreleri (DDX4, bir pan germ hücre belirteci) ile Sertoli hücrelerinin kümeleri (SOX9 ve βCatenin) olarak sunulan 2D ECM'siz organoidler . Şekil 2B-D'nin 5 μm'lik bir kesit değil, tüm 2B ECM içermeyen numunenin epifloresan görüntüleri olduğunu unutmayın; bu hem bazal somatik hücre tabakasının hem de Sertoli ve mikrop hücrelerinin üstün odaklı agregalarının görselleştirilmesini sağlar. Buna karşılık, 2D ECM kültürü büyük ölçüde farklı bir fenotip ile sunulmuştur, farklı sınırları olan açık biyolojik yapılar bazal ECM jelin üzerine kolayca ayırt edilmiştir(Şekil 2E). Bu yapılar, testislerin interstisyel hücre tiplerine karşı tübülün de novo kompartımanlaşması ile karmaşık bir iç morfolojiye sahip olmuşlar ve bu nedenle başarılı organoidler olarak kabul edilmiştir. Tübüler bölgeler Sertoli, peritubüler ve mikrop hücreleri, interstisyel bölgeler ise Leydig, peritubüler hücreler ve etiketli olmayan hücreler denidir(Şekil 2F-H). Benzer şekilde, 3D ECM içermeyen organoidler de bir bölümlü iç morfolojisahip ve böylece başarılı organoidler kabul edildi. Özellikle 3D ECM içermeyen organoidler, özellikle Sertoli grupları ve yüksek sadakatli mikrop hücrelerinin etrafında şekillenen peritubüler hücreler içeren tübüler bölgelerle ayırt edildiler (Şekil 2I-L). 3D ECM monte edilmiş yapılar sofistike bir morfolojiye sahip değildi, ancak bunun yerine ara sıra mikrop ve Leydig hücreleri ile Sertoli hücrelerinin kümeleri olduğu gözlenmiştir. Bu örneklerde birçok Sertoli ve etiketlenmemiş hücre organoidler arasında "stroma benzeri" bir oryantasyonda asılı kalmıştır(Şekil 2M-P). Bu veriler birlikte, farklı organoid üretim yöntemlerinin ürettiği morfolojik fenotiplerdeki değişkenliği vurgulamakta ve testis kompartmanizasyonunun son derece mimetik bir iç morfolojisi olan testis organoidlerinin üretimi için iki özel organoid montaj ortamıolan 2D ECM ve 3D ECM'siz kullanımı desteklemektedir.
Testis organoid fonksiyonunu daha fazla değerlendirmek için daha derin uzun süreli bir analiz için 3D ECM içermeyen biraraya getirilmiş organoidler seçilmiştir. Bu çalışma için, bu organoidler 14 gün boyunca kültürlendi ve daha sonra hücre ve yapıya özgü belirteçler için incelendi. 14 günde immünofloresan analizi ile 3D ECM içermeyen organoidlerin tüp benzeri yapılar (TLS) ve in vivo testislere oldukça benzer bir doku mimarisi içerdiği gözlenmiştir(Şekil 3A-D). Interstisyel hücreler TLS'den ayrı bölgelerde uygun bir şekilde yer aldı. Daha sonra pan germ hücre belirteci, DDX4, spermatogonial kök hücre belirteci, SALL4 ve mayoz marker, SCP3(Şekil 3E-G)için doku kesitleri incelenmiştir. Nadir DDX4-pozitif ve SALL4-pozitif hücreler gözlendi, ancak SCP3 sinyali saptanmadı. TLS'nin daha derin karakterizasyonu üzerine, polarize Sertoli hücreleri ile çevrili lümen görünümlü bir alan ve peritübüler hücrelerin dış monotabakası içerdiği gözlenmiştir(Şekil 3I-L). Sertoli hücreleri de iletim elektron mikroskobu ile görselleştirilen ve kan testis bariyerinin bir junctional protein ve bileşeni olan ZO-1'e karşı etiketleme ile birbirleri arasında sıkı kavşaklar sergilenebilmiştir (Şekil 3H,L). Daha sonra, 3D ECM içermeyen organoidler 12 haftalık, gonadotropin stimülasyonu ile uzun süreli kültürde endokrin fonksiyon için çalışılmıştır(Şekil 4). Testosteron ve inhibin B, sırasıyla Leydig ve Sertoli hücrelerinden üreme hormonları, hem tanımlanmış ve organoid klimalı ortamdan ölçülen(Şekil 4A). Kültürün 12 hafta boyunca, her iki hormon önemli ölçüde gonadotropinler FSH ve hCG takviyesi yanıt olarak ölçüldü (kırmızı ok takviyesi başlangıcı gösterir, hafta boyunca 2 - 12). Tamamlandığında, endokrin duyarlılığın korunduğuna karar vermek için bir test yapıldı. Gonadotropinler 48 saat boyunca çıkarıldı, bu süre boyunca hem testosteron hem de inhibin B konsantrasyonları konsantrasyonda önemli ölçüde azaldı. 48 saat sonra gonadotropinler kültüre geri döndü ve her iki hormon konsantrasyonu da son 24 saat içinde önemli ölçüde artarak uygun endokrin duyarlılığı gösterdi (Şekil 4B). Bu histolojik ve endokrin tahnit sonuçları testis organoidlerinin testis gelişimi (yani de novo kompartmanizasyon ve tübulogenez) ve in vitro (örn. sıkı kavşak oluşumu ve endokrin fonksiyon) için yararlı bir model olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Organoidler 2D ve 3D, ECM ve ECM içermeyen kültür koşullarında kendi kendine biraraya getirilirler.
5 dpp murine testis hücreleri dört farklı koşullarda kültürlendi: 2D ECM'siz (asırası), 2D ECM (bsırası), 3D ECM'siz (Csatırı), ve 3D ECM (d sırası) Kültür yöntemini gösteren grafikler sol sütunda sağlanır. Temsili görüntü montajları, canlı kültür sırasında çekilen hızlandırılmış görüntülerden bir araya getirilmiştir. Her görüntü için zaman noktaları en üst kenar boşluğunda etiketlenir. Zaman 0 h herhangi bir organoid montaj meydana gelmeden önce, zaman 3 h devam eden hücre güdümlü organoid montaj sırasında, ve kez 6 h ve 9 h temsili göstermek, başarıyla oluşan organoidler. Sarı oklar hücre kümelerini işaretler ve kırmızı oklar ayrı hücre kümelerinin geçirildiği ve birbirleştiği konumları işaretler. Tüm ölçek çubukları = 1 mm. (E) Ayrı hücre kümelerinin gözle görülür bir şekilde takdir edilemeden önce gereken süre her durum için kaydedildi. 2DF = 2D ECM içermez; 2DE = 2B ECM; 3DF = 3D ECM içermez; 3DE = 3D ECM. (F) Her kültür koşulu için küme başına alan ölçüldü. Görüntüler n= 3 - 5 ayrı deneyden seçildi. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA 1E ve 1F'deki önemi belirlemek için kullanıldı; grafikler n=4 ayrı deneyler aracılığı ile biraraya getirilmiştir. Bu rakam Edmonds ve Woodruff37değiştirilmiştir. © IOP Yayıncılık. İzin ile çoğaltılır. Tüm hakları saklıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 2D ECM ve 3D ECM içermeyen kültürlü organoidler tübüler ve interstisyel hücre tiplerinin bölümselleştirilmesini sergilerler.
72 saat kültürden sonra kendi kendine biraraya getirilen organoidlerin temsili brightfield ve immünofloresan görüntüleri. 2D ECM içermeyen numuneler tüm montaj da, diğer tüm örnekler 5 μm doku kesitlerinde görüntülendi. (A – D) 2D ECM'siz kültür. (E – H) 2D ECM kültürü. (I – L) 3D ECM içermeyen kültür. (M – P) 3D ECM kültürü. Analiz için kullanılan hücreye özgü belirteçler üst kenar boşluğunda etiketlenir: Sertoli hücre çekirdekleri (SOX9) ve hücre cisimleri (βCatenin), germ hücreleri (DDX4, pan germ hücre belirteci), Leydig hücreleri (3βHSD) ve peritubuler hücreler (αSMA). Tüm floresan örnekleri DAPI ile DNA için eşlenmişti. Sarı oklar soldan ikinci sütundaki DDX4 işaretli mikrop hücrelerini, kırmızı oklar sağ iki sütundaki Sertoli hücre kümelerini gösterir. Parlak alan ölçeği çubukları = 400 μm, floresan ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakam Edmonds ve Woodruff37değiştirilmiştir. © IOP Yayıncılık. İzin ile çoğaltılır. Tüm hakları saklıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Organoidler nadir mikrop hücrelerinin yaşadığı tübül benzeri yapılar geliştirirler.
3D-ECM içermeyen birleştirilmiş organoidler 14 gün boyunca kültürlendi. (A–D) Temsili H&E ve immünofloresan görüntüler tübül benzeri yapılar (TLS) etrafında hücre tipleri ve doku özellikleri ayrıntılı; aynı organoid morfolojik özelliklerin yan yana karşılaştırılmasını sağlayan komşu doku bölümlerinde tasvir edilir: Leydig hücreleri (3βHSD), peritübüler hücreler (αSMA), Sertoli hücre organları (βCatenin), kollajen membran (COL IV) ve Sertoli hücre çekirdekleri (SOX9); ölçek çubukları = 100 μm. (E – G) Pan germ hücre belirteci (DDX4), spermatogonial kök hücre belirteci (SALL4) ve meiotik aktif spermatositler (SCP3) dahil olmak üzere mikrops hücrelerine karşı immünofloresan etiketleme yapıldı. Yüksek oranda büyütülmüş insets 3E ve 3F sarı paneller tarafından özetlenir. Yeşil üçgenler DDX4 etiketli hücreleri işaret eder; Kırmızı oklar SALL4 etiketli hücreleri işaret eder. ( H ) Bir organoid içindeki Sertoli hücreleri arasındaki sıkı bir kavşaktan(TEM)temsilci iletim elektron mikrografı (TEM); TEM ölçek çubuğu = 100 nm. (I – L) Sıkı kavşaklar (ZO1) ve laminin dahil olmak üzere seminiferous epitel in temel özellikleri için etiketlenmiş bir TLS yüksek büyütme temsilcisi görüntüleri. Aynı TLS paneller I bitişik doku bölümlerinde gösterilmiştir - L. Tüm floresan örnekleri DAPI ile DNA için eşlenmişti. Görüntüler n=7 ayrı biyolojik deneyden seçilmiştir. Bu rakam Edmonds ve Woodruff37değiştirilmiştir. © IOP Yayıncılık. İzin ile çoğaltılır. Tüm hakları saklıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Organoidler gonadotropinler FSH ve hCG yanıt olarak kültür 12 hafta boyunca testosteron ve inhibin B salgılar.
3D-ECM içermeyen organoidlerden toplanan şartlı ortam, enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) ile testosteron ve inhibin B için ölçüldü. (A)Organoidler on iki hafta boyunca kültürlendi, 2 - 12 hafta boyunca FSH ve hCG takviyesi ile (takviyesi başlangıcı x ekseninde kırmızı bir ok ile işaretlenir); tüm değerler istatistiksel testler için kültürün 7. (B) Endokrin yanıt 12 hafta sonra korunmuş olup olmadığını belirlemek için bir "yeniden stimülasyon testi" büyütülmüş grafik. Test dönemi 4A gri kutu tarafından özetlenir. Kültürde 12 haftalık sürenin tamamlanmasıyla, gonadotropinler 48 saat boyunca çıkarıldı ve daha sonra kültürün son 24 saat için yeniden takviyesi yapıldı. Hormonlar gonadotropin re-stimülasyon sonra 0, 2, 6, 12 ve 24 saat olarak ölçüldü; kırmızı gölgeli alanlar FSH ve hCG ile kültür sırasında zaman dönemleri belirlemek, gölgeli olmayan alanlar FSH ve hCG olmadan zaman dönemleri belirlemek; belirtilen p-değerleri yeniden uyarılmasından sonra 2 saate göredir. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü ANOVA tüm endokrin verilerin önemini belirlemek için kullanıldı, n=5 ayrı biyolojik deneyler. Bu rakam Edmonds ve Woodruff37değiştirilmiştir. © IOP Yayıncılık. İzin ile çoğaltılır. Tüm hakları saklıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu organoid nesil protokolünün tamamlanması ile, kullanıcı testis yapıları ve organoidler ecm veya ECM içermeyen ortamlarda montajı için onlara mevcut dört farklı kültür teknikleri olacaktır. Daha da önemlisi, dört yöntem de araştırmacının zaman atlamalı görüntüleme veya video kaydı yoluyla organoid kendi kendini birleştirmeyi zaman içinde non-invaziv olarak gözlemlemesine ve kültür sırasında dokuları rahatsız etmeden salgılanan hormonların ve sitokinlerin analizi için koşullandırılmış ortam toplamasına olanak sağlar. Tüm yöntemlerde, 24 saat boyunca, bir deneyci hücre numaraları izin olarak, birkaç yüz organoidler / testis yapıları kadar üretebilir. Bu yöntemler doku kendini montaj farklı boyutlarda ve morfolojileri ile yapılar içine teşvik; organoid boyutu hücre sayısı ve konsantrasyon kültürde kullanılan bağlıdır, diğer organoid raporlarda görüldüğü gibi34. Organoid boyutu veya çapı nın azaltılması bazen daha büyük organoidlerde bulunan nekrozun iç bölgelerinin gelişimini azaltmaya yardımcı olabilir. 2D ECM ve 3D ECM içermeyen protokol yöntemlerinin özel bir gücü, tübüler ve interstisyel hücre tiplerinin de novo kompartmanizasyonunu içeren morfolojik mimetik testis organoidleri üretme yetenekleridir. Ayrıca, 3D ECM içermeyen birleştirilmiş organoidler, uygun şekilde kompartımanlaştırılmış ve odaklı Sertoli ve peritubüler hücrelere sahip, seminiferous TLS'nin de novo tubulogenezi için bir model sunar. Bu testis organoidleri incelemek için önemli bir fenotip, ve hala farklı testis organoid raporlar arasında değişken bir sonuçtur; birden fazla diğer raporlar interstisyum bölümleme karşı tübül eksikliği ve hatta bir "iç-dış tübül" fenotip32,33,34,38geliştirmek . Bu el yazmasında sunulan organoid üretim yöntemlerinin hiçbiri kültürün uzun gün boyunca büyük germ hücre popülasyonları korumak için karakterize iken, germ hücreleri nadiren 72 saat gibi erken gözlenen gibi, hem 2D ECM ve 3D ECM-free yöntemleri in vitro tubulogenez ve spermatogonial niş ortamının somatik hücre bileşeni çalışmak için yararlı bir araç sağlayabilir. Bu amaç göz önünde bulundurularak, testis organoidleri in vitro germline kök hücre bakımı, meiyolik ilerleme ve farklılaşma geliştirmek için gelecekteki protokolleri optimize etmek için potansiyel bir platform sağlar.
Bu protokollerin bir diğer avantajı da organoid üretimi özelleştirme ve ölçeklendirme yeteneğidir. Özelleştirilmiş, ilaçla tedavi edilmiş veya tasarlanmış hücre popülasyonları, birincil fare testis hücrelerinin yerine başka bir deyişlekullanılabilir 37. Hücre süspansiyonları düşük canlılıkta ise (<%80), hücre süspansiyonunun hücre canlılığını artırmak için yöntemler alınmalıdır. Bunlar arasında dissosyasyon ortamlarında harcanan sürenin azaltılması ve doku sindirimi sırasında triturasyonun en aza indirilmesi (2.4.1 – 2.5.2), dissosilasyon sonrası yıkar sayısının artırılması veya hücre sıralama veya ölü hücre etiketleme kitleri ile dissociasyondan sonra ölü hücrelerin çıkarılması sayılabilir. Ancak, bu raporda paylaşılan temsili verileri üretmek için bu adımların hiçbiri gerekli değildi. 2D ve 3D ECM kültür yöntemleri için bu protokoller, burada sunulan çalışmalarda kullanılanlara ek olarak diğer yapısal protein bazlı biyomalzeme matrisleri ile de kullanılabilir. Bu diğer biyomalzemeler kollajen, jelatin, ticari olarak kullanılabilir ECM özleri ve özel yapılmış hücreli ECM kaynaklı hydrogels25,26,28içerir. Sorun giderici ECM jel dağıtım ve yüksek kaliteli agarose 3D Petri çanak ekler oluşturmak için birkaç işaretçiler vardır. ECM jelleri oda plakalarına döküm yaparken, kültür çanağı dağıtmadan önce ecm'nin bir tüp veya pipet ucu içinde erken polimerizasyonunu önlemek için hızlı bir şekilde çalışmaya ve soğuk pipet uçları kullandığınızdan emin olun. 3D Petri çanak kalıpları içine erimiş agarose döküm (3D ECM-free kültür için), minimum varyasyon ile eklerin yüksek kaliteli döküm sağlamak için sadece sıcak ve sıcak agarose kullanın ve agarose tamamen oda sıcaklığına soğutulmuş ve kalıp kaldırmak için denemeden önce katılaşmış olup olmadığını kontrol edin. Agarose 3D Petri yemekleri en iyi ince çömeçler ile hafifçe işlenir. Fiksasyon için organoidler toplarken, tüm organoidlerin koleksiyonunu görselleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu altında çalışmaya emin olun. Organoidler kültür yemekleri plastik tarafı ve pipet ipuçları iç sopa olabilir; cam pipetler plastikten daha az organoid yapışma sergiler. ECM'nin içinde veya üstünde kapsüllenmiş olan organoidlerin sabitlenmesi, fiksasyondan önce ECM'den çıkarmaktan daha zorlu ve hassas bir süreçtir. Doku işleme jeli fiksasyon39önce jel güçlendirmek için kültür odasından çıkarılmadan önce ECM-organoid yapı üzerinde döküm olabilir. 4 °C'ye düşürülürse polimerize olma olasılığı yüksek olan ECM hidrojelleri almak için oda sıcaklığında fiksasyon yapılmalıdır. Ayrıca, % 0.1 - 1.0 % glutaraldehit% 4 PFA çözeltisine eklenebilir ve ECM'nin daha fazla çapraz bağlanmasına yardımcı olur; ancak, bu yöntem örnek arka plan otofloresans artırır.
Yukarıda sunulan organoid üretim yöntemlerinin elde ettiği sonuçlarda, gelecekteki inovasyon için öncelikli alanları temsil eden, hücreye özgü önemli sınırlamalar vardır. Mikrop hücreleri genişletilmiş kültür üzerinde kötü desteklenir, sadece kolayca kültürün ilk birkaç gün boyunca gözlenen ve nadiren kültürün ilk haftası nın sonuna kadar ve daha sonraki zaman noktalarında gözlenir. Farklılaşmamış spermatogonia in vitro hücre kültürü içinde muhafaza edilebilirken, in vivo tübüllere transplantasyon sırasında spermatogenezi geri getirme yeteneklerini korurken40, tübül somatik mikroçevre (yani, doğrudan Sertoli hücre etkileşimleri) içine ve meyozis ve spermiyogenez in vitro1,5,,40,41pre-meyotik mikrop hücrelerinin ayırt etmek için bir ön koşul olarak hipotez. Yapısal olarak mimetik TLS içinde erken zaman noktalarında spermatogoni içeren testis organoidleri, alanın non-invaziv somatik-somatik ve somatik-germ hücre etkileşimlerini tamamen invitro olarak incelemesine olanak sağlayabilir. Medya katkı maddeleri ve hücre hazırlama nın kültürden önce optimizasyonu (örn. in vitro spermatogonial kök hücre kültürü için kullanılan ajanların birleştirilmesi)42,43 gelecekteki çalışmalarda mikrop hücrelerinin verimini artırabilir, özellikle birkaç günden uzun kültür dönemlerinde. Ters, mikroplar gibi TLS oluştuktan sonra spermatogonia yeniden tanıtmak için yöntemler, organoidler içinde mikrop hücrelerini geri yüklemek için ilginç bir fırsat teşkil, ve mikrop hücrelerini korumak için in vitro organize somatik ortamların yeteneğini test. Yaş/olgunluk45 ve genetik arka plan farklılıkları17dahil olmak üzere diğer biyolojik faktörlerin ex vivo eksplant kültürünü etkilediği gözlenmiştir. Bu aynı değişkenler testis organoid biyolojisi alanında doğrudan araştırılmadı. Ancak, farklı montaj, morfoloji ve fonksiyonel fenotiplerin farklı yaşlı hayvanlardan (örneğin, yenidoğan, çocuk, yetişkin) izole edilmiş hücrelerden veya farklı genetik geçmişe sahip hayvanlardan (örn. farklı fare suşları) izole edilen hücrelerden üretilmesi yle ortaya çıkabilir.
Özetle, bu el yazmasında paylaşılan teknikler hücre güdümlü testis yapı öz-montaj, iki ayrı yapısal mimetik testis organoid modelleri nesil ve TLS gelişimi ve hormon duyarlı endokrin fonksiyonu in vitro önemli başarı eğitimi için dört yararlı modeller sağlar. Bu modeller, ecm ve ECM ortamlarında 2D ve 3D mekansal oryantasyonları, en az karmaşık, tamamen tanımlanmış kültür ortamları ile kapsar. Her yöntem son derece çoğaltılabilir ve yalnızca yaygın olarak kullanılabilir kültür kaynaklarını kullanır. Bu yöntemler, testis morfogenezinin in vitro olarak incelenmesi ve in vitro spermatogenez için gelecekteki kültür koşullarının optimize edilebisi için avantajlı olabilir. Daha çok, 2D ECM ve 3D ECM içermeyen yöntemler testis, in vitro tübulogenez ve somatik-somatik ve somatik-germ hücre etkileşimleri benzersiz de novo doku bölümleme sürecini incelemek için yeni bir araç sağlar. Testis organoidleri, somatik testis fizyolojik özelliklerinin gelişimini ve düzenlenmesini araştırmak için esnek ve ölçeklenebilir bir fırsat sağlar; kan-testis bariyeri ve endokrin üretim ve yanıt dahil; ve, aynı zamanda, yeni nesil çevirisel araştırma doku modelleri geliştirmek için yararlı bir araçtır. Bu daha büyük sistem düzeyinde modeller, doku-on-a-CHIP ve mikro-fizyolojik platformlar45,,46gibi üreme hormonları birleştiren içerir. Testis organoidlerinin bir gün uygulanabileceği diğer çevirisel hedefler arasında üreme toksikolojisi ve immünolojik bariyer testi, erkek kontraseptif gelişimi ve yardımcı üreme teknolojisi inovasyonu yer almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsangelişimi Enstitüsü (NICHD) F31 HD089693, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü / Ulusal Merkezi İlerletme Çeviri Bilimleri (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 ve 4UH3ES029073-03 ve Thomas J. Watkin's Professor Memorialship tarafından finanse edilmiştir.
Yazarlar iletim elektron mikroskobu ile yardım için Eric W. Roth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Yumuşak ve Hibrid Nanoteknoloji Deneysel (SHyNE) Kaynak (NSF ECCS-1542205) destek aldı Northwestern Üniversitesi'nin NUANCE Merkezi, BioCryo tesisi kullanımı yaptı; Malzeme Araştırma Merkezi'ndeki MRSEC programı (NSF DMR-1720139); Uluslararası Nanoteknoloji Enstitüsü (IIN); ve Illinois Eyaleti, IIN aracılığıyla. Ayrıca MRI programından (NSF DMR-1229693) destek alan CryoCluster ekipmanından da yararlanmıştır. Şekil 1'deki grafikler BioRender.com kullanılarak tasarlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
