Summary
Här beskrivs fyra metoder för att generera testikelorganoider från primära neonatal murin testikelceller dvs, extracellulära matris (ECM) och ECM-fria 2D och 3D kultur miljöer. Dessa tekniker har flera forskningsapplikationer och är särskilt användbara för att studera testikelutveckling och fysiologi in vitro.
Abstract
Testikelorganoider ger ett verktyg för att studera testikelutveckling, spermatogenes, och endokrinologi in vitro. Flera metoder har utvecklats för att kunna skapa testikelorganoider. Många av dessa metoder förlitar sig på extracellulär matris (ECM) för att främja de novo vävnad montering, det finns dock skillnader mellan metoder i fråga om biomimetiska morfologi och funktion av vävnader. Dessutom finns det få direkta jämförelser av publicerade metoder. Här görs en direkt jämförelse genom att studera skillnader i organoid generation protokoll, med förutsatt resultat. Fyra arketypiska generationsmetoder: (1) 2D ECM-fri, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-fri, och (4) 3D ECM kultur beskrivs. Tre primära riktmärken användes för att bedöma testikelorganoid generation. Dessa är cellulära självmontering, införande av större celltyper (Sertoli, Leydig, groddar, och peritubular celler), och lämpligt uppdelade vävnad arkitektur. Av de fyra testade miljöerna genererade 2D ECM- och 3D ECM-fria kulturer organoider med interna morfologier som mest liknar inhemska testiklar, inklusive de novo-delutrymmet av tubular kontra interstitiell celltyper, utveckling av tubuli-liknande-strukturer, och en etablerad långsiktig endokrina funktion. Alla studerade metoder utnyttjas osorterade, primära murine testikelcell suspensioner och används vanligen tillgängliga kultur resurser. Dessa testikelorganoida generationen tekniker ger en mycket tillgänglig och reproducerbar verktygslåda för forskningsinitiativ i testikelorganogenes och fysiologi in vitro.
Introduction
Testikelorganoider är en banbrytande teknik för att studera testikelutveckling, spermatogenes, och fysiologi in vitro1,2,3,4. Flera metoder har utforskats för organoid generation; dessa inkluderar en mängd olika extracellulära matrissystem (ECM) och ECM-fria odlingssystem, i både tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) orienteringar. Olika generationsmetoder kan främja distinkta cellulära monteringsstrategier; detta resulterar i en hög nivå av morfologiska och funktionella variabilitet mellan publicerade organoidmodeller. Syftet med denna artikel är att diskutera det aktuella läget för in vitro testikelmodeller, och att fungera som en mall för framtida utredare, när man utformar testikelorganoida experiment. Inom den föreliggande studien definieras fyra olika kultursystems arketyper och karakteriseras i experimentell process och biologiskt utfall. Dessa inkluderar: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, och 3D ECM-odlingsmetoder. De strategier som presenteras häri är avsedda att vara enkla, tillgängliga och mycket reproducerbara mellan olika laboratorier och forskargrupper.
Historiskt för testisen, beteckningen "in vitro", har använts för flera olika odlingsmetoder av testikelvävnader och celler. Dessa inkluderar organotypisk vävnad/organ odling metoder (dvs. explant kultur)5, isolerade seminiferous tubule kultur6, testikelcellsodling7, och metoder för de novo vävnad morphogenesis (dvs, biologiska konstruktioner och organoider)1. De första undersökningarna av in vitro-spermatogenes utfördes för ungefär 100 år sedan, med kulturen av kanintestis explants i 19208, och senare i 1937 med mus explants9. Inom dessa inledande experiment spermatogonia observerades till stor del urarta under den första veckan av kultur, även om vissa meiotically differentiera celler identifierades. Påminner om dessa historiska rapporter, testis explant kultur återupplivades och optimerades 2011 för att bli en genomförbar teknik för att studera testis10. Sedan 2011, explant kultur har producerat fertilitet kompetent spermie i flera rapporter11,12,13. Men på grund av explant kulturens beroende av redan existerande inhemska testis tubuli, dessa senaste framsteg är mer exakt beskrivs som exempel på "ex vivo" testikelfunktion och spermatogenes, vävnadsfunktion som bibehölls eller återupptogs vid avlägsnande från en organism kropp. Trots dess prevalens i litteraturen, långsiktiga könsceller underhåll och differentiering inom testikel explants är utmanande att replikera14,15,16,17,18, särskilt över tidsramar tillräckligt länge för att fullt ut observera in vitro spermatogenes (~ 35 dagar i möss19 och 74 hos människor20). Det är spännande att inse att många av de utmaningar som upplevdes för 100 år sedan, fortfarande upplevs inom ex vivo spermatogenes idag.
Annorlunda än ex vivo tillvägagångssätt, testikelorganoider är de novo monterade mikrotissues genereras helt in vitro från cellulära källor (dvs. primära testikelceller). Testikelorganoider ger en kreativ strategi för att kringgå fältets historiska tillit till redan existerande inhemska vävnad, och att rekapitulera testikelbiologi helt in vitro. Det finns flera krav som delas av de flesta organoid vävnadsmodeller; dessa inkluderar (1) in vivo-mimetic vävnad morfologi eller arkitektur, (2) flera större celltyper av den representerade vävnaden, (3) självmontering eller självorganisation i sin generation, och (4) förmågan att simulera en viss nivå av den representerade vävnadens funktion och fysiologi21,22,23,24. För testierna kan detta fångas upp i fyra större kännetecken: (1) införandet av större testikelcellstyper, groddar, Sertoli, Leydig, peritubular och andra interstitialceller, (2) cell-directed tissue assembly, (3) lämpligt-compartmentalized celltyper i separata tubular fack (könsceller och Sertoli) och interstitial regioner (alla andra celltyper), och (4) någon grad av vävnad funktion (t.ex., reproduktiv hormonsekretion eller vävnad svar, och könsceller underhåll och differentiering). Med tanke på de historiska utmaningarna i att upprätthålla könscellsdifferentiering ex vivo och in vitro, rekapitulation av in vivo-mimetic testikelarkitekturer (dvs strukturer som liknar seminiferous tubules) med ytterligare markörer som tyder på simulering av testikelfysiologi (t.ex. endokrina funktion), är prioriterade milstolpar mot att generera organoider som en dag kan upprätthålla i vitro spermaogenes.
Majoriteten av publicerade testikelorganoida metoder dra nytta av kommersiellt tillgängliga ECM (t.ex. kollagen eller egenutvecklade ECM formuleringar)25,26,27 eller custom-sourced ECMs (dvs, decellularized testis ECM-derived hydrogels)28,29,30. Exogen ECM främjar de novo vävnadsbildning genom att tillhandahålla en monterings-stödjande byggnadsställning för vävnadsgenerering. ECM metoder har gett en imponerande nivå av vävnadsbildning, inklusive vissa groddcell närvaro och vävnad-mimetic morfologi25,28. Men de ECM de utnyttjar är inte alltid allmänt tillgängliga (dvs. decellularized ECM-härledda hydrogels), och vissa metoder kräver sofistikerade gel och cell seedning orienteringar (t.ex. 3-lagers lutningar av ECM och 3D-utskrift)25,31,32. Byggnadsställningsfria metoder (t.ex. hängande droppe och nonadherent odlingsplattor)33,34,35 har också genererat robusta och mycket reproducerbara organoider utan behov av ECM-geler eller byggnadsställningar. Men vävnad morfologi av dessa byggnadsställning-fria organoider är ofta olika till in vivo testiklar, och de flesta av dessa rapporter införliva en biokemisk ECM tillsats för att främja vävnadsbildning33,34,36, eller alternativt, förlita sig på centrifugation för påtvingad cell aggregering och packning34, vilket gör dem mindre idealisk för att studera cell-riktad migration och självorganisering.
De fyra organoida generationsmetoderna som presenteras i detta manuskript omfattar både ECM-beroende och oberoende strategier, var och en med hjälp av enkel cellsådd som möjliggör observation av celldriven organoid självmontering. Alla fyra tekniker kan utföras från samma cell suspensioner eller kan använda sig av anpassade och cell-typ berikade populationer. En styrka av dessa metoder är förmågan att observera organoider självmontera i realtid, och att direkt jämföra hur testikelstrukturer själv montera mellan olika kultur mikromiljöer. De fenotypiska skillnaderna mellan dessa fyra odlingsmetoder bör övervägas för deras inverkan på forskningsfrågan eller föremål för prövaren. Varje metod producerar biologiska konstruktioner eller organoider inom 24 h eller mindre. Sammanfattningsvis de metoder som presenteras här ger en verktygslåda av organoid montering tekniker för att studera testikelorganoida församling, vävnad utveckling och testikelfysiologi in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musexperiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Northwestern University, och alla procedurer utfördes enligt IACUC-godkända protokoll.
1. Beredning av enzymatiska vävnad-dissociation lösningar
- Använd två olika enzymatiska lösningar (Lösning 1 och lösning 2), båda gjorda med hjälp av en basal odlingsmedletlösning (BM).
- För att förbereda BM, tillsätt serum och penicillin-streptomycin till minsta väsentliga medelhöga till slutliga koncentrationer på 10% respektive 1 % (se Tabell över material för specifika reagenser). Sterilfiltera sedan BM genom ett 0,22 μm filter. Före användning med celler, förjämföra steril BM till ett neutralt pH genom dispensering i en odlingsskål och placering inom en befuktad, 5% CO2 inkubator vid 37 °C i minst 1 h.
OBS: BM kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka, varefter färsk BM ska göras. - För att förbereda kollagenas I lager lösningar, först lösa 100 mg kollagenas I i 1 mL av sterila embryo grad H2O (slutlig koncentration 10% m/v), invertera eller virvla upp för att lösa, och lagra 20 μL alikvoter vid -20 °C för senare användning. Alikvoter ska tinas upp endast en gång.
- För att förbereda deoxyribonuclease I (DNase I) stamlösningar, tillsätt 20 mg DNase I i 1 mL sterilt embryo grad H2O (slutkoncentration 2% m/v), invertera eller snurra för att lösa upp (vortexas inte), och förvara 20 μL alikvoter vid -20 °C för senare användning. Alikvoter ska tinas upp endast en gång.
- För hyaluronidaselagerlösningar, tillsätt 30 mg i 1 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; slutkoncentration 3% m/v hyaluronidase i PBS innehållande Ca++/Mg++), invertera eller virvla för att lösa upp, och förvara 100 μL alikvoter vid -20 °C för senare användning. Alikvoter kan tinas och frysas igen flera gånger utan förlust av enzymatisk aktivitet.
- För att förbereda dissociation Lösning 1, tillsätt 10 μL kollagenas I och 10 μL DNase I i 1 mL steril, pre-equilibrated BM (Slutliga koncentrationer: 1 mg/mL kollagenas I och 5 μg/mL DNase I). Triturate försiktigt med en pipett för att blanda lösningen, och för-varm till 37 °C före användning med vävnaden.
OBS: Lösning 2 bereds genom att 33 μL hyaluronidas (förvärmd till 37 °C) tillsätts per 1 mL lösning 1, (till en slutkoncentration på 1 mg/mL). Detta sker mitt i vägen genom enzymatisk dissociation av testis vävnad vid steg 2,5 nedan.
2. Testis vävnadsdissociation
OBS: Alla möss var inrymt i polypropylen burar och förses med mat och vatten ad libitum. Djur utfodrades bestrålad chow som inte innehåller fytoöstrogener. Juvenile CD-1 möss, 5 dagar post-partum (dpp), användes för alla experiment och sövdes före dödshjälp och vävnad insamling, inom en anestesi kammare fäst vid en isofluran SPRIDARE (2,5 L/min i O2). Möss bekräftades för full anestesi via avsaknad av ett svar på tå-prick, varefter möss avlivades via halshuggning.
- Bedöva möss i en isoflurankammare, säkerställa anestesi via en tå-prick, och sedan halshugga musen med hjälp av en vass sax. Placera avlivas mus supine på en dissektion matta och sterilisera buken med 70% etanol. Tälta huden på underlivet med tuten och öppna buken med sax.
- Lokalisera testikorna i nedre vänstra och högra inguinal regioner i buken. Skär sina anslutningar till vas deferens och eventuella förankring bindväv, lyft sedan hela testis (med epididymis fortfarande fäst) från djuret. Placera testes i en petriskål av förjämförd BM.
- Under ett dissekeringsmikroskop och inom ett sterilt fält, gör ett litet snitt i tunica albuginea på ena änden av varje testis med antingen en liten mikrodissectionsax eller genom att riva försiktigt med hjälp av två fina tänjningar.
- Sedan, medan du håller testis från den motsatta änden av snittet, försiktigt pressa testis med fina tänja och tryck i en mild svepande rörelse mot hålet i tunica; detta kommer att släppa testikelvävnaden som en sammanhållen pjäs.
- Skär testiklen i mindre bitar (≤ 2 mm3) och placera dem i 1 mL förvarvad (37 °C) dissociation Lösning 1.
- Inkubera vid 37 °C i 10 min.
- För mer än 10 testikörare, öka den totala dissociationslösningsvolymen med 1 mL, vilket garanterar minst 1 mL dissociationslösning per 10 testikontroller (t.ex. 2 mL för 20 testikör, 3 mL för 30 testikörare etc.).
- Triturtera försiktigt testisbitarna 50 gånger (50x) i lösning 1 med hjälp av en P1000-pipett. Se till att tubulina separeras från varandra och från mellanliggande vävnad på denna punkt. Om klumpar kvar, inkubera ytterligare 5 min och triturate en gång till (50x).
- Tillsätt 33 μL stamlösning i Hyaluronidase (förvärmd vid 37 °C, från steg 1.5) per 1 mL av lösning 1 dissociationsblandning (som innehåller den delvis dissocierade testikelvävnaden och tubuli). Efter att ha lagt till hyaluronidase kallas detta lösning 2.
- Triturate (50x) med hjälp av en P1000 och inkubera vid 37 °C i 5 min.
- Triturate (50x) med hjälp av en P200-pipett.
- Se till att vid denna punkt inga synliga tubuli eller klumpar av celler är närvarande. Om klumpar kvarstår, inkubera i upp till 5 mer min, med ytterligare trituration med hjälp av en P200-pipett (50x).
- Släcka dissociationsenzymerna genom att lägga till fetalt bovint serum (FBS) till 10% av den totala volymen av lösning 2. Triturate flera gånger med hjälp av en P200 pipetter för att säkerställa att inga klumpar kvar, och filtrera genom en 40 μm cell sil för att producera en encellig suspension.
- Centrifugera celler vid 100 x g i 7 min, kassera supernatanten och resuspend cellerna i färska BM.
- Räkna de totala och livskraftiga cellkoncentrationerna med hjälp av trypan blå uteslutning på en hemocytometer. Tillsätt 10 μL av 1:1 utspädd, cellförstärkelse: trypanblålösning, i kammaren för nedräkning av cellcellen (se Tabell över material).
- Re-centrifug celler vid 100 x g för 7 min och resuspend i färska BM.
OBS: Använd endast gångbara celler för beräkning av cellkoncentration och tal. Använd endast cell suspensioner av ≥ 80% livskraft för att generera organoider. - Förbered engångscellsupphängningen i cellkoncentrationer enligt beskrivningen för att alikvotera 280 000 celler givet de volymer som används i protokollets specifika steg nedan i avsnitt 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 celler/mL, 2D ECM – 0,56 x 106 celler/mL , 3D ECM-Fri – 4,66 x 106 celler/mL, 3D ECM – 2,8 x 106 celler/mL.
OBS: Alla odlingsexperiment som presenteras här börjar med 280 000 celler seedade per odlingsväl. Dessa siffror matchas mot de representativa uppgifterna i figur 1, figur 2, diagram 3 och figur 4.
- Re-centrifug celler vid 100 x g för 7 min och resuspend i färska BM.
3. Beredning av organoid kultur rätter och sådd av celler
OBS: För att säkerställa en homogen ECM, pre-tina frysta alikvoter av ECM natten före experiment. ECM alikvoter bör vara nedsänkt i en hink med is inom en 4 °C kylskåp eller kallt rum för att garantera en långsam, gradvis ökning av temperaturen. All ECM används vid en 1:1 slutlig utspädning i BM för kultur. Håll upptinad ECM och 1:1 utspädd ECM på is till omedelbart före användning, annars kan ECM polymerisera i förtid.
- För 2D ECM-fri odling är ingen speciell beredning nödvändig, platta encellsupphängningar (500 μL på 0,56 x 106 celler/mL i BM) direkt på 4- brunnskammarens objektglas, och placera i en 35 °C inkubator för kultur.
OBS: Celler bör följa botten av odlingsfatet inom de första 24 h av kultur och kan uppvisa några små 3D-cellkluster inom denna samma tid. - För 2D ECM-odling, dosera 100 μL kallt 1:1 utspädd extracellulär källarmatrismedium i en 4 brunnskammaresglas, vilket säkerställer att gelen täcker hela diskbotten.
- Placera kammaren glida i en 35 °C inkubator i minst 30 min så att ECM att polymerisera till en gel.
- Tillsätt cellupphängningen (500 μL på 0,56 x 106 celler/mL i BM) direkt på 2D-gelens ovansida när den har polymeriserat.
OBS: Celler bör kluster tillsammans för att bilda små 3D-kluster inom de första 24 h av kultur.
- För 3D ECM-fri kultur, förbereda Agarrose 3D Petri skålen skär innan du startar cellkulturen.
- Först autoklav 1,5 g agaros pulver i en 100 mL bägare, tillsätt sedan 75 mL steril, destillerat vatten och mikrovågsugn för att producera smält 2% agaros för 3D Petri skålen gjutning.
- Inom en steril arbetsyta, dispense smält agaros i 3D Petri skålen mögel tills menisken är i nivå med sidorna av formen.
- Låt agarosen svalna och stelna. När fast, vända mögel upp och ner och försiktigt flex upprepade gånger tills agaros 3D Petri skålen faller fri från mögel.
OBS: Vid denna punkt kan man förbereda många agarrose 3D Petri rätter och förvara dem i sterilA H2O eller DPBS vid 4 °C för uppemot en månad. - Före odling, placera agaros 3D Petri rätter i en 24 väl kultur maträtt, och täcka dem med 1 mL BM. Låt 3D Petri-disken ekvili i BM i minst 30 min inom en 37 °C-odlingsinkubator. Kassera BM, och upprepa jämvikten en gång till med 1 mL färsk BM. Efter jämvikt av 3D Petri-rätter i BM, kommer de att visas samma färg som BM (dvs. rosa).
- För att förbereda för cellsådd, ta bort alla BM från brunnen och dispensera 200 μL färsk BM runt, men inte inuti centrum fördjupningen av 3D Petri-skålen. Också, samla eventuella återstående BM inifrån centrum cell-seeding fördjupning av microwell infoga.
- Dispensera den encelliga suspensionen (4,66 celler/mL i 60 μL BM) i centrumfördjupningen på agaros 3D Petri-skålen. Försiktigt triturate upp och ner för att blanda celler och garantera en enda cell suspension i början av kulturen.
- Placera in i i en befuktad 35 °C inkubator för kultur. Följande dag, ta bort 200 μL BM från runt mikrobrunnsinsatsen, och ersätt med 1 mL färsk BM. Detta kommer att föra vätskenivån över kroppens plan, dränka hela kulturen.
- Långsamt och försiktigt ta bort / lägga till media från utsidan av agaros 3D Petri-skålen. De organoider bör ha komprimerat över natten, så att de kan vila längst ner och gör det möjligt för media förändringar för att lämna organoider ostört.
- För 3D ECM-odling, preparera en encellsupphängning genom att kombinera, i lika delar, cellupphängningen i BM med kall, förtinad ECM (slutkoncentration = 2,8 x 106 celler/mL).
- Omedelbart dispensera cell-ECM blandningen i en 4 väl kammarsglas, se blandningen täcker hela botten av plattan.
- Placera kammarens diabilder vid 35 °C i en inkubator och låt dess innehåll polymerisera. Detta bör ta minst 30 min. Efter polymerisationen, tillsätt 500 μL BM på toppen av kulturen.
OBS: Celler bör ha klustrade tillsammans för att bilda små 3D aggregat inom de första 24 h av kultur.
4. Organoid underhåll
- Odla alla organoida modelltyper vid 35 °C. För Alla kulturtyper utbyte hälften av sina medier med färska BM varje 2 dagar. För att säkerställa att organoider inte av misstag samlas in medan utbyte av medium, samla alltid media långsamt från ett hörn av kammaren slide skålen, och från en extern punkt utanför Agaros 3D Petri rätter. Alla medier kan lagras vid -20 °C för användning med immunanalyser eller andra analyser senare (dvs. kvantifiering av utsöndrade reproduktionshormoner eller cytokiner).
- Efter 7 dagar i kultur, använd BM som innehåller follikelstimulerande hormon (slutlig koncentration 20 mIU/mL) och humant korion gonadotropin (slutlig koncentration 4,5 IU/mL). Detta gäller alla organoid kulturtyper.
- Rutinmässigt bild alla organoid kulturer (dvs. time-lapse imaging) för att karakterisera organoid bildning och kvantifiera mått på självmontering, utveckling och tillväxt över tiden.
5. Organoid Samling
OBS: Alla organoider kan fixeras med 4% paraformaldehyd i PBS för immunolabeling nedströms och histologiska analyser. Fix för 2 h vid rumstemperatur med rotation, eller över natten vid 4 °C.
- För 2D ECM-fria kulturer, skölj först provet med färsk PBS, och tillsätt sedan fixativ direkt ovanpå de följsamma konstruktionerna.
- För ECM (2D och 3D) odlingsmetoder, skölj en gång med PBS, och sedan antingen lägga fixativ direkt på toppen av ECM-organoid provet (för att fixera ECM gel och organoider tillsammans), eller alternativt, försiktigt pipetter organoiderna upp och ner för att frigöra dem från den omgivande ECM, och överföring till ett separat rör för fixering.
- För 3D ECM-fri kultur, försiktigt pipetter organoiderna upp och ner inom centrum fördjupningen av agaros 3D Petri-skålen; detta kommer att spola organoiderna ut underlätta deras enkla samling med en pipett. Överför sedan organoider till ett separat rör för fixering.
- Innan bearbetning till paraffin, bädda in många organoider (≥ 20) inom en liten volym (~ 30 μL) av vävnad bearbetning gel; detta hjälper orientera och koncentrera organoider till ett litet område inom paraffin block, underlätta enklare observation när sektionering och enklare visuell identifiering inom paraffin sektioner.
OBS: Organoider kan vara utmanande att identifiera efter paraffin inbäddning och snittning på en mikrotom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoid generation ansågs misslyckas om testikelceller inte själv montera inom 72 h av kultur, dock alla metoder som presenteras här montera inom 24 h när du använder juvenil (5 dpp) murin celler. Fel på biologisk konstruera generationen presenteras som en fortsättning av fritt upphängda celler (0 h kolumn i figur 1) även efter utökad kultur (72 h). I avsaknad av vävnad självmontering, någon uppenbar cell kluster lätt spridda i enskilda celler på ens mild manipulation (dvs. pipettering). Framgångsrikt genererade vävnader observerades ursprungligen som 3D-cell "kluster" (gula pilar i 6 h kolumn i figur 1). Inom ECM-fria miljöer (2D och 3D), dessa konstruktioner synbart tycktes "kompakt" över de första 24 h av kultur, särskilt när det i 3D agaros Petri rätter (Figur 1A,C). I ECM-miljöer (2D och 3D) hade cellkluster tydliga marginaler mellan klustret och deras omgivande miljö (Figur 1B,D). Cellkluster observerades också för att migrera över ECM och säkring tillsammans bildar större kluster (röda pilar i figur 1B). Den tid som krävdes för att uppskatta separata självmonterade strukturer mättes, och det fanns ingen signifikant skillnad i tid som krävdes mellan både 2D och 3D ECM-fria förhållanden och 2D ECM, dock krävde 3D ECM-kultur betydligt mer tid för att montera de novo strukturer än alla andra odlingsmetoder (Figur 1E). 2D ECM-fri och 3D ECM-odling genererade cellkluster med betydligt mindre storlekar än 2D ECM- och 3D ECM-fria odlingsmetoder. 3D ECM-fri kultur producerade de största klustren med ett enda stort och kompakt kluster inom varje brunn av 3D-agarnos Petriskålen (Figur 1C,F). Sammanfattningsvis visar dessa data hur lätt som att producera testikelbiologiska konstruktioner från juvenil mus primära celler i fyra arketypiska kultur miljöer och belysa olika cell-riktade montering-fenotyper inom dessa olika kultur miljöer.
Ett mål för alla organoidmodeller är att rekapitulera en inre morfologi mimetik av inhemsk vävnad. För att bedöma för detta utfall odlades biologiska konstruktioner som samlats inom varje odlingsvillkor för 72 h och därefter sonderades för cellspecifika markörer och visualiserades med immunofluorescens (figur 2). Variabilitet i vävnad morfologi observerades mellan olika odlingsmetoder. 2D ECM-fria organoider som presenteras som kluster av Sertoli-celler (SOX9 och βCatenin) med vissa könsceller (DDX4, en pangroddcellsmarkör) som följs ovanpå ett 2D-basalt sammanflödesskikt som innehåller många somatiska celler, inklusive Sertoli, peritubular (αSMA), och Leydig-celler (3βHSD) (Figur 2A-D). Observera att figur 2B-D är epifluorescerande bilder av hela 2D ECM-fritt prov, inte ett 5 μm-avsnitt; detta möjliggör visualisering av både det basala somatiska cellskiktet och de överlägset orienterade aggregaten av Sertoli- och könsceller. Däremot 2D ECM kultur presenteras med en i stort sett olika fenotyp, som tydliga biologiska strukturer med distinkta gränser var lätt urskiljas ovanpå den basala ECM gel (Figur 2E). Dessa strukturer besatt en komplex inre morfologi med de novo delindelning av tubule vs. vardför vartitiell cell typer av testis, och så ansågs framgångsrika organoids. Tubular regioner innehöll Sertoli, peritubular, och könsceller, och interstitial regioner innehöll Leydig, peritubular celler och icke-märkta celler (Figur 2F-H). På samma sätt 3D ECM-fria organoider också besatt en compartmentalized inre morfologi och så ansågs framgångsrika organoider. I synnerhet var 3D ECM-fria organoider särskiljas genom tubulär regioner som innehåller peritubular celler som särskilt orienterade runt grupper av Sertoli och könsceller med hög trohet (Figur 2I-L). 3D ECM monterade strukturer inte har en sofistikerad morfologi, men i stället observerades vara kluster av Sertoli celler, med enstaka könsceller och Leydig celler. I dessa prover förblev många Sertoli- och icke-märkta celler upphängda mellan organoider i en "stromaliknande" orientering (Figur 2M-P). Tillsammans belyser dessa data variabiliteten i morfologiska fenotyper som olika organoida genereringsmetoder producerar och stöder användningen av två specifika organoida monteringsmiljöer, 2D ECM och 3D ECM-fria, för generering av testikelorganoider med en inre morfologi mycket mimetiska av testikelfack.
För att ytterligare bedöma testikelorganoid funktion, 3D ECM-fria monterade organoider valdes ut för en djupare långsiktig analys. För denna studie var dessa organoider odlade i 14 dagar och sedan sonderade för cell och struktur specifika markörer. Vid immunofluorescerande analys vid 14 dagar observerades 3D ECM-fria organoider för att innehålla tubuliliknande-strukturer (TLS) och en vävnadsarkitektur som på ett anmärkningsvärt sätt liknar in vivo-testikor (figur 3A-D). Interstitiell celler var lämpligt belägna i separata regioner från TLS. Vävnadssektioner var sedan sonderade för pan könscell markör, DDX4, spermatogoniell stamceller markör, SALL4, och meios markör, SCP3 (Figur 3E-G). Sällsynta DDX4-positiva och SALL4-positiva celler observerades, dock ingen SCP3 signal identifierades. Vid djupare karakterisering av TLS observerades de för att innehålla ett lumen-visas utrymme omgiven av polariserade Sertoli celler och en extern monolayer av peritubular celler (Figur 3I-L). Sertolicellerna ställde också ut åtsittande korsningar mellan varandra, som visualiserade med transmissionselektronmikroskopi och med märkning mot ZO-1, ett junctionalprotein och komponent i blod-testisbarriären (Figur 3H,L). Därefter studerades 3D ECM-fria organoider för endokrin funktion i 12-veckors, långtidskultur med gonadotropinstimulering (Figur 4). Testosteron och inhibin B, reproduktiva hormoner från Leydig och Sertoli celler respektive, identifierades och kvantifieras från organoid betingade medium (Figur 4A). Över 12-veckor av kultur, båda hormonerna mättes för att avsevärt svara på tillskott av gonadotropiner FSH och hCG (röd pil betecknar början av tillskott, under veckor 2 – 12). Vid slutförandet utfördes ett test för att avgöra om endokrina lyhördhet bevarades. Gonadotropiner togs bort för 48 h, under vilken både testosteron och inhibin B koncentrationer minskade signifikant i koncentration. Efter 48 h, gonadotropiner åter till kultur och båda hormonkoncentrationerna ökade betydligt igen under en slutlig 24 h, visar korrekt endokrin-lyhördhet (Figur 4B). Tillsammans visar dessa histologiska och endokrina analysresultat att testikelorganoider är en användbar modell för att studera testikelutveckling (dvs. de novo compartmentalization och tubulogenesis) och somatisk cell testikelfunktion in vitro (t.ex. snäva korsningen bildning och endokrina funktion).
Figur 1: Organoider självmontera i 2D och 3D, ECM och ECM-fria odlingsförhållanden.
5 dpp murine testikelceller odlades i fyra olika villkor: 2D ECM-fri (rad A), 2D ECM (rad B), 3D ECM-fri (rad C), och 3D ECM (rad D). Grafik som skildrar kulturmetoden tillhandahålls i vänsterkolumnen. Representativa bildmontage monterades från timelapsebilder som togs under livekulturen. Tidspunkter för varje bild märks vid toppmarginalen. Tid 0 h är innan någon organoid montering har inträffat, tid 3 h är under pågående cell-driven organoid montering, och gånger 6 h och 9 h demonstrera representativa, framgångsrikt bildade organoider. Gula pilar markerar cellkluster och röda pilar markerar platser där separata cellkluster migrerats och sammanfogats. Alla skalstreck = 1 mm. (E) Tid som krävs innan separata cellkluster kunde synligt uppskattas registrerades för varje villkor. 2DF = 2D ECM-fri; 2DE = 2D ECM; 3DF = 3D ECM-fri; 3DE = 3D ECM. (F) Area per kluster mättes för varje odlingsvillkor. Bilder valdes ut från n= 3 – 5 separata experiment. Enkelriktad ANOVA med Tukeys test av flera jämförelser användes för att fastställa signifikans i 1E och 1F; grafer monterades från hjälpmedlet av n=4 separata experiment. Denna siffra har ändrats från Edmonds och Woodruff37. © IOP Publishing. Reproduceras med tillstånd. Alla rättigheter förbehållna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: 2D ECM och 3D ECM-fria odlade organoider uppvisar delindelning av rörformiga och interstitiella celltyper.
Representativa brightfield och immunofluorescent bilder av självmonterade organoider efter 72 h av kultur. 2D ECM-fria prover avbildades hela fästet, alla andra prover avbildades i 5 μm vävnadssektioner. (A – D) 2D ECM-fri kultur. (E – H) 2D ECM kultur. (I – L) 3D ECM-fri kultur. (M – P) 3D ECM kultur. Cellspecifika markörer som används för analys är märkta på den översta marginalen: Sertoli cellkärnor (SOX9) och cellkroppar (βCatenin), könsceller (DDX4, en pansarkärncellsmarkör), Leydigceller (3βHSD) och peritubulära celler (αSMA). Alla fluorescerande prover var co-färgas för DNA med DAPI. Gula pilar pekar på DDX4-märkta könsceller i den andra kolumnen från vänster, röda pilar pekar på Sertoli-cellkluster i de högra två kolumnerna. Ljusa fältskalas barer = 400 μm, fluorescerande skalstreck = 100 μm. Denna siffra har ändrats från Edmonds och Woodruff37. © IOP Publishing. Reproduceras med tillstånd. Alla rättigheter förbehållna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Organoider utvecklar tubuliliknande strukturer befolkade av sällsynta könsceller.
3D-ECM-fria monterade organoider var odlade i 14 dagar. (A–D) Representant H&E och immunofluorescerande bilder med detaljer om celltyper och vävnadsfunktioner runt tubuliliknande strukturer (TLS); samma organoid avbildas i intilliggande vävnadssektioner som möjliggör jämförelse sida vid sida av morfologiska egenskaper: Leydigceller (3βHSD), peritubularceller (αSMA), Sertoli-cellkroppar (βCatenin), kollagenmembran (COL IV), och Sertolicellkärnor (SOX9); skalstreck = 100 μm. (E – G) Immunofluorescent märkning utfördes mot könsceller, inklusive en pan könscell markör (DDX4), spermatogoniell stamceller markör (SALL4) och meiotically aktiva spermatocyter (SCP3). Mycket förstorade insets skisseras av gula paneler i 3E och 3F. Gröna trianglar pekar på DDX4-märkta celler; Röda pilar pekar på SALL4-märkta celler. (H) Representativ transmissionselektronmikrograf (TEM) av en tät korsning mellan Sertoli-celler inom en organoid; TEM-skalans streck = 100 nm. (I – L) Hög förstoring representativa bilder av en TLS märkt för viktiga funktioner i seminiferous epitel inklusive snäva korsningar (ZO1) och laminin. Samma TLS avbildas i intilliggande vävnadssektioner i panelerna I – L. Alla fluorescerande prover var co-färgas för DNA med DAPI. Bilder valdes ut från n=7 separata biologiska experiment. Denna siffra har ändrats från Edmonds och Woodruff37. © IOP Publishing. Reproduceras med tillstånd. Alla rättigheter förbehållna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Organoider utsöndrar testosteron och inhibin B över 12-veckors kultur som svar på gonadotropiner FSH och hCG.
Konditionerade medier som samlats in från 3D-ECM-fria organoider mättes för testosteron och inhibin B via enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). (A) Organoider var odlade i tolv veckor, med FSH och hCG tillskott under veckor 2 – 12 (början av tillskott är markerad med en röd pil på x-axeln); alla värden jämfördes med dag 7 av kultur för statistiska tester. (B) Förstorad graf av ett "re-stimulation test" för att avgöra om endokrin lyhördhet bevarades efter 12 veckor. Perioden för testet skisseras av den grå rutan i 4A. Vid slutförandet av 12-veckor i kultur, gonadotropins togs bort för 48 h och sedan åter kompletteras för en slutlig 24 h av kultur. Hormoner mättes vid 0, 2, 6, 12, och 24 h efter gonadotropin åter stimulans; rödskuggade områden utse tidsperioder under kultur med FSH och hCG, icke-skuggade områden utse tidsperioder utan FSH och hCG; noterade p-värden är i förhållande till 2 h efter återstimulering. Tvåvägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelses test användes för att fastställa signifikans för alla endokrina data, n=5 separata biologiska experiment. Denna siffra har ändrats från Edmonds och Woodruff37. © IOP Publishing. Reproduceras med tillstånd. Alla rättigheter förbehållna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med slutförandet av denna organoid generation protokoll, kommer användaren att ha fyra olika kultur tekniker tillgängliga för dem för montering testikelkonstruktioner och organoider i antingen ECM eller ECM-fria miljöer. Viktigt, alla fyra metoder tillåter forskaren att icke-invasivt observera organoid självmontering över tiden genom time-lapse imaging eller videoinspelning, och att noninvasively samla betingade medier för analys av utsöndrade hormoner och cytokiner, utan störande vävnader under kultur. I alla metoder, under loppet av 24 h, kan en experimenter generera så många som flera hundra organoider / testikelkonstruktioner, som cellnummer tillåter. Dessa metoder främjar vävnads självmontering till konstruktioner med olika storlek och morfologier; organoid storlek beror på cellen antal och koncentration som används i kultur, som ses i andra organoid rapporter34. Minska organoid storlek eller diameter kan bidra till att minska utvecklingen av inre regioner av nekros som ibland presenterar i större organoider. En särskild styrka 2D ECM och 3D ECM-fria protokoll metoder är deras förmåga att generera morfologiskt mimetic testikel organoids, som innehåller de novo compartmentalization av tubular kontra interstitiell celltyper. Vidare ger 3D ECM-fria monterade organoider en modell för de novo tubulogenesis av seminiferous TLS, med lämpligt uppdelade och orienterade Sertoli och peritubular celler. Detta är en viktig fenotyp för att studera testikelorganoider, och är fortfarande ett varierande utfall bland olika testikelorganoidrapporter; flera andra rapporter saknar tubule kontra interstitium fackinslag och vissa även utveckla en "inside-out tubule" fenotyp32,33,34,38. Medan ingen av de organoid generation metoder som presenteras i föreliggande manuskriptet kännetecknades för att upprätthålla stora könsceller populationer över utökade dagar av kultur, som könsceller observerades sällan så tidigt som 72 h, både 2D ECM och 3D ECM-fria metoder kan ge ett användbart verktyg för att studera in vitro tubulogenesis och den somatiska cellen komponenten i en spermatogonial nisch miljö. Med detta mål i åtanke, testikelorganoider ger en potentiell plattform för att optimera framtida protokoll för att förbättra in vitro sett stamcellsunderhåll, meiotic progression, och differentiering.
En annan fördel med dessa protokoll är möjligheten att anpassa och skala organoid generation. Anpassade, drogbehandlade eller konstruerade cellpopulationer kan ersätta, eller användas utöver, primära mustestikelceller37. Om cell suspensioner är av låg livskraft (<80%), bör metoder vidtas för att förbättra cellens livskraft cellen suspension. Dessa kan vara att minska tiden i dissociation media och minimera trituration under vävnadsuppslutning (steg 2.4.1 – 2.5.2), öka antalet tvättar efter dissociation, eller ta bort döda celler efter dissociation med cell-sortering eller död-cell märkning kit. Inget av dessa steg var dock nödvändigt för att ta fram de representativa uppgifter som delades i denna rapport. För 2D- och 3D ECM-odlingsmetoder kan dessa protokoll användas med andra strukturella proteinbaserade biomaterialmatriser utöver de som används för de studier som presenteras här. Dessa andra biomaterial inkluderar kollagen, gelatin, kommersiellt tillgängliga ECM-extrakt, och skräddarsydda decellulariserade ECM-härledda hydrogeler25,26,28. Det finns några pekare för problem-skytte ECM gel dispensering och skapa högkvalitativa agaros 3D Petri skålen skär. Vid gjutning ECM geler på kammarplattor, se till att arbeta snabbt och använda kall pipett tips för att förhindra för tidig polymerisering av ECM inom ett rör eller pipett spets före dispensering i odlingsskålen. Vid gjutning smält agaros i 3D Petri skålen formar (för 3D ECM-fri kultur), använd endast varm och inte varm agaros för att säkerställa hög kvalitet gjutning av skären med minimal variation, och kontrollera att agaros har helt kylts till rumstemperatur och stelnat innan du försöker ta bort från formen. Agarose 3D Petri rätter hanteras bäst försiktigt med fina timkraft. När samla organoider för fixering, se till att arbeta under en dissekering mikroskop för att visualisera insamling av alla organoider. Organoider kan hålla sig till den plastiska sidan av kulturrätter och insidan av pipettspetsar; glaspipetter uppvisar mindre organoid följsamhet än plast. Fastställande organoider medan fortfarande inkapslade inom eller ovanpå ECM är en mer utmanande och känslig process än att ta bort dem från ECM före fixering. Vävnad bearbetning gel kan gjutas ovanför ECM-organoid konstruera före avlägsnande från odlingskammaren för att förstärka gelen före fixering39. Fixering bör utföras vid rumstemperatur för att hämta ECM hydrogels eftersom de sannolikt kommer att avpolymerisera om de sänks till 4 °C. Dessutom kan 0,1 % - 1,0 % glutaraldehyd läggas till 4 % PFA-lösningen för att hjälpa till att ytterligare korslänka ECM; emellertid, denna metod ökar bakgrund autofluorescens av provet.
Det finns avsevärda cellcellsspecifika begränsningar för de resultat som uppnåtts med de organoida genereringsmetoder som presenteras ovan och som representerar prioriterade områden för framtida innovation. Könsceller är dåligt stöd över utökad kultur, är endast lätt observeras under de första dagarna av kultur och sällan observeras i slutet av den första veckan av kultur och vid senare tidpunkt punkter. Medan odifferentierade spermatogonia kan upprätthållas inom in vitro-cellkultur samtidigt som deras förmåga att återställa spermatogenesen vid transplantation i in vivo-tubuli40, den tubule somatiska mikromiljö (dvs. direkt Sertoli cell interaktioner) är hypotesen att vara en förutsättning för att differentiera pre-meiotiska könsceller in i och genom meios och spermiogenesis in vitro1,5,40,41. Testikelorganoider som innehåller spermatogonia vid tidiga tidpunkter inom en strukturellt mimtisk TLS kan göra det möjligt för fältet att icke-invasivt studera somatisk-somatisk, och somatisk-könsceller interaktioner helt in vitro. Optimering av medietillsatser och cellberedning före odling (t.ex. inkorporering av medel som används för spermatogaromärendestamcellsodling in vitro)42,43 kan öka utbytet av könsceller i framtida studier, särskilt över odlingsperioder längre än flera dagar. Omvänt, metoder för att återinföra spermatogonia efter TLS har bildats, såsom genom mikroinjektion, utgör en intressant möjlighet att återställa könsceller inom organoider, och testa förmågan hos in vitro organiserad somatiska miljöer för att upprätthålla könsceller. Andra biologiska faktorer har observerats påverka ex vivo explant kultur, inklusive ålder/ mognad45 och genetiska bakgrundsskillnader17. Samma variabler har ännu inte direkt undersökts inom området testikelorganoidbiologi. Det är dock rimligt att olika monterings-, morfologi- och funktionella fenotyper kan bli följden när organoider genereras från celler som isolerats från olika åldersdjur (dvs. neonatal, juvenil, vuxen), eller djur med varierande genetisk bakgrund (t.ex. olika musstammar).
Sammanfattningsvis ger de tekniker som delas i detta manuskript fyra användbara modeller för att studera cell-driven testikelkonstruktion självmontering, generering av två separata strukturellt mimetiska testikelorganoidmodeller och den viktiga uppnåendet av TLS utveckling och hormon-lyhörd endokrin funktion in vitro. Dessa modeller omfattar 2D- och 3D-rumsliga orienteringar i ECM- och ECM-miljöer med minimalt komplexa, helt definierade kulturmedier. Varje metod är mycket reproducerbar och använder endast allmänt tillgängliga kulturresurser. Dessa metoder kan visa sig fördelaktigt för att studera testikel morfogens in vitro och optimera framtida kultur villkor för in vitro spermatogenes. Mer så, 2D ECM och 3D ECM-fria metoder ger ett nytt verktyg för att studera processen för de novo vävnad fackindelning unika för testi, in vitro tubulogenesis och somatiska-somatiska och somatiska-könsceller cell interaktioner. Testikelorganoider ger en flexibel och skalbar möjlighet att undersöka utvecklingen och regleringen av somatiska testikelfysiologiska kontrollstämplar; inklusive blodtestspärren och endokrin produktion och reaktion, och, även, ett användbart verktyg för att utveckla nästa generations translationella modeller för forskning vävnad. Dessa inkluderar införliva reproduktiva hormoner i större system-nivå modeller, såsom vävnad-på-en-CHIP och mikro-fysiologiska plattformar45,46. Andra translationella mål mot vilka testikelorganoider en dag kan tillämpas inkluderar reproduktiv toxikologi och immunologisk barriärtestning, manlig preventivmedelsutveckling och assisterad innovation inom reproduktiv teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 och 4UH3ES029073-03, och Thomas J. Watkin's Memorial Professorship.
Författarna vill tacka Eric W. Roth för deras hjälp med transmissionselektronmikroskopi. Detta arbete använt sig av BioCryo anläggningen i Northwestern University's NUANCE Center, som har fått stöd från Soft och Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); MRSEC-programmet (NSF DMR-1720139) vid Materials Research Center; internationella institutet för nanoteknik (IIN); och staten Illinois, genom IIN. Det gjorde också använda av CryoCluster utrustning, som har fått stöd från MRI programmet (NSF DMR-1229693). Grafik i figur 1 utformades med hjälp av BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
References
- Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
- Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
- Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680 (2019).
- Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
- Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
- Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
- Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472 (2011).
- Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472 (2016).
- Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884 (2018).
- Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
- Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
- Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
- Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
- Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
- Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
- Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
- Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227 (2018).
- Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
- Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
- Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
- Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011 (2019).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
- Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002 (2020).
- Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15 (2011).
- Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
- Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
- Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
- Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
- Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171 (2015).
- Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
- Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017 (2020).
