Summary
在这里，介绍了从原发性新生儿穆林睾丸细胞生成睾丸器官的四种方法，即细胞外基质 （ECM） 和无 ECM 的 2D 和 3D 培养环境。这些技术具有多种研究应用，特别适用于研究睾丸发育和体外生理学。
Abstract
睾丸器官为研究体外睾丸发育、精子生成和内分泌学提供了工具。为了制造睾丸器官，已经开发出几种方法。许多这些方法依靠细胞外基质（ECM）来促进新组织组装，然而，在仿生形态和组织功能方面，方法之间存在差异。此外，对已发布的方法几乎没有直接的比较。在这里，通过研究器官生成协议的差异，提供结果，进行直接比较。介绍了四种原型生成方法：（1） 2D 无 ECM、（2） 2D ECM、（3） 3D ECM 无和 （4） 3D ECM 培养。三个主要基准用于评估睾丸器官生成。这些是细胞自组装，包括主要细胞类型（Sertoli，Leydig，细菌和围膜细胞），以及适当的分立组织结构。在测试的四个环境中，2D ECM 和 3D ECM 培养物生成具有与原生睾丸最相似的内部形态的有机体，包括管状细胞与间质细胞类型的去新隔离、类似管状结构的发展以及已建立的长期内分泌功能。研究的所有方法都利用了未排序的原发性睾丸细胞悬浮液，并使用了常用的培养资源。这些睾丸器官生成技术为睾丸器官生成和体外生理学的研究举措提供了高度可访问和可重复的工具包。
Introduction
睾丸器官是研究睾丸发育、精子生成和体,外1、2、3、4,2的生理学的开创性技术。已探索了几种方法，用于组织生成;其中包括各种细胞外基质 （ECM） 和无 ECM 培养系统，包括二维 （2D） 和三维 （3D） 方向。不同的生成方法可以促进不同的细胞组装策略;这导致已发表的器官模型之间的形态和功能变异程度很高。本文的目的是讨论体外睾丸模型的当前状态，并在设计睾丸器官实验时作为未来研究者的模型。本研究确定了四种不同的培养系统原型，并在实验过程和生物结果中进行了描述和描述。这些包括：2D ECM 无 ECM、2D ECM、3D ECM 无和 3D ECM 培养方法。本文介绍的策略旨在在不同的实验室和研究组之间简单、易于访问和高度可重复。
从历史上看，睾丸的指定"体外"，已被用于睾丸组织和细胞的几种不同的培养方法。这些包括有机组织/器官培养方法（即外植培养）5、分离的半纤维培养6、睾丸细胞培养7，以及新组织形态生成方法（即生物构造和器官）1。第一次对体外精子发生的调查是在大约100年前进行的，1920年8月，兔子睾丸的培养，后来于1937年与小鼠外植9。在这些最初的实验中，观察到精子在培养的第一周大体退化，尽管发现了一些具有美色区分的细胞。回想这些历史报告，睾丸外培养在2011年恢复和优化，成为一个可行的技术，研究睾丸10。自2011年以来，在11、12、13的多个报告中，植外培养已经产生了生育能力强的精子。然而，由于植物外培养对预先存在的原生睾丸的依赖，这些最近的进步被更准确地描述为"外活"睾丸功能和精子生成的例子，组织功能从生物体的身体中去除后保持或恢复。尽管它在文献中流行，但长期的生殖细胞维持和睾丸外植分化是具有挑战性的复制14，15，16，17，18，特别是在足够长的时间充分观察体外精子发生（+35,15,16,17,18天在小鼠19和74在人类20）。有趣的是，许多相同的挑战经历了100年前，仍然经历在外体精子发生今天。
与外体方法不同，睾丸器官是完全从细胞源（即原发性睾丸细胞）在体外产生的。睾丸器官提供了一个创造性的策略，以规避该领域对预先存在的原生组织的历史依赖，并完全在体外重述睾丸生物学。大多数器官组织模型有多种共同要求;其中包括（1）体内膜状组织形态或结构，（2）代表组织的多种主要细胞类型，（3）自组装或自组织在它们的生成，和（4）模拟一定水平的表示组织的功能和生理的能力21，22，23，24。,22,23,24对于睾丸，这可以在四个主要特征中捕获：（1） 包含主要睾丸细胞类型， 细菌、Sertoli、Leydig、围膜和其他间膜细胞，（2）细胞定向组织组装，（3）适当分离细胞类型，分为单独的管状隔间（细菌和Sertoli）和间膜区域（所有其他细胞类型），以及（4）某种程度的组织功能（如生殖激素分泌或组织反应，以及生殖细胞维持和分化）。考虑到在维持生殖细胞分化外体和体外方面的历史挑战，在体内-哑膜睾丸结构（即类似半膜状管状结构）的回顾，以及暗示睾丸生理学模拟（例如内分泌功能）的其他标记，是生成有朝一日可能维持体外精子生成器官的优先里程碑。
大多数已发表的睾酮类药物都利用了市售的 ECM（例如胶原蛋白或专有 ECM 配方）25、26、27,26,27或定制来源的 ECM（即去细胞化睾丸 ECM 衍生水凝胶）28、29、30。28,29,30外源 ECM 通过提供用于组织生成组装支持的支架来促进非新组织的形成。ECM方法提供了令人印象深刻的组织形成水平，包括一些生殖细胞的存在和组织-模仿形态25，28。25,但是，它们利用的 ECM 并不总是通用的（即去细胞化 ECM 衍生水凝胶），并且某些方法需要复杂的凝胶和细胞播种方向（例如，ECM 的 3 层梯度和 3D 打印）25、31,31、32。,无脚手架方法（如吊滴和非坚固培养板）33、34、35也产生了坚固且高度可重复的有机体，无需ECM凝胶或脚手架。33,34,35然而，这些无支架器官的组织形态往往与体内睾丸不同，这些报告中大多数都含有生化ECM添加剂，以促进组织形成33、34、36，,34,36或者依靠离心进行强制细胞聚集和压实34，使得它们不太适合研究细胞定向迁移和自组织。
本手稿中介绍的四种器官生成方法包括 ECM 依赖和独立策略，每种策略都使用简单的细胞播种，从而能够观察细胞驱动的器官自组装。所有四种技术都可以从相同的细胞悬浮液中执行，也可以利用自定义和细胞类型的富集种群。这些方法的强项是能够实时观察器官自组装，并直接比较睾丸结构在不同文化微环境之间如何自我组装。这四种文化方法之间的表型差异，对于研究者的研究问题或课题的影响，应考虑它们。每种方法在24小时或更小范围内产生生物构造或器官。总之，本文介绍的方法为研究睾丸器官组装、组织发育和体外睾丸生理学提供了器官组装技术工具包。
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Protocol
所有小鼠实验都得到西北大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，所有程序都根据国际动物保护委员会批准的议定书进行。
1. 酶组织分离解决方案的制备
- 使用两种不同的酶解决方案（解决方案 1 和解决方案 2），这两种解决方案都是使用基底培养基介质解决方案 （BM） 制造的。
- 要准备BM，将血清和青霉素-链霉素添加到最低基本介质到最终浓度的10%和1%（ 参见特定试剂 材料表）。然后通过 0.22 μm 过滤器对 BM 进行无菌过滤。与细胞一起使用之前，通过配入培养皿并将5%CO2 培养箱置于37°C下，至少1小时，将无菌BM预平衡至中性pH。
注：BM 可储存在 4 °C 长达 1 周，之后应制作新鲜 BM。 - 要制备胶原酶 I 库存溶液，首先将 100 毫克胶原酶 I 溶解成 1 mL 的无菌胚胎 H2O（最终浓度 10% m/v），反转或涡流溶解，并在 -20 °C 下储存 20 μL 等分，供以后使用。阿里语只能解冻一次。
- 为了制备脱氧核糖核酸酶一（DNase I）库存溶液，将20毫克DNase I加入1 mL的无菌胚胎H2O（最终浓度2%m/v），反转或涡流溶解（不要涡流），并在-20°C下储存20μL等分，供以后使用。阿里语只能解冻一次。
- 对于 hyaluronidase 库存溶液，将 30 mg 加入 1 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS;最终浓度 3% m/v hyaluronidase 在含有 Ca+/Mg+） 的PBS 中，反转或涡流溶解，并在 -20°C 下储存 100 μL 等物，供以后使用。可多次解冻和重新冷冻，而不会损失酶活性。
- 为了制备分离溶液 1，加入10μL胶原酶 I 和 10 μL DNase I 到 1 mL 的无菌，预平衡 BM（最终浓度：1 mg/mL 胶原酶 I 和 5 μg/mL DNase I）。用移液器轻轻搅拌，混合溶液，预热至37°C，然后与组织一起使用。
注：溶液2是通过将溶液1的1 mL添加33μL的海卢罗尼达酶（预后至37°C）（最终浓度为1mg/mL）制备的。这发生在中途通过酶分离睾丸组织在步骤2.5下。
2. 睾丸组织分离
注：所有小鼠都存放在聚丙烯笼子里，并配有食物和水。动物被喂去辐照的周，其中不含植物雌激素。少年CD-1小鼠，产后5天（dpp），用于安乐死和组织收集之前的所有实验和麻醉，在麻醉室内连接到异氟烷蒸发器（2.5 L/min在O 2）。小鼠因对头趾刺没有反应而被确认为全身麻醉，之后小鼠通过斩首被安乐死。
- 麻醉小鼠在异氟体室，确保麻醉通过一个头角，然后用锋利的剪刀斩首小鼠。将安乐死小鼠在解剖垫上，用70%乙醇对腹部进行消毒。用钳子将下腹部的皮肤帐篷，用剪刀打开腹部。
- 在腹部的左下、右下部区域找到睾丸。切断它们与血管和任何锚定结缔组织的连接，然后从动物中抬起整个睾丸（仍然附着表皮）。将睾丸放在预平衡 BM 的培养皿中。
- 在解剖显微镜下和在无菌场内，用一个小的微解剪刀或使用两个细钳轻轻撕裂，在每个睾丸的一端的图尼卡阿尔布吉纳做一个小切口。
- 然后，当从切口的另一端握住睾丸时，用细钳轻轻挤压睾丸，然后轻轻的扫地运动向图尼卡的孔推进;这将释放睾丸组织作为一个内聚的一块。
- 将睾丸切成更小的≤（2 mm3），并放入1 mL预热（37°C）分离溶液1。
- 在37°C下孵育10分钟。
- 对于超过 10 个睾丸，将总分离溶液体积增加 1 mL，确保每 10 个睾丸至少 1 mL 分离溶液（例如，20 个睾丸 2 mL，30 个睾丸 3 mL 等）。
- 使用 P1000 移液器在溶液 1 中轻轻三角 50 倍（50 倍）的睾丸。确保此时的管状分开，从间状组织分离。如果团块仍然存在，再孵育5分钟，再三酸酯（50倍）。
- 每1 mL溶液1分离混合物（含有部分分离的睾丸组织和管子）加入33μL的海卢罗尼达塞库存溶液（在37°C下预热，从步骤1.5开始）。添加 hyaluronidase 后，这称为解决方案 2。
- 使用 P1000 进行三酸酯 （50 倍），在 37 °C 下孵育 5 分钟。
- 使用 P200 移液器进行三酸酯 （50 倍）。
- 确保此时不存在可见的团或细胞团。如果团块持续，孵育时间长达5分钟，使用P200移液器（50倍）进一步三分。
- 通过将胎儿牛血清（FBS）添加到溶液总体积的10%2，将分离酶淬火。使用 P200 移液器多次三次三酸化，以确保没有团块，并通过 40 μm 细胞滤株过滤以产生单细胞悬浮液。
- 在100 x g下离心 细胞7分钟，丢弃上一代，并在新鲜BM中重新产生细胞。
- 使用血细胞计上的 trypan 蓝色排除数值总和可行的细胞浓度。加入10μL的1：1稀释，细胞悬浮液：尝试蓝色溶液，放入血细胞计细胞计数室（ 见材料表）。
- 以 100 x g 重新离心机 7 分钟，并在新鲜 BM 中重新发送。
注：仅使用可行细胞计算细胞浓度和数量。仅使用细胞悬浮液≥ 80% 的生存能力生成有机体。 - 将单细胞悬浮液准备到所述细胞浓度中，以便根据以下第 3 节中协议特定步骤中使用的体积等分 280，000 个细胞：2D ECM-无 - 0.56 x 106 6 细胞/mL， 2D ECM = 0.56 x 106 6 细胞/mL，3D ECM-无 - 4.66 x 106 6 细胞/mL，3D ECM = 2.8 x 106 细胞/mL。
注：这里介绍的所有培养实验都从每个培养的280，000个细胞开始。这些数字与图1、图 2、图 3和图 4 中的代表性数据相匹配。
- 以 100 x g 重新离心机 7 分钟，并在新鲜 BM 中重新发送。
3. 组织培养皿的准备和细胞的播种
注：为确保 ECM 均匀，在试验前一夜预解冻 ECM 的冻结等等。ECM 等分应浸入 4°C 冰箱或冷藏室内的一桶冰中，以保证温度缓慢、逐渐升高。所有 ECM 在 BM 中的 1：1 最终稀释时用于培养。将解冻的 ECM 和 1：1 稀释的 ECM 留在冰上，直到使用前，否则 ECM 可能会过早聚合。
- 对于无 2D ECM 培养，无需特殊制备，将板单单元悬浮液（500 μL 的 0.56 x 106 6 细胞/mL 在 BM 中）直接放到 4 井腔腔间滑梯上，并放入 35°C 培养箱进行培养。
注意：细胞应在培养的24小时内粘附在培养皿的底部，并可能同时表现出一些小型的3D细胞簇。 - 对于 2D ECM 培养，将 100 μL 的冷 1：1 稀释的细胞外基底基质介质分配到 4 井室滑盘中，确保凝胶覆盖整个菜底。
- 将腔室滑轨放入 35°C 培养箱中至少 30 分钟，使 ECM 能够聚合到凝胶中。
- 聚合后，将细胞悬浮液（500 μL的0.56 x10 6 6 6细胞/mL在BM中）直接添加到2D凝胶的顶部。
注意：细胞应聚集在一起，在培养的 24 小时内形成小型 3D 群集。
- 对于 3D ECM 培养，在开始细胞培养之前，请准备 agarose 3D 培养皿插入件。
- 首先，在100 mL烧杯中下1.5克阿加糖粉，然后加入75 mL无菌、蒸馏水和微波，为3D Petri盘铸造产生熔融的2%阿加糖。
- 在无菌工作空间内，将熔融的糖分入 3D Petri 盘模中，直到半月板与模具的两侧平。
- 让加糖冷却和凝固。当固体时，将模具倒置，轻轻弯曲，直到阿加罗斯 3D Petri 盘从模具中脱落。
注意：在这一点上，你可以准备许多阿加罗斯3D培养皿，并把它们储存在无菌的H2O或DPBS在4°C超过一个月。 - 在栽培之前，将阿加罗斯3D培养皿放入24个井文化菜肴中，用1 mL的BM覆盖它们。让 3D 培养皿在 BM 中平衡至少 30 分钟，在 37 °C 培养箱内。丢弃 BM，再用 1 mL 新鲜 BM 重复平衡。在 BM 中平衡 3D 培养皿后，它们将显示与 BM 相同的颜色（即粉红色）。
- 为了准备细胞播种，从井中去除所有BM，并分配200μL的新鲜BM周围，但不是在3D培养皿的中心凹槽内。此外，从微井插入的中心细胞种子凹槽内收集任何剩余的BM。
- 将单细胞悬浮液（4.66细胞/mL，60μL的BM）分配到阿加罗斯3D培养皿的中心凹槽中。轻轻上下三角混合细胞，保证培养开始时的单个细胞悬浮液。
- 放入加湿的 35°C 培养箱中，用于培养。第二天，从微井刀片周围取出 200 μL 的 BM，然后更换为 1 mL 的新鲜 BM。这将把液位高于插入物的平面，淹没整个区域性。
- 慢慢地小心地从阿加罗斯 3D 培养皿外取出/添加介质。器官应该在一夜之间压实，允许它们在底部休息，使介质变化使器官不受干扰。
- 对于 3D ECM 培养，通过将 BM 中的电池悬浮液与冷、预解冻 ECM（最终浓度 = 2.8 x 106 6 电池 /mL）在相同部分中组合，准备单个单元悬浮液。
- 立即将电池-ECM 混合物分配到 4 井室滑轨中，确保混合物覆盖整个板底。
- 将腔室在 35°C 下滑入培养箱中，让其内装物聚合。这至少需要 30 分钟。聚合后，在培养基顶部加入500μL的BM。
注意：细胞应该聚集在一起，在培养的 24 小时内形成小型的 3D 聚合。
4. 有机体维护
- 培养所有有机体模型类型在35°C。 对于所有文化类型，每 2 天使用一次新鲜 BM 交换一半的媒体。为确保在交换介质时不会意外收集有机体，请始终从室内幻灯片盘的一角，以及从 agarose 3D Petri 盘外的外部点缓慢收集介质。所有介质都可以储存在-20°C，用于免疫分析或其他分析以后（即分泌生殖激素或细胞因子的定量）。
- 在培养7天后，使用BM含有卵泡刺激激素（最终浓度20 mIU/mL）和人类胆碱性腺激素（最终浓度4.5 IU/mL）。这适用于所有器官培养类型。
- 定期成像所有器官培养物（即延时成像），以描述器官形成特征，并量化自组装、发育和一段时间增长的指标。
5. 有机体收集
注：所有器官都可以在PBS中用4%的半形式醛固定，用于下游免疫标记和组织学分析。在室温下旋转2小时，或在4°C下过夜。
- 对于无 2D ECM 培养物，首先使用新鲜的 PBS 冲洗样品，然后直接在粘附结构上添加固定剂。
- 对于 ECM（2D 和 3D）培养方法，使用 PBS 冲洗一次，然后直接在 ECM-器官样品的顶部添加固定剂（将 ECM 凝胶和有机体固定在一起），或者轻轻地上下移液管，将其从周围的 ECM 中释放出来，然后转移到单独的管上进行固定。
- 对于无 3D ECM 培养，在 agarose 3D 培养皿的中心凹槽内轻轻移液管风琴;这将冲洗出器官， 方便他们很容易收集与移液器。然后将器官转移到单独的管子中进行固定。
- 在加工成石蜡之前，将许多有机物（≥20）嵌入组织加工凝胶的小体积（±30μL）中;这有助于将器官定向和浓缩到石蜡块内的一小块区域中，便于在石蜡块内进行剖切和更容易的视觉识别。
注：在石蜡嵌入和切块在微原子上之后，器官可能具有挑战性。
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Representative Results
如果睾丸细胞在培养的72小时内没有自组装，则有机细胞生成被认为是不成功的，然而，在使用幼细胞（5 dpp）时，这里提供的所有方法在24小时内组装。生物构造生成的失败呈现为自由悬浮细胞的延续（图1中的0 h列）， 即使在扩展培养（72小时）之后。在没有组织自组装的情况下，任何明显的细胞簇在轻轻操作（即移液）后也很容易分散到单个细胞中。成功生成的组织最初被观测为3D细胞"集群"（图1的6小时列中的 黄色箭头）。在无 ECM 环境（2D 和 3D）中，这些构造在培养的 24 小时环境中明显"紧凑"，尤其是在 3D 阿加罗斯培养皿中（图1A，C） 。在 ECM 环境中（2D 和 3D）单元群集在群集与其周围环境之间具有清晰的边距（图 1B，D）。还观察到细胞簇在 ECM 之间迁移并熔合在一起形成更大的聚类（图 1B 中的红色箭头）。测量了欣赏独立自组装结构所需的时间，2D 和 3D ECM 无 ECM 条件和 2D ECM 之间所需的时间差异没有显著差异，但是，3D ECM 培养需要比所有其他培养方法更多的时间来组装 de novo 结构（图 1E）。2D 无 ECM 和 3D ECM 培养生成比 2D ECM 和 3D 无 ECM 培养方法尺寸小得多的单元组;3D ECM 培养产生最大的聚类，在 3D agarose Petri 盘的每个井内都有一个大而紧凑的聚类（图 1C，F）。总之，这些数据说明了在四个原型培养环境中从幼鼠原细胞中产生睾丸生物构造的易用性，并突出了这些不同培养环境中不同的细胞导向组装表型。
所有器官模型的目标是重述原生组织的内部形态模仿。为了评估这一结果，在每个培养条件下组装的生物结构被培养72小时，然后探测细胞特异性标记物，并用免疫荧光可视化（图2）。不同培养方法之间观察到组织形态的变异性。2D ECM 无器官呈现为 Sertoli 细胞（SOX9 和 αCatenin）的簇状，与一些生殖细胞（DDX4，一个泛生殖细胞标记）粘附在包含许多体细胞的 2D 基底汇聚层上，包括 Sertoli、围膜 （μSMA） 和 Leydig 细胞 （3+HSD） （图 2A-D）。请注意， 图 2B-D 是整个 2D 无 ECM 样品的荧光图像，而不是 5 μm 部分;这实现了基础体细胞层的可视化，以及Sertoli和生殖细胞的优越导向聚合。相比之下，2D ECM 培养具有完全不同的表型，因为在基底 ECM 凝胶顶部很容易识别出具有不同边界的清晰生物结构（图 2E）。这些结构具有复杂的内部 形态，与 睾丸的间层细胞类型不同，具有非新分型，因此被认为是成功的器官。管状区域包含Sertoli、围膜和生殖细胞，间体区域包含LeyDig、围膜细胞和非标记细胞（图2F-H）。同样，3D无 ECM 器官也具有分门别类的内部形态，因此被认为是成功的器官。特别是，3D无 ECM 器官由含有卵管细胞的管状区域进行区分，这些细胞专门围绕高保真的 Sertoli 和生殖细胞组（图 2I-L）。3D ECM 组装结构并不具有复杂的形态，而是观察到是 Sertoli 细胞群，偶尔有细菌和 Leydig 细胞。在这些样本中，许多Sertoli和未标记的细胞仍然悬浮在器官之间，以"类频"方向（图2M-P）。这些数据共同突出了不同器官生成方法产生的形态表型的变异性，并支持使用两种特定的有机体组装环境，即 2D ECM 和 3D ECM，用于生成具有睾丸分块内形态高度模仿的睾丸器官。
为了进一步评估睾丸器官功能，选择了3D无ECM组装的器官进行更深入的长期分析。在这项研究中，这些器官被培养了14天，然后探究细胞和结构特异性标记。在14天的免疫荧光分析中，观察到3D无 ECM有机体含有类似管状结构（TLS）和组织结构，与体内睾丸非常相似（图3A-D）。间分裂细胞位于与TLS不同的区域。然后对泛生殖细胞标记、DDX4、精子干细胞标记、SALL4和美病标记SCP3（图3E-G）进行组织部分的探测。观察到罕见的DDX4阳性和SALL4阳性细胞，但是，没有SCP3信号被识别。在TLS的更深表征后，观察到它们包含一个流明出现的空间，周围是极化Sertoli细胞和外层围膜细胞（图3I-L）。Sertoli细胞还表现出彼此之间的紧密交汇点，如透射电子显微镜和标记ZO-1，一种结蛋白和血睾丸屏障的成分（图3H，L）。其次，对12周长期培养的内分泌功能进行了3D ECM无器官研究，用性腺激素刺激（图4）。睾酮和血红素B，分别来自莱迪格和Sertoli细胞的生殖激素，都从器官条件介质中识别和量化（图4A）。在培养的12周内，测量这两种激素对性腺激素FSH和hCG的补充剂有显著反应（红色箭头表示补充的开始，在第2周至第12周）。完成后，执行了测试，以确定内分泌反应能力是否得到保留。戈纳多罗平被移除48小时，在此期间，睾酮和内辛宾B浓度显著降低浓度。48小时后，腺腺激素被恢复培养，两种激素浓度在最后24小时再次显著增加，显示出适当的内分泌反应（图4B）。这些组织学和内分泌测定结果表明，睾丸器官是研究睾丸发育（即去新分型和输卵管发生）和体外体体体体体体体体体细胞睾丸功能（例如紧密结形成和内分泌功能）的有用模型。
图 1：有机体在 2D 和 3D、ECM 和 ECM 无培养条件下自组装。
5 dpp murine 睾丸细胞在四种不同的条件下培养：2D 无 ECM（A行）、2D ECM（B行）、3D ECM-无 （C行）和 3D ECM（D 行）。左侧列中提供了描述区域性方法的图形。代表性图像蒙太奇由现场文化中拍摄的延时图像组装。每个图像的时间点都标在上边距处。时间 0 h 是任何器官组装发生之前，时间 3 h 是在正在进行的细胞驱动器官组装期间，并且时间 6 小时和 9 小时证明具有代表性，成功形成器官。黄色箭头标记单元格群集，红色箭头标记单独的单元格群集迁移和合并在一起的位置。所有比例杆 = 1 mm. （E） 每个条件都记录了单独的细胞簇可以明显升值之前需要的时间。2DF = 2D 无 ECM;2DE = 2D ECM;3DF = 3D 无 ECM;3DE = 3D ECM。（F） 每个聚类的面积都测量了每个区域性条件.图像是从n=3=5单独的实验中选择的。使用具有 Tukey 多重比较测试的双向 ANOVA 来确定 1E 和 1F 中的重要性;图形是利用n=4独立实验的进行组合的。这个数字已经修改从爱德蒙和伍德拉夫37。© IOP 发布。经许可复制。保留所有权利。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：2D ECM 和 3D 无 ECM 培养的有机体表现出管状细胞和间质细胞类型的分型。
具有72小时培养后自组装器官的亮场和免疫荧光图像的代表。2D 无 ECM 样品被成像整个安装，所有其他样品在 5 μm 组织部分成像。（A + D） 2D 无 ECM 培养。（E = H） 2D ECM 培养。（I = L） 3D 无 ECM 培养.（M + P） 3D ECM 培养.用于分析的细胞特异性标记标记在上边距上：Sertoli 细胞核 （SOX9） 和细胞体 （+卡泰宁）、生殖细胞 （DDX4，泛生殖细胞标记）、Leydig 细胞 （3+HSD） 和围膜细胞 （μS+MA）。所有荧光样品都与DAPI共同染色DNA。黄色箭头指向左侧第二列中 DDX4 标记的生殖细胞，红色箭头指向右两列中的 Sertoli 细胞簇。亮场刻度杆 = 400 μm，荧光刻度杆 = 100 μm。这个数字已经修改从爱德蒙和伍德拉夫37。© IOP 发布。经许可复制。保留所有权利。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：有机物发展由稀有生殖细胞填充的结核状结构。
3D-ECM 无 ECM 组装的有机体被培养 14 天。（A=D）代表性 H&E 和免疫荧光图像，详细说明细胞类型和组织特征围绕管状结构 （TLS）;在相邻组织部分描绘了相同的器官，从而能够并排比较形态特征：Leydig 细胞（3+HSD）、围膜细胞（μSMA）、Sertoli细胞体（+卡泰宁）、胶原膜（COL IV）和Sertoli细胞核（SOX9）;比例线 = 100 μm。（E + G）对生殖细胞进行免疫荧光标记，包括泛生细胞标记（DDX4）、精子干细胞标记（SALL4）和美的活性精子细胞（SCP3）。高度放大的内集由 3E 和 3F 中的黄色面板勾勒出。绿色三角形指向 DDX4 标记的单元格;红色箭头指向 SALL4 标记的单元格。（H） 有机体内Sertoli细胞之间紧密结的代表性传输电子显微图（TEM）;TEM 刻度杆 = 100 nm。（I = L）标有半膜上皮主要特征（包括紧密结 （ZO1） 和层压的 TLS 的高放大率代表性图像。在面板 I + L 中的相邻组织部分中描绘了相同的 TLS。所有荧光样品都与DAPI共同染色DNA。图像是从n=7单独的生物实验中挑选的。这个数字已经修改从爱德蒙和伍德拉夫37。© IOP 发布。经许可复制。保留所有权利。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：有机物分泌睾酮和内辛宾B超过12周的培养，以回应性腺激素FSH和hCG。
通过酶链接免疫吸附剂测定（ELISA），测量了从3D-ECM无器官收集的条件介质，用于睾酮和英希宾B。（A） 有机体培养十二周，在第2至第12周补充FSH和hCG（补充开始时在x轴上标有红色箭头）;所有值都比较了第 7 天的区域性统计测试。（B） 放大"再刺激测试"的图，以确定内分泌反应能力在12周后是否得到保留。测试周期由 4A 中的灰色框勾选中。在完成12周的培养时，将去除18小时，然后重新补充，进行最后24小时的文化。激素在 0、2、6、12 和 24 小时时在性腺激素重新刺激后测量;红色阴影区域使用 FSH 和 hCG 指定区域性期间的时间段，非阴影区域指定没有 FSH 和 hCG 的时间段;注意到的 p 值相对于重新刺激后 2 小时。采用Tukey的多重比较测试的双向 ANOVA 用于确定所有内分泌数据的意义，n=5 单独的生物实验。这个数字已经修改从爱德蒙和伍德拉夫37。© IOP 发布。经许可复制。保留所有权利。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
随着此器官生成协议的完成，用户将有四种不同的培养技术可供他们组装睾丸构造和无 ECM 环境中的器官。重要的是，这四种方法都允许研究人员通过延时成像或录像，在一段时间内对器官自我组装进行非侵入性观察，并且能够无创地收集条件介质来分析分泌的激素和细胞因子，而不会在培养过程中干扰组织。在所有方法中，在24小时过程中，实验者可以生成多达数百个器官/睾丸构造，如细胞数允许。这些方法促进组织自组装成具有不同大小和形态的构造;器官大小取决于培养物中使用的细胞数量和浓度，如其他器官报告34中所见。减少器官大小或直径可能有助于减少坏死的内部区域的发展，而坏死有时呈现在较大的器官中。2D ECM 和 3D ECM 无协议方法的一个特别强度是它们能够生成形态性模仿睾丸器官，包含管状细胞与间质细胞类型的去新分型。此外，3D ECM 无组装的器官为半纤维TLS的去新管生成提供了模型，具有适当分型和定向的Sertoli和围膜细胞。这是研究睾丸器官的重要表型，在不同睾丸器官报告中仍然是一个可变的结果;多个其他报告缺乏浴缸与间型分块，有的甚至发展出"从内到外的浴缸"表型32，33，34，38。32,33,34,38虽然本手稿中介绍的有机体生成方法都没有在长期培养期间保持大量生殖细胞群，因为早在 72 小时就很少观察到生殖细胞，但 2D ECM 和 3D ECM 无生成方法可能为研究体外管状发生和精子利基环境中的体细胞成分提供了有用的工具。基于这一目标，睾丸器官提供了一个潜在的平台，优化未来的协议，以改善体外生殖质干细胞维持，美的进展和分化。
这些协议的另一个优点是能够自定义和缩放器官生成。定制、药物治疗或工程细胞群可以取代或使用原发性小鼠睾丸细胞37。如果细胞悬浮液的生存能力较低（<80%），应采用提高细胞悬浮液细胞生存能力的方法。这些措施包括减少分离介质所花费的时间，在组织消化过程中尽量减少三角化（步骤2.4.1 = 2.5.2），增加分离后洗涤的数量，或在与细胞分选或死细胞标记包分离后去除死细胞。但是，这些步骤都没有必要产生本报告中共享的代表性数据。对于 2D 和 3D ECM 培养方法，除了用于此处介绍的研究外，这些协议还可以与其他基于蛋白质的结构生物材料基质一起使用。这些其他生物材料包括胶原蛋白、明胶、市售的 ECM 提取物和定制的脱细胞化 ECM 衍生水凝胶 25、26、28。25,26,28有几个指针用于制造故障的 ECM 凝胶点胶和创建高品质的 agarose 3D 培养皿刀片。将 ECM 凝胶铸造到培养盘上时，请务必快速工作并使用冷移液器尖端，以防止 ECM 在培养盘中点胶之前在管或移液器尖端内过早聚合。当将熔融的 agarose 铸造到 3D Petri 盘模中时（对于 3D ECM 无培养物），请仅使用热和不热的 agarose，以确保刀片的高质量铸造，变化最小，并检查 agarose 已完全冷却到室温并凝固，然后再尝试从模具中去除。阿加罗斯3D培养皿最好用细钳轻轻处理。收集器官进行固定时，请务必在解剖显微镜下工作，以可视化所有器官的收集。有机体可以粘在培养皿的塑料侧面和移液器尖端的内侧;玻璃移液器比塑料表现出更少的有机粘附性。与固定之前从 ECM 中去除器官（从 ECM 上去除）时，修复仍然封装在 ECM 内部或顶部的风琴是一个更具挑战性和微妙的过程。组织加工凝胶可以在从培养室中去除之前施铸在 ECM-有机体结构之上，以帮助在固定前加固凝胶39。应在室温下进行固定，以检索 ECM 水凝胶，因为如果降低到 4°C，它们可能会脱聚合。 此外，0.1 % - 1.0 % 谷胱甘肽可添加到 4% PFA 溶液中，以帮助进一步交叉连接 ECM;但是，此方法增加了样品的背景自荧光。
以上所述的有机体生成方法所取得的成果存在相当大的生殖细胞特异性限制，这是未来创新的优先领域。生殖细胞在扩展培养中支持不足，仅在培养的最初几天才容易观察到，在培养的第一周结束时和以后的点很少观察到。虽然未分化的精子可以在体外细胞培养中保持，同时保持其在移植到体内输卵管40中恢复精子生成的能力，而输卵管体微环境（即 直接Sertoli细胞相互作用）被假设为区分前美生生殖细胞进入和通过美病和精子发生在体外1，5，40，415,40,的先决条件。1在结构模仿TLS的早期点含有精子的睾丸器官可能使该领域能够完全在体外进行非侵入性研究体外体细胞和体细胞相互作用。培养前的培养基添加剂和细胞制剂的优化（例如，加入用于体外精子干细胞培养的制剂）42、43,43可在未来的研究中增加生殖细胞的产量，特别是在培养时间超过几天的情况下。相反，TLS形成后重新引入精子的方法，如通过微注射，为恢复器官内的生殖细胞提供了一个有趣的机会，并测试体外组织体体环境维持生殖细胞的能力。其他生物因素已观察到影响体外外培养，包括年龄/成熟度45和遗传背景差异17。这些相同的变量尚未在睾丸器官生物学领域直接研究。然而，当器官是由从不同年龄的动物（即新生儿、少年、成人）或不同遗传背景（如不同的小鼠菌株）分离出的细胞中产生的时，可能产生不同的组装、形态和功能表型是合理的。
总之，本手稿中共享的技术为研究细胞驱动睾丸结构自组装、生成两个独立的结构模仿睾丸器官模型以及TLS发育和体外激素反应内分泌功能的重要成就提供了四个有用的模型。这些模型包括 ECM 和 ECM 环境中的 2D 和 3D 空间方向，具有最小复杂、完全定义的培养介质。每种方法都是高度可重复的，并且仅使用常用的区域性资源。这些方法可能证明有利于研究体外睾丸形态发生，优化体外精子发生的未来培养条件。更需要，2D ECM 和 3D ECM 无方法为研究睾丸特有的新组织分块化过程、体外管状生成以及体细胞和体细胞的相互作用提供了一种新颖的工具。睾丸器官为研究体细胞生理特征的发育和调节提供了灵活和可扩展的机会;包括血睾阻和内分泌的产生和反应;也是开发下一代转化研究组织模型的有用工具。其中包括将生殖激素纳入更大的系统级模型，如组织对一个芯片和微生理平台45，46。45,睾丸器官有朝一日可能应用的其他转化目标包括生殖毒理学和免疫屏障测试、男性避孕药具发育和辅助生殖技术创新。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由国家卫生研究所、国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）F31 HD089693、国家环境卫生科学研究所/国家促进转化科学中心（NIEHS/NCATS）UH3TR001207和4UH3ES029073-03以及托马斯·沃特金纪念教授职位资助。
作者要感谢埃里克·罗斯在透射电子显微镜方面的帮助。这项工作利用了西北大学NUANCE中心的BioCryo 设施，该设施得到了软和混合纳米技术实验（SHyNE）资源（NSF ECCS-1542205）的支持;材料研究中心的 MRSEC 计划 （NSF DMR-1720139）;国际纳米技术研究所;和伊利诺伊州，通过IN。它还使用 CryoCluster 设备，该设备得到了 MRI 计划 （NSF DMR-1229693） 的支持。图 1 中的图形 是使用BioRender.com。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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