Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج مورين للتعرض الجنين لالتهاب الأم لدراسة آثار التهاب المشيمة الحاد على نمو الأمعاء حديثي الولادة

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61464
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1,4
1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

Summary

طورنا نموذجا لالتهاب المشيمة لمحاكاة تعرض الجنين لالتهاب الأم (FEMI) دون مضاعفات الكائنات الحية لدراسة آثار FEMI على تطور القناة المعوية للذرية. وهذا يسمح لدراسة الأسباب الميكانيكية لتطوير الإصابة المعوية بعد التهاب المشيمة.

Abstract

التهاب المشيمة هو أحد الأمراض الشائعة المبكرة للولادة المبتسرة ويرتبط بالعديد من أمراض الخداج ، بما في ذلك التهاب الأمعاء المعوي النخري (NEC). ومع ذلك، لا يزال يتعين اكتشاف صلة ميكانيكية بين هذين الشرطين. لقد اعتمدنا نموذج مورين لالتهاب المشيمة الذي ينطوي على التعرض للدهون (LPS) الناجم عن تعرض الجنين لالتهاب الأم (FEMI). هذا النموذج من FEMI يحفز الأم العقيمة، المشيمة، وتتالي التهاب الجنين، والذي هو أيضا موجود في كثير من الحالات من التهاب المشيمة السريرية. على الرغم من وجود نماذج تستخدم البكتيريا الحية وتقليد أكثر دقة الفيزيولوجيا المرضية للعدوى الصاعدة مما يؤدي إلى التهاب المشيمة ، قد تسبب هذه الطرق آثارا غير مباشرة على تطور الجهاز المعوي غير الناضج والميكروبيوم النامي المرتبط به. باستخدام هذا البروتوكول، أثبتنا أن FEMI الناجم عن LPS يؤدي إلى زيادة تعتمد على الجرعة في فقدان الحمل والولادة المبتسرة، فضلا عن اضطراب النمو المعوي الطبيعي في النسل. علاوة على ذلك ، أثبتنا أن FEMI يزيد بشكل كبير من الإصابة المعوية والسيتوكينات المصلية في النسل ، مع تقليل الكؤوس وخلايا Paneth في وقت واحد ، وكلاهما يوفر الخط الأول من المناعة الفطرية ضد التهاب الأمعاء. على الرغم من أن نموذجا مماثلا من FEMI الناجم عن LPS قد استخدمت لنموذج الارتباط بين التهاب المشيمة والتشوهات اللاحقة للجهاز العصبي المركزي، على حد علمنا، وهذا البروتوكول هو الأول في محاولة لتوضيح وجود صلة ميكانيكية بين التهاب المشيمة والاضطرابات في وقت لاحق في التنمية المعوية كحلقة وصل محتملة بين التهاب المشيمة والأمعاء.

Introduction

تلعب الأغشية المشيمية دورا أساسيا في حمل الثدييات. وهي تشمل المشيمة و amnion، والتي تخدم وظائف متعددة. فهي تحيط وتحمي الجنين ، وتسهيل إشارات الباراكورين بين مقصورات الأم والجنين1، وخلق حلقات التغذية المرتدة المحلية داخل الأغشية المشيمية ، والتي قد تشارك في بدء الولادة1. الفهم الحالي للأغشية يشير إلى أن amnion يوفر وظيفة الحاجز الهيكلي ، ويوفر المشيمة حاجزا مناعيا في المقام الأول لحماية الجنين النامي من الجهاز المناعي للأم2. التهاب هذه الأغشية يعرف باسم التهاب المشيمة. تاريخيا، تم تشخيص التهاب المشيمة السريرية بعد وجود حمى الأم بالإضافة إلى واحد أو أكثر من النتائج السريرية الجنينية أو الأمومية3،4. ومع ذلك ، في حين أن هذا التعريف مفيد سريريا ، إلا أن افتقاره إلى الدقة جعل أبحاث التهاب المشيمة صعبة. في عام 2015 ، في محاولة لتوضيح التشخيص ، عرفت ورشة عمل فريق خبراء من قبل معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التهاب المشيمة بأنه التهاب داخل الرحم ، أو العدوى ، أو كليهما (الثلاثي I)3. هذا التوضيح مهم لأنه في حين أن العدوى الناجمة عن الميكروبات هي سبب مهم لالتهاب الرحم / السلى ، فإنه يحدث بشكل أقل شيوعا من التهاب الرحم / السلوي العقيم5،6،7. عموما، لا يزال التهاب المشيمة مشكلة صحية عامة كبيرة، كما هو واضح في 2٪من الولادات الأجل و 25٪\ 25 ٪ من الولادات قبل الأوان8،9.

يمكن أن يكون لالتهاب المشيمة آثار كبيرة على الجنين والمواليد لحديثي الولادة. وقد تم توثيقه جيدا في الأدب أن التهاب المشيمة يرتبط بزيادة خطر العديد من المراضات الخداج، بما في ذلك خلل التنسج القصبيالرئوي 10، إصابةالمادة البيضاءالدماغية 11،نزيف داخل البطين12،اعتلال الشبكية من الخداج13،وكلا يشتبه وأكد بداية مبكرة تعفن الدم الوليدي14،15. كما أننا مهتمون في آليات الإصابة والإصلاح من الأمعاء غير ناضجة, من المهم أن نلاحظ أن يرتبط أيضا التهاب المشيمة مع التنمية في وقت لاحق من التهاب الأمعاء النخري (NEC)15,16. NEC هو مرض معوي مدمر للرضع الخدج يؤدي إلى استجابة مضيفة غير خصية للالتهاب ونخر الأمعاء اللاحق17. كل عام، NEC يصيب أكثر من 4000 الرضع في الولايات المتحدة، ويموت ما يصل إلى ثلث هؤلاء الرضع من المرض18. من المرجح أن ينطوي الإمراض في NEC على مزيج من عدم النضج المعوي ، وخلل تنظيم الجهاز المناعي غير الناضج ، والتهاب الأمعاء ، ونقل الجرثومية19، وبلغت ذروتها في مسار مشترك نهائي لنخر الأمعاء. الأهم من ذلك ، فإن بداية NEC غالبا ما يحدث بعد أسابيع من الولادة والتعرض المحتمل لالتهاب المشيمة ، مما يجعل الصلة الميكانيكية بين التهاب المشيمة والتنمية اللاحقة لل NEC غيرواضحة 20. إحدى الآليات المحتملة التي يمكن من خلالها أن يساهم التهاب المشيمة في الفيزيولوجيا المرضية في NEC هي من خلال تنظيم الجهاز المناعي للأم ، مما ينتج لاحقا استجابة التهابية جنينية قوية قد تعطل أنماط نمو الجنين الطبيعية21و22و23.

نماذج الثدييات متعددة من التهاب المشيمة موجودة في القوارض والأغنام24،25،26،27،28،29،30،31،32. ومع ذلك، توجد بيانات قليلة تتعلق بتطور الجهاز المعوي بعد فترة حديثي الولادة الأولية بعد تعرض الجنين الناجم عن التهاب المشيمة لالتهاب الأمهات (FEMI). من أجل استكشاف العلاقة بين FEMI والتطور اللاحق لإصابة الجهاز المعوي غير الناضج ، قمنا بتكييف نموذج FEMI الناجم عن الليبوبوليساكريد (LPS). شواريد الليبوبوليساكريد هي عنصر رئيسي من السطح خارج الخلية على البكتيريا السلبية غرام وهي منبه قوي للجهاز المناعي الفطري من الأنواع eukaryotic متعددة، بما في ذلك البشر33. الأم LPS حقن النتائج في سلسلة التهابات معقمة دون آثار محيرة من البكتيريا الحية, وهو نموذج راسخ لتحريض الولادة المبتسرة34, فضلا عن نموذج لالتهاب المشيمية الحاد ومتلازمة الاستجابة الالتهابية الجنينية (FIRS), وهو الشكل الأكثر حدة من التهاب المشيمة24,35. كما ثبت للحث على حد سواء إصابة المادة البيضاء والرمادية الدماغية في نموذج الأغنام36 ونموذج مورين37,38,39,40. ومع ذلك، على حد علمنا، ونحن أول من استخدم هذا النموذج من التهاب المشيمة وFEMI للتحقيق في آثاره على تطوير الجهاز الهضمي الولادة الماضية، وكذلك للتحقيق في وجود صلة ميكانيكية محتملة بين التهاب المشيمة والتنمية في وقت لاحق من NEC41،42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة أيوا (البروتوكول #8041401). تم إيواء جميع الحيوانات في جمعية لتقييم واعتماد رعاية الحيوانات المختبرية (AALAC) وافقت vivarium في جامعة أيوا. وكانت جميع الفئران سلالة نوع البرية C57Bl/6J.

1. إنشاء FEMI في الفئران الحوامل

  1. إعداد LPS
    1. استخدام LPS المستمدة من الإشريكية القولونية O55:B5 (تركيز المخزون 2 ملغم / مل).
    2. تمييع تركيز مخزون LPS 1:100 مع محلول ملحي معقم لتركيز عمل 20 ميكروغرام /مل.
  2. حقن LPS الأم
    1. حقن السدود الحوامل في يوم الحمل e15. هذه النقطة الزمنية هي حوالي 75٪ من خلال الحمل مورين، مما يجعل هذا النموذج مماثلة تنمويا إلى الثلث الثالث المبكر من الحمل البشري، وهو عندما تحدث غالبية الولادات المبتسرة بسبب التهاب المشيمة.
    2. وزن الفئران الحامل مباشرة قبل الحقن لتحديد ال دوس LPS المناسبة.
    3. حساب جرعة تركيز العمل باستخدام الصيغة التالية: 5 ميكرولتر × غرام وزن الجسم (gbw)، لجرعة إجمالية من LPS من 100 ميكروغرام /كغ. لحيوانات التحكم، استخدم حجم مكافئ من المالحة العادية للحقن.
    4. حل دوامة LPS ثلاث مرات لمدة 15 ثانية على ارتفاع قبل كل حقنة.
    5. ارسم حجم LPS في حقنة 1 مل.
    6. كبح جماح الماوس الحوامل مع تقنية scruffing. عقد في موقف شغل الظهر وأداء الحقن.
      1. أدخل إبرة مقاس 30 ملم مقاس 8 مم تغلف الربع السفلي الأيمن من البطن (لتجنب الأوعية المثانة والبطن) بزاوية 30 درجة. إدراج حوالي 1/4 إلى 1/2 طول الإبرة.
      2. سحب على المكبس حقنة لضمان الضغط السلبي قبل الحقن. المضي قدما في الحقن إذا كان الضغط السلبي موجود.
      3. بعد الحقن، رصد الفئران لمدة 30 دقيقة تقريبا ومن ثم العودة إلى أقفاص لبقية فترة الحمل.

2. تسليم ورعاية النسل، والحصاد المعوي

  1. ولادة الجراء عادة عن طريق الولادة المهبلية في e20.
    ملاحظة: هذا النموذج لديه معدل فقدان الجنين تعتمد على الجرعة المتوقعة التي يمكن رؤيتها في الشكل 1 وتناقش في النتائج أدناه.
  2. السماح للجراء بالبقاء مع الأمهات وتلقي تغذية libitum الإعلانية.
  3. في يوم الحصاد، عادة ما يكون يوم ما بعد الولادة 14 (P14)، يقتل الجراء عن طريق خلع عنق الرحم وفقا لبروتوكولات اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
  4. باستخدام مقص وملقط، وجعل شق عمودي أسفل خط الوسط من البطن، من خلال الجلد والغشاء البريتوني، لكامل طول البطن. استئصال الأمعاء الدقيقة من المعدة إلى الكوم مع مقص وإزالة mesentery مع ملقط.
  5. عزل والحفاظ على الأمعاء الدقيقة البعيدة (ممثل القسم من الايليوم البشري) ، والتخلص من الأمعاء الدقيقة القريبة ، والسيكوم ، والقولون.
  6. تقسيم جزء الايليوم إلى نصفين باستخدام مقص.
  7. ضع النصف القريب في حل تثبيت الحمض النووي الريبي للقياس الكمي الحمض النووي الريبي في وقت لاحق.
  8. وضع النصف القاصي في 10٪ محايدة العازلة الفورمالين لإعداد الشريحة.

3. تسجيل إصابات معوية

  1. قسم البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة في شرائح سميكة 5 ميكرومتر وجبل على الشرائح الزجاجية.

    ملاحظة: نرسل العينات إلى نواة الأنسجة لتضمين البارافين، والقسم، وتصاعد على الشرائح.
  2. deparaffinize الشرائح وفقا للإجراءات القياسية.
  3. أقسام وصمة عار مع الهيماتوكسيلين واليوزين وفقا للإجراءات القياسية.
  4. نقاط المقاطع على مقياس من 3 نقاط للإصابة المعوية كما سبق وصفه42,43.
    1. باستخدام المجهر الخفيف، تقييم الإصابات المعوية المعممة من قبل اثنين من المحققين المكفوفين منفصلة على مقياس من 3 نقاط تقييم سلامة villus والانفصال عن غشاء الطابق السفلي43 (الشكل التكميلي 1). يتم تقييم الإصابة المعوية على أفضل وجه في التكبير 20x والفتحة العددية 0.50.
    2. تعيين درجة 0 لوصف الغشاء المخاطي العادي.
    3. تعيين درجة من 1 وصف إصابة خفيفة التي تشمل تطوير الفضاء Gruenhagen تحت الإبط، vacuolization أو رفع تحت الإبط تقتصر على بروبريا الصفيحة أو نصائح من الزغب.
    4. تعيين درجة 2 لوصف الإصابة الشديدة، وأشار إلى رفع الظهارية وvacuolization أكبر من نصف الزغب، تشويه زغب، أو تقرح المخاطية وتفكك بروبريا الصفيحة.

4. القياس الكمي للخلايا بانيث والكؤوس

  1. بعد إزالة البارافينين، بقع الشرائح من أقسام الأنسجة من الخطوة 2.8 مع الأزرق الألسيان / دوري حمض شيف وصمة عار للدلالة على كل من الكؤوس وخلايا بانيث كما هو موضح سابقا44،45 وفقا للخطوات التالية.
    ملاحظة: في حين أن البقعة Alcian Blue / Periodic Acid Schiff ليست محددة إما لخلايا Paneth أو الكؤوس ، في تجربتنا ، فإن المحققين ذوي الخبرة المكفوفين لديهم قياس كمي خلوي مكافئ باستخدام هذه البقعة مقارنة بالأجسام المضادة المستهدفة الخلوية ، مع خلفية أقل بكثيرتلطيخ 46.
  2. deparaffinize، وصمة عار، والشرائح المجففة على النحو التالي.
    1. غمر الشرائح في xylene لمدة 10 دقيقة مرتين.
      تنبيه: يجب استخدام الزيلين في غطاء الدخان.
    2. شطف مع 100٪ EtOH.
    3. غمر الشرائح في 100 ٪ EtOH لمدة 3 دقائق ، ثم في 90 ٪ EtOH لمدة 3 دقائق ، تليها 70 ٪ EtOH لمدة 3 دقائق ، وأخيرا غمر الشرائح في 50 ٪ EtOH لمدة 3 دقائق.
    4. يغسل تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 5 دقائق.
      تنبيه: وجه المقطع بعيدا عن المياه الجارية لمنع فقدان عينة الأنسجة.
    5. تصفية محلول البقع الزرقاء Alcian مع مرشح القهوة القياسية.
    6. بقع الشرائح في البقع الزرقاء Alcian لمدة 15 دقيقة ثم يغسل تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 2 دقيقة.
    7. تمييع 1 ملغ من حمض دوري في 200 مل من الماء المقطر المزدوج. اغمر الشرائح في هذا الحل لمدة 5 دقائق. ثم يغسل تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 1 دقيقة.
    8. وصمة عار مع كاشف شيف لمدة 10 دقائق. يغسل تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 5 دقائق.
    9. لطخ الشرائح بالهيماتوكسيلين لمدة دقيقة واحدة ثم اغسلها تحت مياه الصنبور الجارية لمدة دقيقتين.
    10. غمرها في الكحول الحمضي (1 مل من حمض الهيدروكلوريك مختلطة في 99 مل من 70٪ EtOH) لمدة 1 دقيقة.
    11. اغمر مياه الصنبور في سكوت (تركيز 0.1٪ من NaHCO3 في مياه الصنبور) لمدة دقيقة واحدة ثم اغسل تحت مياه الصنبور الجارية لمدة دقيقة واحدة.
    12. يجفف الشرائح.
      1. تراجع كل شريحة 10 مرات في 70٪ EtOH، ثم تراجع 10 مرات في 90٪ EtOH، و 10 مرات في 100٪ EtOH.
      2. غمر الشرائح في 100٪ EtOH لمدة 10 دقيقة، تليها غمر مرتين في xylene الطازجة لمدة 3 دقائق لكل منهما.
    13. ضع قطرة من الوسائط المتصاعدة على العينة وضع غطاء فوقها.
  3. عد الخلايا الكؤوس
    1. باستخدام المجهر الخفيف، عد الخلايا الكؤوس (الشكل التكميلي 2). لكل قطعة من الأنسجة المعوية، عد عدد الخلايا الكؤوس و 500 خلية ظهارية والتعبير عن نسبة الخلايا الملمعة كنسبة لكل 100 خلية ظهارية. يتم احتساب أفضل خلايا الكؤوس في التكبير 20x والفتحة العددية 0.5.
  4. عد الخلايا في الجزء
    1. باستخدام المجهر الخفيف، عد الخلايا بانيث (الشكل التكميلي 2). لكل قطعة من الأنسجة المعوية، والتعبير كنسبة من الخلايا بانيث لكل سرداب الأمعاء. عد 100 سرداب معوي لكل قطعة من الأنسجة المعوية. يتم حساب خلايا Paneth بشكل أفضل عند تكبير 20x-60x وفتحة العدسة العددية 0.50-1.30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التعرض لFEMI في اليوم الجنيني 15 يؤدي إلى فقدان الجرعة تعتمد على الحمل ومعدل الجرعة تعتمد على المخاض قبل الأوان (الشكل 1)42. بالنسبة للتجارب ، اخترنا استخدام جرعة LPS من 100 ميكروغرام / كجم لتقليل فقدان الحمل والخداج (50٪ فقدان بين كل من الخداج وزوال الجنين داخل الرحم) مع تعريض الأجنة لإهانة التهابية كبيرة.

باستخدام هذا النهج ، درسنا بعد ذلك آثار FEMI على الإصابة اللاحقة للذرية. باستخدام مقياس الهسولوجية من 3 نقاط لقياس الإصابة المعوية المعممة، وجدنا إصابة كبيرة عند الولادة (P0) وعند مرحلة البلوغ (P56 أو 8 أسابيع من الحياة)(الشكل 2). من المهم ملاحظة أن هذه الإصابة حدثت في غياب أي محفزات إضافية للحيوانات غير FEMI ، مما يشير إلى أن FEMI وحدها تعطل التوازن الطبيعي للأمعاء المورين حديثي الولادة. كما يولد الماوس مع الأمعاء غير ناضجة نسبيا التي لا تزال تتطور خلال الأسابيع ال 4 الأولى من الحياة47،48، وهذا هو ذات الصلة للرضع الخدج الذين لديهم أيضا المسالك المعوية غير ناضجة.

لمزيد من الفهم لتأثير FEMI على كل من التطور الطبيعي للظهارة المعوية وعلى آليات الدفاع في الجهاز المعوي غير الناضج ، قمنا بقياس عدد خلايا الكؤوس المنتجة للموسين وخلايا بانيث المنتجة للببتيد المضاد للميكروبات في الثلث القاصي من القناة المعوية الصغيرة التي تشبه الإيليوم البشري. وجدنا أن FEMI عطل التركيب الطبيعي للظهارة المعوية عن طريق إحداث فقدان كل من خلايا الكؤوس وخلايا بانيث مقارنة بالحيوانات دون FEMI (الشكل 3).

للتحقيق في آثار FEMI على الاستجابة الالتهابية الوليدية ، باستخدام ELISA مع الكيمياء الكهربائية ، قمنا بقياس مجموعة متنوعة من علامات التهاب المصل ، والتي شملت IL-1β ، IL-10 ، KC-GRO (ما يعادل مورين IL-8) ، وIL-6 ، من مصل الجراء مع وبدون FEMI (الشكل 4). وجدنا أن FEMI زاد بشكل كبير من سلسلة الالتهابات لجميع السيتوكينات في P0. اختلفت السلسلة الالتهابية في الأعمار اللاحقة (P7\u2012P56) استنادا إلى نقطة زمنية وسيتوكين. والأكثر إثارة للاهتمام، بالنسبة ل IL-6، كانت هناك مستويات مماثلة في P7\u2012P28 في FEMI والجماعات الصورية، ولكن على الرغم من عدم وجود تدخل ثانوي، كانت هناك مستويات أعلى بكثير في مجموعة FEMI في P56. هذا مهم بشكل خاص كما أثبتنا أن IL-6 هو السيتوكين الحرجة لتطوير الإصابة المعوية بعد الولادة في نموذج FEMI.

Figure 1
الشكل 1: تأثير جرعة FEMI على نتائج الحمل. بقاء القمامة الحمل يعتمد على الجرعة مع جرعات أعلى مما تسبب في ارتفاع معدلات فقدان الحمل (أ) وارتفاع معدلات الولادة المبكرة (ب). يتم تكييف الشكل بإذن من Fricke وآخرون42. FEMI باستخدام جرعة LPS من 100 ميكروغرام / كجم يخلق بقاء 50٪ للجراء من قبل أسبوع واحد من الحياة. تمثل كل نقطة بيانات n > 8 حالات حمل وثلاث تجارب فردية على الأقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تأثير FEMI على أنماط الإصابة المعوية الصغيرة البعيدة بمرور الوقت. تم حصاد عينات الأمعاء عند الولادة، وأسبوع واحد من الحياة، وأسبوعين من الحياة، و8 أسابيع من الحياة من الفئران المعرضة لFEMI (100 ميكروغرام / كجم من LPS) أو السيطرة الصورية. وسجلت عينات باستخدام مقياس إصابة 3 نقاط من قبل المحققين أعمى42،43. FEMI وحدها مع عدم وجود مزيد من الإهانة تسبب قدرا كبيرا من الإصابة عند الولادة، 1 أسبوع من الحياة، وفي 8 أسابيع من الحياة. وقد تم تكييف الشكل بإذن من Frickeوآخرون. كل نقطة بيانات تمثل n > 10 جراء وثلاث تجارب فردية على الأقل من 3 سدود حامل على الأقل. تم استخدام اختبار T غير البارامترية مان ويتني لمقارنة درجات الإصابة المعوية في كل نقطة زمنية. تشير العلامة النجمية إلى p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: FEMI يؤدي إلى تعديلات من الكؤوس العادية وكميات خلية Paneth في الأمعاء الدقيقة أثناء التنمية. تم حصاد عينات الأمعاء عند الولادة، 1، 2، 4، و 8 أسابيع من الحياة من الفئران المعرضة لFEMI (100 ميكروغرام / كجم LPS) أو السيطرة الصورية. كانت العينات ملطخة ببقعة Alcian Blue/Periodic Acid Schiff للكشف عن كل من الكؤوس وخلايا Paneth وتم قياسها كميا من قبل محقق أعمى. وأظهرت كل من الخلايا الكؤوس والخلايا Paneth من الحيوانات مع FEMI إما اتجاها أو انخفاضا كبيرا بالمقارنة مع الضوابط صورية في جميع الأعمار. الشكل المكيف بإذن من إلجين وآخرون41. كل نقطة بيانات تمثل n > 10 جرو وثلاث تجارب فردية على الأقل. تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي في الوسط. تم استخدام اختبار T للطالب لمقارنة كميات من الكؤوس وخلايا Paneth في كل نقطة زمنية. تشير العلامة النجمية إلى p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يحفز FEMI طفرة التهابية عالمية لحديثي الولادة لجميع السيتوكينات مباشرة بعد الولادة في P0 ، مع ارتفاع متأخر من IL-6 في P56. تم قياس السيتوكينات المصلية في P0 و P7 و P14 و P28 باستخدام ELISA مع الكيمياء الكهربائية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وقرأت لوحات في 620 نانومتر. يتم تمثيل قيم السيتوكين هنا في مؤامرة رادار، ويتم رسم جميع السيتوكينات بنسبة مئوية من القيمة القصوى. كانت هناك زيادات كبيرة في جميع السيتوكينات (IL-1β، IL-10، KC-GRO و IL-6) في P0 في مجموعة FEMI مقارنة بمجموعة التحكم (جميع p < 0.05). كانت هناك أيضا زيادة متجددة في مستويات IL-6 في P56 في الجراء مع FEMI مقارنة مع أي FEMI (ص < 0.05 عن طريق اختبار كروسكال واليس غير البارامترية)، الذي كان السيتوكين الوحيد الذي تم رفعه بشكل كبير في مجموعة FEMI مقارنة بالسيطرة في هذه النقطة الزمنية المتأخرة. الشكل المكيف بإذن من إلجين وآخرون41. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تسجيل الإصابات المعوية للأنسجة الايلية الملطخة H&.E. يتم تحديد درجات الإصابة من خلال مقياس تسجيل الإصابات المعوية من ثلاث نقاط (0 = طبيعي ، 1 = إصابة خفيفة ، 2 = إصابة شديدة) استنادا إلى درجة من التكميل الخافق ، التقرح المخاطي ، تلف البربريا الصفيحة ، ووجود نزيف داخل الزغب كما هو موضح سابقا43. الشكل المكيف بإذن من إلجين وآخرون41. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: المظهر التمثيلي لل أزرق ألسيان / PAS تلطيخ الكؤوس وخلايا بانيث. Alcian الأزرق / PAS تلطيخ الأنسجة المعوية يسمح تصور واضح للخلايا الكؤوس، موجودة في الزغب المعوي (لوحة أعلى ملحوظ مع السهام البيضاء، والصورة التي اتخذت في التكبير 20x)، وخلايا بانيث، موجودة في سرداب Lieberkuhn، وتقع تحت الزغب المعوي في بروبريا الصفيحة (لوحة أسفل ملحوظ مع السهام الصفراء، والصورة التي اتخذت في التكبير 60x). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يؤثر التهاب المشيمة على 2٪، و25٪، من حالات الولادة قبل الأوان8،9. ومع ذلك ، فإن تأثير التهاب المشيمة يمكن أن يمتد لفترة طويلة بعد الولادة حيث ثبت أن له تأثيرات كبيرة على الجنين والوليد10،11،12،13،14،15،16. الأهم من ذلك، وقد ثبت أن التهاب المشيمة المرتبطة التنمية اللاحقة من NEC15،16. في حين أنه لا يزال غير مفهوم بشكل كامل ، فإن الإمراض في NEC ينطوي على الأرجح على مزيج من عدم النضج المعوي ، وخلل تنظيم الجهاز المناعي غير الناضج ، والتهاب الأمعاء ، ونقل البكتيريا ، وبلغت ذروتها في مسار مشترك نهائي لنخر الأمعاء19. ومع ذلك ، لا تزال الصلة الميكانيكية بين التهاب المشيمة والتطور اللاحق لل NEC غيرواضحة 20، وكانت النماذج الحيوانية السابقة لالتهاب المشيمة غير كافية لدراسة هذه العلاقة. لمعالجة هذه الفجوة في المعرفة، قمنا بتعديل نموذج المرين المستحث عادة من LPS لالتهاب المشيمة والولادة المبتسرة34و37و38و39و40 للسماح بالولادة الوليدية والبقاء على قيد الحياة. في القيام بذلك ، أنشأنا نموذجا يقترب من الحالة الالتهابية التي شوهدت في التهاب المشيمة42 لدراسة تأثير تعرض الجنين لالتهاب الأم (FEMI) على التطور المعوي اللاحق.

مع هذا البروتوكول، أثبتنا أن هذا النموذج مورين من التهاب المشيمة، وذلك باستخدام FEMI الناجم عن LPS، يؤدي إلى كل من الإصابة المعوية على المدى القصير والطويل، فضلا عن انقطاع النمو المعوي الطبيعي، وأبرزها downregulation من كل من الكؤوس وخلايا بانيث، وكلاهما يوفر الخط الأول من المناعة الفطرية ضد التهاب الأمعاء. تشير الإصابة المعوية والتغيرات الخلوية النسيجية التي تظهر مع هذا النموذج إلى أنه نموذج فعال لمحاكاة الإصابة التي شوهدت في NEC. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى أن التنظيم السفلي للخلايا بانيث والخلايا الكؤوس على حد سواء قد تورطت في الإمراض من NEC، وأنماط الإصابة النسيجية مماثلة لما ينظر إليه في الحالات البشرية من NEC41،42،49. لذلك ، فإن هذا النموذج FEMI الناجم عن LPS لالتهاب المشيمة هو نموذج مثالي للتحقيق في الصلة الميكانيكية بين التهاب المشيمة والإصابة المعوية في وقت لاحق ، وتحديدا تطوير NEC ، وكذلك الآثار المحتملة لالتهاب المشيمة على الميكروبيوم النامي ، والذي لن يكون ممكنا مع النماذج الحالية التي تستخدم البكتيريا الحية.

في الجسم الحي، التهاب المشيمة غالبا ما ينطوي على عدوى بكتيرية تصاعدية التي غالبا ما تؤدي إلى تمزق الخدج من الأغشية والنمط الظاهري السريري لالتهاب المشيمة، والنماذج الحيوانية من التهاب المشيمة موجودة والتي تعكس بدقة أكبر هذا الفيزيولوجيا المرضية25،28،30،32. ومع ذلك ، لأن لدينا دراسات مختبرية التنمية المعوية ، بما في ذلك الميكروبيوم النامية ، ووجود البكتيريا الحية في نموذج لالتهاب المشيمة من شأنه أن يربك تحليل الميكروبيوم. ولذلك، فإن النماذج الموجودة من التهاب المشيمة باستخدام البكتيريا الحية غير عملية للتحقيق في الصلة الميكانيكية بين التهاب المشيمة والتنمية اللاحقة لل NEC. بالإضافة إلى ذلك ، كانت النماذج الناجمة عن LPS لالتهاب المشيمة فعالة بالفعل في نمذجة إصابة الدماغ للمادة البيضاء والرمادية بعد الولادة36، مما يدل على أن هذه الطريقة هي طريقة فعالة لنموذج المراضة الخداج التي ترتبط بالتعرض لالتهاب المشيمة في وقت الولادة.

ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن هذا النموذج يعتمد اعتمادا كبيرا على جرعة من LPS المستخدمة للحث FEMI. الخطوة الحاسمة الأساسية في هذا البروتوكول هو تحريض FEMI في السدود الحوامل مع الحقن داخل الصفاق من LPS; لذلك ، ليس من المستغرب ، وجدنا أن جرعة LPS المستخدمة للحث على FEMI مهمة للغاية في نتائج هذه التجارب. مع التجارب الأولية، تم استخدام جرعة من 100 ميكروغرام/كغ من LPS، حيث لم تكن هذه الجرعة LPS مرتبطة بوفيات الأمهات وأسفرت عن بقاء ما يقرب من 50٪ من حديثي الولادة وكذلك إصابة معوية كبيرة فيالنسل 41،42.

LPS يربط إلى مستقبلات مثل حصيلة 4 (TLR4) المعقدة, مما أدى إلى تجميع البروتينات الإشارات داخل الخلايا, إنتاج السيتوكين, وبدء الإشارات المؤيدة للالتهابات50. مستقبلات مثل حصيلة (TLRs) بما في ذلك TLR2، TLR3، TLR4، TLR7، TLR8، وTLR9 مهمة في تحريض الاستجابة الالتهابية التي ينظر إليها مع مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض والكائنات الحية الدقيقة مثل الفيروسات والبكتيريا والفطريات51. ومن المثير للاهتمام، كما تبين أن upregulation من TLR3 ترتبط مع زيادة تلف الأمعاء النسيجية وذرف الفيروسية في نموذج فيروس الروتا مورين حديثي الولادة؛ وعلاوة على ذلك، خروج المغلوب من TLR3 تحسين هذه الآثار52. وهكذا، في حين أن النموذج يستخدم مسارات TLR4، فمن المعقول افتراض أن تحفيز TLRs الأخرى قد يمنح نتائج مماثلة.

باستخدام هذه المنهجية ، تمكنا من إظهار أن حقن LPS في السدود الحوامل يسبب زيادات في علامات التهابات الأم والمشيمة والجنين مع تجنيب السائل السلوي ، بالإضافة إلى إحداث ضرر مباشر للمشيمة42. ومن المثير للاهتمام أن هذه المنهجية لم تظهر أي تغيير في المقاومة في شرايين الرحم. نموذج FEMI له أيضا تأثير كبير على النسل كما أظهرنا أن الجراء المكشوفة لديها إصابة معوية كبيرة42 من خلال مسار IL-6التابعة 41 ويمكن أن تؤثر على آليات الدفاع الهامة للأمعاء مثل خلايا الكؤوس وخلايا بانيث41. هذه الإصابة تجعل النسل الوليدي عرضة بشكل متزايد للإصابة المعوية اللاحقة الناجمة عن LPS والالتهاب41 مما قد يفسر لماذا الرضع المعرضين لالتهاب المشيمة لديهم قابلية متزايدة لتطوير NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المعاهد الوطنية للصحة (DK097335 و T32AI007260) وقسم الأسرة في جامعة أيوا ستيد لطب الأطفال.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma HT501128
Alcian blue stain Newcomer supply 1003A
C57Bl6/J mice Jackson Laboratories 664
Ethanol Decon labs 2701
HCl Sigma H1758
Hematoxylin stain Leica 381562
LPS Sigma L2880
NaHCO3 Sigma S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope Nikon 2CE-MQVJ-1
Periodic Acid ACROS H5106 CAS# 10450-59-9
RNAlater Thermofisher Am7021
Schiff's reagent Sigma S5133
Secor Imager 2400 Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene Sigma 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
  2. Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
  3. Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
  4. Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
  5. Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
  6. Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
  7. Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
  8. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  9. Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
  10. Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
  11. Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
  12. Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
  13. Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
  14. Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
  15. Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
  16. Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
  17. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
  18. Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
  19. Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
  20. Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
  21. Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
  22. Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
  23. Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
  24. Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
  25. Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
  26. Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
  27. Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
  28. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
  29. Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
  30. Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
  31. Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
  32. Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
  33. Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
  34. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
  35. Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
  36. Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
  37. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
  38. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
  39. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
  40. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  41. Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  42. Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
  43. Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
  44. Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
  45. McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
  46. McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
  47. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
  48. McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
  49. McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
  50. Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
  51. Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
  52. Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).

Tags

هذا الشهر في JoVE، العدد 160، ليبوبوليساكاريد (LPS)، تعرض الجنين لالتهاب الأم (FEMI)، التهاب المشيمة، تطور الأمعاء، خلية بانيث، خلية غوبلت
نموذج مورين للتعرض الجنين لالتهاب الأم لدراسة آثار التهاب المشيمة الحاد على نمو الأمعاء حديثي الولادة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke,… More

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke, E. M., Gong, H., Reese, J., McElroy, S. J. A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development. J. Vis. Exp. (160), e61464, doi:10.3791/61464 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter