Summary
Wir entwickelten ein Modell der Chorioamnionitis, um die fetale Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) ohne Komplikationen lebender Organismen zu simulieren, um die Auswirkungen von FEMI auf die Entwicklung des Darmtraktes der Nachkommen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Ursachen für die Entwicklung von Darmverletzungen nach Chorioamnionitis.
Abstract
Chorioamnionitis ist ein häufiges Ausfällmittel der Frühgeburt und ist mit vielen der Morbiditäten der Frühreife verbunden, einschließlich nekrotisierender Enterokolitis (NEC). Eine mechanistische Verbindung zwischen diesen beiden Bedingungen muss jedoch noch entdeckt werden. Wir haben ein murines Modell der Chorioamnionitis mit Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte fetale Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung (FEMI) angenommen. Dieses Modell von FEMI induziert eine sterile mütterliche, Plazenta und fetale entzündliche Kaskade, die auch in vielen Fällen der klinischen Chorioamnionitis vorhanden ist. Obwohl Es Modelle gibt, die lebende Bakterien nutzen und die Pathophysiologie einer aufsteigenden Infektion, die zu Einer Chorioamnionitis führt, genauer imitieren, können diese Methoden indirekte Auswirkungen auf die Entwicklung des unreifen Darmtraktes und das damit verbundene entwickelnde Mikrobiom verursachen. Mit diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass LPS-induzierte FEMI zu einer dosisabhängigen Zunahme des Schwangerschaftsverlusts und der Frühgeburt sowie zu einer Störung der normalen Darmentwicklung bei Nachkommen führt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass FEMI darmverletzungen und Serumzytokine bei Nachkommen signifikant erhöht und gleichzeitig Die Kelch- und Panethzellen verringert, die beide eine erste Reihe angeborener Immunität gegen Darmentzündungen bieten. Obwohl ein ähnliches Modell der LPS-induzierten FEMI verwendet wurde, um die Assoziation zwischen Chorioamnionitis und nachfolgenden Anomalien des zentralen Nervensystems zu modellieren, ist dieses Protokoll unseres Wissens der erste Versuch, eine mechanistische Verbindung zwischen Chorioamnionitis und späteren Störungen in der Darmentwicklung als potenzielleverbindung zwischen Chorioamnionitis und NEC aufzuklären.
Introduction
Die Chorionmembranen spielen eine wesentliche Rolle bei der Hautschwangerschaft. Dazu gehören die Chorion und Amnion, die mehrere Funktionen erfüllen. Sie umgeben und schützen den Fötus, erleichtern die parakrine Signalisierung zwischen dem mütterlichen und dem fetalen Kompartiment1und erstellen lokale Rückkopplungsschleifen innerhalb der Chorionmembranen, die an der Initiierung der Parturition1beteiligt sein können. Das aktuelle Verständnis der Membranen deutet darauf hin, dass das Amnion eine strukturelle Barrierefunktion bietet, und die Chorion bietet einen immunologischen Puffer, der in erster Linie den sich entwickelnden Fötus vor dem mütterlichen Immunsystem schützt2. Entzündung dieser Membranen ist bekannt als Chorioamnionitis. Historisch gesehen wurde die Diagnose der klinischen Chorioamnionitis nach dem Vorhandensein von mütterlichem Fieber plus einem oder mehreren fetalen oder mütterlichen klinischen Befunden3,4gemacht. Obwohl diese Definition klinisch nützlich ist, hat ihre mangelnde Präzision die Chorioamnionitis-Forschung zu einer Herausforderung gemacht. Im Jahr 2015 definierte ein Experten-Panel-Workshop des Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development Chorioamnionitis als intrauterine Entzündung oder Infektion oder beides (Triple I)3. Diese Klärung ist wichtig, weil, während mikrobielle induzierte Infektion ist eine wichtige Ursache für Gebärmutter/Amnion-Entzündung, es tritt seltener als sterile Gebärmutter/Amniotische Entzündung5,6,7. Insgesamt bleibt die Chorioamnionitis ein erhebliches Problem der öffentlichen Gesundheit, wie sie in 2-u20124% der Laufzeitlieferungen und 25-u201230% der Frühlieferungen8,9gesehen wird.
Chorioamnionitis kann signifikante Auswirkungen auf den Fötus und Neugeborenen haben. Es ist in der Literatur gut dokumentiert, dass Chorioamnionitis mit einem erhöhten Risiko für viele der Morbiditäten der Frühreife verbunden ist, einschließlich bronchopulmonaler Dysplasie10, zerebrale weiße Materie Verletzung11, intraventrikuläre Blutung12, Retinopathie der Frühreife13, und sowohl vermutet und bestätigt früh einsetzte neonatale Sepsis14,15. Da wir an Verletzungs- und Reparaturmechanismen des unreifen Darmtraktes interessiert sind, ist es wichtig zu beachten, dass Chorioamnionitis auch mit der späteren Entwicklung der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC)15,16verbunden ist. NEC ist eine verheerende Magen-Darm-Erkrankung von Frühgeborenen, die zu einer dysregulierten Wirtsreaktion auf Entzündungen und anschließende Darmnekrose17führt. Jedes Jahr betrifft NEC über 4000 Säuglinge in den Vereinigten Staaten, und bis zu einem Drittel dieser Säuglinge sterben an der Krankheit18. Die Pathogenese von NEC beinhaltet wahrscheinlich eine Kombination von Darmunreife, Dysregulation des unreifen Immunsystems, Darmentzündung, und bakterielle Translokation19, die in einem letzten gemeinsamen Weg der Darmnekrose gipfelt. Wichtig ist, dass der Beginn von NEC oft Wochen nach der Geburt und eine mögliche Exposition gegenüber Chorioamnionitis auftritt, was die mechanistische Verbindung zwischen Chorioamnionitis und der anschließenden Entwicklung von NEC unklarmacht 20. Ein potenzieller Mechanismus, durch den Chorioamnionitis zur Pathophysiologie von NEC beitragen kann, ist durch Upregulation des mütterlichen Immunsystems, die anschließend eine starke fetale Entzündungsreaktion produziert, die normale fetale Entwicklungsmuster stören kann21,22,23.
Mehrere Säugetiermodelle der Chorioamnionitis existieren bei Nagetieren und Schafen24,25,26,27,28,29,30,31,32. Es liegen jedoch nur wenige Daten über die Entwicklung des Darmtraktes nach der ersten Neugeborenenperiode nach der Chorioamnionitis-induzierten fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung (FEMI) vor. Um den Zusammenhang zwischen FEMI und der anschließenden Entwicklung der Verletzung des unreifen Darmtraktes zu untersuchen, haben wir das Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte FEMI-Modell angepasst. Lipopolysaccharide sind ein wichtiger Bestandteil der extrazellulären Oberfläche auf gramnegativen Bakterien und sind ein starkes Stimulans des angeborenen Immunsystems mehrerer eukaryotischer Arten, einschließlich Menschen33. Die mütterliche LPS-Injektion führt zu einer sterilen entzündlichen Kaskade ohne die verwirrenden Wirkungen lebender Bakterien, und es ist ein etabliertes Modell für die Induktion der Frühgeburt34, sowie ein Modell der akuten Chorioamnionitis und des fetalen Entzündungsreaktionssyndroms (FIRS), das die schwerste Form der Chorioamnionitis24,35ist. Es hat sich auch gezeigt, dass sowohl zerebrale weiße und graue Materie Verletzung in einem Schaf Modell36 und ein murines Modell37,38,39,40induzieren. Unserer Kenntnis nach sind wir jedoch die ersten, die dieses Modell der Chorioamnionitis und FEMI verwenden, um seine Auswirkungen auf die Entwicklung des Magen-Darm-Traktes nach der Geburt zu untersuchen und einen möglichen mechanistischen Zusammenhang zwischen Chorioamnionitis und späterer Entwicklung von NEC41,42zu untersuchen.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Iowa (Protocol #8041401) genehmigt. Alle Tiere wurden in einer Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) zugelassenem Vivarium an der Universität von Iowa untergebracht. Alle Mäuse waren Wildtyp-Stamm C57Bl/6J.
1. Etablierung von FEMI bei trächtigen Mäusen
- LPS-Vorbereitung
- Verwenden Sie LPS aus Escherichia coli O55:B5 (Lagerkonzentration 2 mg/ml).
- LpS-Lagerkonzentration 1:100 mit steriler Saline für eine Arbeitskonzentration von 20 g/ml verdünnen.
- Mütterliche LPS-Injektion
- Injizieren Sie schwangere Muttern am Trächtigkeitstag e15. Dieser Zeitpunkt beträgt etwa 75% durch die murine Schwangerschaft, was dieses Modell entwicklungsähnlich dem frühen dritten Trimester von menschlichen Schwangerschaften macht, das ist, wenn die Mehrheit der Frühgeburten aufgrund von Chorioamnionitis auftreten.
- Wiegen Sie schwangere Mäuse unmittelbar vor der Injektion, um eine geeignete LPS-Dosierung zu bestimmen.
- Berechnen Sie die Dosis der Arbeitskonzentration nach folgender Formel: 5 l x Gramm Körpergewicht (gbw), für eine Gesamtdosis von LPS von 100 g/kg. Verwenden Sie für Kontrolltiere ein äquivalentes Volumen normaler Saline zur Injektion.
- Vortex LPS Lösung dreimal für 15 Sekunden auf hoch vor jeder Injektion.
- LPS-Volumen in eine 1 ml Spritze aufteilen.
- Halten Sie schwangere Maus mit Scruffing-Technik. Halten Sie in dorsaler Recumbency-Position und führen Sie die Injektion durch.
- Legen Sie eine 30 Gauge 8 mm Nadelabschrägung über dem rechten unteren Quadranten des Bauches (um Blase und Bauchgefäße zu vermeiden) in einem Winkel von 30 bis 201240° ein. Legen Sie etwa 1/4 bis 1/2 die Länge der Nadel ein.
- Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um vor der Injektion einen Unterdruck zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Injektion fort, wenn ein Unterdruck vorliegt.
- Nach der Injektion, beobachten Sie Mäuse für ca. 30 min und kehren dann für den Rest der Schwangerschaft in Die Käfige zurück.
2. Lieferung und Pflege des Nachwuchses und Darmernte
- Liefern Sie Welpen normalerweise über vaginale Lieferung bei e20.
HINWEIS: Dieses Modell hat eine erwartete dosisabhängige fetale Verlustrate, die in Abbildung 1 zu sehen ist und in den folgenden Ergebnissen erläutert wird. - Lassen Sie Welpen bei Müttern bleiben und erhalten Ad libitum Feeds.
- Am Tag der Ernte, typischerweise am 14. Tag (P14), werden Welpen durch Zervixdislokation in Übereinstimmung mit den Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee eingeschläfert.
- Mit Schere und Zange, machen einen vertikalen Schnitt nach unten die Mittellinie des Bauches, durch die Haut und Peritoneum, für die gesamte Länge des Bauches. Den Dünndarm mit der Schere vom Magen zum Cecum verbrauchen und das Mesentery mit Zangen entfernen.
- Isolieren und halten Sie die distalen 1/3 des Dünndarms (Abschnitt repräsentativ für menschliches Ileum), werfen sie den proximalen Dünndarm, das Cecum und den Dickdarm.
- Teilen Sie den Ileum-Anteil mit einer Schere in die Hälfte.
- Legen Sie die proximale Hälfte in eine RNA-Stabilisierungslösung für die spätere RNA-Quantifizierung.
- Legen Sie die distale Hälfte in 10% neutral gepuffertes Formalin für die Folienvorbereitung.
3. Darmverletzung Scoring
- Schnitt Paraffin eingebettet Gewebe in 5 'm dicke Scheiben und montieren auf Glasrutschen.
HINWEIS: Wir senden die Proben an einen Histologiekern für Paraffineinbettung, Schnitt und Montage auf Dias. - Deparaffinisieren Sie Dias nach Standardverfahren.
- Fleckenabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardverfahren.
- Punkteabschnitte auf einer 3-Punkte-Skala für Darmverletzungen wie zuvor beschrieben42,43.
- Bewerten Sie mit Hilfe der Lichtmikroskopie die generalisierte Darmverletzung durch zwei getrennte blinde Forscher auf einer 3-Punkte-Skala, in der die Villusintegrität und die Trennung von der Kellermembran43 (Ergänzende Abbildung 1) bewertet werden. Darmverletzungen werden am besten bei 20-facher Vergrößerung und numerischer Blende 0,50 beurteilt.
- Weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu, um die normale Schleimhaut zu beschreiben.
- Weisen Sie eine Punktzahl von 1 beschreiben leichte Verletzungen, die die Entwicklung von subepithelialen Grünhagen Raum, Vakuolisierung oder subepitheliale Heben beschränkt auf die Lamina propria oder Spitzen von Villi umfasst.
- Weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu, um schwere Verletzungen zu beschreiben, die durch epitheliale Hebung und Vakuolisierung von mehr als der Hälfte der Zotten-, Zottenverzerrung oder Schleimhautulzerung und Desintegration der Laminapropria angezeigt werden.
4. Quantifizierung von Paneth- und Kelchenzellen
- Nach der Deparaffinierung, Flecken diagletten von Gewebeabschnitten aus Schritt 2.8 mit Alcian Blue/Periodic Acid Schiff Fleck, um sowohl Kelchen und Paneth Zellen wie zuvor beschrieben44,45 nach den folgenden Schritten zu bezeichnen.
HINWEIS: Während Alcian Blue/Periodic Acid Schiff Fleck ist nicht spezifisch für Paneth oder Kelche Zellen, unserer Erfahrung nach, blinde erfahrene Forscher haben gleichwertige zelluläre Quantifizierung mit diesem Fleck im Vergleich zu zellulären gezielten Antikörpern, mit deutlich weniger Hintergrundfärbung46. - Deparaffinisieren, Flecken, und dehydrieren gleitet wie folgt.
- Zweimal 10 min in Xylol untertauchen.
VORSICHT: Xylol sollte in einer Dunstabzugshaube verwendet werden. - Spülen Sie mit 100% EtOH.
- Untertauchen Sie Dias in 100 % EtOH für 3 min, dann in 90% EtOH für 3 min, gefolgt von 70% EtOH für 3 min, und schließlich tauchen Dias in 50% EtOH für 3 min.
- Waschen Sie unter fließendem Leitungswasser für 5 min.
VORSICHT: Zeigen Sie den Abschnitt vom fließenden Wasser weg, um den Verlust der Gewebeprobe zu verhindern. - Filter Alcian blau Fleck Lösung mit einem Standard-Kaffeefilter.
- Fleck gleitet in Alcian blauen Fleck für 15 min und dann unter fließendem Leitungswasser für 2 min waschen.
- 1 mg Periodensäure in 200 ml doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Untertauchen Sie Dias in dieser Lösung für 5 min. Dann unter fließendem Leitungswasser für 1 min waschen.
- Mit Schiff-Reagenz 10 min färben. Waschen Sie unter fließendem Leitungswasser für 5 min.
- Die Dias mit Hämatoxylin 1 min beflecken und dann 2 min unter fließendem Leitungswasser waschen.
- Untertauchen Sie sie in sauren Alkohol (1 ml Salzsäure gemischt in 99 ml von 70% EtOH) für 1 min.
- In Scotts Leitungswasser (0,1% Konzentration von NaHCO3 in Leitungswasser) für 1 min untertauchen und dann 1 min unter fließendem Leitungswasser waschen.
- Dehydrieren Sie die Dias.
- Tauchen Sie jede Rutsche 10 Mal in 70% EtOH, dann tauchen Sie 10 mal in 90% EtOH, und 10 mal in 100% EtOH.
- Untertauchen Sie diagleitet in 100% EtOH für 10 min, gefolgt von dem Tauchen zweimal in frisches Xylol für jeweils 3 min.
- Legen Sie einen Tropfen Montagemedium auf das Exemplar und legen Sie einen Deckeldarüberabschlag darüber.
- Zweimal 10 min in Xylol untertauchen.
- Goblet-Zellzählung
- Mit Hilfe der Lichtmikroskopie Kelchenzellen zählen (Ergänzende Abbildung 2). Für jedes Stück Darmgewebe zählen Sie die Anzahl der Kelchenzellen und 500 Epithelzellen und exprimieren Sie das Kelchenzellverhältnis als Verhältnis pro 100 Epithelzellen. Kelchzellen werden am besten bei 20-facher Vergrößerung und numerischer Blende 0,5 gezählt.
- Paneth-Zellzählung
- Mit Hilfe der Lichtmikroskopie panegieren Sie Paneth-Zellen (Ergänzende Abbildung 2). Für jedes Stück Darmgewebe, Exprimieren als Verhältnis von Paneth-Zellen pro Darmkrypta. Zählen Sie 100 Darmkrypten pro Stück Darmgewebe. Paneth-Zellen werden am besten bei 20x-60x Vergrößerung und numerischer Blende 0.50-1.30 gezählt.
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Representative Results
Die Exposition gegenüber FEMI am embryonalen Tag 15 führt zu einem dosisabhängigen Schwangerschaftsverlust und einer dosisabhängigen Rate der Frühzeitarbeit (Abbildung 1)42. Für die Experimente haben wir uns für eine LPS-Dosis von 100 g/kg entschieden, um Schwangerschaftsverlust und Frühreife (50% Verlust zwischen Frühreife und intrauterinem fetalem Tod) zu minimieren und gleichzeitig die Föten einer signifikanten entzündlichen Beleidigung auszusetzen.
Mit diesem Ansatz untersuchten wir als nächstes die Auswirkungen von FEMI auf die folgeverletzungen der Nachkommen. Mit einer 3-Punkt-Histologisch-Skala zur Messung generalisierter Darmverletzungen fanden wir signifikante Verletzungen bei der Geburt (P0) und im Erwachsenenalter (P56 oder 8 Wochen Des Lebens) (Abbildung 2). Es ist wichtig zu beachten, dass diese Verletzung in Ermangelung zusätzlicher Reize für die Tiere außer FEMI aufgetreten ist, was darauf hindeutet, dass FEMI allein die normale Homöostase des neugeborenen murinen Darmtraktes stört. Da die Maus mit einem relativ unreifen Darm geboren wird, der sich in den ersten 4 Lebenswochen47,48weiter entwickelt, ist dies für Frühgeborene relevant, die auch unreife Darmtrakte haben.
Um die Wirkung von FEMI sowohl auf die normale Entwicklung des Darmepithels als auch auf die Abwehrmechanismen des unreifen Darmtraktes weiter zu verstehen, quantifizierten wir die Anzahl der mucinproduzierenden Kelchzellen und antimikrobiellen Peptid produzierenden Panethzellen im distalen Drittel des kleinen Darmtraktes, der dem menschlichen Ileum ähnelt. Wir fanden heraus, dass FEMI die normale Zusammensetzung des Darmepithels störte, indem es den Verlust sowohl der Kelchenzellen als auch der Paneth-Zellen im Vergleich zu Tieren ohne FEMI induzieren ließ (Abbildung 3).
Um die Auswirkungen von FEMI auf die neonatale Entzündungsreaktion zu untersuchen, mit ELISA mit Elektrochemilumineszenz, quantifizierten wir eine Vielzahl von Serum-Entzündlichen Markern, die IL-1, IL-10, KC-GRO (das murine Äquivalent von IL-8) und IL-6 aus Serum von Welpen mit und ohne FEMI enthielten (Abbildung 4). Wir fanden heraus, dass FEMI die entzündliche Kaskade für alle Zytokine bei P0 signifikant erhöhte. Die entzündliche Kaskade in späteren Jahren (P7-u2012P56) unterschied sich je nach Zeitpunkt und Zytokin. Am interessantesten ist, dass es für IL-6 ähnliche Werte bei P7-u2012P28 in den FEMI- und Scheingruppen gab, aber trotz keiner sekundären Intervention gab es in der FEMI-Gruppe bei P56 deutlich höhere Werte. Dies ist besonders wichtig, da wir gezeigt haben, dass IL-6 ein kritisches Zytokin für die Entwicklung von postnatalen Darmverletzungen im FEMI-Modell ist.
Abbildung 1: Wirkung der FEMI-Dosis auf die Schwangerschaftsergebnisse. Das Überleben von Schwangerschaftsabfällen ist dosisabhängig mit höheren Dosen, die höhere Raten des Schwangerschaftsverlustes (A) und höhere Raten der Frühgeburt (B) verursachen. Die Figur wurde mit Genehmigung von Fricke et al42angepasst. FEMI mit einer LPS-Dosis von 100 g/kg erzeugt ein 50%iges Überleben für Welpen um eine Woche. Jeder Datenpunkt ist repräsentativ für eine n > 8 Schwangerschaften und mindestens drei Einzelexperimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wirkung von FEMI auf distale kleine Darmverletzungsmuster im Laufe der Zeit. Darmproben wurden bei der Geburt, 1 Lebenswoche, 2 Wochen Leben und 8 Wochen Leben von Mäusen geerntet, die FEMI (100 g/kg LPS) oder Scheinkontrolle ausgesetzt waren. Die Proben wurden anhand einer 3-Punkte-Verletzungsskala von geblendeten Ermittlern42,43bewertet. FEMI allein ohne weitere Beleidigung induzierterhebliche Menge an Verletzungen bei der Geburt, 1 Woche des Lebens, und bei 8 Wochen des Lebens. Die Figur wurde mit Genehmigung von Fricke et al.42angepasst. Jeder Datenpunkt ist repräsentativ für eine n > 10 Welpen und mindestens drei Einzelexperimente von mindestens 3 schwangeren Muttertieren. Mann-Whitney nicht-parametrische T-Tests wurden verwendet, um Darmverletzungswerte zu jedem Zeitpunkt zu vergleichen. Das Sternchen gibt p < 0,05 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: FEMI induziert Veränderungen der normalen Kelchen- und Panethzellmengen im Dünndarm während der Entwicklung. Darmproben wurden bei der Geburt, 1, 2, 4 und 8 Wochen Des Lebens von Mäusen geerntet, die FEMI (100 g/kg LPS) oder Scheinkontrolle ausgesetzt waren. Die Proben wurden mit Alcian blue/Periodic Acid Schiff Fleck gefärbt, um sowohl Kelchen- als auch Paneth-Zellen zu erkennen, und diese wurden von einem geblendeten Forscher quantifiziert. Sowohl Kelchenzellen als auch Paneth-Zellen von Tieren mit FEMI zeigten entweder einen Trend oder eine signifikante Abnahme im Vergleich zu Scheinkontrollen in allen Altersgruppen. Figur angepasst mit Genehmigung von Elgin et al.41. Jeder Datenpunkt ist repräsentativ für eine n > 10 Welpen und mindestens drei Einzelexperimente. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler des Mittelwerts dar. Student T-Testing wurde verwendet, um Mengen von Kelchen und Paneth-Zellen zu jedem Zeitpunkt zu vergleichen. Das Sternchen gibt p < 0,05 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: FEMI induziert eine globale neonatale Entzündungswelle für alle Zytokine unmittelbar nach der Geburt bei P0, mit einem späten Anstieg von IL-6 bei P56. Serumzytokine wurden bei P0, P7, P14 und P28 mit ELISA mit Elektrochemilumineszenz gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert, und Platten wurden bei 620 nm gelesen. Zytokinwerte werden hier in einem Radardiagramm dargestellt, und alle Zytokine werden als Prozent des Maximalwerts dargestellt. In der FEMI-Gruppe gab es signifikante Zunahmen bei allen Zytokinen (IL-1, IL-10, KC-GRO und IL-6) bei P0 in der FEMI-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (alle p < 0,05). Es gab auch einen wieder auflebenden Anstieg der IL-6-Spiegel bei P56 bei den Welpen mit FEMI im Vergleich zu keinem FEMI (p < 0,05 durch nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Tests), das das einzige Zytokin war, das in der FEMI-Gruppe signifikant erhöht war, verglichen mit der Kontrolle zu diesem späten Zeitpunkt. Figur angepasst mit Genehmigung von Elgin et al.41. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Darmverletzung stoliertes Ilealgewebe. Die Schadensbewertungen werden durch eine Drei-Punkte-Darmverletzungs-Scoring-Skala (0=normal, 1=leichte Verletzung, 2=schwere Verletzung) bestimmt, basierend auf dem Grad der Villi-Vakuolisierung, Schleimhautulzerrung, Lamina-Propria-Schäden und dem Vorhandensein von Blutungen in der Zottenart, wie zuvor beschrieben43. Figur angepasst mit Genehmigung von Elgin et al.41. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Repräsentatives Auftreten von Alcian Blue/PAS Färbung von Kelchen- und Panethzellen. Alcian Blue/PAS Färbung von Darmgewebe ermöglicht eine klare Visualisierung von Kelchzellen, vorhanden in Darmzotten (obere Platte mit weißen Pfeilen markiert, Bild bei 20-facher Vergrößerung aufgenommen), und Paneth-Zellen, in Krypten von Lieberkuhn, unter der Darmzotten in der Lamina propria (untere Platte mit gelben Pfeilen markiert, Bild bei 60-facher Vergrößerung aufgenommen). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Chorioamnionitis wirkt sich auf 2-u20124% der Laufzeit und 25-u201230% der Frühlieferungen8,9. Jedoch, die Auswirkungen der Chorioamnionitis kann lange nach der Geburt verlängern, da es gezeigt hat, dass signifikante Auswirkungen auf den Fötus und Neugeborenen10,11,12,13,14,15,16haben. Wichtig ist, dass Chorioamnionitis nachweislich mit der späteren Entwicklung von NEC15,16in Verbindung gebracht wird. Während es noch unvollständig verstanden wird, beinhaltet die Pathogenese von NEC wahrscheinlich eine Kombination aus Darmunreife, Dysregulation des unreifen Immunsystems, Darmentzündung und bakterielle Translokation, die in einem letzten gemeinsamen Weg der Darmnekrose19gipfelt. Ein mechanistischer Zusammenhang zwischen Chorioamnionitis und der anschließenden Entwicklung von NEC bleibt jedoch unklar20, und frühere Tiermodelle der Chorioamnionitis reichten nicht aus, um diese Beziehung zu untersuchen. Um diese Wissenslücke zu schließen, haben wir das häufig verwendete LPS-induzierte murine Modell der Chorioamnionitis und Frühgeburt34,37,38,39,40 modifiziert, um die Geburt und das Überleben von Neugeborenen zu ermöglichen. Dabei haben wir ein Modell erstellt, das den entzündlichen Zustand bei Chorioamnionitis42 annähert, um die Auswirkungen der fetalen Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) auf die nachfolgende Darmentwicklung zu untersuchen.
Mit diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass dieses murine Modell der Chorioamnionitis, mit LPS-induzierter FEMI, sowohl zu kurz- und langfristigen Darmverletzungen als auch zu einer Unterbrechung der normalen Darmentwicklung führt, insbesondere zu einer Downregulation sowohl von Kelchen- als auch von Panethzellen, die beide eine erste Linie angeborener Immunität gegen Darmentzündungen bieten. Die Darmverletzung und histologische zelluläre Veränderungen, die mit diesem Modell gesehen werden, zeigt, dass es ein effektives Modell ist, um die Verletzung in NEC gesehen zu imitieren. Dies liegt in erster Linie daran, dass die Downregulation von Paneth-Zellen und Kelchzellen beide in die Pathogenese von NEC verwickelt sind, und die Muster der histologischen Verletzung sind ähnlich wie in menschlichen Fällen von NEC41,42,49. Daher ist dieses LPS-induzierte FEMI-Modell der Chorioamnionitis ein ideales Modell für die Untersuchung des mechanistischen Zusammenhangs zwischen Chorioamnionitis und späterer Darmverletzung, insbesondere der Entwicklung von NEC, sowie möglichen Auswirkungen der Chorioamnionitis auf das sich entwickelnde Mikrobiom, was mit bestehenden Modellen, die lebende Bakterien nutzen, nicht möglich wäre.
In vivo, Chorioamnionitis beinhaltet oft eine aufsteigende bakterielle Infektion, die oft zu einem Frühbruch der Membranen und dem klinischen Phänotyp der Chorioamnionitis führt, und Tiermodelle der Chorioamnionitis, die diese Pathophysiologie genauer widerspiegeln25,28,30,32. Da unsere Laborstudien jedoch die Darmentwicklung, einschließlich des sich entwickelnden Mikrobioms, untersuchen, würde das Vorhandensein lebender Bakterien in einem Modell der Chorioamnionitis die Mikrobiomanalyse verwirren. Daher sind bestehende Modelle der Chorioamnionitis unter Verwendung lebender Bakterien unpraktisch für die Untersuchung des mechanistischen Zusammenhangs zwischen Chorioamnionitis und späterer Entwicklung von NEC. Darüber hinaus, LPS-induzierte Modelle der Chorioamnionitis waren bereits wirksam bei der Modellierung postnatale weiße und graue Materie Hirnverletzung36, zeigt, dass diese Methode ist ein effektiver Weg, um Morbiditäten der Frühreife zu modellieren, die mit der Exposition gegenüber Chorioamnionitis zum Zeitpunkt der Geburt verbunden sind.
Es ist auch wichtig zu beachten, dass dieses Modell in hohem Maße von der Dosis von LPS abhängig ist, die verwendet wird, um FEMI zu induzieren. Der wichtigste kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Induktion von FEMI in den schwangeren Muttertieren mit intraperitonealer Injektion von LPS; Daher haben wir nicht überraschend festgestellt, dass die Dosis von LPS, die zur Induzieren von FEMI verwendet wird, für die Ergebnisse dieser Experimente äußerst wichtig ist. Bei ersten Experimenten wurde eine Dosis von 100 g/kg LPS verwendet, da diese LPS-Dosis nicht mit der Müttersterblichkeit in Verbindung gebracht wurde und zu etwa 50% neonatalen Überlebens sowie signifikanten Darmverletzungen bei Nachkommen41,42führte.
LPS bindet an den Toll-like-Rezeptor-4(TLR4)-Komplex, was zu einer Aggregation von intrazellulären Signalproteinen, der Zytokinproduktion und der Initiierung der pro-inflammatorischen Signalisierung50führt. Mautähnliche Rezeptoren (TLRs) einschließlich TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 und TLR9 sind wichtig für die Induktion der Entzündungsreaktion, die bei einer Vielzahl von Krankheitserregern und Mikroorganismen wie Viren, Bakterien und Pilzen gesehen wird51. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die Upregulation von TLR3 auch mit erhöhten histologischen Darmschäden und viralem Vergießen in einem neonatalen murinen Rotavirus-Modell korreliert; darüber hinaus hat der Knockout von TLR3 diese Effekte verbessert52. Während das Modell tLR4-Wege nutzt, ist es daher vernünftig anzunehmen, dass die Stimulation anderer TLRs ähnliche Befunde liefern kann.
Mit dieser Methode konnten wir zeigen, dass die LPS-Injektion bei trächtigen Muttersteinen zu einer Zunahme der entzündlichen Marker von Müttern, Plazenta und Fötus führt, während die Fruchtwasserflüssigkeit geschont wird, und dass sie direkte Schäden an der Plazenta42verursacht. Interessanterweise zeigte diese Methode keine Veränderung des Widerstands in den Gebärmutterarterien. Das FEMI-Modell hat auch einen signifikanten Einfluss auf die Nachkommen, da wir gezeigt haben, dass exponierte Welpen eine signifikante Darmverletzung42 durch einen IL-6-abhängigen Weg41 haben und wichtige Abwehrmechanismen des Darms wie Kelchenzellen und Panethzellen41beeinflussen können. Diese Verletzung macht die neugeborenen Nachkommen zunehmend anfällig für nachfolgende LPS-induzierte Darmverletzungen und Entzündungen41, was erklären kann, warum Säuglinge, die einer Chorioamnionitis ausgesetzt sind, eine erhöhte Anfälligkeit für die Entwicklung von NEC haben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) und der University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| Alcian blue stain | Newcomer supply | 1003A | |
| C57Bl6/J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Ethanol | Decon labs | 2701 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| Hematoxylin stain | Leica | 381562 | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Nikon Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 2CE-MQVJ-1 | |
| Periodic Acid | ACROS | H5106 | CAS# 10450-59-9 |
| RNAlater | Thermofisher | Am7021 | |
| Schiff's reagent | Sigma | S5133 | |
| Secor Imager 2400 | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| V-Plex Assay | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| Xylene | Sigma | 534056 |
References
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