Summary
We ontwikkelden een model van chorioamnionitis om foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI) te simuleren zonder complicaties van levende organismen om de effecten van FEMI op de ontwikkeling van het darmkanaal van het nageslacht te onderzoeken. Dit maakt het mogelijk om mechanistische oorzaken voor de ontwikkeling van darmletsel na chorioamnionitis te bestuderen.
Abstract
Chorioamnionitis is een veel voorkomende precipitant van vroeggeboorte en wordt geassocieerd met veel van de morbiditeiten van prematuriteit, waaronder necrotiserende enterocolitis (NEC). Een mechanistisch verband tussen deze twee aandoeningen moet echter nog worden ontdekt. We hebben een murien model van chorioamnionitis aangenomen waarbij lipopolysaccharide (LPS) wordt veroorzaakt door foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI). Dit model van FEMI induceert een steriele maternale, placenta en foetale inflammatoire cascade, die ook aanwezig is in veel gevallen van klinische chorioamnionitis. Hoewel er modellen bestaan die levende bacteriën gebruiken en nauwkeuriger de pathofysiologie van een oplopende infectie nabootsen die resulteert in chorioamnionitis, kunnen deze methoden indirecte effecten hebben op de ontwikkeling van het onrijpe darmkanaal en het bijbehorende ontwikkelende microbioom. Met behulp van dit protocol hebben we aangetoond dat LPS-geïnduceerde FEMI resulteert in een dosisafhankelijke toename van zwangerschapsverlies en vroeggeboorte, evenals verstoring van de normale darmontwikkeling bij nakomelingen. Verder hebben we aangetoond dat FEMI darmletsel en serumcytokinen bij nakomelingen aanzienlijk verhoogt, terwijl tegelijkertijd de bokaal- en Paneth-cellen afnemen, die beide een eerste lijn van aangeboren immuniteit tegen darmontsteking bieden. Hoewel een soortgelijk model van LPS-geïnduceerde FEMI is gebruikt om de associatie tussen chorioamnionitis en daaropvolgende afwijkingen van het centrale zenuwstelsel te modelleren, is dit protocol voor zover wij weten het eerste dat probeert een mechanistisch verband tussen chorioamnionitis en latere verstoringen in de darmontwikkeling op te helderen als een potentieel verband tussen chorioamnionitis en NEC.
Introduction
De chorionmembranen spelen een integrale rol bij de zwangerschap van zoogdieren. Ze omvatten het koraal en amnion, die meerdere functies vervullen. Ze omringen en beschermen de foetus, vergemakkelijken paracrinesignalering tussen de maternale en foetalecompartimenten 1, en creëren lokale feedbacklussen binnen de chorionmembranen, die betrokken kunnen zijn bij het initiëren van de bevalling1. Huidig begrip van de membranen geeft aan dat het amnion een structurele barrièrefunctie biedt, en het chorion biedt een immunologische buffer voornamelijk om de zich ontwikkelende foetus te beschermen tegen het maternale immuunsysteem2. Ontsteking van deze membranen staat bekend als chorioamnionitis. Historisch gezien werd de diagnose van klinische chorioamnionitis gesteld na de aanwezigheid van maternale koorts plus een of meer foetale of maternale klinische bevindingen3,4. Hoewel deze definitie klinisch nuttig is, heeft het gebrek aan precisie het onderzoek naar chorioamnionitis uitdagend gemaakt. In 2015, in een poging om de diagnose te verduidelijken, definieerde een workshop van een deskundigenpanel door het Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis als intra-uteriene ontsteking, of infectie, of beide (triple I)3. Deze verduidelijking is belangrijk omdat, hoewel microbiële geïnduceerde infectie een belangrijke oorzaak is van baarmoeder/vruchtwaterontsteking, het minder vaak voorkomt dan steriele baarmoeder/vruchtwaterontsteking5,6,7. Over het algemeen blijft chorioamnionitis een significant probleem voor de volksgezondheid, zoals blijkt uit 2\u20124% van de termijnleveringen en 25\u201230% van de te vroeg geleverde leveringen8,9.
Chorioamnionitis kan aanzienlijke effecten hebben op de foetus en neonaat. Het is goed gedocumenteerd in de literatuur dat chorioamnionitis geassocieerd is met een verhoogd risico op veel van de morbiditeiten van prematuriteit, waaronder bronchopulmonale dysplasie10, cerebrale wittestofletsel11, intraventriculaire bloeding12, retinopathie van prematuriteit13, en zowel vermoede als bevestigde vroeg beginnende neonatale sepsis14,15. Aangezien we geïnteresseerd zijn in verwondings- en herstelmechanismen van het onrijpe darmkanaal, is het belangrijk op te merken dat chorioamnionitis ook wordt geassocieerd met latere ontwikkeling van necrotiserende enterocolitis (NEC)15,16. NEC is een verwoestende gastro-intestinale ziekte van premature zuigelingen die resulteert in een ontregelde gastheerrespons op ontsteking en daaropvolgende intestinale necrose17. Elk jaar treft NEC meer dan 4000 zuigelingen in de Verenigde Staten, en tot een derde van deze zuigelingen sterft aan de ziekte18. De pathogenese van NEC omvat waarschijnlijk een combinatie van intestinale onvolwassenheid, dysregulatie van het onrijpe immuunsysteem, darmontsteking en bacteriële translocatie19, culminerend in een laatste gemeenschappelijke route van intestinale necrose. Belangrijk is dat het begin van NEC vaak weken na de geboorte optreedt en mogelijke blootstelling aan chorioamnionitis, waardoor het mechanistische verband tussen chorioamnionitis en de daaropvolgende ontwikkeling van NEC onduidelijkis 20. Een potentieel mechanisme waarmee chorioamnionitis kan bijdragen tot de pathofysiologie van NEC is door upregulatie van het maternale immuunsysteem, waardoor vervolgens een sterke foetale ontstekingsreactie ontstaat die normale foetale ontwikkelingspatronen kan verstoren21,22,23.
Meerdere zoogdiermodellen van chorioamnionitis bestaan bij knaagdieren en schapen24,25,26,27,28,29,30,31,32. Er bestaan echter weinig gegevens over de ontwikkeling van het darmkanaal na de eerste pasgeboren periode na chorioamnionitis-geïnduceerde foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI). Om de relatie tussen FEMI en de daaropvolgende ontwikkeling van letsel van het onrijpe darmkanaal te onderzoeken, hebben we het lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde FEMI-model aangepast. Lipopolysachariden zijn een belangrijk onderdeel van het extracellulaire oppervlak op gramnegatieve bacteriën en zijn een krachtig stimulerend middel van het aangeboren immuunsysteem van meerdere eukaryotische soorten, waaronder mensen33. Maternale LPS-injectie resulteert in een steriele ontstekingscascade zonder de verstorende effecten van levende bacteriën, en het is een bekend model voor inductie van vroeggeboorte34, evenals een model van acute chorioamnionitis en het foetale inflammatoire responssyndroom (FIRS), de meest ernstige vorm van chorioamnionitis24,35. Het is ook aangetoond dat zowel cerebrale witte als grijze stof letsel veroorzaken in een schapenmodel36 en een murien model37,38,39,40. Voor zover wij weten, zijn we echter de eersten die dit model van chorioamnionitis en FEMI gebruiken om de effecten ervan op de ontwikkeling van het maagdarmkanaal na de geboorte te onderzoeken, evenals om een mogelijk mechanistisch verband te onderzoeken tussen chorioamnionitis en latere ontwikkeling van NEC41,42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #8041401). Alle dieren werden ondergebracht in een door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) goedgekeurd vivarium aan de Universiteit van Iowa. Alle muizen waren wilde type stam C57Bl/6J.
1. Oprichting van FEMI bij zwangere muizen
- LPS voorbereiding
- Gebruik LPS afgeleid van Escherichia coli O55:B5 (stamconcentratie 2 mg/ml).
- Verdun lps-stamconcentratie 1:100 met steriele zoutoplossing voor een werkconcentratie van 20 μg/ml.
- Maternale LPS injectie
- Injecteer zwangere moederdieren op zwangerschapsdag e15. Dit tijdspunt is ongeveer 75% door de muriene zwangerschap, waardoor dit model ontwikkelingsgericht vergelijkbaar is met het vroege derde trimester van menselijke zwangerschappen, dat is wanneer de meerderheid van de vroeggeboorten als gevolg van chorioamnionitis optreedt.
- Weeg zwangere muizen onmiddellijk voorafgaand aan de injectie om de juiste LPS-dosering te bepalen.
- Bereken de dosis werkconcentratie met behulp van de volgende formule: 5 μL x gram lichaamsgewicht (gbw), voor een totale dosis LPS van 100 μg/kg. Gebruik voor controledieren een equivalent volume normale zoutoplossing voor injectie.
- Vortex LPS-oplossing driemaal gedurende 15 seconden op hoog voorafgaand aan elke injectie.
- Trek het LPS-volume op in een spuit van 1 ml.
- Houd zwangere muis in bedwang met scruffing techniek. Houd de dorsale lighouding vast en voer de injectie uit.
- Plaats een 30 gauge 8 mm naald afschuining over het rechter onderste kwadrant van de buik (om blaas en buikvaten te voorkomen) onder een hoek van 30\u201240°. Steek ongeveer 1/4 tot 1/2 van de lengte van de naald in.
- Trek de zuiger van de spuit terug om een negatieve druk te garanderen voordat u gaat injecteren. Ga verder met de injectie als er een negatieve druk aanwezig is.
- Controleer na injectie muizen ongeveer 30 minuten en keer vervolgens terug naar kooien voor de rest van de zwangerschap.
2. Levering en verzorging van nakomelingen, en darmoogst
- Lever pups normaal via vaginale bevalling op e20.
OPMERKING: Dit model heeft een verwachte dosisafhankelijke foetale verliessnelheid die te zien is in figuur 1 en wordt besproken in de onderstaande resultaten. - Laat pups bij moeders blijven en ad libitum feeds ontvangen.
- Op de dag van de oogst, meestal postnatale dag 14 (P14), euthanaseren pups via cervicale dislocatie in overeenstemming met de protocollen van het Institutional Animal Care and Use Committee.
- Maak met behulp van een schaar en tang een verticale incisie langs de middellijn van de buik, door de huid en het buikvlies, over de hele lengte van de buik. Verwijder de dunne darm van de maag naar de cecum met een schaar en verwijder de mesenterie met een tang.
- Isoleer en houd de distale 1/3 van de dunne darm (sectie representatief voor menselijk ileum), waarbij de proximale dunne darm, het cecum en de dikke darm worden weggegooid.
- Verdeel het ileumgedeelte doormidden met een schaar.
- Plaats de proximale helft in een RNA-stabilisatieoplossing voor latere RNA-kwantificering.
- Plaats de distale helft in 10% neutrale gebufferde formaline voor diavoorbereiding.
3. Darmblessure scoren
- Sectie paraffine ingebed weefsel in 5 μm dikke plakjes en monteren op glazen dia's.
OPMERKING: We sturen de specimens naar een histologiekern voor paraffine-inbedding, doorsneden en montage op dia's. - Dia's deparaffiniseren volgens standaardprocedures.
- Vleksecties met hematoxyline en eosine volgens standaardprocedures.
- Scoresecties op een 3-puntsschaal voor darmletsel zoals eerder beschreven42,43.
- Beoordeel met behulp van lichtmicroscopie gegeneraliseerd darmletsel door twee afzonderlijke geblindeerde onderzoekers op een 3-puntsschaal die de villus-integriteit en scheiding van het keldermembraan evalueert43 (Aanvullende figuur 1). Darmletsel kan het best worden beoordeeld bij 20x vergroting en numerieke opening 0,50.
- Wijs een score van 0 toe om het normale slijmvlies te beschrijven.
- Wijs een score van 1 toe die milde verwonding beschrijft die de ontwikkeling van subepitheliale Gruenhagen's ruimte, vacuolisatie of subepitheliale lifting omvat die beperkt is tot de lamina propria of uiteinden van villi.
- Wijs een score van 2 toe om ernstig letsel te beschrijven, aangegeven door epitheliale lifting en vacuolisatie groter dan de helft van de villi, villi vervorming of mucosale ulceratie en desintegratie van de lamina propria.
4. Kwantificering van Paneth- en bokaalcellen
- Na deparaffinisatie worden vlekdia's van weefselsecties uit stap 2.8 met Alcian Blue/Periodic Acid Schiff-vlek weergegeven om zowel bokaal- als Paneth-cellen aan te duiden zoals eerder beschreven44,45 volgens de volgende stappen.
OPMERKING: Hoewel Alcian Blue/Periodic Acid Schiff-vlek niet specifiek is voor Paneth- of bokaalcellen, hebben geblindeerde ervaren onderzoekers in onze ervaring een gelijkwaardige cellulaire kwantificering met behulp van deze vlek in vergelijking met cellulaire gerichte antilichamen, met aanzienlijk minder achtergrondkleuring46. - Dia's als volgt deparaffiniseren, bevlekken en uitdrogen.
- Dompel dia's twee keer 10 minuten onder in xyleen.
LET OP: Xyleen dient in een zuurkast te worden gebruikt. - Spoel af met 100% EtOH.
- Dompel dia's 3 minuten onder in 100 % EtOH, vervolgens in 90% EtOH gedurende 3 minuten, gevolgd door 70% EtOH gedurende 3 minuten, en ten slotte dompelt u dia's in 50% EtOH gedurende 3 minuten onder.
- Wassen onder stromend leidingwater gedurende 5 min.
LET OP: Wijs het gedeelte uit de buurt van het stromende water om verlies van weefselmonsters te voorkomen. - Filter Alcian blauwe vlekoplossing met een standaard koffiefilter.
- Vlek glijdt in Alcian blauwe vlek gedurende 15 min en was vervolgens onder stromend leidingwater gedurende 2 min.
- Verdun 1 mg periodiek zuur in 200 ml dubbel gedestilleerd water. Dompel dia's gedurende 5 minuten onder in deze oplossing. Was vervolgens 1 minuut onder stromend leidingwater.
- Vlek met Schiff's reagens gedurende 10 min. Wassen onder stromend leidingwater gedurende 5 min.
- Bevlek de dia's met hematoxyline gedurende 1 min en was vervolgens 2 min onder stromend leidingwater.
- Dompel ze gedurende 1 min onder in zure alcohol (1 ml zoutzuur gemengd in 99 ml van 70% EtOH).
- Dompel onder in Scott's kraanwater (0,1% concentratie Van NaHCO3 in leidingwater) gedurende 1 min en was vervolgens onder stromend leidingwater gedurende 1 min.
- Droog de dia's uit.
- Dip elke dia 10 keer in 70% EtOH, dip dan 10 keer in 90% EtOH en 10 keer in 100% EtOH.
- Dompel dia's 100% EtOH onder gedurende 10 minuten, gevolgd door tweemaal onderdompelen in verse xyleen gedurende elk 3 minuten.
- Plaats een druppel montagemedia op het monster en plaats er een afdeklip overheen.
- Dompel dia's twee keer 10 minuten onder in xyleen.
- Het tellen van de gobletcel
- Tel met behulp van lichte microscopie bokaalcellen (Aanvullend figuur 2). Tel voor elk stukje darmweefsel het aantal bokaalcellen en 500 epitheelcellen en druk de gobletcelverhouding uit als een verhouding per 100 epitheelcellen. Bokaalcellen kunnen het beste worden geteld bij 20x vergroting en numeriek diafragma 0,5.
- Paneth-celtelling
- Tel met behulp van lichtmicroscopie Paneth-cellen (Aanvullend figuur 2). Voor elk stukje darmweefsel, uitdrukken als een verhouding van Paneth cellen per intestinale crypte. Tel 100 darm crypten per stuk darmweefsel. Paneth cellen kunnen het beste geteld worden bij 20x-60x vergroting en numeriek diafragma 0,50-1,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blootstelling aan FEMI op embryonale dag 15 leidt tot een dosisafhankelijk zwangerschapsverlies en een dosisafhankelijk percentage vroegtijdige arbeid (Figuur 1)42. Voor de experimenten kozen we ervoor om een LPS-dosis van 100 μg/kg te gebruiken om zwangerschapsverlies en prematuriteit (50% verlies tussen zowel prematuriteit als intra-uteriene foetale ondergang) te minimaliseren, terwijl we de foetussen blootstelden aan een significante ontstekingsbelediging.
Met behulp van deze aanpak onderzochten we vervolgens de effecten van FEMI op de daaropvolgende verwonding van het nageslacht. Met behulp van een 3-punts histologische schaal om gegeneraliseerd darmletsel te meten, vonden we significant letsel bij de geboorte (P0) en op volwassen leeftijd (P56 of 8 weken van het leven) (Figuur 2). Het is belangrijk op te merken dat deze verwonding is opgetreden bij afwezigheid van extra stimuli voor de andere dieren dan FEMI, wat suggereert dat FEMI alleen de normale homeostase van het pasgeboren muriene darmkanaal verstoort. Omdat de muis wordt geboren met een relatief onvolwassen darm die zich blijft ontwikkelen tijdens de eerste 4 weken van het leven47,48, is dit relevant voor premature zuigelingen die ook onrijpe darmen hebben.
Om het effect van FEMI op zowel de normale ontwikkeling van het darmepitheel als op de afweermechanismen van het onrijpe darmkanaal verder te begrijpen, hebben we het aantal mucineproducerende bokaalcellen en antimicrobiële peptideproducerende Paneth-cellen in het distale derde van het kleine darmkanaal gekwantificeerd, wat vergelijkbaar is met het menselijke ileum. We ontdekten dat FEMI de normale samenstelling van het darmepitheel verstoorde door verlies van zowel bokaalcellen als Paneth-cellen op te wekken in vergelijking met dieren zonder FEMI (Figuur 3).
Om de effecten van FEMI op de neonatale ontstekingsreactie te onderzoeken, met behulp van ELISA met elektrochemiluminescentie, hebben we een verscheidenheid aan serumontstekingsmarkers gekwantificeerd, waaronder IL-1β, IL-10, KC-GRO (het muriene equivalent van IL-8) en IL-6, uit serum van pups met en zonder FEMI (Figuur 4). We ontdekten dat FEMI de ontstekingscascade voor alle cytokinen bij P0 aanzienlijk verhoogde. De inflammatoire cascade op latere leeftijd (P7\u2012P56) verschilde op basis van tijdspunt en cytokine. Het meest interessant is dat er voor IL-6 vergelijkbare niveaus waren op P7\u2012P28 in de FEMI- en schijngroepen, maar ondanks geen secundaire interventie waren er significant hogere niveaus in de FEMI-groep op P56. Dit is vooral belangrijk omdat we hebben aangetoond dat IL-6 een kritische cytokine is voor de ontwikkeling van postnatale darmletsel in het FEMI-model.
Figuur 1: Effect van femi dosis op zwangerschapsuitkomsten. De overleving van zwangerschapsstrooisel is dosisafhankelijk met hogere doses die hogere percentages zwangerschapsverlies (A) en hogere percentages vroeggeboorte (B) veroorzaken. Figuur is aangepast met toestemming van Fricke et al42. FEMI met een LPS-dosis van 100 μg/kg creëert een overleving van 50% voor pups na een week van het leven. Elk gegevenspunt is representatief voor een n > 8 zwangerschappen en ten minste drie individuele experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Effect van FEMI op distale kleine darmletselpatronen in de loop van de tijd. Darmmonsters werden geoogst bij de geboorte, 1 week van het leven, 2 weken van het leven en 8 weken leven van muizen blootgesteld aan FEMI (100 μg/kg LPS) of schijncontrole. Monsters werden gescoord met behulp van een 3-punts letselschaal door geblindeerde onderzoekers42,43. FEMI alleen zonder verdere belediging veroorzaakte aanzienlijke hoeveelheid letsel bij de geboorte, 1 week van het leven en bij 8 weken van het leven. Figuur is aangepast met toestemming van Fricke et al.42. Elk gegevenspunt is representatief voor een n > 10 jongen en ten minste drie individuele experimenten van ten minste 3 zwangere moeders. Mann-Whitney niet-parametrische T-testen werden gebruikt om darmblessurescores op elk moment te vergelijken. Het sterretje geeft p < 0,05 aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: FEMI induceert veranderingen van normale bokaal- en Panethcelhoeveelheden in de dunne darm tijdens de ontwikkeling. Darmmonsters werden geoogst bij de geboorte, 1, 2, 4 en 8 weken leven van muizen blootgesteld aan FEMI (100 μg/kg LPS) of schijncontrole. Monsters werden bevlekt met Alcian blauw/periodiek zuur schiff vlek om zowel bokaal en Paneth cellen te detecteren en deze werden gekwantificeerd door een verblinde onderzoeker. Zowel bokaalcellen als Paneth-cellen van dieren met FEMI vertoonden een trend of een significante afname in vergelijking met schijncontroles op alle leeftijden. Figuur aangepast met toestemming van Elgin et al.41. Elk datapunt is representatief voor een n > 10 pups en ten minste drie individuele experimenten. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Student T-testing werd gebruikt om hoeveelheden bokaal en Paneth cellen te vergelijken op elk moment. Het sterretje geeft p < 0,05 aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: FEMI induceert een wereldwijde neonatale inflammatoire piek voor alle cytokinen onmiddellijk na de geboorte bij P0, met een late piek van IL-6 bij P56. Serumcytokinen werden gekwantificeerd bij P0, P7, P14 en P28 met elisa met elektrochemiluminescentie volgens de instructies van de fabrikant, en platen werden gelezen bij 620 nm. Cytokinewaarden worden hier weergegeven in een radarplot en alle cytokinen worden uitgezet als percentage van de maximale waarde. Alle cytokinen (IL-1β, IL-10, KC-GRO en IL-6) bij P0 in de FEMI-groep waren significant stegen in vergelijking met de controlegroep (alle p < 0,05). Er was ook een heropleving van de IL-6-spiegels bij P56 bij de pups met FEMI in vergelijking met geen FEMI (p < 0,05 door niet-parametrische Kruskal-Wallis-tests), wat het enige cytokine was dat significant verhoogd was in de FEMI-groep in vergelijking met controle op dit late tijdstip. Figuur aangepast met toestemming van Elgin et al.41. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Intestinale letselscore van H&E gekleurd ileaalweefsel. Letselscores worden bepaald door een driepunts intestinale letselscoreschaal (0=normaal, 1=licht letsel, 2=ernstig letsel) op basis van mate van villi vacuolisatie, mucosale ulceratie, lamina propria schade en aanwezigheid van bloeding binnen villi zoals eerder beschreven43. Figuur aangepast met toestemming van Elgin et al.41. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Representatief uiterlijk van Alcian Blue/PAS-kleuring van bokaal- en Panethcellen. Alcian Blue / PAS-kleuring van darmweefsels maakt een duidelijke visualisatie mogelijk van bokaalcellen, aanwezig in intestinale villi (bovenste paneel gemarkeerd met witte pijlen, afbeelding genomen bij 20x vergroting), en Paneth-cellen, aanwezig in crypten van Lieberkuhn, gelegen onder de intestinale villi in de lamina propria (onderste paneel gemarkeerd met gele pijlen, afbeelding genomen bij 60x vergroting). Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chorioamnionitis beïnvloedt 2\u20124% van termijn en 25\u201230% van preterm leveringen8,9. De impact van chorioamnionitis kan echter lang na de geboorte duren, omdat is aangetoond dat het significante effecten heeft op de foetus en neonaat10,11,12,13,14,15,16. Belangrijk is dat is aangetoond dat chorioamnionitis geassocieerd is met de latere ontwikkeling van NEC15,16. Hoewel het nog steeds onvolledig wordt begrepen, omvat de pathogenese van NEC waarschijnlijk een combinatie van intestinale onvolwassenheid, dysregulatie van het onrijpe immuunsysteem, darmontsteking en bacteriële translocatie, culminerend in een laatste gemeenschappelijke route van intestinale necrose19. Een mechanistisch verband tussen chorioamnionitis en de daaropvolgende ontwikkeling van NEC blijft echter onduidelijk20, en eerdere diermodellen van chorioamnionitis waren onvoldoende om deze relatie te onderzoeken. Om deze kloof in kennis aan te pakken, hebben we het veelgebruikte LPS-geïnduceerde muriene model van chorioamnionitis en vroeggeboorte34,37,38,39,40 aangepast om neonatale geboorte en overleving mogelijk te maken. Daarbij hebben we een model gemaakt dat de ontstekingsaandoening benadert die wordt gezien bij chorioamnionitis42 om de impact van foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI) op de daaropvolgende darmontwikkeling te bestuderen.
Met dit protocol hebben we aangetoond dat dit muriene model van chorioamnionitis, met behulp van LPS-geïnduceerde FEMI, resulteert in zowel kort- als langdurig darmletsel en onderbreking van de normale darmontwikkeling, met name downregulatie van zowel bokaal- als Paneth-cellen, die beide een eerste lijn van aangeboren immuniteit tegen darmontsteking bieden. De darmblessure en histologische cellulaire veranderingen die met dit model worden gezien, geven aan dat het een effectief model is om de blessure van NEC na te bootsen. Dit komt in de eerste plaats omdat de downregulatie van Paneth-cellen en bekercellen beide betrokken zijn geweest bij de pathogenese van NEC , en de patronen van histologisch letsel vergelijkbaar zijn met wat wordt gezien in menselijke gevallen van NEC41,42,49. Daarom is dit LPS-geïnduceerde FEMI-model van chorioamnionitis een ideaal model voor het onderzoeken van het mechanistische verband tussen chorioamnionitis en later darmletsel, met name de ontwikkeling van NEC, evenals mogelijke effecten van chorioamnionitis op het zich ontwikkelende microbioom, wat niet mogelijk zou zijn met bestaande modellen die levende bacteriën gebruiken.
In vivo gaat chorioamnionitis vaak gepaard met een oplopende bacteriële infectie die vaak resulteert in vroegtijdige breuk van membranen en het klinische fenotype van chorioamnionitis, en er bestaan diermodellen van chorioamnionitis die deze pathofysiologie nauwkeuriger weerspiegelen25,28,30,32. Omdat ons laboratorium echter de darmontwikkeling bestudeert, inclusief het zich ontwikkelende microbioom, zou de aanwezigheid van levende bacteriën in een model van chorioamnionitis de microbioomanalyse verwarren. Daarom zijn bestaande modellen van chorioamnionitis met behulp van levende bacteriën onpraktisch voor het onderzoeken van het mechanistische verband tussen chorioamnionitis en latere ontwikkeling van NEC. Bovendien zijn LPS-geïnduceerde modellen van chorioamnionitis al effectief geweest bij het modelleren van postnatale witte en grijze stof hersenletsel36, wat aantoont dat deze methode een effectieve manier is om morbiditeiten van prematuriteit te modelleren die geassocieerd zijn met blootstelling aan chorioamnionitis op het moment van geboorte.
Het is ook belangrijk op te merken dat dit model sterk afhankelijk is van de dosis LPS die wordt gebruikt om FEMI te induceren. De primaire kritische stap in dit protocol is inductie van FEMI bij de zwangere moeders met intraperitoneale injectie van LPS; daarom hebben we niet verrassend vastgesteld dat de dosis LPS die wordt gebruikt om FEMI te induceren uiterst belangrijk is in de resultaten van deze experimenten. Bij initiële experimenten werd een dosis van 100 μg/kg LPS gebruikt, omdat deze LPS-dosis niet geassocieerd was met maternale mortaliteit en resulteerde in ongeveer 50% neonatale overleving en significant darmletsel bij nakomelingen41,42.
LPS bindt aan het Toll-achtige receptor 4 (TLR4) complex, wat resulteert in aggregatie van intracellulaire signaaleiwitten, cytokineproductie en het starten van pro-inflammatoire signalering50. Tol-achtige receptoren (TLRs) waaronder TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 en TLR9 zijn belangrijk bij de inductie van de ontstekingsreactie die wordt gezien met een verscheidenheid aan pathogenen en micro-organismen zoals virussen, bacteriën en schimmels51. Interessant is dat het ook is aangetoond dat upregulatie van TLR3 correleert met verhoogde histologische darmschade en virale afstoting in een neonatale muriene rotavirusmodel; bovendien heeft de knock-out van TLR3 deze effecten versterkt52. Hoewel het model dus gebruik maakt van TLR4-trajecten, is het redelijk om aan te nemen dat stimulatie van andere TLR's vergelijkbare bevindingen kan opleveren.
Met behulp van deze methodologie hebben we kunnen aantonen dat LPS-injectie bij zwangere moeders een toename van maternale, placenta- en foetale ontstekingsmarkers veroorzaakt terwijl het vruchtwater wordt spaard, evenals directe schade aan de placentaveroorzaakt 42. Interessant is dat deze methodologie geen verandering van weerstand in de baarmoederslagaders liet zien. Het FEMI-model heeft ook een aanzienlijke impact op het nageslacht, omdat we hebben aangetoond dat blootgestelde pups significant darmletsel42 hebben via een IL-6-afhankelijke route41 en belangrijke verdedigingsmechanismen van de darm kunnen beïnvloeden, zoals bokaalcellen en Paneth-cellen41. Deze verwonding maakt de neonatale nakomelingen steeds vatbaarder voor daaropvolgend LPS-geïnduceerd darmletsel en ontsteking41, wat kan verklaren waarom zuigelingen die worden blootgesteld aan chorioamnionitis een verhoogde gevoeligheid hebben om NEC te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) en de University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| Alcian blue stain | Newcomer supply | 1003A | |
| C57Bl6/J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Ethanol | Decon labs | 2701 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| Hematoxylin stain | Leica | 381562 | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Nikon Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 2CE-MQVJ-1 | |
| Periodic Acid | ACROS | H5106 | CAS# 10450-59-9 |
| RNAlater | Thermofisher | Am7021 | |
| Schiff's reagent | Sigma | S5133 | |
| Secor Imager 2400 | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| V-Plex Assay | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| Xylene | Sigma | 534056 |
References
- Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
- Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
- Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
- Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
- Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
- Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
- Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
- Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
- Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
- Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
- Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
- Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
- Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
- Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
- Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
- Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
- Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
- Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
- Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
- Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
- Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
- Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
- Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
- Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
- Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
- Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
- McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
- Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
- Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
- Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
- McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
- McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
- McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
- McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
- Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
- Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
- Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).
