Summary
Nous avons développé un modèle de chorioamnionite pour simuler l’exposition foetale à l’inflammation maternelle (FEMI) sans complications des organismes vivants pour examiner les effets de FEMI sur le développement du tractus intestinal de la progéniture. Ceci permet l’étude des causes mécanistes pour le développement des dommages intestinaux suivant chorioamnionitis.
Abstract
Chorioamnionitis est un précipité commun de la naissance prématurée et est associé à beaucoup des morbidités de la prématurité, y compris l’entérocolite nécrosante (NEC). Cependant, un lien mécaniste entre ces deux conditions reste à découvrir. Nous avons adopté un modèle murin de chorioamnionitis impliquant l’exposition foetale lipopolysaccharide (LPS)-induite à l’inflammation maternelle (FEMI). Ce modèle de FEMI induit une cascade inflammatoire maternelle, placentaire, et foetale stérile, qui est également présente dans beaucoup de cas de chorioamnionitis clinique. Bien qu’il existe des modèles qui utilisent des bactéries vivantes et imitent plus précisément la pathophysiologie d’une infection ascendante entraînant une chorioamnionite, ces méthodes peuvent causer des effets indirects sur le développement du tractus intestinal immature et du microbiome en développement associé. En utilisant ce protocole, nous avons démontré que l’IGF induite par le SLS entraîne une augmentation dépendante de la dose de la perte de grossesse et de la naissance prématurée, ainsi que la perturbation du développement intestinal normal chez la progéniture. En outre, nous avons démontré que FEMI augmente de manière significative les dommages intestinaux et les cytokines sériques chez la progéniture, tout en diminuant simultanément les cellules de gobelet et de Paneth, qui fournissent toutes deux une première ligne d’immunité innée contre l’inflammation intestinale. Bien qu’un modèle semblable de FEMI LPS-induit ait été employé pour modéliser l’association entre chorioamnionitis et anomalies suivantes du système nerveux central, à notre connaissance, ce protocole est le premier à essayer d’élucider un lien mécaniste entre chorioamnionitis et perturbations plus tard dans le développement intestinal comme lien potentiel entre chorioamnionitis et NEC.
Introduction
Les membranes chorioniques jouent un rôle essentiel dans la grossesse chez les mammifères. Ils comprennent le chorion et l’amnion, qui servent de multiples fonctions. Ils entourent et protègent le foetus, facilitent la signalisation paracrine entre les compartiments maternel et fœtal1,et créent des boucles de rétroaction locales dans les membranes chorioniques, qui peuvent être impliquées dans l’initiation de la parturition1. La compréhension actuelle des membranes indique que l’amnion fournit la fonction structurale de barrière, et le chorion fournit un tampon immunologique principalement pour protéger le foetus en développement du système immunitaire maternel2. L’inflammation de ces membranes est connue sous le nom de chorioamnionite. Historiquement, le diagnostic de chorioamnionitis clinique a été fait suivant la présence de la fièvre maternelle plus un ou plusieurs résultats cliniques foetaux oumaternels 3,4. Cependant, bien que cette définition soit cliniquement utile, son manque de précision a rendu la recherche sur la chorioamnionite difficile. En 2015, dans le but de clarifier le diagnostic, un atelier d’experts de l’Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development a défini la chorioamnionite comme une inflammation intra-utérine, ou une infection, ou les deux (triple I)3. Cette clarification est importante parce que tandis que l’infection induite microbienne est une cause importante de l’inflammation utérine/amniotique, elle se produit moins généralement que l’inflammation utérine/amniotiquestérile 5,6,7. Dans l’ensemble, la chorioamnionite reste un problème de santé publique important, comme on le voit dans 2\u20124% des accouchements à terme et 25\u201230% des accouchements prématurés8,9.
Chorioamnionitis peut avoir des effets significatifs sur le foetus et le nouveau-né. Il a été bien documenté dans la littérature que chorioamnionitis est associé au risque accru de beaucoup des morbidités de la prématurité, y compris la dysplasie bronchopulmonaire10,dommages cérébraux de matière blanche11,hémorragie intraventriculaire12,rétinopathie de la prématurité13, et à la fois suspecté et confirmé sepsis néonatal de débuttôt 14,15. Comme nous nous intéressons aux mécanismes de blessure et de réparation du tractus intestinal immature, il est important de noter que la chorioamnionite est également associée au développement ultérieur de l’entérocolite nécrosante (NEC)15,16. Nec est une maladie gastro-intestinale dévastatrice des enfants en bas âge prématurés qui a comme conséquence une réponse dysregulated d’hôte à l’inflammation et à la nécrose intestinalesuivante 17. Chaque année, nec affecte plus de 4000 nourrissons aux États-Unis, et jusqu’à un tiers de ces nourrissons meurent de la maladie18. La pathogénie de NEC implique probablement une combinaison de l’immaturité intestinale, de la dysrégulation du système immunitaire immature, de l’inflammation intestinale, et de la translocationbactérienne 19,culminant dans une voie commune finale de nécrose intestinale. Fait important, le début du NEC se produit souvent des semaines après la naissance et l’exposition potentielle à la chorioamnionitis, rendant le lien mécaniste entre chorioamnionitis et développement suivant de NECpeu clair 20. Un mécanisme potentiel par lequel la chorioamnionite peut contribuer à la pathophysiologie de NEC est par la déréglementation du système immunitaire maternel, produisant plus tard une réponse inflammatoire foetale forte qui peut perturber les modèles développementaux foetauxnormaux 21,22,23.
Plusieurs modèles mammifères de chorioamnionite existent chez les rongeurs et les moutons24,25,26,27,28,29,30,31,32. Cependant, peu de données existent concernant le développement du tractus intestinal au-delà de la période initiale du nouveau-né suivant l’exposition foetale induite par chorioamnionitis à l’inflammation maternelle (FEMI). Afin d’explorer la relation entre FEMI et le développement ultérieur des dommages du tractus intestinal immature, nous avons adapté le modèle fEMI lipopolysaccharide (LPS) induit. Les lipopolysaccharides sont un composant majeur de la surface extracellulaire sur les bactéries gram négatives et sont un puissant stimulant du système immunitaire inné de multiples espèces eucaryotes, y compris leshumains 33. L’injection maternelle de LPS a comme conséquence une cascade inflammatoire stérile sans les effets confusionnels des bactéries vivantes, et c’est un modèle bien établi pour l’induction de la naissance prématurée34,aussi bien qu’un modèle de chorioamnionitis aiguë et du syndrome foetal de réponse inflammatoire (FIRS), qui est la forme la plus grave de chorioamnionitis24,35. Il a également été démontré qu’il induit à la fois des lésions cérébrales de matière blanche et grise dans un modèlede mouton 36 et un modèle murin37,38,39,40. Cependant, à notre connaissance, nous sommes les premiers à utiliser ce modèle de chorioamnionitis et FEMI pour étudier ses effets sur le développement du tractus gastro-intestinal après la naissance, ainsi que pour étudier un lien mécaniste possible entre chorioamnionitis et développement ultérieur de NEC41,42.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Iowa (Protocole #8041401). Tous les animaux étaient logés dans un vivarium approuvé par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) à l’Université de l’Iowa. Toutes les souris étaient souches sauvages C57Bl/6J.
1. Établissement de femi chez les souris enceintes
- Préparation LPS
- Utilisez le LPS dérivé d’Escherichia coli O55:B5 (concentration de stock 2 mg/mL).
- Diluer la concentration de stock de LPS 1:100 avec la solution saline stérile pour une concentration de travail de 20 μg/mL.
- Injection maternelle de LPS
- Injecter des mères enceintes au jour de gestation e15. Ce point de temps est d’environ 75% par la grossesse murine, ce qui rend ce modèle développementairement similaire au début du troisième trimestre des grossesses humaines, qui est quand la majorité des naissances prématurées dues à la chorioamnionite se produisent.
- Pesez les souris enceintes immédiatement avant l’injection pour déterminer le dosage approprié du SLSP.
- Calculez la dose de concentration de travail en utilisant la formule suivante : 5 μL x gramme de poids corporel (gbw), pour une dose totale de LPS de 100 μg/kg. Pour les animaux de contrôle, utilisez un volume équivalent de solution saline normale pour l’injection.
- Vortex LPS solution trois fois pendant 15 secondes sur le haut avant chaque injection.
- Dessinez le volume LPS dans une seringue de 1 mL.
- Retenir la souris enceinte avec la technique de scruffing. Maintenez la position dorsale de la couchée et effectuez l’injection.
- Insérez une aiguille de calibre 30 de 8 mm qui se dénabère au-dessus du quadrant inférieur droit de l’abdomen (pour éviter les vaisseaux vésicaux et abdominaux) à un angle de 30\u201240°. Insérer environ 1/4 à 1/2 de la longueur de l’aiguille.
- Reculez sur le piston de seringue pour assurer une pression négative avant l’injection. Procéder à l’injection si une pression négative est présente.
- Après l’injection, surveiller les souris pendant environ 30 minutes, puis retourner dans des cages pour le reste de la grossesse.
2. Livraison et soin de la progéniture, et récolte intestinale
- Livrer les chiots normalement par voie vaginale à e20.
REMARQUE : Ce modèle a un taux de perte fœtale dépendant de la dose qui peut être vu à la figure 1 et qui est discuté dans les résultats ci-dessous. - Permettre aux chiots de rester avec les mères et de recevoir des aliments ad libitum.
- Le jour de la récolte, généralement après le jour 14 (P14), euthanasier les petits par dislocation cervicale conformément aux protocoles du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
- À l’aide de ciseaux et de forceps, faire une incision verticale sur la ligne médiane de l’abdomen, à travers la peau et le péritoine, sur toute la longueur de l’abdomen. Exciser l’intestin grêle de l’estomac au cécu avec des ciseaux et enlever la mesenterie avec des forceps.
- Isoler et garder le distal 1/3 de l’intestin grêle (section représentative de l’iléum humain), en jetant l’intestin grêle proximal, le cécu, et le côlon.
- Diviser la portion d’iléum en deux à l’aide de ciseaux.
- Placez la moitié proximale dans une solution de stabilisation de l’ARN pour une quantification ultérieure de l’ARN.
- Placer la moitié distale dans une formaline tamponnée neutre à 10 % pour la préparation des diapositives.
3. Notation intestinale de blessure
- Sectionz le tissu incorporé paraffine en tranches de 5 μm d’épaisseur et montez sur des glissières en verre.
REMARQUE : Nous envoyons les spécimens à un noyau d’histologie pour l’intégration, la sectionne et le montage de paraffine sur des toboggans. - Déparaffiniser les diapositives selon les procédures standard.
- Sections de tache avec l’hématoxyline et l’éosine selon les procédures standard.
- Marquer des sections sur une échelle de 3 points pour les blessures intestinales comme décritprécédemment 42,43.
- À l’aide d’une microscopie légère, évaluer les lésions intestinales généralisées par deux chercheurs aveugles distincts sur une échelle de 3 points évaluant l’intégrité et la séparation villus de la membranedu sous-sol 43 (Figure supplémentaire 1). Les dommages intestinaux sont mieux évalués au grossissement de 20x et à l’ouverture numérique 0.50.
- Attribuez un score de 0 pour décrire la muqueuse normale.
- Assignez une note de 1 décrire les blessures légères qui englobent le développement de l’espace subepithelial Gruenhagen, la vacuolisation ou le levage subepithelial limité à la propria lamina ou des pointes de villi.
- Attribuez une note de 2 pour décrire les blessures graves, indiquées par le levage épithélial et la vacuolisation supérieures à la moitié des villosités, la distorsion des villosités ou l’ulcération muqueuse et la désintégration des propria lamina.
4. Quantification des cellules de Paneth et de gobelet
- Après la déparaffinisation, les glissements de tache des sections de tissu de l’étape 2.8 avec la tache bleue/périodique d’acide d’Alcian pour indiquer les cellules de gobelet et de Paneth commeprécédemment décrit 44,45 selon les étapes suivantes.
REMARQUE : Tandis que la tache bleue/périodique de Schiff d’acide d’Alcian n’est pas spécifique aux cellules de Paneth ou de gobelet, dans notre expérience, les investigateurs expérimentés aveuglés ont la quantification cellulaire équivalente utilisant cette tache comparée aux anticorps ciblés cellulaires, avec sensiblement moins de taches de fond46. - Déparaffiner, tacher et déshydrater les diapositives comme suit.
- Submerger les toboggans en xylène pendant 10 min deux fois.
AVERTISSEMENT : Xylene doit être employé dans un capot de fumée. - Rincer à 100% EtOH.
- Submergez les glissières en 100 % EtOH pendant 3 min, puis en 90% EtOH pendant 3 min, suivies de 70% d’EtOH pendant 3 min, et enfin submergez les diapositives dans 50% EtOH pendant 3 min.
- Laver sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
MISE EN GARDE : Éloignez la section de l’eau courante pour éviter la perte d’échantillon de tissu. - Filtrez la solution de tache bleue alcienne avec un filtre à café standard.
- Taches glissées dans la tache bleue alcienne pendant 15 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 2 min.
- Diluer 1 mg d’acide périodique dans 200 mL d’eau distillée double. Submergez les glissières dans cette solution pendant 5 min. Ensuite, laver sous l’eau courante du robinet pendant 1 min.
- Tache avec le réaménagement de Schiff pendant 10 min. Laver sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
- Tacher les toboggans avec de l’hématoxyline pendant 1 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 2 min.
- Submergez-les dans de l’alcool acide (1 mL d’acide chlorhydrique mélangé à 99 mL de 70% d’EtOH) pendant 1 min.
- Submerger dans l’eau du robinet de Scott (concentration de 0,1 % de NaHCO3 dans l’eau du robinet) pendant 1 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 1 min.
- Déshydratez les diapositives.
- Plongez chaque diapositive 10 fois dans 70% EtOH, puis plongez 10 fois dans 90% EtOH, et 10 fois dans 100% EtOH.
- Submergez les glissières dans 100% EtOH pendant 10 min, puis submergez deux fois en xylène frais pendant 3 min chacune.
- Placez une goutte de supports de montage sur le spécimen et placez un coverslip sur elle.
- Submerger les toboggans en xylène pendant 10 min deux fois.
- Comptage des cellules de gobelet
- À l’aide d’une microscopie légère, compter les cellules de gobelet(figure supplémentaire 2). Pour chaque morceau de tissu intestinal, comptez le nombre de cellules gobelet et 500 cellules épithéliales et le rapport express de cellules de gobelet comme rapport par 100 cellules épithéliales. Les cellules de gobelet sont mieux comptées au grossissement de 20x et à l’ouverture numérique 0.5.
- Comptage des cellules de Paneth
- À l’aide d’une microscopie légère, compter les cellules de Paneth(figure supplémentaire 2). Pour chaque morceau de tissu intestinal, exprimer comme un rapport de cellules Paneth par crypte intestinale. Comptez 100 cryptes intestinales par morceau de tissu intestinal. Les cellules de paneth sont mieux comptées au grossissement de 20x-60x et à l’ouverture numérique 0.50-1.30.
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Representative Results
L’exposition à l’IGF le jour embryonnaire 15 entraîne une perte de grossesse dépendante de la dose et un taux dépendant de la dose de travail prématuré (figure 1)42. Pour les expériences, nous avons choisi d’utiliser une dose de LPS de 100 μg/kg pour minimiser la perte de grossesse et la prématurité (perte de 50% entre la prématurité et la mort fœtale intra-utérine) tout en exposant les fœtus à une insulte inflammatoire significative.
En utilisant cette approche, nous avons ensuite examiné les effets de femi sur les dommages ultérieurs de la progéniture. En utilisant une échelle histologique en 3 points pour mesurer les lésions intestinales généralisées, nous avons constaté des blessures importantes à la naissance (P0) et à l’âge adulte (P56 ou 8 semaines de vie) (figure 2). Il est important de noter que cette blessure s’est produite en l’absence de tout stimulus supplémentaire pour les animaux autres que FEMI, suggérant que FEMI seul perturbe l’homéostasie normale du tractus intestinal murin nouveau-né. Comme la souris est née avec un intestin relativement immature qui continue de se développer au cours des 4 premières semaines devie 47,48, cela est pertinent pour les nourrissons prématurés qui ont également des voies intestinales immatures.
Pour mieux comprendre l’effet de l’IGF sur le développement normal de l’épithélium intestinal et sur les mécanismes de défense du tractus intestinal immature, nous avons quantifié le nombre de cellules gobelet productrices de mucine et de cellules paneth productrices de peptides antimicrobiens dans le tiers distal du petit tractus intestinal qui est semblable à l’iléum humain. Nous avons constaté que FEMI a perturbé la composition normale de l’épithélium intestinal en induisant la perte des cellules de gobelet et des cellules de Paneth comparées aux animaux sans FEMI (figure 3).
Pour étudier les effets de femi sur la réponse inflammatoire néonatale, utilisant ELISA avec l’électrochemiluminescence, nous avons quantifié une série de marqueurs inflammatoires de sérum, qui ont inclus IL-1β, IL-10, KC-GRO (l’équivalent murine d’IL-8), et IL-6, du sérum des chiots avec et sans FEMI (figure 4). Nous avons constaté que FEMI a augmenté de manière significative la cascade inflammatoire pour toutes les cytokines à P0. La cascade inflammatoire aux âges plus tard (P7\u2012P56) différait selon le point de temps et la cytokine. Plus intéressant encore, pour IL-6, il y avait des niveaux similaires à P7\u2012P28 dans le FEMI et les groupes factices, mais en dépit de l’aucune intervention secondaire, il y avait des niveaux sensiblement plus élevés dans le groupe FEMI à P56. Ceci est particulièrement important car nous avons démontré qu’IL-6 est une cytokine critique pour le développement des dommages intestinaux postnatals dans le modèle de FEMI.
Figure 1 : Effet de la dose femi sur les résultats de la grossesse. La survie des portées de grossesse dépend de la dose avec des doses plus élevées causant des taux plus élevés de perte de grossesse (A) et des taux plus élevés de naissance prématurée (B). Figure est adaptée avec la permission de Fricke et al42. FEMI utilisant une dose de LPS de 100 μg/kg crée une survie de 50% pour les chiots par une semaine de vie. Chaque point de données est représentatif d’un n > 8 grossesses et d’au moins trois expériences individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Effet de l’IGF sur les petits modèles de blessures intestinales distales au fil du temps. Des échantillons intestinaux ont été prélevés à la naissance, 1 semaine de vie, 2 semaines de vie et 8 semaines de vie chez des souris exposées à l’IGF (100 μg/kg de LPS) ou à un faux contrôle. Des échantillons ont été notés à l’aide d’une échelle de blessures de 3 points par desenquêteurs aveugles 42,43. FEMI seul sans autre insulte induit quantité significative de blessures à la naissance, 1 semaine de vie, et à 8 semaines de vie. Figure a été adaptée avec la permission de Fricke et coll.42. Chaque point de données est représentatif d’un n > 10 petits et d’au moins trois expériences individuelles d’au moins 3 mères enceintes. Les tests T non paramétriques Mann-Whitney ont été utilisés pour comparer les scores des blessures intestinales à chaque point de temps. L’astérisque indique p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : L’IGF induit des altérations des quantités normales de gobelet et de cellules paneth dans l’intestin grêle pendant le développement. Des échantillons intestinaux ont été prélevés à la naissance, 1, 2, 4 et 8 semaines de vie chez des souris exposées à femi (100 μg/kg LPS) ou à un faux contrôle. Des échantillons ont été tachés avec la tache bleue/périodique de Schiff d’acide d’Alcian pour détecter les cellules de gobelet et de Paneth et ceux-ci ont été quantifiés par un investigateur aveuglé. Les cellules de gobelet et les cellules de Paneth des animaux avec FEMI ont montré une tendance ou une diminution significative comparée aux contrôles simulés à tous les âges. Figure adaptée avec la permission d’Elgin et coll.41. Chaque point de données est représentatif d’un n > 10 chiots et d’au moins trois expériences individuelles. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne. Les tests T des élèves ont été utilisés pour comparer les quantités de gobelet et de cellules Paneth à chaque point de temps. L’astérisque indique p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : FEMI induit une poussée inflammatoire néonatale globale pour toutes les cytokines immédiatement après naissance à P0, avec une poussée tardive d’IL-6 à P56. Les cytokines sériques ont été quantifiées à P0, P7, P14 et P28 à l’aide d’ELISA avec électrochimiluminescence selon les instructions du fabricant, et les plaques ont été lues à 620 nm. Les valeurs de cytokine sont représentées ici dans une parcelle radar, et toutes les cytokines sont tracées comme pourcentage de valeur maximale. Il y a eu des augmentations significatives de toutes les cytokines (IL-1β, IL-10, KC-GRO et IL-6) à P0 dans le groupe FEMI par rapport au groupe témoin (tous p < 0,05). Il y a également eu une augmentation résurgence des niveaux d’IL-6 chez P56 chez les chiots avec FEMI par rapport à aucun FEMI (p < 0,05 par les essais non paramétriques kruskal-wallis), qui était la seule cytokine qui a été significativement élevée dans le groupe FEMI par rapport au contrôle à ce moment tardif. Figure adaptée avec la permission d’Elgin et coll.41. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Notation intestinale de dommages du tissu iléal souillé de H&E. Les scores de blessure sont déterminés par une échelle de notation intestinale de dommages de trois points (0=normal, 1=blessure douce, 2=blessure grave) basée sur le degré de vacuolization de villi, ulcération muqueuse, dommages de propria de lamina, et présence de l’hémorragie dans les villosités commeprécédemment décrit 43. Figure adaptée avec la permission d’Elgin et coll.41. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : Apparition représentative de la coloration Alcian Blue/PAS des cellules de gobelet et de Paneth. La coloration Alcian Blue/PAS des tissus intestinaux permet une visualisation claire des cellules de gobelets, présentes dans les villosités intestinales (panneau supérieur marqué de flèches blanches, image prise au grossissement 20x), et des cellules de Paneth, présentes dans les cryptes de Lieberkuhn, situées sous les villosités intestinales dans la propria lamina (panneau inférieur marqué de flèches jaunes, image prise à 60x grossissement). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Chorioamnionitis impacts 2\u20124% de terme et 25\u201230% des accouchements prématurés8,9. Cependant, l’impact de la chorioamnionite peut prolonger la naissance longue après car il a été montré pour avoir des effets significatifs sur le foetus et lenouveau-né 10,11,12,13,14,15,16. Fait important, la chorioamnionite s’est montrée associée au développement ultérieur de NEC15,16. Bien qu’elle soit encore incomplètement comprise, la pathogénie de NEC implique probablement une combinaison de l’immaturité intestinale, de la dysrégulation du système immunitaire immature, de l’inflammation intestinale, et de la translocation bactérienne, culminant dans une voie commune finale de nécrose intestinale19. Cependant, un lien mécaniste entre chorioamnionitis et développement suivant de NEC restepeu clair 20,et les modèles animaux précédents de chorioamnionitis ont été insuffisants pour examiner cette relation. Pour combler cette lacune dans les connaissances, nous avons modifié le modèle murin couramment utilisé induit par le LPS de chorioamnionite et de naissanceprématurée 34,37,38,39,40 pour permettre la naissance néonatale et la survie. Ce faisant, nous avons créé un modèle qui se rapproche de l’état inflammatoire observé dans la chorioamnionite42 pour étudier l’impact de l’exposition fœtale à l’inflammation maternelle (IGF) sur le développement intestinal ultérieur.
Avec ce protocole, nous avons démontré que ce modèle murin de chorioamnionitis, utilisant FEMI LPS-induit, a comme conséquence des dommages intestinaux à court et à long terme aussi bien que l’interruption du développement intestinal normal, plus particulièrement la downregulation des cellules de gobelet et de Paneth, qui fournissent toutes deux une première ligne d’immunité innée contre l’inflammation intestinale. Les dommages intestinaux et les changements cellulaires histologiques qui sont vus avec ce modèle indique qu’il est un modèle efficace pour imiter les dommages vus dans NEC. C’est principalement parce que la downregulation des cellules de Paneth et des cellules de gobelet ont été impliquées dans la pathogénie de NEC, et les modèles des dommages histologiques sont semblables à ce qui sont vus dans les cas humains de NEC41,42,49. Par conséquent, ce modèle FEMI induit par le LPS de chorioamnionitis est un modèle idéal pour étudier le lien mécaniste entre chorioamnionitis et dommages intestinaux plus tard, spécifiquement le développement de NEC, aussi bien que les effets potentiels de chorioamnionitis sur le microbiome en développement, qui ne serait pas possible avec les modèles existants qui utilisent des bactéries vivantes.
In vivo, chorioamnionitis implique souvent une infection bactérienne ascendante qui a souvent comme résultat la rupture prématurée des membranes et le phénotype clinique de chorioamnionitis, et des modèles animaux de chorioamnionitis existent qui reflètent plus exactement cette pathophysiologie25,28,30,32. Cependant, parce que notre laboratoire étudie le développement intestinal, y compris le microbiome en développement, la présence de bactéries vivantes dans un modèle de chorioamnionite confondrait l’analyse du microbiome. Par conséquent, les modèles existants de chorioamnionitis utilisant des bactéries vivantes ne sont pas pratiques pour étudier le lien mécaniste entre chorioamnionitis et développement ultérieur de NEC. En outre, les modèles lps-induits de chorioamnionitis ont déjà été efficaces en modelant les dommages postnatals de cerveau blancs et gris de matière36, démontrantque cette méthode est un moyen efficace de modéliser des morbidités de la prématurité qui sont associées à l’exposition à la chorioamnionitis au moment de la naissance.
Il est également important de noter que ce modèle est fortement dépendant de la dose de LPS utilisée pour induire femi. La principale étape critique dans ce protocole est l’induction de FEMI dans les mères enceintes avec injection intraperitoneal de LPS ; par conséquent, il n’est pas surprenant que nous avons constaté que la dose de LPS utilisée pour induire femi est extrêmement important dans les résultats de ces expériences. Avec des expériences initiales, une dose de 100 μg/kg de LPS a été utilisée, car cette dose de LPS n’a pas été associée à la mortalité maternelle et a eu comme conséquence la survie néonatale approximativement de 50% aussi bien que les dommages intestinaux significatifs dansla progéniture 41,42.
LPS se lie au complexe toll-like receptor 4 (TLR4), ce qui entraîne l’agrégation de protéines de signalisation intracellulaires, la production de cytokine, et l’initiation de la signalisation pro-inflammatoire50. Les récepteurs toll-like (TLRs) comprenant TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, et TLR9 sont importants dans l’induction de la réponse inflammatoire qui est vue avec une série d’agents pathogènes et de micro-organismes tels que des virus, des bactéries, et des champignons51. Fait intéressant, la réglementation du TLR3 s’est également corrélée avec des dommages intestinaux histologiques accrus et l’excrétion virale dans un modèle néonatal de rotavirus murin ; en outre, KO de TLR3 amélioré ces effets52. Ainsi, bien que le modèle utilise les voies TLR4, il est raisonnable de supposer que la stimulation d’autres TLR peut conférer des résultats similaires.
En utilisant cette méthodologie, nous avons pu montrer que l’injection de LPS dans les mères enceintes provoque une augmentation des marqueurs inflammatoires maternels, placentaux et fœtaux tout en épargnant le liquide amniotique, ainsi qu’en induisant des dommages directs au placenta42. Fait intéressant, cette méthodologie n’a montré aucune altération de la résistance dans les artères utérine. Le modèle FEMI a également un impact significatif sur la progéniture car nous avons montré que les chiots exposés ont des lésions intestinalessignificatives 42 par une voie dépendante il-641 et peuvent avoir un impact sur les mécanismes de défense importants de l’intestin tels que les cellules de gobelet et les cellules paneth41. Cette blessure rend la progéniture néonatale de plus en plus sensible aux dommages intestinaux et à l’inflammation induits par LPSsuivants 41 qui peuvent expliquer pourquoi les enfants en bas âge exposés à la chorioamnionitis ont une susceptibilité accrue pour développer NEC.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par les National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) et le Département de pédiatrie de l’Université de l’Iowa Stead Family.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| Alcian blue stain | Newcomer supply | 1003A | |
| C57Bl6/J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Ethanol | Decon labs | 2701 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| Hematoxylin stain | Leica | 381562 | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Nikon Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 2CE-MQVJ-1 | |
| Periodic Acid | ACROS | H5106 | CAS# 10450-59-9 |
| RNAlater | Thermofisher | Am7021 | |
| Schiff's reagent | Sigma | S5133 | |
| Secor Imager 2400 | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| V-Plex Assay | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| Xylene | Sigma | 534056 |
References
- Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
- Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
- Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
- Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
- Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
- Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
- Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
- Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
- Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
- Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
- Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
- Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
- Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
- Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
- Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
- Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
- Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
- Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
- Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
- Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
- Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
- Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
- Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
- Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
- Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
- Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
- Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
- McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
- Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
- Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
- Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
- McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
- McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
- McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
- McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
- Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
- Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
- Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).
