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Medicine

नवजात आंतों के विकास पर तीव्र कोरियोनामियोनाइटिस के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए मातृ सूजन के भ्रूण एक्सपोजर का एक मुरीन मॉडल

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61464
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1,4
1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

Summary

हमने संतान के आंतों के पथ के विकास पर फेमी के प्रभावों की जांच करने के लिए जीवित जीवों की जटिलताओं के बिना मातृ सूजन (फेमी) के भ्रूण जोखिम का अनुकरण करने के लिए कोरियोनामियोनाइटिस का एक मॉडल विकसित किया। यह कोरियोनामियोनाइटिस के बाद आंतों की चोट के विकास के लिए मशीनी कारणों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

Abstract

कोरियोनामियोनाइटिस अपरिपक्व जन्म का एक आम पूर्वसपसिद्ध है और प्रीमैच्योरिटी की कई रुग्णताओं से जुड़ा हुआ है, जिसमें नेक्रोटाइजिंग एंटोकोलाइटिस (एनईसी) शामिल है। हालांकि, इन दोनों स्थितियों के बीच एक यंत्रवादी कड़ी अभी तक खोजा जाना बाकी है । हमने कोरियोनामियोनाइटिस का एक मुरीन मॉडल अपनाया है जिसमें लिपोपोलिनासैचराइड (एलपीएस) शामिल है-मातृ सूजन (FEMI) के लिए प्रेरित भ्रूण जोखिम । फेमी का यह मॉडल एक बाँझ मातृ, अपरा और भ्रूण भड़काऊ झरना को प्रेरित करता है, जो नैदानिक कोरियोनामियोनाइटिस के कई मामलों में भी मौजूद है। यद्यपि मॉडल मौजूद हैं जो जीवित बैक्टीरिया का उपयोग करते हैं और एक आरोही संक्रमण के रोगविज्ञान की अधिक सटीक नकल करते हैं जिसके परिणामस्वरूप कोरियोनामियोनाइटिस होता है, इन तरीकों से अपरिपक्व आंतों के पथ के विकास और संबद्ध विकासशील माइक्रोबायोम पर अप्रत्यक्ष प्रभाव पड़ सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने दिखा दिया है कि एलपीएस-प्रेरित फेमी के परिणामस्वरूप गर्भावस्था के नुकसान और अपरिपक्व जन्म में खुराक-निर्भर वृद्धि होती है, साथ ही संतानों में सामान्य आंतों के विकास में व्यवधान होता है। इसके अलावा, हमने दिखा दिया है कि फेमी संतानों में आंतों की चोट और सीरम साइटोकिन्स को काफी बढ़ाता है, जबकि एक साथ गोबलेट और पैनेथ कोशिकाओं को कम करता है, दोनों आंतों की सूजन के खिलाफ सहज प्रतिरक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करते हैं। यद्यपि एलपीएस-प्रेरित फेमी के समान मॉडल का उपयोग हमारे ज्ञान के लिए कोरियोनामियोनाइटिस और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के बाद की असामान्यताओं के बीच संबंध को मॉडल करने के लिए किया गया है, यह प्रोटोकॉल सबसे पहले कोरियोनामियोनाइटिस और बाद में आंतों के विकास में कोरियोनामियोनाइटिस और एनईसी के बीच एक संभावित कड़ी के रूप में एक यंत्रवादी लिंक को स्पष्ट करने का प्रयास है।

Introduction

कोरियोनिक झिल्ली स्तनधारी गर्भावस्था में एक अभिन्न भूमिका निभाते हैं। इनमें कोरियोन और एमनियन शामिल हैं, जो कई कार्यों की सेवा करते हैं। वे भ्रूण को घेरते हैं और उसकी रक्षा करते हैं, मातृ और भ्रूण के डिब्बों के बीच पैराक्रिन सिग्नलिंगकीसुविधा प्रदान करते हैं, और कोरियोनिक झिल्ली के भीतर स्थानीय प्रतिक्रिया लूप बनाते हैं, जो पार्टिएशन1शुरू करने में शामिल हो सकते हैं। झिल्ली की वर्तमान समझ इंगित करती है कि एमनियन संरचनात्मक बाधा कार्य प्रदान करता है, और कोरियोन मुख्य रूप से मातृ प्रतिरक्षा प्रणाली2से विकासशील भ्रूण की रक्षा के लिए एक प्रतिरक्षा बफर प्रदान करता है। इन झिल्लियों की सूजन को कोरियोनामियोनाइटिस के रूप में जाना जाता है। ऐतिहासिक रूप से, नैदानिक कोरियोनामियोनाइटिस का निदान मातृ बुखार के साथ-साथ एक या अधिक भ्रूण या मातृ नैदानिक निष्कर्षों3,4की उपस्थिति के बाद किया गया था। हालांकि, जबकि यह परिभाषा चिकित्सकीय रूप से उपयोगी है, इसकी सटीकता की कमी ने कोरियोनामियोनाइटिस अनुसंधान को चुनौतीपूर्ण बना दिया है। 2015 में, निदान को स्पष्ट करने के प्रयास में, यूनिस कैनेडी श्रिवर नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट द्वारा एक विशेषज्ञ पैनल कार्यशाला ने कोरियोमेनियोनाइटिस को इंट्रायूटेरिन सूजन, या संक्रमण, या दोनों (ट्रिपल I)3के रूप में परिभाषित किया। यह स्पष्टीकरण महत्वपूर्ण है क्योंकि जब माइक्रोबियल प्रेरित संक्रमण गर्भाशय/एमनियोटिक सूजन का एक महत्वपूर्ण कारण है, तो यह बाँझ गर्भाशय/एमनियोटिकसूजन5,6,7की तुलना में कम आमतौर पर होता है । कुल मिलाकर, कोरियोनामियोनाइटिस एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या बनी हुई है, क्योंकि यह 2\u20124% अवधि के प्रसव और 25\u201230% अपरिपक्व प्रसव8, 9मेंदेखा जाताहै।

कोरियोनामियोनाइटिस भ्रूण और नवजात पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। साहित्य में यह अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है कि कोरियोनामियोनाइटिस प्रीमैचुरिटी की कई रुग्णता के बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ है, जिसमें ब्रोन्कोपल्मोनरी डिस्प्लासिया10,सेरेब्रल व्हाइट मैटर इंजरी11,इंट्रावेंट्रिकुलर हेमरेज12,प्रीमैचुरिटी13की रेटिनोपैथी, और संदिग्ध और पुष्टि दोनों जल्दी शुरू नियोनटल सेप्सिस14,15शामिल हैं । जैसा कि हम अपरिपक्व आंतों के पथ के चोट और मरम्मत तंत्र में रुचि रखते हैं, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोरियोनामियोनाइटिस बाद में नेक्रोटाइजिंग एंटोकोलाइटिस (एनईसी)15, 16के विकास से भी जुड़ा हुआ है। एनईसी अपरिपक्व शिशुओं की एक विनाशकारी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप सूजन और बाद में आंतों के परिगलन17के प्रति एक डिस्लाइनेप्टेड होस्ट प्रतिक्रिया होती है । हर साल, एनईसी संयुक्त राज्य अमेरिका में 4000 से अधिक शिशुओं को प्रभावित करता है, और इनमें से एक तिहाई शिशुओं की बीमारी18से मर जाती है। एनईसी के रोगजनकों में आंतों की अपरिपक्वता, अपरिपक्व प्रतिरक्षा प्रणाली के डिस्रेगुलेशन, आंतों की सूजन और बैक्टीरियल ट्रांसलोकेशन19का संयोजन शामिल है, जिसका समापन आंतों के परिगलन के अंतिम आम मार्ग में होता है। महत्वपूर्ण बात, एनईसी की शुरुआत अक्सर जन्म के बाद के सप्ताह और कोरियोनामियोनाइटिस के संभावित संपर्क के बाद होती है, जिससे कोरियोनामियोनाइटिस और एनईसी अस्पष्ट20के बाद के विकास के बीच मशीनी लिंक बन जाता है। एक संभावित तंत्र जिसके द्वारा कोरियोनामियोनाइटिस एनईसी के रोगविज्ञान में योगदान दे सकता है, मातृ प्रतिरक्षा प्रणाली के उपनियम के माध्यम से है, बाद में एक मजबूत भ्रूण भड़काऊ प्रतिक्रिया का उत्पादन करता है जो सामान्य भ्रूण विकास पैटर्न21,22,23को बाधित कर सकता है।

कृंतक और भेड़ 24 , 25 , 26 , 27 ,28,29, 30,31,32में कोरियोनामियोनाइटिस के कई स्तनधारी मॉडल मौजूद हैं । हालांकि, कुछ डेटा प्रारंभिक नवजात अवधि से परे आंतों के पथ के विकास के विषय में मौजूद है जो कोरियोनामियोनाइटिस-प्रेरित भ्रूण जोखिम के बाद मातृ सूजन (FEMI) के लिए प्रेरित है। फेमी और अपरिपक्व आंतों के पथ की चोट के बाद के विकास के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए, हमने लिपोपोलिनासैचराइड (एलपीएस) प्रेरित फेमी मॉडल को अनुकूलित किया है। लिपोपोलिनासैकराइड्स चने के नकारात्मक बैक्टीरिया पर बाह्य सतह का एक प्रमुख घटक है और यह मनुष्य33सहित कई यूकेरियोटिक प्रजातियों की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली का एक शक्तिशाली उत्तेजक है। मातृ एलपीएस इंजेक्शन के परिणामस्वरूप जीवित बैक्टीरिया के भ्रामक प्रभावों के बिना एक बाँझ भड़काऊ झरना होता है, और यह अपरिपक्व जन्म34के प्रेरण के साथ-साथ तीव्र कोरियोनामियोनाइटिस और भ्रूण भड़काऊ प्रतिक्रिया सिंड्रोम (एफआइआर) का एक मॉडलहै,जो कोरियोनामियोनाइटिस24,35का सबसे गंभीर रूप है। इसमें भेड़ के मॉडल 36 और मुरीन मॉडल 37 , 38,39, 40में सेरेब्रल व्हाइट और ग्रे मैटर दोनों चोट को प्रेरित करने के लिए भी दिखाया गया है . हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, हम पिछले जन्म में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के विकास पर इसके प्रभावों की जांच करने के साथ-साथ कोरियोनामियोनाइटिस और एनईसी41, 42के बाद के विकास के बीच संभावित मशीनी लिंक की जांच करने के लिए कोरियोनामियोनाइटिस और फेमी के इस मॉडल का उपयोग करने वाले पहले हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं आयोवा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल #8041401) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया । सभी जानवरों के मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल (AALAC) के प्रत्यायन के लिए एक एसोसिएशन में रखे गए आयोवा विश्वविद्यालय में vivarium को मंजूरी दे दी । सभी चूहों जंगली प्रकार तनाव C57Bl/6J थे ।

1. गर्भवती चूहों में फेमी की स्थापना

  1. एलपीएस तैयारी
    1. एस्चेरिचिया कोलाई O55: B5 (स्टॉक एकाग्रता 2 मिलीग्राम/एमएल) से प्राप्त एलपीएस का उपयोग करें।
    2. तनु एलपीएस स्टॉक एकाग्रता 1:100 बाँझ नमकीन के साथ 20 μg/mL के एक काम एकाग्रता के लिए ।
  2. मातृ एलपीएस इंजेक्शन
    1. गर्भ दिवस e15 पर गर्भवती बांधों सुई। यह समय बिंदु मुरीन गर्भावस्था के माध्यम से लगभग 75% है, जिससे यह मॉडल मानव गर्भधारण के शुरुआती तीसरे तिमाही के समान है, जो तब होता है जब कोरियोनामियोनाइटिस के कारण अधिकांश अपरिपक्व जन्म होते हैं।
    2. उपयुक्त एलपीएस डोजिंग निर्धारित करने के लिए इंजेक्शन से तुरंत पहले गर्भवती चूहों का वजन करें।
    3. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके काम करने की एकाग्रता की खुराक की गणना करें: 5 माइक्रोन एक्स ग्राम शरीर का वजन (gbw), 100 μg/kg के एलपीएस की कुल खुराक के लिए। नियंत्रण जानवरों के लिए, इंजेक्शन के लिए सामान्य नमकीन की बराबर मात्रा का उपयोग करें।
    4. भंवर एलपीएस समाधान प्रत्येक इंजेक्शन से पहले उच्च पर 15 सेकंड के लिए तीन बार ।
    5. एलपीएस वॉल्यूम को 1 मिलील सिरिंज में खींचें।
    6. स्क्रफिंग तकनीक के साथ गर्भवती माउस को नियंत्रित करें। पृष्ठीय प्रतिघन स्थिति में पकड़ें और इंजेक्शन का प्रदर्शन करें।
      1. एक 30 गेज 8 मिमी सुई एक 30 \ u201240 ° कोण पर पेट के दाहिने निचले चतुर्भुज (मूत्राशय और पेट के जहाजों से बचने के लिए) overlying ऊपर bevel डालें । सुई की लंबाई लगभग 1/4 से 1/2 डालें।
      2. इंजेक्शन लगाने से पहले नकारात्मक दबाव सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज प्लंजर पर वापस खींचें। यदि नकारात्मक दबाव मौजूद है तो इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ें।
      3. इंजेक्शन के बाद, लगभग 30 मिनट के लिए चूहों की निगरानी और फिर गर्भावस्था के शेष के लिए पिंजरों में लौटने ।

2. संतान की डिलीवरी और देखभाल, और आंतों की कटाई

  1. e20 पर योनि प्रसव के माध्यम से सामान्य रूप से पिल्ले वितरित करें।
    नोट: इस मॉडल में एक अपेक्षित खुराक-निर्भर भ्रूण हानि दर है जिसे चित्रा 1 में देखा जा सकता है और नीचे दिए गए परिणामों में चर्चा की जाती है।
  2. पिल्ले माताओं के साथ रहने के लिए और विज्ञापन libitum फ़ीड प्राप्त करने के लिए अनुमति दें ।
  3. फसल के दिन, आम तौर पर प्रसवोत्तर दिन 14 (P14), संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल के अनुपालन में ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से पिल्ले इच्छामृत्यु ।
  4. कैंची और संदंश का उपयोग करके, पेट की पूरी लंबाई के लिए, त्वचा और पेरिटोनम के माध्यम से पेट की मिडलाइन के नीचे एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं। पेट से छोटी आंत को कैंची से सेकम तक एक्साइज करें और जबरदस्ती से मेसेंट्री निकालें।
  5. छोटी आंत (मानव इलियम के अनुभाग प्रतिनिधि) के डिस्टल 1/3 को अलग और रखें, समीपस्थ छोटी आंत, सीकम और कोलन को त्याग दें।
  6. कैंची का उपयोग कर आधे में ileum भाग विभाजित।
  7. बाद में आरएनए क्वांटिफिकेशन के लिए एक आरएनए स्थिरीकरण समाधान में समीपस्थ आधा रखें।
  8. स्लाइड तैयार करने के लिए डिस्टल हाफ को 10% न्यूट्रल बफर फॉर्मेलिन में रखें।

3. आंतों की चोट स्कोरिंग

  1. सेक्शन पैराफिन एम्बेडेड टिश्यू को 5 माइक्रोन मोटी स्लाइस में और ग्लास स्लाइड पर माउंट करें।

    नोट: हम नमूनों को पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और स्लाइड्स पर बढ़ते के लिए एक हिस्टोनी कोर में भेजते हैं।
  2. मानक प्रक्रियाओं के अनुसार स्लाइडों को डिपैराफिनाइज करें।
  3. मानक प्रक्रियाओं के अनुसार हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन के साथ दाग वर्ग।
  4. आंतों की चोट के लिए 3-पॉइंट स्केल पर स्कोर सेक्शन पहले42,43वर्णित हैं।
    1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, एक 3 सूत्री पैमाने पर दो अलग अंधा जांचकर्ताओं द्वारा सामान्यीकृत आंतों की चोट का आकलन एक 3 सूत्री पैमाने पर विल्लस अखंडता और तहखाने झिल्ली४३ (अनुपूरक चित्रा 1)से जुदाई का मूल्यांकन । आंतों की चोट का सबसे अच्छा मूल्यांकन 20x आवर्धन और संख्यात्मक एपर्चर 0.50 पर किया जाता है।
    2. सामान्य म्यूकोसा का वर्णन करने के लिए 0 का स्कोर असाइन करें।
    3. 1 का स्कोर असाइन हल्के चोट का वर्णन करता है जिसमें उपपिथेल ग्रुएनहेगन के अंतरिक्ष, वैक्यूलाइजेशन या उपपिथेलिकल लिफ्टिंग के विकास को शामिल किया गया है जो लैमिना प्रोपरिया या विली के सुझावों तक सीमित है।
    4. गंभीर चोट का वर्णन करने के लिए 2 का स्कोर असाइन करें, जो एपिथेलियल लिफ्टिंग और वैक्यूलाइजेशन द्वारा इंगित किया जाता है जो विली, विली विरूपण, या म्यूकोसल अल्सर और लैमिना प्रोप्रिया के विघटन के आधे से अधिक है।

4. पैनेथ और गोबलेट कोशिकाओं का मात्राकरण

  1. deparaffinization के बाद, Alcian ब्लू के साथ कदम २.८ से ऊतक वर्गों के दाग स्लाइड/आवधिक एसिड Schiff दाग दोनों goblet और Paneth कोशिकाओं को निरूपित करने के रूप में पहले४४,४५ निम्नलिखित चरणों के अनुसार वर्णित है ।
    नोट: जबकि Alcian ब्लू/आवधिक एसिड Schiff दाग या तो Paneth या goblet कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है, हमारे अनुभव में, अंधा अनुभवी जांचकर्ताओं के बराबर सेलुलर लक्षित एंटीबॉडी की तुलना में इस दाग का उपयोग कर मात्राकरण है, काफी कम पृष्ठभूमिधुंधला ४६के साथ ।
  2. डिपैराफिनाइज, दाग और डिहाइड्रेट स्लाइड्स इस प्रकार हैं।
    1. दो बार 10 मिनट के लिए जाइलीन में जलमग्न स्लाइड ।
      सावधानी: जाइलीन का उपयोग धूम हुड में किया जाना चाहिए।
    2. 100% एटोह के साथ कुल्ला।
    3. 3 मिनट के लिए 100% EtOH में स्लीव्स जलमग्न, फिर 3 मिनट के लिए 90% एटोह में, इसके बाद 3 मिनट के लिए 70% एटोह, और अंत में 3 मिनट के लिए 50% एटोह में स्लाइड जलमग्न हो गए।
    4. 5 मिनट के लिए चल रहे नल के पानी के नीचे धोएं।
      सावधानी: ऊतक नमूने के नुकसान को रोकने के लिए बहते पानी से दूर अनुभाग बिंदु।
    5. एक मानक कॉफी फिल्टर के साथ Alcian नीले दाग समाधान फ़िल्टर करें।
    6. 15 मिनट के लिए Alcian नीले दाग में दाग स्लाइड और फिर 2 मिनट के लिए चल नल के पानी के नीचे धोने ।
    7. डबल आसुत पानी के 200 मिलील में 1 मिलीग्राम आवधिक एसिड पतला करें। 5 मिनट के लिए इस समाधान में डूबे स्लाइड। फिर 1 मिनट के लिए चल रहे नल के पानी के नीचे धोएं।
    8. 10 मिनट के लिए शिफ के रिएजेंट के साथ दाग । 5 मिनट के लिए चल रहे नल के पानी के नीचे धोएं।
    9. 1 मिनट के लिए हेमेटॉक्सीलिन के साथ स्लाइड दाग और फिर 2 मिनट के लिए चल नल के पानी के नीचे धो लें ।
    10. उन्हें एसिड अल्कोहल में डूबे (70% एटोह के 99 एमएल में मिश्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड का 1 एमएल) 1 मिनट के लिए।
    11. स्कॉट के नल के पानी में जलमग्न (नल के पानी में NaHCO 3 के०.१% एकाग्रता) 1 मिनट के लिए और फिर 1 मिनट के लिए चल नल के पानी के नीचे धोने ।
    12. स्लाइड्स में है डिहाइड्रेट।
      1. प्रत्येक स्लाइड को 70% एटोह में 10 बार डुबोएं, फिर 90% एटोह में 10 बार डुबकी लगाई, और 100% एटोह में 10 बार।
      2. 10 मिनट के लिए 100% EtOH में जलमग्न स्लाइड, 3 मिनट प्रत्येक के लिए ताजा जाइलीन में दो बार जलमग्न होने के बाद।
    13. नमूने पर बढ़ते मीडिया की एक बूंद रखें और उस पर एक कवरस्लिप रखें।
  3. गोबलेट सेल गिनती
    1. हल्की माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, गोबलेट कोशिकाओं(अनुपूरक चित्रा 2) कीगणना करें। आंतों के ऊतकों के प्रत्येक टुकड़े के लिए, गोबलेट कोशिकाओं और 500 एपिथेलियल कोशिकाओं की संख्या गिनें और प्रति 100 एपिथेलियल कोशिकाओं के अनुपात के रूप में गोबलिट सेल अनुपात व्यक्त करें। गोबलेट कोशिकाओं को सबसे अच्छा 20x आवर्धन और संख्यात्मक अपर्चर 0.5 पर गिना जाता है।
  4. पनेथ सेल गिनती
    1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, पैनेथ कोशिकाओं(अनुपूरक चित्रा 2) कीगणना करें। आंतों के ऊतकों के प्रत्येक टुकड़े के लिए, आंतों के तहखाने प्रति Paneth कोशिकाओं के अनुपात के रूप में व्यक्त करें। आंतों के ऊतकों के प्रत्येक टुकड़े के प्रति 100 आंतों के क्रिप्ट्स की गणना करें। पैनेथ कोशिकाओं को सबसे अच्छा 20x-60x आवर्धन और संख्यात्मक एपर्चर 0.50-1.30 पर गिना जाता है।

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Representative Results

भ्रूण दिवस 15 पर फेमी के संपर्क में आने से गर्भावस्था की खुराक पर निर्भर हानि होती है और अपरिपक्व श्रम की खुराक निर्भर दर(चित्र 1)42. प्रयोगों के लिए, हम १०० μg/kg की एक एलपीएस खुराक का उपयोग करने के लिए गर्भावस्था के नुकसान और प्रीमैच्योरिटी (दोनों पूर्वपरिष्ठाता और अंतर्गर्भाशयी भ्रूण निधन के बीच ५०% नुकसान) को कम करने के लिए चुना है, जबकि एक महत्वपूर्ण भड़काऊ अपमान के लिए भ्रूण को उजागर ।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हमने अगले संतानों की बाद की चोट पर फेमी के प्रभावों की जांच की। सामान्यीकृत आंतों की चोट को मापने के लिए 3-पॉइंट हिस्टोलॉजिक स्केल का उपयोग करके, हमें जन्म (पी0) और वयस्कता (पी 56 या जीवन के 8 सप्ताह)(चित्र 2)में महत्वपूर्ण चोट मिली। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह चोट फेमी के अलावा अन्य जानवरों के लिए किसी भी अतिरिक्त उत्तेजनाओं के अभाव में हुई, यह सुझाव देते हुए कि अकेले फेमी नवजात मुरीन आंतों के पथ के सामान्य होमोस्टेसिस को बाधित करता है। चूंकि माउस अपेक्षाकृत अपरिपक्व आंत के साथ पैदा होता है जो जीवन के पहले 4 सप्ताह के दौरान विकसित होता रहता है47,48,यह अपरिपक्व शिशुओं के लिए प्रासंगिक है जिनके पास अपरिपक्व आंतों के ट्रैक्ट भी हैं।

आंतों के एपिथेलियम के सामान्य विकास और अपरिपक्व आंतों के पथ के रक्षा तंत्र दोनों पर फेमी के प्रभाव को समझने के लिए, हमने छोटे आंतों के पथ के डिस्टल तीसरे में म्यूसिन उत्पादक गोबलेट कोशिकाओं और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड-उत्पादक पैनेथ कोशिकाओं की संख्या निर्धारित की है जो मानव उम के समान है। हमने पाया कि फेमी ने फेमआई(चित्रा 3)के बिना जानवरों की तुलना में गोबलेट कोशिकाओं और पैनेथ कोशिकाओं दोनों के नुकसान को प्रेरित करके आंतों के एपिथेलियम की सामान्य संरचना को बाधित किया।

नवजात भड़काऊ प्रतिक्रिया पर फेमी के प्रभावों की जांच करने के लिए, इलेक्ट्रोकेमेमिनेसेंस के साथ एलिसा का उपयोग करके, हमने विभिन्न प्रकार के सीरम भड़काऊ मार्कर की मात्रा निर्धारित की, जिसमें आईएल-1, आईएल-10, केसी-ग्रो (आईएल-8 के मुरीन समकक्ष), और आईएल-6, पिल्ले के सीरम से और बिना फेमी(चित्रा 4)शामिल थे। हमने पाया कि फेमी ने पी0 में सभी साइटोकिन्स के लिए भड़काऊ झरना में काफी वृद्धि की। बाद की उम्र में भड़काऊ झरना (P7\u2012P56) समय बिंदु और साइटोकिन के आधार पर भिन्न था। सबसे दिलचस्प बात यह है कि आईएल-6 के लिए, फेमी और नकली समूहों में P7\u2012P28 में समान स्तर थे, लेकिन कोई माध्यमिक हस्तक्षेप के बावजूद, P56 में फेमी समूह में काफी उच्च स्तर थे। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि हमने यह प्रदशत किया है कि आईएल-6 फेमी मॉडल में प्रसवोत्तर आंतों की चोट के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण साइटोकिन है।

Figure 1
चित्रा 1: गर्भावस्था के परिणामों पर फेमी खुराक का प्रभाव। गर्भावस्था के लिटर का अस्तित्व उच्च खुराक के साथ निर्भर खुराक है जिससे गर्भावस्था हानि(ए)की उच्च दर और समय से पहले जन्म की उच्च दर(बी)होती है। चित्रा फ्रिक एट अल42से अनुमति के साथ अनुकूलित किया जाता है। FEMI १०० μg/kg की एक एलपीएस खुराक का उपयोग कर जीवन के एक सप्ताह तक पिल्ले के लिए एक ५०% अस्तित्व बनाता है । प्रत्येक डेटा बिंदु एक एन > 8 गर्भधारण और कम से कम तीन व्यक्तिगत प्रयोगों का प्रतिनिधि है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: समय के साथ डिस्टल छोटे आंतों की चोट पैटर्न पर फेमी का प्रभाव। आंतों के नमूनों को जन्म के समय काटा गया, जीवन का 1 सप्ताह, जीवन के 2 सप्ताह, और चूहों से जीवन के 8 सप्ताह FEMI (१०० μg/kg LPS) या नकली नियंत्रण के संपर्क में । नमूनों को अंधा जांचकर्ताओं द्वारा 3 अंकों की चोट के पैमाने का उपयोग करके४२,४३ कोई और अपमान के साथ अकेले FEMI जन्म के समय चोट की महत्वपूर्ण राशि प्रेरित, जीवन के 1 सप्ताह, और जीवन के 8 सप्ताह में । चित्रा फ्रिक एट अलसेअनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है । प्रत्येक डेटा बिंदु एक एन > 10 पिल्ले और कम से कम 3 गर्भवती बांधों से कम से कम तीन व्यक्तिगत प्रयोगों का प्रतिनिधि है। मान-व्हिटनी गैर-पैरामेट्रिक टी-परीक्षण का उपयोग प्रत्येक समय बिंदु पर आंतों की चोट के स्कोर की तुलना करने के लिए किया जाता था। तारांकन 0.05 < पी इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: फेमी विकास के दौरान छोटी आंत में सामान्य गोबलेट और पैनेथ सेल मात्रा में परिवर्तन लाती है। आंतों के नमूनों को जन्म के समय काटा गया, 1, 2, 4, और जीवन के 8 सप्ताह चूहों से FEMI (१०० μg/kg LPS) या नकली नियंत्रण के संपर्क में । नमूनों को एलेशियन ब्लू/आवधिक एसिड शिफ दाग के साथ दाग दिया गया ताकि गोबलेट और पैनेथ कोशिकाओं दोनों का पता लगाया जा सके और इन्हें एक अंधे अन्वेषक द्वारा निर्धारित किया गया । फेमी के साथ जानवरों से गोबलेट कोशिकाओं और पैनेथ कोशिकाओं दोनों ने सभी उम्र में नकली नियंत्रण की तुलना में या तो एक प्रवृत्ति या एक महत्वपूर्ण कमी दिखाई। एल्गिन एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित चित्रा41। प्रत्येक डेटा बिंदु एक एन > 10 पिल्ले और कम से कम तीन व्यक्तिगत प्रयोगों का प्रतिनिधि है। त्रुटि सलाखों के मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । छात्र टी परीक्षण हर समय बिंदु पर गोबलेट और Paneth कोशिकाओं की मात्रा की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । तारांकन 0.05 < पी इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: FEMI P56 में आईएल-6 की देर से वृद्धि के साथ, पी0 में जन्म के तुरंत बाद सभी साइटोकिन्स के लिए एक वैश्विक नवजात भड़काऊ वृद्धि लाती है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार इलेक्ट्रोकेमैल्यूमिनेसेंस के साथ एलिसा का उपयोग करके पी0, पी 7, पी 14 और पी 28 में सीरम साइटोकिन्स की मात्रा निर्धारित की गई थी, और प्लेटों को 620 एनएम पर पढ़ा गया था। साइटोकिन मूल्यों को यहां रडार प्लॉट में दर्शाया जाता है, और सभी साइटोकिन्स को अधिकतम मूल्य के प्रतिशत के रूप में प्लॉट किया जाता है। नियंत्रण समूह (सभी पी < 0.05) की तुलना में फेमी समूह में पी0 में सभी साइटोकिन्स (आईएल-10, आईएल-10, केसी-ग्रो और आईएल-6) में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई। फेमी के साथ पिल्ले में पी-56 में आईएल-6 के स्तर में भी एक उभरते वृद्धि हुई थी, जबकि कोई फेमी (पी < 0.05 गैर-पैरामेट्रिक क्रुस्कल-वालिस परीक्षण द्वारा), जो एकमात्र साइटोकिन था जो इस देर से समय की तुलना में फेमी समूह में काफी ऊंचा था। एल्गिन एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित चित्रा41। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: एचएंडई दाग वाले इलियाल टिश्यू की आंतों की चोट स्कोरिंग । चोट स्कोर एक तीन सूत्री आंतों की चोट स्कोरिंग पैमाने (0 = सामान्य, 1 = हल्की चोट, 2 = गंभीर चोट) विली vacuolization, म्यूकोसल अल्सर, लैमिना प्रोप्रिया क्षति की डिग्री के आधार पर निर्धारित कर रहे हैं, और विली के भीतर नकसीर की उपस्थिति के रूप में पहले४३वर्णित है । एल्गिन एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित चित्रा41। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: एल्सियन ब्लू/पीए की प्रतिनिधि उपस्थिति गोबलेट और पैनेथ कोशिकाओं का धुंधला होता है। आंतों के ऊतकों के एल्सियन ब्लू/पीए धुंधला, आंतों विली में मौजूद गोबलेट कोशिकाओं के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है (शीर्ष पैनल सफेद तीर के साथ चिह्नित, 20x आवर्धन पर ली गई छवि), और पैनेथ कोशिकाएं, लीबरकुहन के क्रिप्ट्स में मौजूद हैं, जो लैमिना प्रोपरिया में आंतों की विली के नीचे स्थित हैं (नीचे पैनल पीले तीर के साथ चिह्नित, 60x आवर्धन पर ली गई छवि)। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कोरियोनामियोनाइटिस 2\u20124% अवधि और 25\u201230% अपरिपक्व प्रसव8,9को प्रभावित करता है। हालांकि , कोरियोनामियोनाइटिस का प्रभाव पिछले जन्म के लंबे समय तक बढ़ सकता है क्योंकि इसमें भ्रूण और नवजात 10 , 11 ,12,13,14,15,16पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि कोरियोनामियोनाइटिस को एनईसी15 , 16के बाद के विकास से जुड़ा हुआ दिखाया गया है । हालांकि यह अभी भी अधूरा समझ में आता है, एनईसी के रोगजनन की संभावना आंतों की अपरिपक्वता, अपरिपक्व प्रतिरक्षा प्रणाली के डिस्रेगुलेशन, आंतों की सूजन, और बैक्टीरियल स्थानांतरण का संयोजन शामिल है, जिसका समापन आंतों के परिगलन19के अंतिम आम मार्ग में होता है। हालांकि, कोरियोनामियोनाइटिस और एनईसी के बाद के विकास के बीच एक मशीनवादी लिंक अस्पष्ट20बना हुआ है, और कोरियोनामियोनाइटिस के पिछले पशु मॉडल इस संबंध की जांच करने के लिए अपर्याप्त रहे हैं। ज्ञान में इस अंतर को दूर करने के लिए, हमने नवजात जन्म और अस्तित्व के लिए अनुमति देने के लिए कोरियोमेनिओनाइटिस और अपरिपक्व जन्म34,37, 38,39,40 के आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एलपीएस-प्रेरित मुरीन मॉडल को संशोधित किया। ऐसा करने में, हमने एक मॉडल बनाया है जो बाद के आंतों के विकास पर मातृ सूजन (फेमी) के भ्रूण जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कोरियोनामियोनाइटिस42 में देखी गई भड़काऊ स्थिति का अनुमान लगाता है।

इस प्रोटोकॉल के साथ, हमने दिखा दिया है कि एलपीएस-प्रेरित फेमी का उपयोग करके कोरियोनामियोनाइटिस का यह मुरीन मॉडल, छोटी और दीर्घकालिक आंतों की चोट के साथ-साथ सामान्य आंतों के विकास में रुकावट के परिणामस्वरूप, सबसे विशेष रूप से गोबलेट और पैनेथ कोशिकाओं दोनों का डाउनरेगुलेशन, दोनों आंतों की सूजन के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करते हैं। इस मॉडल के साथ देखे जाने वाले आंतों की चोट और हिस्टोलॉजिक सेलुलर परिवर्तन इंगित करते हैं कि एनईसी में देखी गई चोट की नकल करने के लिए यह एक प्रभावी मॉडल है। इसका मुख्य कारण यह है कि पैनेथ कोशिकाओं और गोबलेट कोशिकाओं की डाउनरेगुलेशन दोनों को एनईसी के रोगजनन में फंसाया गया है, और हिस्टोलॉजिक चोट के पैटर्न एनईसी41,42, 49के मानव मामलों में देखे गए हैं। इसलिए, कोरियोनामियोनाइटिस का यह एलपीएस-प्रेरित फेमी मॉडल कोरियोनामियोनाइटिस और बाद में आंतों की चोट के बीच मशीनी लिंक की जांच करने के लिए एक आदर्श मॉडल है, विशेष रूप से एनईसी का विकास, साथ ही विकासशील माइक्रोबायोम पर कोरियोनामियोनाइटिस के संभावित प्रभाव, जो मौजूदा मॉडलों के साथ संभव नहीं होगा जो बैक्टीरिया का उपयोग करते हैं।

वीवो में, कोरियोनामियोनाइटिस में अक्सर एक आरोही जीवाणु संक्रमण होता है जिसके परिणामस्वरूप अक्सर झिल्ली का अपरिपक्व टूटना और कोरियोमोनियोनाइटिस का नैदानिक फेनोटाइप होता है, और कोरियोनामियोनाइटिस के पशु मॉडलमौजूद होते हैं जो इस रोगविज्ञान25, 28,30,32को अधिक सटीक रूप से दर्शाते हैं। हालांकि, क्योंकि हमारी प्रयोगशाला आंतों के विकास का अध्ययन करता है, जिसमें विकासशील माइक्रोबायोम शामिल है, कोरियोनामियोनाइटिस के मॉडल में जीवित बैक्टीरिया की उपस्थिति माइक्रोबायोम विश्लेषण को चकित कर देगी। इसलिए, जीवित बैक्टीरिया का उपयोग करने वाले कोरियोनामियोनाइटिस के मौजूदा मॉडल कोरियोनामियोनाइटिस और एनईसी के बाद के विकास के बीच मशीनी लिंक की जांच के लिए अव्यावहारिक हैं। इसके अलावा, कोरियोनामियोनाइटिस के एलपीएस-प्रेरित मॉडल पहले से ही प्रसवोत्तर सफेद और ग्रे मैटर ब्रेन इंजरी36मॉडलिंग में प्रभावी रहे हैं, यह प्रदर्शित करते हुए कि यह विधि जन्म के समय कोरियोनामियोनाइटिस के संपर्क में आने वाले प्रीमैच्योरिटी के मॉडल के लिए एक प्रभावी तरीका है।

यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह मॉडल फेमी को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एलपीएस की खुराक पर अत्यधिक निर्भर है। इस प्रोटोकॉल में प्राथमिक महत्वपूर्ण कदम एलपीएस के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ गर्भवती बांधों में फेमी को शामिल करना है; इसलिए, आश्चर्य नहीं, हमने पाया है कि फेमी को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाने वाली एलपीएस की खुराक इन प्रयोगों के परिणामों में अत्यंत महत्वपूर्ण है। प्रारंभिक प्रयोगों के साथ, एलपीएस की 100 μg/kg की एक खुराक का उपयोग किया गया था, क्योंकि यह एलपीएस खुराक मातृ मृत्यु दर से जुड़ी नहीं थी और इसके परिणामस्वरूप लगभग 50% नवजात अस्तित्व के साथ-साथ संतान41,42में महत्वपूर्ण आंतों की चोट हुई।

एलपीएस टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (टीएलआर 4) परिसर से बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग प्रोटीन, साइटोकिन उत्पादन और प्रो-भड़काऊ सिग्नलिंग50की शुरुआत होती है। टीएलआर 2, टीएलआर 3, टीएलआर 4, टीएलआर 7, टीएलआर 8 और टीएलआर 9 सहित टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) विभिन्न प्रकार के रोगजनकों और सूक्ष्मजीवों जैसे वायरस, बैक्टीरिया और कवक51के साथ देखे जाने वाले भड़काऊ प्रतिक्रिया को शामिल करने में महत्वपूर्ण हैं। दिलचस्प बात यह है कि टीएलआर 3 के उपनियम को नवजात आंतों की क्षति और नवजात मुरीन रोटावायरस मॉडल में वायरल शेडिंग के साथ सहसंबंधित करने के लिए भी दिखाया गया है; इसके अलावा, TLR3 के नॉकआउट इन प्रभावों को सुधार५२। इस प्रकार, जबकि मॉडल TLR4 रास्तों का उपयोग करता है, यह मानना उचित है कि अन्य टीएलआर की उत्तेजना समान निष्कर्ष प्रदान कर सकती है।

इस पद्धति का उपयोग करके, हम यह दिखाने में सक्षम रहे हैं कि गर्भवती बांधों में एलपीएस इंजेक्शन एमनियोटिक द्रव को बख्शते समय मातृ, अपरा और भ्रूण भड़काऊ मार्कर में वृद्धि का कारण बनता है, साथ ही प्लेसेंटा42को सीधे नुकसान पहुंचाता है। दिलचस्प बात यह है कि इस पद्धति ने गर्भाशय की धमनियों में प्रतिरोध का कोई परिवर्तन नहीं दिखाया। फेमी मॉडल का संतानों पर भी महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है क्योंकि हमने दिखाया है कि उजागर पिल्ले में आईएल-6 निर्भर मार्ग41 के माध्यम से महत्वपूर्ण आंतों की चोटहै और आंत के महत्वपूर्ण रक्षा तंत्र जैसे गोबलेट कोशिकाओं और पैनेथ कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है41। यह चोट नवजात संतानों को तेजी से बाद के एलपीएस-प्रेरित आंतों की चोट और सूजन41 के लिए अतिसंवेदनशील बनाती है जो समझा जा सकता है कि कोरियोनामियोनाइटिस के संपर्क में आने वाले शिशुओं में एनईसी विकसित करने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (DK097335 और T32AI007260) और आयोवा स्टेड फैमिली डिपार्टमेंट ऑफ पीडियाट्रिक्स के माध्यम से समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma HT501128
Alcian blue stain Newcomer supply 1003A
C57Bl6/J mice Jackson Laboratories 664
Ethanol Decon labs 2701
HCl Sigma H1758
Hematoxylin stain Leica 381562
LPS Sigma L2880
NaHCO3 Sigma S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope Nikon 2CE-MQVJ-1
Periodic Acid ACROS H5106 CAS# 10450-59-9
RNAlater Thermofisher Am7021
Schiff's reagent Sigma S5133
Secor Imager 2400 Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene Sigma 534056

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