Summary
Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.
Abstract
A coioamnionite é um precipitante comum do nascimento prematuro e está associada a muitas das morbidades da prematuridade, incluindo enterocolite necrosante (NEC). No entanto, ainda não foi descoberto um elo mecanicista entre essas duas condições. Adotamos um modelo murino de coioamnionite envolvendo lipopolisacarídeo (LPS) induzido exposição fetal à inflamação materna (FEMI). Este modelo de FEMI induz uma cascata inflamatória materna, placentária e fetal estéril, que também está presente em muitos casos de coioamnionite clínica. Embora existam modelos que utilizem bactérias vivas e imitem com mais precisão a fisiopatologia de uma infecção ascendente que resulta em coioamnionite, esses métodos podem causar efeitos indiretos no desenvolvimento do insorudo do trato intestinal imaturo e do microbioma em desenvolvimento associado. Usando este protocolo, demonstramos que o FEMI induzido pelo LPS resulta em um aumento dependente de dose na perda de gravidez e nascimento prematuro, bem como interrupção do desenvolvimento intestinal normal na prole. Além disso, demonstramos que o FEMI aumenta significativamente a lesão intestinal e citocinas séricas na prole, ao mesmo tempo em que diminui as células de cálice e Paneth, ambas fornecem uma primeira linha de imunidade inata contra inflamação intestinal. Embora um modelo semelhante de FEMI induzido pelo LPS tenha sido usado para modelar a associação entre corioamnionite e anormalidades subsequentes do sistema nervoso central, pelo que sabemos, este protocolo é o primeiro a tentar elucidar um elo mecanicista entre a coioamnionite e posterior perturbações no desenvolvimento intestinal como um potencial elo entre a coioamnionite e a NEC.
Introduction
As membranas coriônicas desempenham um papel integral na gravidez dos mamíferos. Eles incluem o acorde e amnion, que servem múltiplas funções. Cercam e protegem o feto, facilitam a sinalização paracrina entre os compartimentos materno e fetal1, e criam laços de feedback locais dentro das membranas coriônicas, que podem estar envolvidas no início da parturição1. A compreensão atual das membranas indica que o amnion fornece função de barreira estrutural, e o acorde fornece um tampão imunológico principalmente para proteger o feto em desenvolvimento do sistema imunológico materno2. A inflamação dessas membranas é conhecida como coioamnionite. Historicamente, o diagnóstico de coioamnionite clínica foi feito após a presença de febre materna mais um ou mais achados clínicos fetais ou maternos3,4. No entanto, embora essa definição seja clinicamente útil, sua falta de precisão tornou a pesquisa de coioamnionite desafiadora. Em 2015, na tentativa de esclarecer o diagnóstico, uma oficina de painéis de especialistas do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver definiu a coioamnionite como inflamação intrauterina, ou infecção, ou ambos (triplo I)3. Esse esclarecimento é importante porque, embora a infecção induzida por microbiano seja uma importante causa de inflamação uterina/amniótica, ocorre menos comumente do que a inflamação uterina/amniótica estéril5,6,7. No geral, a coioamnionite continua sendo um problema significativo de saúde pública, como é visto em 2\u20124% dos partos a termo e 25\u201230% das entregas pré-termo8,9.
A coioamnionite pode ter efeitos significativos no feto e no recém-nascido. Tem sido bem documentado na literatura que a coioamnionite está associada ao aumento do risco de muitas das morbidades da prematuridade, incluindo displasia broncopulmonar10, lesão de matéria branca cerebral11,hemorragia intraventricular12, retinopatia da prematuridade13, e tanto suspeita e confirmada início precoce da sepse neonatal14,15. Como estamos interessados em mecanismos de lesão e reparação do trato intestinal imaturo, é importante notar que a coioamnionite também está associada ao desenvolvimento posterior da enterocolite necrosante (NEC)15,16. A NEC é uma doença gastrointestinal devastadora de bebês prematuros que resulta em uma resposta desregulada do hospedeiro à inflamação e necrose intestinal subsequente17. A cada ano, a NEC afeta mais de 4.000 bebês nos Estados Unidos, e até um terço desses bebês morrem pela doença18. A patogênese da NEC provavelmente envolve uma combinação de imaturidade intestinal, desregulação do sistema imunológico imaturo, inflamação intestinal e translocação bacteriana19,culminando em uma via comum final de necrose intestinal. É importante ressaltar que o início da NEC ocorre muitas vezes semanas após o nascimento e exposição potencial à coioamnionite, tornando incerto o vínculo mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento subsequente da NEC20. Um mecanismo potencial pelo qual a coioamnionite pode contribuir para a fisiopatologia da NEC é através da regulação do sistema imunológico materno, produzindo posteriormente uma forte resposta inflamatória fetal que pode interromper os padrões normais de desenvolvimento fetal21,22,23.
Múltiplos modelos mamíferos de coioamnionite existem em roedores e ovelhas24,25,26,27,28,29,30,31,32. No entanto, existem poucos dados relativos ao desenvolvimento do trato intestinal além do período inicial do recém-nascido após a exposição fetal induzida pela coioamnionite à inflamação materna (FEMI). A fim de explorar a relação entre FEMI e o desenvolvimento subsequente da lesão do trato intestinal imaturo, adaptamos o modelo FEMI induzido por lipopolissacarídeo (LPS). Lipopolisacarídeos são um componente importante da superfície extracelular em bactérias gram negativas e são um potente estimulante do sistema imunológico inato de múltiplas espécies eucarióticas, incluindo humanos33. A injeção de LPS materno resulta em uma cascata inflamatória estéril sem os efeitos confusos das bactérias vivas, sendo um modelo bem estabelecido para a indução do nascimento pré-parto34, bem como um modelo de corioamnionite aguda e a síndrome de resposta inflamatória fetal (FIRS), que é a forma mais grave de coioamnionite24,35. Também foi demonstrado induzir tanto a lesão de matéria branca e cinza cerebral em um modelo de ovelha36 como um modelo murino37,38,39,40. No entanto, pelo que sabemos, somos os primeiros a utilizar esse modelo de coioamnionite e FEMI para investigar seus efeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal após o nascimento, bem como para investigar uma possível ligação mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento posterior da NEC41,42.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Iowa (Protocol #8041401). Todos os animais foram alojados em uma Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados De Animais laboratoriais (AALAC) aprovada na Universidade de Iowa. Todos os ratos eram do tipo selvagem C57Bl/6J.
1. Estabelecimento de FEMI em camundongos gestantes
- Preparação do LPS
- Use LPS derivado de Escherichia coli O55:B5 (concentração de estoque 2 mg/mL).
- Concentração de estoque de LPS diluída 1:100 com soro fisiológico estéril para uma concentração de trabalho de 20 μg/mL.
- Injeção de LPS materno
- Injete barragens grávidas no dia da gestação e15. Esse ponto de tempo é de aproximadamente 75% durante a gestação murina, tornando esse modelo de desenvolvimento semelhante ao terceiro trimestre precoce de gestações humanas, que é quando ocorre a maioria dos nascimentos prematuros devido à cooamnionite.
- Pese camundongos gestantes imediatamente antes da injeção para determinar a dosagem LPS apropriada.
- Calcule a dose de concentração de trabalho utilizando a seguinte fórmula: 5 μL x grama de peso corporal (gbw), para uma dose total de LPS de 100 μg/kg. Para animais de controle, use um volume equivalente de soro fisiológico normal para injeção.
- Solução LPS vortex três vezes por 15 segundos em alta antes de cada injeção.
- Desenhe o volume LPS em uma seringa de 1 mL.
- Contenha o rato grávida com técnica de escroffing. Segure na posição de recumbência dorsal e realize a injeção.
- Insira uma agulha de 30 mm de 8 mm sobreo painel do quadrante inferior direito do abdômen (para evitar bexiga e vasos abdominais) em um ângulo de 30\u201240°. Insira cerca de 1/4 a 1/2 o comprimento da agulha.
- Puxe para trás o êmbolo da seringa para garantir a pressão negativa antes da injeção. Proceda com a injeção se houver pressão negativa.
- Após a injeção, monitore os camundongos por aproximadamente 30 minutos e depois retorne às gaiolas pelo resto da gravidez.
2. Parto e cuidado de descendentes, e colheita intestinal
- Entregue filhotes normalmente através do parto vaginal no e20.
NOTA: Este modelo tem uma taxa de perda fetal dependente de dose esperada que pode ser observada na Figura 1 e é discutida nos resultados abaixo. - Permita que os filhotes permaneçam com as mães e recebam rações ad libitum.
- No dia da colheita, tipicamente no dia 14 (P14), os filhotes de eutanásia via deslocamento cervical em conformidade com os protocolos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
- Usando tesouras e fórceps, faça uma incisão vertical pela linha média do abdômen, através da pele e do peritônio, durante toda a extensão do abdômen. Extirpe o intestino delgado do estômago até o ceco com uma tesoura e remova a mesenteria com fórceps.
- Isole e mantenha o distal 1/3 do intestino delgado (seção representativa do íleo humano), descartando o intestino delgado proximal, o ceco e o cólon.
- Divida a porção de íleo ao meio usando uma tesoura.
- Coloque a metade proximal em uma solução de estabilização de RNA para quantificação posterior do RNA.
- Coloque a metade distal em formalina tamponada 10% neutra para a preparação do slide.
3. Pontuação de lesão intestinal
- Seção parafina embutida tecido em fatias de 5 μm de espessura e montar em lâminas de vidro.
NOTA: Enviamos os espécimes para um núcleo de histologia para incorporação, secção e montagem em slides. - Desparafinar slides de acordo com os procedimentos padrão.
- Manchas com hematoxilina e eosina de acordo com os procedimentos padrão.
- Escore seções em uma escala de 3 pontos para lesão intestinal como descrito anteriormente42,43.
- Utilizando microscopia leve, avalie a lesão intestinal generalizada por dois investigadores cegos separados em uma escala de 3 pontos avaliando a integridade e separação de Villus da membrana do porão43 (Figura Suplementar 1). A lesão intestinal é melhor avaliada em ampliação de 20x e abertura numérica 0,50.
- Atribua uma pontuação de 0 para descrever a mucosa normal.
- Atribuir uma pontuação de 1 descrever lesão leve que abrange o desenvolvimento do espaço subepiteliol gruenhagen, vacuolização ou elevação subepithelial limitada à lavímen propria ou pontas de villi.
- Atribua um escore de 2 para descrever lesões graves, indicadas por elevação epitelial e vacuolização maior que a metade da vílli, distorção de villi ou ulceração mucosa e desintegração da órcia de lamina.
4. Quantificação de panése e células de cálice
- Após a desparafinação, manchas deslizam de seções teciduais da Etapa 2.8 com a mancha de Ácido Azul/Periódico Alcian Schiff para denotar tanto as células de cálice quanto de Paneth como descrito anteriormente44,45 de acordo com as etapas a seguir.
NOTA: Embora a mancha de Alcian Blue/Periodic Acid Schiff não seja específica nem para células paneth ou cálices, em nossa experiência, investigadores experientes cegos têm quantificação celular equivalente usando esta mancha em comparação com anticorpos mirados celulares, com significativamente menos coloração de fundo46. - Desparafinar, manchar e desidratar lâminas da seguinte forma.
- Submergir desliza em xileno por 10 minutos duas vezes.
ATENÇÃO: O xileno deve ser usado em um capô de fumaça. - Enxágüe com 100% etoh.
- Submergir slides em 100 % EtOH por 3 min, depois em 90% EtOH por 3 min, seguido por 70% EtOH por 3 min, e por último submergir slides em 50% EtOH por 3 min.
- Lave sob água da torneira por 5 minutos.
ATENÇÃO: Aponte a seção para longe da água corrente para evitar a perda da amostra de tecido. - Filtrar a solução de mancha azul alciana com um filtro de café padrão.
- A mancha desliza na mancha azul alciana por 15 minutos e depois lava sob água da torneira por 2 minutos.
- Diluir 1 mg de ácido periódico em 200 mL de água dupla destilada. Submergir slides nesta solução por 5 minutos. Em seguida, lave sob água da torneira por 1 min.
- Mancha com o reagente de Schiff por 10 minutos. Lave sob água da torneira por 5 minutos.
- Manche os slides com hematoxilina por 1 min e depois lave sob água da torneira por 2 minutos.
- Submergir-os em álcool ácido (1 mL de ácido clorídrico misturado em 99 mL de 70% EtOH) por 1 min.
- Submergir na água da torneira de Scott (0,1% de concentração de NaHCO3 na água da torneira) por 1 min e depois lavar sob água da torneira por 1 min.
- Desidratar os slides.
- Mergulhe cada slide 10 vezes em 70% EtOH, depois diminua 10 vezes em 90% EtOH e 10 vezes em 100% EtOH.
- Submergir desliza em 100% EtOH por 10 minutos, seguido por submergir duas vezes em xileno fresco por 3 min cada.
- Coloque uma gota de mídia de montagem sobre o espécime e coloque uma mancha sobre ele.
- Submergir desliza em xileno por 10 minutos duas vezes.
- Contagem de células de cálice
- Utilizando microscopia leve, conte células de cálice(Figura Suplementar 2). Para cada pedaço de tecido intestinal, conte o número de células de cálice e 500 células epiteliais e expresse a razão das células de cálice como uma razão por 100 células epiteliais. As células cálices são melhor contadas em ampliação de 20x e abertura numérica 0,5.
- Contagem de células de Paneth
- Utilizando microscopia leve, conte células paneth(Figura Suplementar 2). Para cada pedaço de tecido intestinal, expresse como uma razão de células paneth por cripta intestinal. Conte 100 criptas intestinais por cada pedaço de tecido intestinal. As células paneth são melhor contadas em 20x-60x de ampliação e abertura numérica 0,50-1,30.
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Representative Results
A exposição ao FEMI no dia 15 embrionário leva a uma perda dependente de dose da gravidez e uma taxa dependente de dose de trabalho de parto prematuro(Figura 1)42. Para os experimentos, optou-se por usar uma dose de LPS de 100 μg/kg para minimizar a perda e a prematuridade da gravidez (perda de 50% entre prematuridade e morte fetal intrauterina) enquanto expunimos os fetos a um insulto inflamatório significativo.
Usando esta abordagem, examinamos em seguida os efeitos do FEMI sobre a lesão subsequente da prole. Utilizando uma escala histológica de 3 pontos para medir lesões intestinais generalizadas, encontramos lesão significativa ao nascer (P0) e na idade adulta (P56 ou 8 semanas de vida)(Figura 2). É importante notar que essa lesão ocorreu na ausência de quaisquer estímulos adicionais aos animais que não o FEMI, sugerindo que o FEMI sozinho interrompe a homeostase normal do trato intestinal murino recém-nascido. Como o camundongo nasce com um intestino relativamente imaturo que continua a se desenvolver durante as primeiras 4 semanas de vida47,48, isso é relevante para bebês prematuros que também têm tratos intestinais imaturos.
Para entender melhor o efeito do FEMI tanto no desenvolvimento normal do epitélio intestinal quanto nos mecanismos de defesa do trato intestinal imaturo, quantificamos o número de células de cálice produtoras de mucina e células paneth produtoras de peptídeos antimicrobianos no terço distal do pequeno trato intestinal que é semelhante ao íleo humano. Verificou-se que o FEMI interrompeu a composição normal do epitélio intestinal induzindo a perda de ambas as células de cálice e células de Paneth em comparação com animais sem FEMI(Figura 3).
Para investigar os efeitos do FEMI na resposta inflamatória neonatal, utilizando ELISA com eletroquimiluminascência, quantificamos uma variedade de marcadores inflamatórios séricos, que incluíam IL-1β, IL-10, KC-GRO (equivalente murino de IL-8) e IL-6, do soro de filhotes com e sem FEMI(Figura 4). Descobrimos que o FEMI aumentou significativamente a cascata inflamatória para todas as citocinas em P0. A cascata inflamatória em idades posteriores (P7\u2012P56) difere com base no ponto de tempo e citocina. O mais interessante é que, para o IL-6, houve níveis semelhantes em P7\u2012P28 nos grupos FEMI e sham, mas apesar de nenhuma intervenção secundária, houve níveis significativamente mais elevados no grupo FEMI em P56. Isto é especialmente importante, pois demonstramos que o IL-6 é uma citocina crítica para o desenvolvimento de lesões intestinais pós-natais no modelo FEMI.
Figura 1: Efeito da dose FEMI nos desfechos da gravidez. A sobrevida das ninhadas de gravidez é uma dose dependente de doses mais elevadas, causando maiores taxas de perda de gravidez (A)e maiores taxas de nascimento prematuro(B). A figura é adaptada com permissão de Fricke et al42. FEMI usando uma dose LPS de 100 μg/kg cria uma sobrevida de 50% para filhotes em uma semana de vida. Cada ponto de dados é representativo de um n > 8 gestações e pelo menos três experimentos individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito do FEMI sobre pequenos padrões de lesão intestinal distal ao longo do tempo. Amostras intestinais foram colhidas ao nascer, 1 semana de vida, 2 semanas de vida e 8 semanas de vida de camundongos expostos ao FEMI (100 μg/kg de LPS) ou controle falso. As amostras foram pontuadas utilizando uma escala de lesão de 3 pontos pelos investigadores cegos42,43. FEMI sozinho sem mais insultos induziu quantidade significativa de lesão ao nascer, 1 semana de vida, e em 8 semanas de vida. A figura foi adaptada com permissão de Fricke et al.42. Cada ponto de dados é representativo de um n > 10 filhotes e pelo menos três experimentos individuais de pelo menos 3 barragens grávidas. O teste T não paramétrico de Mann-Whitney foi usado para comparar os escores de lesões intestinais em cada ponto de tempo. O asterisco indica p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: FEMI induz alterações de quantidades normais de cálice e células paneth no intestino delgado durante o desenvolvimento. As amostras intestinais foram colhidas ao nascer, 1, 2, 4 e 8 semanas de vida de camundongos expostos ao FEMI (100 μg/kg LPS) ou ao controle falso. As amostras foram manchadas com a mancha de azul alciano/ácido periódico Schiff para detectar as células de cálice e Paneth e estas foram quantificadas por um investigador cego. Ambas as células de cálice e células paneth de animais com FEMI apresentaram uma tendência ou uma diminuição significativa em comparação com os controles falsos em todas as idades. Figura adaptada com permissão de Elgin et al.41. Cada ponto de dados é representativo de um n > 10 filhotes e pelo menos três experimentos individuais. As barras de erro representam erro padrão da média. O teste T estudantil foi usado para comparar quantidades de células de cálice e Paneth em cada ponto de tempo. O asterisco indica p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: FEMI induz um surto inflamatório neonatal global para todas as citocinas imediatamente após o nascimento em P0, com uma onda tardia de IL-6 em P56. Citocinas de soro foram quantificadas em P0, P7, P14 e P28 utilizando ELISA com eletroquímica de acordo com as instruções do fabricante, e as placas foram lidas a 620 nm. Os valores da citocina são representados aqui em uma trama de radar, e todas as citocinas são plotadas como por cento do valor máximo. Houve aumentos significativos em todas as citocinas (IL-1β, IL-10, KC-GRO e IL-6) em P0 no grupo FEMI em comparação com o grupo controle (todos p < 0,05). Houve também um aumento ressurgente nos níveis de IL-6 em P56 nos filhotes com FEMI em comparação com nenhum FEMI (p < 0,05 por teste kruskal-wallis não paramétrico), que foi o único citocina que foi significativamente elevado no grupo FEMI em comparação com o controle neste ponto de tempo tardio. Figura adaptada com permissão de Elgin et al.41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Pontuação de lesão intestinal de tecido ileal manchado de H&E. Os escores de lesões são determinados por uma escala de pontuação de lesão intestinal de três pontos (0=normal, 1=lesão leve, 2=lesão grave) com base no grau de vacuolização de villi, ulceração mucosa, dano de lamina propria e presença de hemorragia dentro de vílli como descrito anteriormente43. Figura adaptada com permissão de Elgin et al.41. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: Aparência representativa da coloração azul/pas alciana de células de cálice e paneth. A coloração azul/PAS alciana de tecidos intestinais permite visualização clara de células de cálice, presentes em villi intestinal (painel superior marcado com setas brancas, imagem tirada em ampliação de 20x), e células paneth, presentes em criptas de Lieberkuhn, localizadas abaixo do villi intestinal na álminação (painel inferior marcado com setas amarelas, imagem tomada em 60x de ampliação). Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
A coioamnionite impacta 2\u20124% do prazo e 25\u201230% das entregas pré-termo8,9. No entanto, o impacto da coioamnionite pode se estender muito além do nascimento, pois tem se mostrado ter efeitos significativos sobre o feto e o recém-nascido10,11,12,13,14,15,16. É importante ressaltar que a coioamnionite tem se mostrado associada ao desenvolvimento subsequente da NEC15,16. Embora ainda seja incompletamente compreendida, a patogênese da NEC provavelmente envolve uma combinação de imaturidade intestinal, desregulação do sistema imunológico imaturo, inflamação intestinal e translocação bacteriana, culminando em uma via comum final de necrose intestinal19. No entanto, uma ligação mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento subsequente da NEC permanece incerta20, e modelos animais anteriores de coioamnionite têm sido insuficientes para examinar essa relação. Para suprir essa lacuna de conhecimento, modificamos o modelo murina comumente utilizado induzido por LPS de coioamnionite e nascimento prematuro34,37,38,39,40 para permitir o nascimento e a sobrevivência neonatal. Ao fazê-lo, criamos um modelo que aproxima a condição inflamatória observada na coioamnionite42 para estudar o impacto da exposição fetal à inflamação materna (FEMI) no desenvolvimento intestinal subsequente.
Com este protocolo, demonstramos que este modelo murino de coioamnionite, utilizando FEMI induzido pelo LPS, resulta em lesão intestinal de curto e longo prazo, bem como interrupção do desenvolvimento intestinal normal, mais notavelmente a baixa regulação das células de cálice e Paneth, ambas fornecem uma primeira linha de imunidade inata contra inflamação intestinal. A lesão intestinal e as alterações celulares histológicas que são vistas com este modelo indicam que é um modelo eficaz para imitar a lesão vista na NEC. Isso ocorre principalmente porque a baixa regulação das células paneth e das células de cálice foram implicadas na patogênese da NEC, e os padrões de lesão histológica são semelhantes aos observados em casos humanos de NEC41,42,49. Portanto, este modelo femi induzido pelo LPS de coioamnionite é um modelo ideal para investigar a ligação mecanicista entre a coioamnionite e a lesão intestinal posterior, especificamente o desenvolvimento da NEC, bem como potenciais efeitos da coioamnionite no microbioma em desenvolvimento, o que não seria possível com modelos existentes que utilizam bactérias vivas.
In vivo, a coioamnionite muitas vezes envolve uma infecção bacteriana ascendente que muitas vezes resulta em ruptura pré-cardíaca de membranas e o fenótipo clínico de coioamnionite, e existem modelos animais de coioamnionite que refletem com mais precisão essa fisiopatologia25,28,30,32. No entanto, como nosso laboratório estuda o desenvolvimento intestinal, incluindo o microbioma em desenvolvimento, a presença de bactérias vivas em um modelo de coioamnionite confundiria a análise do microbioma. Portanto, os modelos existentes de coioamnionite utilizando bactérias vivas são impraticáveis para investigar a ligação mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento posterior da NEC. Além disso, modelos induzidos por LPS de coioamnionite já foram eficazes na modelagem da lesão cerebral de matéria branca e cinza pós-natal36,demonstrando que esse método é uma maneira eficaz de modelar morbidades de prematuridade que estão associadas à exposição à coioamnionite no momento do nascimento.
Também é importante notar que este modelo é altamente dependente da dose de LPS utilizada para induzir femi. O principal passo crítico neste protocolo é a indução de FEMI nas barragens grávidas com injeção intraperitoneal de LPS; portanto, não surpreendentemente, descobrimos que a dose de LPS usada para induzir o FEMI é extremamente importante nos resultados desses experimentos. Com os experimentos iniciais, utilizou-se uma dose de 100 μg/kg de LPS, uma vez que esta dose de LPS não estava associada à mortalidade materna e resultou em aproximadamente 50% de sobrevivência neonatal, bem como lesão intestinal significativa na prole41,42.
O LPS se liga ao complexo do receptor Toll-like 4 (TLR4), resultando na agregação de proteínas de sinalização intracelular, produção de citocinas e início da sinalização pró-inflamatória50. Receptores semelhantes a pedágio (TLRs) incluindo TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 e TLR9 são importantes na indução da resposta inflamatória que é vista com uma variedade de patógenos e microrganismos como vírus, bactérias e fungos51. Curiosamente, a regulação do TLR3 também tem se mostrado correlaciona-se com o aumento dos danos hetológicos e derramamento viral em um modelo de rotavírus murina neonatal; além disso, o nocaute do TLR3 amenizou esses efeitos52. Assim, enquanto o modelo faz uso de vias TLR4, é razoável supor que a estimulação de outras TLRs pode conferir achados semelhantes.
Utilizando essa metodologia, pudemos mostrar que a injeção de LPS em barragens grávidas causa aumentos nos marcadores inflamatórios maternos, placentários e fetais, poupando o fluido amniótico, além de induzir danos diretos à placenta42. Curiosamente, essa metodologia não mostrou alteração de resistência nas artérias uterinas. O modelo FEMI também tem um impacto significativo na prole, pois mostramos que os filhotes expostos têm lesão intestinal significativa42 através de uma via dependente il-641 e podem impactar mecanismos de defesa importantes do intestino, como células de cálice e células de Paneth41. Esta lesão torna a prole neonatal cada vez mais suscetível à lesão intestinal induzida pelo LPS subsequente e inflamação41, o que pode explicar por que os bebês expostos à coioamnionite têm uma suscetibilidade aumentada para desenvolver NEC.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte através dos Institutos Nacionais de Saúde (DK097335 & T32AI007260) e do Departamento de Pediatria da Família Stead da Universidade de Iowa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| Alcian blue stain | Newcomer supply | 1003A | |
| C57Bl6/J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Ethanol | Decon labs | 2701 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| Hematoxylin stain | Leica | 381562 | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Nikon Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 2CE-MQVJ-1 | |
| Periodic Acid | ACROS | H5106 | CAS# 10450-59-9 |
| RNAlater | Thermofisher | Am7021 | |
| Schiff's reagent | Sigma | S5133 | |
| Secor Imager 2400 | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| V-Plex Assay | Meso Scale Discovery (MSD) | ||
| Xylene | Sigma | 534056 |
References
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